CN108250159B - 脲类化合物、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脲类化合物、其制备方法及其应用。所述化合物的结构如式I所示，式中各变量的定义如说明书所述。所述化合物能够阻断PD‑1/PD‑L1信号通路之间的相互作用。本发明化合物可用于治疗/预防与该信号通路相关的疾病，例如癌症、自身免疫性疾病、慢性感染性疾病及其它疾病。
Figure DDA0001527420840000011

Description

脲类化合物、其制备方法及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及具有能够阻断PD-1/PD-L1信号通路之间相互作用的脲类化合物，本发明还涉及所述化合物的制备方法、包含所述化合物作为活性成分的药物组合物以及其制药应用。本发明的化合物可作为靶向PD-1/PD-L1信号通路之间相互作用的免疫检查点抑制剂，用于治疗/预防与该信号通路相关的疾病，例如癌症、自身免疫性疾病、慢性感染性疾病及其它疾病。
背景介绍
肿瘤免疫治疗(Cancer immunotherapy)是一种通过激发人体的免疫系统，增强自身的抗肿瘤免疫力，从而抑制或杀死肿瘤细胞的新治疗方法。该方法经过百余年的努力取得了突破性进展。2013年，《Science》杂志将肿瘤免疫治疗列为年度十大科学突破之首(Couzin-Frankel J.,2013,Science,342:1432-1433)，已成为最具前景的抗肿瘤治疗领域之一。该疗法主要包括免疫检查点抑制剂(Immune checkpointinhibitors)和细胞免疫治疗(Celltherapy)。近几年，免疫检查点抑制剂是该领域的热门研究方向并取得了重大的临床研究进展，为抗击癌症提供了新型武器(Sharma P.,AllisonJ.P.,2015,Science,348:56-61)。
肿瘤细胞相比正常细胞，具有多种遗传学和表观遗传学的改变，免疫系统可利用肿瘤细胞产生的表面抗原将二者区分，进而引发抗肿瘤免疫反应。在T细胞抗肿瘤免疫过程中，其被T细胞受体(T cellreceptor，TCR)介导的抗原识别信号激活后，通过共刺激和共抑制信号综合调节T细胞效应，这些信号即被称为免疫检查点，包括细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte associated antigen4,CTLA4)、程序性死亡受体1(Programmed deathprotein1,PD-1)、T细胞活化的免疫球蛋白抑制V型结构域(V-domainimmunoglobulin suppressor of T-cellactivation,VISTA)、T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域的分子3(T cellimmunoglobulin and mucin domain–containing-3,TIM3)、淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte activationgene 3,LAG3)等抑制信号的抑制性受体，及CD28、CD134(OX40)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(Glucocorticoid-induced TNFR-related protein,GITR)、CD137、CD27、HVEM等刺激信号的活化性受体(见图1)(MellmanI.,Coukos G.,DranoffG.,2011,Nature,480:480-489)。在正常生理条件下，免疫检查点一方面参与维持自身抗原的免疫耐受，避免自身免疫性疾病；另一方面避免免疫反应过度激活导致组织损伤。然而，在肿瘤细胞中，其可通过免疫检查点抑制T细胞激活而逃避免疫杀伤。因此，需要通过激活共刺激信号(踩“油门”)并抑制共抑制信号(松“刹车”)而重新激活T细胞攻击肿瘤细胞，进而实现肿瘤免疫治疗。临床研究表明，免疫检查点阻断是T细胞激活的关键策略之一，而几个抗体药物的成功上市和巨大的市场潜力无疑使免疫检查点的研究成为了国内外各大制药公司的聚焦点(PardollD.M.,2012,Nat.Rev.Cancer.,12:252-264)。当今，PD-1是最热门的免疫检查点之一。
