CN108276506A - 疏水壳聚糖的制备方法及其产物、及其产物用于制备止血材料的用途 - Google Patents

Abstract

本发明是关于一种疏水壳聚糖的制备方法，其包括如下步骤：(1)准备黏均分子量为10万至100万、脱乙酰度70％至100％的壳聚糖；(2)将所述壳聚糖溶入乙酸水溶液中，得到壳聚糖乙酸水溶液；其中所述乙酸水溶液的浓度范围为0.1％(ml/ml)至90％(ml/ml)，所述壳聚糖乙酸水溶液的浓度范围为0.1％(g/ml)至10％(g/ml)；(3)于前述壳聚糖乙酸水溶液加入含有疏水基的底物进行反应，而后调整其pH值为6至14，再进行过滤，过滤后洗涤至中性，再干燥，得到疏水壳聚糖。本发明亦关于一种由前述疏水壳聚糖的制备方法所制备而得的疏水壳聚糖。本发明又关于一种疏水壳聚糖用于制备止血材料的用途。

Description

疏水壳聚糖的制备方法及其产物、及其产物用于制备止血材 料的用途

技术领域

本发明涉及一种制备方法，特别是指一种疏水壳聚糖的制备方法；本发明更涉及一种由前述制备方法所制备而得的疏水壳聚糖；本发明另涉及一种用途，特别是前述制备方法所制备而得的疏水壳聚糖用于制备止血材料的用途。

背景技术

人类活动意外伤害事件繁多，其中因受伤失血过多是导致创伤死亡的最主要因素。

现有止血材料是通过收伤口部位的水分从而富集红细胞、血小板以及凝血因子等，或与组织紧密黏附形成封闭创面，或使血管收缩减少出血，进而从多方面进行止血。止血材料从作用机制上大致可分为三类：(1)纤维蛋白类止血材料：是提供外来的凝血成分，从而提高伤口部位凝血成分浓度；(2)高分子多糖类、无机类沸石等：使伤口部位自身的凝血成分浓缩、聚集；(3)α-氰基丙烯酸酯类材料：利用材料对组织很强的黏着力，直接封闭创面。

然而前述三类止血材料在实际应用中各自有一定的不足之处，生物制品类容易导致病源感染和免疫反应且黏附力较差；而明胶和胶原的组织黏附力较差，且两者的止血功能均依赖于足量的血小板和凝血因子，因此在应用上受限。硅铝酸盐类具有强烈的放热效应，易皮肤烧伤；多孔沸石和马铃薯淀粉在吸收血液中的水分后会放出大量的热，也容易造成伤口炎症；α-氰基丙烯酸酯类降解过程中会释放出氰和甲醛等有毒物质，则会造成伤口愈合延迟。

壳聚糖相关产品因具有生物兼容性高、生物可降解性和安全性好，又兼具抗菌特性和成本低廉等特点，是一种最具潜力的急救止血剂；但纯壳聚糖止血材料仅对于轻度出血创面的应用效果较好，而对于严重出血的止血效果不稳定，且止血速度与效果不尽理想，难以完全满足理想快速止血材料的要求，因此，亟待开发一种组织黏附性好、生物安全性高、促进创面愈合、无毒副作用的新型高效止血材料。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供一种疏水壳聚糖的制备方法，从而改善现有技术因为疏水壳聚糖合成制备中的资源浪费及污染，并简化制备流程，且可得到具有较高取代度的疏水壳聚糖。此外，将由前述的疏水壳聚糖的制备方法所得到的疏水壳聚糖用于制备止血材料可以有效达到快速止血的效果。

为了达到上述目的，本发明遂提供一种疏水壳聚糖的制备方法，其包括如下步骤：

(1)准备黏均分子量为10万至100万、脱乙酰度70％至100％的壳聚糖；

(2)将所述壳聚糖溶入乙酸水溶液中，得到壳聚糖乙酸水溶液；其中所述壳聚糖与所述乙酸水溶液的重量体积比范围为1g：10ml至1g：1000ml；以及，

(3)于前述壳聚糖乙酸水溶液加入含有疏水基的底物进行反应，而后调整其pH值为6至14，再进行过滤，过滤后洗涤至中性，再干燥，得到疏水壳聚糖。

优选地，其中于步骤(3)中，所述含有疏水基的底物，其中所述疏水基是选自于由含有芳香基的烃基、含有酯基的烃基、含有醚基的烃基、含有胺基的烃基、含有酰胺基的烃基、含有酸酐基的烃基、含有烯基的烃基、及其组合所构成的群组，且其疏水基的碳数为5至20。