PD-1表达于激活的T细胞、B细胞及骨髓细胞中，属于CD28家族，是T细胞上的一种1型跨膜糖蛋白，由288个氨基酸组成。PD-1的分子结构由具有免疫球蛋白IgV样(氨基酸35-145)的胞外区、跨膜区、具有连接信号肽功能的胞质尾区构成，其上的胞外区与配体结合发挥重要功能(ChengX.,Veverka V.,RadhakrishnanA.,et al.2013,J.Biol.Chem.,288:11771-11785)。PD-1的配体包括程序性死亡配体1(Programmed deathproteinligand 1,PD-L1)和程序性死亡配体2(Programmed deathproteinligand 2,PD-L2)两种，其中PD-L1可持续性表达于多种肿瘤细胞、T细胞、APC及多种非造血细胞；PD-L2只限制性地表达于树突状细胞和巨噬细胞中。PD-L1/2属于B7家族，均为1型跨膜糖蛋白，PD-L1由290个氨基酸组成；PD-L2由262个氨基酸组成。PD-L1/2的分子结构均由免疫球蛋白IgV样区(膜远端)、IgC样区(膜近端)、跨膜区及短而保守的胞浆区构成(Lázár-Molnár E.,YanQ.,Cao E.,etal.2008,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,105:10483-10488)。等温滴定量热法(ITC)试验表明：PD-1/PD-L1之间的相互作用由熵变驱动，而PD-1/PD-L2之间的相互作用由焓变驱动，二者与PD-1之间竞争性结合，PD-L2与PD-1之间的亲和力是相应PD-L1与PD-1之间亲和力的3-4倍，这种弱的相互作用可能是启动潜效抑制信号的关键(Ghiotto M.,Gauthier L.,SerriariN.,et al.2010,Int.Immunol.,22:651-660)。PD-1与其配体的相互作用会抑制T细胞激活，这对于维持正常机体的免疫耐受至关重要；而在肿瘤细胞中和病毒感染时，T细胞上的PD-1被诱导性高表达，PD-L1/2的表达上调，导致PD-1信号通路持续激活而抑制T细胞增殖(见图2)，造成肿瘤细胞和病原体的免疫逃逸(Fuller M.J.,CallendretB.,ZhuB.,et al.2013,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,110:15001-15006；DolanD.E.,Gupta S.,2014,Cancer Control,21:231-237；Chen L.,HanX.,2015,J.Clin.Invest.,125:3384-3391；Postow M.A.,CallahanM.K.,Wolchok J.D.,2015,J.Clin.Oncol.,33:1974-1982)。
目前，针对阻断这一信号通路的3个抗体药物已获FDA批准，全球多个抗体药物正处于临床研究中(见表1)(Li Y.,Li F.,JiangF.,et al.2016,Int.J.Mol.Sci.,17:E1151)。多项研究证实这些抗体药物在多种肿瘤中有效，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、头颈部、食管鳞状细胞癌及霍奇金淋巴瘤等。
表1全球靶向PD-1和PD-L1抗体药物的获批及临床阶段研发一览表
Figure BDA0001527420820000031
综上可见，靶向PD-1/PD-L1抗体药物的免疫检查点抑制剂已取得了重要进展。然而，现有的抗体药物均须注射给药、具有多种ADMET(药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性)问题、或者具有免疫系统相关的严重副作用等，归其原因可能是这些大分子的半衰期太长(长达15-20天)，导致靶标被持续抑制而导致。与现有的抗体药物相比，小分子的免疫检查点抑制剂具有明显优势，包括可口服、可通过药理学特性调整使得最大限度降低副作用等。另外，小分子抑制剂将具有更低的成本和价格优势。截至目前，除了由Aurigene和Curis公司报道的口服小分子抑制剂CA-170(靶向PD-L1/VISTA，美国一期临床研究中)和AUPM-327(靶向PD-L1/TIM3，临床前研究中)外，尚未公开报道更多的小分子抑制剂。
本发明所公开的小分子免疫检查点抑制剂可用于治疗和/或预防黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、头颈部、食管鳞状细胞癌及霍奇金淋巴瘤等，但并不限于此。同时，这些化合物或者包含其作为活性成分的药物组合物等可在安全治疗窗口内能将对这些疾病的临床疗效达到最大化。
发明内容
本发明的一个方面，涉及能够阻断PD-1/PD-L1信号通路之间相互作用的脲类化合物，包括其药学上可接受的盐、水合物、立体异构体及前药等衍生物。
本发明另一方面涉及本文所述化合物的制备方法。
本发明的又一方面涉及包括其本发明化合物作为活性成分的药物组合物，以及本发明化合物或药物组合物用于治疗/预防与PD-1/PD-L1信号通路相关疾病的临床应用，以及本发明化合物或药物组合物在制备用于治疗和/或预防与PD-1/PD-L1信号通路相关疾病的药物中的应用。
本发明涉及式I所示的化合物，包括其前药、立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，