更优选地，其中于步骤(3)中，所述含有疏水基的底物，其中所述疏水基的碳数为10至18。

更优选地，其中于步骤(3)中，所述含有疏水基的底物为月桂酸酐。

优选地，其中所述乙酸水溶液的浓度为1％(ml/ml)。

优选地，其中所述壳聚糖乙酸水溶液浓度为1％(g/ml)。

优选地，其中于步骤(3)中包含如下步骤：于前述壳聚糖乙酸水溶液加入含有疏水基的底物，于温度20℃至80℃条件下进行反应，而后调整其pH值为6至14，再进行过滤，过滤后洗涤至中性，再干燥，得到所述疏水壳聚糖。

更优选地，其中于步骤(3)中包含如下步骤：于前述壳聚糖乙酸水溶液加入含有疏水基的底物，于温度55℃条件下反应2小时至24小时，而后调整其pH值为11，再进行过滤，过滤后洗涤至中性，再干燥，得到所述疏水壳聚糖。

本发明另提供一种疏水壳聚糖，其是由前述疏水壳聚糖的制备方法所制备而得。

本发明又提供一种疏水壳聚糖用于制备止血材料的用途，所述止血材料包含疏水壳聚糖以及其医药学上可接受之佐剂；其中所述疏水壳聚糖是由前述疏水壳聚糖的制备方法所制备而得。

根据本发明所述的止血材料为疏水壳聚糖止血海绵，其是由所述疏水壳聚糖溶于所述乙酸水溶液中，并添加聚乙烯醇(PVA)溶液、明胶溶液及海藻酸钠溶液混合而得。

根据本发明所述的止血材料为疏水壳聚糖止血凝胶，其是由羧甲基纤维素钠溶液混匀少量甘羟铝、乙二胺四乙酸，而后添加卡波姆溶液、甘油、聚丙烯酸钠以形成高黏度基质，最后添加前述疏水壳聚糖乙酸水溶液及酒石酸液混合而得。

根据本发明所述的止血材料为疏水壳聚糖止血薄膜，其是由述疏水壳聚糖溶于所述乙酸水溶液中，并添加明胶、碳酸氢钠、PEG20000搅拌均匀，加入戊二醛、甘油，分取下层溶液，风干即得。

根据本发明所述的止血材料为疏水壳聚糖止血粉，其是由述疏水壳聚糖溶于溶于所述乙酸水溶液中，加入氯化钙，再加入无水乙醇反应，过滤后将滤渣以无水乙醇洗涤至中性，最后干燥粉碎而得。

本发明所述的「中性」，意指pH值为7。

本发明的优点在于：该制备方法快速简便，所需材料较少，反应过程温和，产物易于纯化，可以改善现有技术合成疏水壳聚糖制程过长、制备材料过于复杂、反应过程产生大量泡沫且会造成污染等问题，而且以本发明制备方法所制备而得疏水壳聚糖，在取代度为9％-15％时，疏水壳聚糖在混合体系中的浓度不小于0.6％(g/ml)时，其对血浆具有快速凝集的效果，可在1-5秒之内凝固，而用烷基化方法合成的疏水壳聚糖，在相同取代度和浓度条件下，凝血时间较长；当烷基化而得的疏水壳聚糖在混合体系中的浓度不小于0.75％(g/ml)时，其对血浆的凝集效果与本发明所述方法合成的疏水壳聚糖在混合体系中的浓度不小于0.6％(g/ml)的效果一致。因此本文所述方法合成的疏水壳聚糖，其止血效果明显优于传统烷基化方法所合成的疏水壳聚糖。

附图说明

图1为壳聚糖与疏水壳聚糖红外光谱(IR)图。

图2为壳聚糖与疏水壳聚糖核磁共振光谱(NMR)图。

图3为疏水壳聚糖海绵纵切面扫描电子显微镜(SEM)图。

具体实施方式

以下配合图式及本发明之较佳实施例，进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段。

制备例1疏水壳聚糖的制备

(1)将黏均分子量为40万、脱乙酰度不小于95％的壳聚糖溶于浓度为1％(ml/ml)的乙酸水溶液至完全溶解，而后进行抽滤；其中前述疏水壳聚糖与前述乙酸水溶液的重量体积比为1g:100ml；

(2)在由步骤(1)获得的溶液中加入0.3g月桂酸酐，并于55℃的温度条件下反应2至24小时，以氢氧化钠(NaOH)调整pH值至11，将溶液过滤后洗涤至中性，再进行干燥后，即得疏水壳聚糖。

将前述得到的疏水壳聚糖与一般壳聚糖进一步使用红外线光谱及核磁共振分析，得到图1及图2。

图1为壳聚糖与所得疏水壳聚糖的红外线图谱。在谱图中，疏水壳聚糖的2894cm^-1和2933cm^-1是乙基和甲基的伸缩振动峰，3459cm^-1处的峰属于壳聚糖羟基的伸缩振动峰，1621cm^-1是氨基的伸缩振动峰。从图上可以看出，疏水壳聚糖在1388cm^-1处新出现了甲基和乙基的弯曲振动峰，2894cm^-1和2933cm^-1的乙基和甲基峰强度随着脂肪长链的成功取代而增强，以上结果表明疏水基取代了壳聚糖氨基上的氢。同时疏水壳聚糖氨基的氮氢键的1670cm^-1吸收峰明显增强，而氨基的1621cm^-1吸收峰消失，表明反应发生在壳聚糖的氨基上，合成的产物为疏水壳聚糖。

图2为壳聚糖与所得疏水壳聚糖的核磁图谱。从图谱中可见在化学位移在1.08ppm，1.06ppm和1.05ppm处出现－CH₃对应的质子峰，1.17ppm处出现－CH₂－对应的质子峰，其中亚甲基的峰面积明显大于甲基的峰面积，说明有脂肪长链的存在。这个实验结果与红外光谱的测定结果一致。以上反应是将壳聚糖的氨基与月桂酸酐进行酰基化反应，氨基的氢原子可被酰基取代，生成N―取代酰胺或N，N－二取代酰胺。

制备例2疏水壳聚糖止血海绵的制备

(1)将取代度为2％至50％的疏水壳聚糖溶于浓度为2％(ml/ml)的乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解；其中前述疏水壳聚糖与前述乙酸水溶液的重量体积比为0.1g：100ml至10g：100ml；

(2)配制4％(g/ml)的聚乙烯醇(PVA)溶液、8％(g/ml)的明胶溶液和2％(g/ml)的海藻酸钠溶液；

(3)在由步骤(1)所获得的溶液中依序加入这步骤(2)所配制的3种溶液，并使其混合均匀，使疏水壳聚糖：明胶：PVA：海藻酸钠的最终重量比例为1:1:0.5:1；

(4)搅拌由步骤(3)所获得的溶液至充分起泡，然后倒入模具中，在-20℃冷冻6小时，再进行冷冻干燥48小时，即得到疏水壳聚糖止血海绵。

由制备例2所制得的疏水壳聚糖止血海绵剖面的SEM图如图3所示，由图3可知，疏水壳聚糖止血海绵有疏松多孔的结构，无固体颗粒杂质附着。

制备例3疏水壳聚糖止血凝胶的制备

(1)配制5％(g/ml)的羧甲基纤维素钠溶液，并加入少量甘羟铝、乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，混合均匀。

(2)配制5％(g/ml)的卡波姆溶液，将其加入步骤(1)所得溶液中，搅拌均匀；再加入10g甘油并混合均匀，加入聚丙烯酸钠，搅拌均匀，形成高黏度基质，随后加入10ml疏水壳聚糖乙酸水溶液(其中所述疏水壳聚糖的取代度为5％-50％、所述疏水壳聚糖与前述乙酸水溶液的重量体积比为1g：100ml至10g：100ml，再加入酒石酸液，混合均匀后，涂布于无纺布上。

制备例4疏水壳聚糖止血薄膜的制备

(1)将取代度为2％至50％的疏水壳聚糖溶于浓度为1％(ml/ml)的乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解；其中前述疏水壳聚糖与前述乙酸水溶液的重量体积比为1g：100ml至10g：100ml。