Figure BDA0001527420820000041
其中，
R1为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、C1-C4烷基、CN、卤
素、NH2、COOH、C1-C4烷基氨基、C1-C4烷基氧基、C1-C4卤代烷基和Ar1；
其中，
Ar1选自
Figure BDA0001527420820000042
Figure BDA0001527420820000043
其中，
R4为一个或多个取代基，选自相同或不同的H、C1-C4烷基、CN、
卤素、NH2、COOH、C1-C4烷基氨基、C1-C4烷基氧基和C1-C4卤代烷基；
i为1到5的整数；
Z选自C、NH、O、C(O)、S、S(O)和S(O)2；
R2选自H、C1-C4烷基、-CH2-(CH2)k-CN和-(CH2)k-Ar2；
其中，
k为0到6的整数；
Ar2选自
Figure BDA0001527420820000044
其中，
R5为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、C1-C4烷基、CN、卤素、NH2、COOH、C1-C4烷基氨基、C1-C4烷基氧基和C1-C4卤代烷基；
v为1到5的整数；
R3为一个或多个取代基，选自相同或不同的H、C1-C4烷基、CN、卤素、C1-C4烷基氧基和C1-C4卤代烷基；
X选自C和N；
Y选自NH、O、S、S(O)和S(O)2；
A选自
Figure BDA0001527420820000051
Figure BDA0001527420820000052
Figure BDA0001527420820000053
或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链，如
Figure BDA0001527420820000054
等，或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链且被R6取代，如/>
Figure BDA0001527420820000055
等，但并不限于此；
其中，
R6为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、C1-C4烷基、C1-C4烷基羰基、C1-C4烯基羰基和C1-C4烷基氨基C1-C4烷基C1-C4烯基羰基；
het选自饱和的或芳香的杂环，如吗啉、N-甲基哌嗪、四氢吡咯、吡啶、噻吩、噻唑、三氮唑、四氮唑等，但并不限于此；
w为0到2的整数；
m为1到5的整数；
n为1到3的整数；
p独立地0到2的整数；
q为0到2的整数。
在一个优选的方面，本发明涉及式I所示的化合物，包括其前药、立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、C1-C4烷基、CN、卤
素、NH2、COOH、C1-C4烷基氨基、C1-C4烷基氧基、C1-C4卤代烷基和Ar1；
其中，
Ar1选自
Figure BDA0001527420820000061
Figure BDA0001527420820000062
其中，
R4为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、C1-C4烷基、
CN、卤素、NH2、COOH、C1-C4烷基氨基、C1-C4烷基氧基和C1-C4卤代烷基；
i为1到5的整数；
Z选自C、NH、O、C(O)、S、S(O)和S(O)2；
R2选自CH3、-CH2-(CH2)k-CN和-(CH2)k-Ar2；
其中，
k为0到6的整数；
Ar2选自
Figure BDA0001527420820000063
其中，
R5为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、CH3、C2H5、
CN、F、Cl、NH2、COOH、CH3NH、(CH3)2N、CH3O、CF3和CHF2；
v为1到5的整数；
R3为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、C1-C4烷基、CN、卤素、C1-C4烷基氧基和C1-C4卤代烷基；
X选自C和N；
Y选自NH、O、S、S(O)和S(O)2；
A选自
Figure BDA0001527420820000064
Figure BDA0001527420820000071
Figure BDA0001527420820000072
或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、
Gln、Phe、Glu等的侧链，如
Figure BDA0001527420820000073
等，或者A
为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链且被R6取代，如
Figure BDA0001527420820000074
等，但并不限于此；
其中，
R6为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、C1-C4烷基、C1-C4烷基羰基、C1-C4烯基羰基和C1-C4烷基氨基C1-C4烷基C1-C4烯基羰基；
het选自饱和的或芳香的杂环，如吗啉、N-甲基哌嗪、四氢吡咯、吡啶、噻吩、噻唑、三氮唑、四氮唑等，但并不限于此；
w为0到2的整数；
m为1到5的整数；
n为1到3的整数；
p独立地为0到2的整数；
q为0到2的整数。
在一个更优选的方面，本发明涉及式I所示的化合物，包括其前药、立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、C1-C4烷基、CN、卤素、NH2、COOH、C1-C4烷基氨基、C1-C4烷基氧基、C1-C4卤代烷基和Ar1；
其中，
Ar1选自
Figure BDA0001527420820000075
Figure BDA0001527420820000081
其中，
R4为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、C1-C4烷基、CN、卤素、NH2、COOH、C1-C4烷基氨基、C1-C4烷基氧基和C1-C4卤代烷基；
i为1到5的整数；
Z选自C、NH、O、C(O)、S、S(O)和S(O)2；
R2为-(CH2)k-Ar2；
其中，
k为1；
Ar2选自
Figure BDA0001527420820000082
其中，
R5为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、CH3、C2H5、CN、F、Cl、NH2、COOH、CH3NH、(CH3)2N、CH3O和CF3CHF2；v为1到5的整数；
R3为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、CH3、C2H5、CN、F、Cl、CH3O、CF3和CHF2；
X选自C和N；
Y选自NH、O、S、S(O)和S(O)2；
A选自
Figure BDA0001527420820000083
Figure BDA0001527420820000084
Figure BDA0001527420820000085
或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链，如
Figure BDA0001527420820000091
等或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链且被R6取代，如/>
Figure BDA0001527420820000092
等，但并不限于此；
其中，
R6为一个或多个取代基，选自相同或不同的H、C1-C4烷基、C1-C4烷基羰基、C1-C4烯基羰基和C1-C4烷基氨基C1-C4烷基C1-C4烯基羰基；
het选自饱和的或芳香的杂环，如吗啉、N-甲基哌嗪、四氢吡咯、吡啶、噻吩、噻唑、三氮唑、四氮唑等，但并不限于此；
w为0到2的整数；
m为1到5的整数；
n为1到3的整数；
p独立地为0到2的整数；
q为0到2的整数。
在另一个更优选的方面，本发明涉及式I所示的化合物，包括其前药、立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、C1-C4烷基、CN、卤
素、NH2、COOH、C1-C4烷基氨基、C1-C4烷基氧基、C1-C4卤代烷基和Ar1；
其中，
Ar1选自
Figure BDA0001527420820000093
Figure BDA0001527420820000094
其中，
R4为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、C1-C4烷基、
CN、卤素、NH2、COOH、C1-C4烷基氨基、C1-C4烷基氧基和C1-C4卤代烷基；
i为1到5的整数；
Z选自C、NH、O、C(O)、S、S(O)和S(O)2；
R2为-(CH2)k-Ar2；
其中，
k为1；
Ar2选自
Figure BDA0001527420820000101
其中，
R5为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、CH3、C2H5、CN、F、Cl、NH2、COOH、CH3NH、(CH3)2N、CH3O、CF3和CHF2；
v为1到5的整数；
R3为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的CH3、CN、F、Cl、CH3O、CF3和CHF2；
X选自C和N；
Y选自NH、O、S、S(O)和S(O)2；
A选自
Figure BDA0001527420820000102