(2)配制浓度为5％(g/ml)的明胶溶液150ml，将其加入步骤(1)所得溶液中，搅拌均匀；再加2％(g/ml)的碳酸氢钠溶液调节pH值为6.0至6.4左右。

(3)配制0.5％(g/ml)的PEG20000溶液10ml，将其加入步骤(2)所得溶液中，搅拌均匀；

(4)配制2％(ml/ml)的戊二醛溶液2ml，将其加入步骤(3)所得溶液中，搅拌均匀；再滴加几滴甘油后取下层清液，倒入模具中风干成型。

制备例5疏水壳聚糖止血粉的制备

(1)将取代度为2％至50％的疏水壳聚糖溶于浓度为1％(ml/ml)的乙酸水溶液中，搅拌至完全溶解；其中前述疏水壳聚糖与前述乙酸水溶液的重量体积比为1g：100ml至10g：100ml。

(2)向步骤(1)所得的溶液加入氯化钙水溶液混合均匀，加入无水乙醇，于室温下搅拌反应2小时后过滤，将滤渣用无水乙醇洗涤至中性，干燥，粉碎，即得疏水壳聚糖止血粉。

实施例1体外凝血实验

(1)将取代度为5％至20％的疏水壳聚糖1g溶解于1％(ml/ml)的乙酸溶液中，配制成疏水壳聚糖乙酸溶液。

(2)血浆制备家兔静脉取血4.5ml，加入抗凝剂溶液0.5ml(38mg/ml)，混匀后以1000r/min离心10min，分离血浆备用。

(3)测定血浆复钙时间取试管五支，每管加入混合血浆和生理盐水各0.1ml，放入37℃水浴中温育1分钟，然后各加入氯化钙溶液0.1ml(0.025mol/L)。混匀后再放入37℃水浴中，同时开始计时。1分钟后每隔15秒缓慢倾斜试管1次。记录自加Ca²⁺至纤维蛋白形成，液面不动所需时间，计算各试管均值，即为对照组血浆复钙时间

(4)观察疏水壳聚糖的凝血作用按上述方法将各种疏水壳聚糖(取代度分别为5.0％，9.4％，14.5％，16.9％，20.6％)乙酸溶液与血浆按比例混合，使其质量浓度分别达到0.50％、0.60％和0.75％(g/ml)，观察有无凝集反应，记录凝血时间，并以1％的乙酸溶液和壳聚糖作为对照，结果见表1。

表1血浆复钙以及凝血时间(n＝5)

注：CS是1％(g/ml)壳聚糖乙酸溶液；HMC1-HMC5是不同取代度的1％(g/ml)疏水壳聚糖乙酸溶液，其取代度分别为5.0％，9.4％，14.5％，16.9％，20.6％。+∞为无法凝集

结果血浆复钙时间为209.0秒，1％(ml/ml)的乙酸、CS、HMC1、HMC4、HMC5与血浆混合均无法凝集，一直呈流动状态；0.60％的HMC3与血浆混合后发生凝集，形成不稳定的部分凝胶，一分钟后凝胶解体形成流动的絮状液体；而HMC2、HMC3在与血浆混合后，浓度达到0.75％时发生凝集，形成稳定的凝胶，分别用时4.26秒、1.19秒，表明修饰的疏水壳聚糖凝血效果好。

实施例2疏水壳聚糖止血海绵的止血效果测试

(1)体外止血效果(家兔耳朵动静脉出血模型)

取雄性家兔9只，随机分为三组(疏水壳聚糖止血海绵、市售明胶海绵、医用纱布)，每组3只。用10％(g/ml)的水合氯醛麻醉，按1～1.5ml/kg的计量进行腹腔注射，麻醉后耳部脱毛，用手术刀在耳外侧中央处做创伤处理(2cm²)，其中动静脉被横断，但耳朵不切透。待血液充满创面后，分别立即使用疏水壳聚糖海绵、市售海绵、医用纱布三种止血材料，再用50g砝码加压。记录止血时间(每30s观察一次)，计算出血量。

结果如下表2所示，由止血时间及出血量可看出，市售明胶海绵与医用纱布相比，疏水壳聚糖止血海绵可明显缩短止血时间，降低出血量，显示疏水壳聚糖止血海绵体外凝血效果良好。

表2疏水壳聚糖止血海绵对家兔耳出血的止血效果(n＝5)

(2)体内凝血效果(小鼠肝脏出血模型)