Figure BDA0001527420820000103
Figure BDA0001527420820000104
或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链，如
Figure BDA0001527420820000105
等，或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链且被R6取代，如/>
Figure BDA0001527420820000106
等，但并不限于此；
其中，
R6为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、CH3、C2H5、t-Bu、CH3CO、CH2＝CHCO和(CH3)2NCH2CH＝CHCO；
het选自饱和的或芳香的杂环，如吗啉、N-甲基哌嗪、四氢吡咯、吡啶、噻吩、噻唑、三氮唑、四氮唑等，但并不限于此；
w为0到2的整数；
m为1到5的整数；
n为1到3的整数；
p独立地为0到2的整数；
q为0到2的整数。
在一个还更优选的方面，本发明涉及式I所示的化合物，包括其前药、立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、CH3、C2H5、CN、F、Cl、NH2、COOH、CH3NH、(CH3)2N、CH3O、CF3、CHF2和Ar1；
其中，
Ar1选自
Figure BDA0001527420820000111
Figure BDA0001527420820000112
其中，
R4为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、CH3、C2H5、
CN、F、Cl、NH2、COOH、CH3NH、(CH3)2N、CH3O、CF3和CHF2；
i为1到3的整数；
Z选自C、NH、O、C(O)、S、S(O)和S(O)2；
R2为-(CH2)k-Ar2；
其中，
k为1；
Ar2选自
Figure BDA0001527420820000113
其中，
R5为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、CH3、C2H5、
CN、F、Cl、(CH3)2N、CF3和CHF2；
v为1；
R3为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的CH3、CN、F、Cl、CH3O、CF3和CHF2；
X为C；
Y选自NH、O、S、S(O)和S(O)2；
A选自
Figure BDA0001527420820000121
/>
Figure BDA0001527420820000122
Figure BDA0001527420820000123
或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链，如
Figure BDA0001527420820000124
等，或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链
且被R6取代，如
Figure BDA0001527420820000125
等，但并不限于此；
其中，
R6为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、CH3、C2H5、t-Bu、CH3CO、CH2＝CHCO和(CH3)2NCH2CH＝CHCO；
w为0到2的整数；
m为1到3的整数；
n为1到2的整数；
p独立地为0到2的整数；
q为0到2的整数。
在一个还更优选的方面，本发明涉及式I所示的化合物，包括其前药、立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的CH3、CN、F、Cl、CF3
和Ar1；
其中，
Ar1选自
Figure BDA0001527420820000126
Figure BDA0001527420820000131
其中，
R4为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、CH3、CN、F、Cl、(CH3)2N、CF3和CHF2；
i为1到3的整数；
Z选自C、NH、O、C(O)、S、S(O)和S(O)2；
R2为-(CH2)k-Ar2；
其中，
k为1；
Ar2选自
Figure BDA0001527420820000132
其中，
R5为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的CH3、CN、F、
(CH3)2N、CF3和CHF2；
v为1；
R3为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的CH3、CN、F、Cl、CH3O、CF3和CHF2；
X为C；
Y选自NH、O、S、S(O)和S(O)2；
A选自
Figure BDA0001527420820000133
Figure BDA0001527420820000134
Figure BDA0001527420820000135
或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链，如
Figure BDA0001527420820000136
等，或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链且被R6取代，如/>
Figure BDA0001527420820000141
等，但并不限于此；
其中，
R6为一个或多个取代基，选自相同或不同的H、CH3CO、CH2＝CHCO和(CH3)2NCH2CH＝CHCO；
w为1；
m为1到3的整数；
n为1到2的整数；
p独立地为0到2的整数；
q为0到2的整数。
在一个特更优选的方面，本发明涉及式I所示的化合物，包括其前药、立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的CH3、CN、F、Cl、CF3
和Ar1；
其中，
Ar1选自
Figure BDA0001527420820000142
其中，
R4为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H、CH3、CN、F、
Cl、(CH3)2N、CF3和CHF2；
i为1到3的整数；
Z选自C、NH、O和C(O)；
R2为-(CH2)k-Ar2；
其中，
k为1；
Ar2为
Figure BDA0001527420820000143
其中，
R5为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的CH3、CN、F、
(CH3)2N、CF3和CHF2；
v为1；
R3为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的CH3、F、Cl和CH3O；
X为C；
Y选自NH和O；
A选自
Figure BDA0001527420820000151
Figure BDA0001527420820000152
Figure BDA0001527420820000153
或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链，如
Figure BDA0001527420820000154
等，或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链且被/>
R6取代，如
Figure BDA0001527420820000155
等，但并不限于此；
其中，
R6为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H和CH3CO；
w为1；
m为2；
n为1到2的整数；
p为0；
q为0到1的整数。
在一个尤其更优选的方面，本发明涉及式I所示的化合物，包括其前药、立体异构体、药学上可接受的盐或水合物，其中，
R1为两个取代基，独立地选自相同或不同的CH3、CN和Ar1；
其中，
Ar1为
Figure BDA0001527420820000156
其中，
R4为H、CH3、CN、F或Cl；
i为1；
Z为O；
R2为-(CH2)k-Ar2；
其中，
k为1；
Ar2为
Figure BDA0001527420820000161
其中，
R5为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的CH3、CN、F、
(CH3)2N和CF3；
v为1；
R3为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的CH3、F、Cl和CH3O；X为C；
Y选自NH和O；
A选自
Figure BDA0001527420820000162
/>
Figure BDA0001527420820000163
Figure BDA0001527420820000164
或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链，如
Figure BDA0001527420820000165
等，或者A为氨基酸Gly、Ala、Ser、Lys、Arg、Thr、Asn、Gln、Phe、Glu等的侧链且被R6取代，如/>
Figure BDA0001527420820000166
等，但并不限于此；
其中，
R6为一个或多个取代基，独立地选自相同或不同的H和CH3CO；
w为1；
m为2；
n为1到2的整数；
p为0；
q为0到1的整数。
附图说明
图1示出了共刺激和同抑制信号综合调剂T细胞效应的机制。