将小鼠按性别及体重随机分成4组，每组10只，雌雄各半，分别是A组(医用纱布组)，B组(云南白药粉组)，C组(壳聚糖止血粉组，同制备例5制备而得)，D组(疏水壳聚糖止血粉组，由制备例5制备而得)。用硫化钠溶液对小鼠腹部进行脱毛处理，腹部清理干净后，将小鼠静养3天。实验时使用10％(g/ml)的水合氯醛麻醉，按3-5ml/kg的剂量进行腹腔注射。待小鼠完全麻醉后，取仰卧位固定于实验用鼠板上，四肢及头部固定好。用消毒酒精对小鼠腹部消毒处理，于肋弓下沿腹中线作一长约2cm纵行切口，沿腹中线剪开腹肌，挤压腹部至肝中叶从切口处被挤出，吸干肝脏周围腹腔液后将称重后的无菌纱布垫于肝中叶下，于肝中叶做十字创口，待血液充满肝叶面，立即覆盖均匀涂抹有止血材料的纱布，并开始计时，直至出血停止，记录出血时间及出血量。

结果如下表3所示，由止血时间及药粉使用量可看出，和壳聚糖止血粉与云南白药粉相比，疏水壳聚糖止血粉可明显缩短止血时间，并且药粉使用量少，显示疏水壳聚糖止血粉良好的止血效果。

表3疏水壳聚糖止血粉对小鼠肝脏出血的止血效果(n＝10)

组别	止血时间(s)	出血量(g)
			A组(医用纱布组)	154.38±17.70△△	0.1048±0.0383
B组(云南白药粉组)	43.06±8.41**	0.0817±0.0268
			C组(壳聚糖止血粉组)	47.97±2.92**	0.0966±0.0393
D组(疏水壳聚糖止血粉组)	20.33±4.32**△△	0.1025±0.0221

与医用纱布组相比^*＝p<0.05，^**＝p<0.01；与云南白药粉组相比^△＝p<0.05，^△△＝p<0.01

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种疏水壳聚糖的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)准备黏均分子量为10万至100万、脱乙酰度70％至100％的壳聚糖；

(2)将所述壳聚糖溶入乙酸水溶液中，得到壳聚糖乙酸水溶液；其中所述乙酸水溶液的浓度范围为0.1％(ml/ml)至90％(ml/ml)，所述壳聚糖乙酸水溶液的浓度范围为0.1％(g/ml)至10％(g/ml)；以及，

(3)于前述壳聚糖乙酸水溶液加入含有疏水基的底物进行反应，而后调整其pH值为6至14，再进行过滤，过滤后洗涤至中性，再干燥，得到疏水壳聚糖。

2.根据权利要求1所述的疏水壳聚糖的制备方法，其特征在于，其中于步骤(3)中，所述含有疏水基的底物，其中所述疏水基是选自于由含有芳香基的烃基、含有酯基的烃基、含有醚基的烃基、含有胺基的烃基、含有酰胺基的烃基、含有酸酐基的烃基、含有烯基的烃基、及其组合所构成的群组，且其疏水基的碳数为5至20。

3.根据权利要求2所述的疏水壳聚糖的制备方法，其特征在于，其中于步骤(3)中，所述含有疏水基的底物，其中所述疏水基的碳数为10至18。

4.根据权利要求3所述的疏水壳聚糖的制备方法，其特征在于，其中于步骤(3)中，所述含有疏水基的底物为月桂酸酐。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的疏水壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述乙酸水溶液的浓度为1％(ml/ml)。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的疏水壳聚糖的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖乙酸水溶液浓度为1％(g/ml)。

7.根据权利要求5所述的疏水壳聚糖的制备方法，其特征在于，其中于步骤(3)中包含如下步骤：于前述壳聚糖乙酸水溶液加入含有疏水基的底物，于温度20℃至80℃条件下进行反应，而后调整其pH值为6至14，再进行过滤，过滤后洗涤至中性，再干燥，得到所述疏水壳聚糖。

8.根据权利要求7所述的疏水壳聚糖的制备方法，其特征在于，其中于步骤(3)中包含如下步骤：于前述壳聚糖乙酸水溶液加入含有疏水基的底物，于温度55℃条件下反应2小时至24小时，而后调整其pH值为11，再进行过滤，过滤后洗涤至中性，再干燥，得到所述疏水壳聚糖。

9.一种疏水壳聚糖，其特征在于，其是由权利要求1至8中任一项所述的疏水壳聚糖的制备方法所制备而得。

10.一种疏水壳聚糖用于制备止血材料的用途，其特征在于，所述止血材料包含疏水壳聚糖以及其医药学上可接受之佐剂；其中所述疏水壳聚糖是由权利要求1至8中任一项所述的疏水壳聚糖的制备方法所制备而得。