图2表明PD-1与PD-L1/2相互作用的信号通路。
图3示出了PD-1/PD-L1结合抑制检测(HTRF)原理示意图。
图4表明了化合物I-5对多个志愿者PBMC细胞的促IL-2分泌作用。
具体实施方式
本发明所述的“卤素”为氟、氯、溴或碘，优先为氟或氯。
本发明所述的“烷基”，包括直链或支链或环状的烷基。本发明中所述的C1-C4烷基，是指碳原子数为1-4的烷基，优先为甲基、乙基、丙基或异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。本发明化合物中的烷基可以是任选取代或未取代的，取代基可以包括烷基、卤素、烷氧基、烃基、羟基等。本发明烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。
本发明所述的“烷氧基”，是指上述烷基与氧原子相连所形成的基团，其中，氧原子具有自由成键能力，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丙氧基、叔丁氧基、环丙氧基等。
本发明所述的“烷基羰基”，是指上述烷基与羰基相连所形成的基团，如乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、环丙酰基等。
本发明所述的“烷基氨基”，是指上述烷基与氨基相连所形成的基团，如甲氨基、乙氨基、4-二甲氨基等。
本发明所述的“可药用的”或“药学上可接受的”被理解为在合理的医学范围内适于人和动物使用，可耐受且并无不可接受的副作用包括毒性、过敏反应、刺激及并发症等。
本发明涉及药物组合物，所述药物组合物含有上述式I的化合物，包括其前药、立体异构体、药学上可接受的盐或水合物作为活性成分，以及任选的可药用载体、辅料或赋形剂等。所述可药用载体、辅料或赋形剂是指任何可用于药物领域的稀释剂、辅助剂和载体，如药用辅料手册(Handbook ofPharmaceutical Excipients 8th ed，2013)中所列的材料，但并不限于此。
本发明所述的化合物任选地可与其它一种或多种活性成分联合使用，其各自用量和比例可由本领域技术人员根据具体病症和患者具体情况以及临床需要等而进行调整。
本发明的制剂形式中通常含有按重量计0.5～70％的活性成分；优选地，含有按重量计1～20％的活性成分。
本发明所述式I的化合物，在临床上可以通过口服或注射方式对哺乳动物(包括人)进行用药，其中优选口服方式。用药剂量为每日0.0001～200mg/kg体重，较佳用药剂量为每日0.01～100mg/kg体重，最佳用药剂量为每日0.1～50mg/kg体重。同时，最佳剂量视个体而定，通常开始时剂量可以较小，然后可以逐渐增加用量。
本发明中所提供的实施例和制备例进一步阐明并举例说明了本发明所述化合物及其制备方法。应当理解，下述制备例和实施例不以任何方式限制本发明的范围。
下面的合成路线描述了本发明的式I化合物的制备方法，如下合成示意图中所用原料、试剂、催化剂、溶剂等均可通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备或者可商购得到。本发明的全部最终衍生物都可都过示意图中所描述的方法或其类似方法制得，这些方法都是有机化学领域普通技术人员熟知的。这些示意图中应用的全部可变因素如下文定义或根据权利要求中的定义。
制备方法：下面各基团的定义如前所述。另外，式I所述的化合物及涉及的中间体均可通过常见的分离方法进行纯化，如萃取、重结晶及硅胶柱层析分离等。所用200-300目的硅胶和薄层层析硅胶板均由青岛海洋化工厂生产。所用化学试剂为一般试剂的分析纯或化学纯市售商品，使用时未经进一步纯化。
(a)关键中间体II可由如下示例性的合成方法制备：
在室温条件下，通过碱催化，以自制或市售的II-1与MsCl反应获得II-2。在回流条件下，II-2与自制的II-3在碱催化下经亲核取代反应后得到II-4。随后在加热条件下，II-4与卤代物II-5经碱催化制备关键中间体II(见方案1)。本路线所用的碱性催化剂可为三乙胺(TEA)、N,N’-二异丙基乙基胺(DIPEA)、碳酸钾(K2CO3)及碳酸铯(Cs2CO3)等；所用的溶剂可为二氯甲烷(CH2Cl2)、1,2-二氯乙烷、乙腈(CH3CN)及N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)等。
Figure BDA0001527420820000191
方案1关键中间体II的合成路线
(b)关键中间体III可由如下示例性的合成方法制备：
关键中间体III的制备分3阶段反应：1)在碱催化下，以市售的叔丁氧羰基(Boc)保护的III-1为起始原料，与碳酰二咪唑(CDI)形成活性中间体。在温度为0℃到室温下，反应30-60min；2)在室温条件下，将另一底物AIII-2加入到前述反应液中，继续搅拌3-5h，浓缩反应液后，得粘稠液体；3)用溶剂溶解该液体后，经酸催化后脱去Boc保护基即得目标中间体(见方案2)。本路线所用的碱性催化剂可为TEA、DIPEA等；所用的酸性催化剂可为浓盐酸(浓HCl)、三氟乙酸(TFA)及醋酸(HOAc)等；所用的溶剂可为CH2Cl2、甲醇(CH3OH)及CH3CN等。
Figure BDA0001527420820000192
方案2关键中间体III的合成路线
(c)本发明所述结构式I可由如下示例性的合成方法制备：
在室温条件下，将上述中间体II和III经还原胺化反应制备本发明所述式I化合物(见方案3)。本路线所用的还原剂可为硼氢化钠(NaBH4)、氰基硼氢化钠(NaBH3CN)及醋酸硼氢化钠(NaBH3OAc)等；所用的碱性催化剂可为TEA和DIPEA等；所用的干燥剂可为无水硫酸镁(MgSO4)、无水硫酸钠(Na2SO4)及分子筛等；所用的溶剂可为CH3OH、CH2Cl2及1,2-二氯乙烷等。
Figure BDA0001527420820000201
方案3式I化合物的合成路线
LC-MS分析方法：
质谱条件：仪器waters ZQ4000；离子源ES+；锥孔电压40V；毛细管电压3.5KV；源温度120℃；脱溶剂气温度350℃；锥孔气流量60L/h。
色谱条件：仪器waters 2695；检测器waters 2996(蒸发光散射检测器)；色谱柱岛津Shim-pack VP-ODS 5μm2.0×150mm；流速0.3mL/min；柱温35℃；流动相CH3OH/H2O/HOAc(70/30/0.5)；
HPLC分析方法：仪器岛津LC-2010A HT(紫外检测器)；色谱柱Thermo ODS-2HYPERSIL 5μm 4.6×150mm；检测波长230nM；流速0.7mL/min；柱温25℃；流动相ACH3OH/H2O/HOAc/TEA(65/35/0.1/0.2)、流动相B CH3OH/H2O/HOAc/TEA(80/20/0.1/0.2)、流动相CCH3OH/H2O/HOAc/TEA(50/50/0.1/0.2)
按照上述说明方法，本发明制备了代表性化合物I-1—I-14(见表2)。
表2本发明所述的代表性化合物I-1—I-14
Figure BDA0001527420820000202
/>
Figure BDA0001527420820000211
/>
Figure BDA0001527420820000221
下面结合具体实例进一步阐述本发明内容，但本发明的保护范围并不仅仅局限于这些实例。本发明所述的百分比除特别注明外，均为重量百分比。说明书中所描述的数值范围，如计量单位、反应条件、化合物物理状态或百分比，均是为了提供明白无误的书面参考。本领域技术人员在实施本发明时，使用在此范围之外或有别于单个数值的温度、浓度、数量、碳原子数等，仍然有可能得到预期结果。
实施例1中间体：(2-甲基-(1,1’-二苯基)-3-基)甲基甲磺酸酯IIa-2的制备
Figure BDA0001527420820000222
分别取市售的IIa-1(2.37g,12.0mmol,1.0当量)和TEA(3.3mL,24mmol,2.0当量)溶解于DCM(40mL)中。在冰浴下，缓慢滴加MsCl(1.4mL,18.0mmol,1.5当量)至反应液中，滴毕，升至室温，继续反应6h，TLC监测反应完毕，用DCM(40mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经柱层析分离后，得到油状物IIa-2 3.50g，直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
实施例2中间体2-羟基-4-(2-甲基-(1,1’-二苯基)-3-基-甲氧基)苯甲醛IIa-4的制备：
Figure BDA0001527420820000231
分别取IIa-2(3.50g,12.0mmol,1.0当量)、市售的IIa-3(1.65g,12.0mmol,1.0当量)及K2CO3(1.65g,12.0mmol,1.0当量)溶解于CH3CN(60mL)中，加热回流至4h后，补加K2CO3(0.50g,3.6mmol,0.3当量)，继续回流5h，TLC监测反应完毕，冷却至室温，加入乙酸乙酯(EtOAc 80mL)稀释反应液，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经柱层析分离后，得产物IIa-4 2.20g，直接用于下一步反应(收率57.6％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)319.3[M+H]+,341.2[M+Na]+。
实施例3中间体2-(3-氰基苯甲氧基)-4-(2-甲基-(1,1’-二苯基)-3-基-甲氧基)苯甲醛IIa的制备
Figure BDA0001527420820000232
分别取IIa-4(1.60g,5.0mmol,1.0当量)、IIa-5(1.20g,6.0mmol,1.2当量)及Cs2CO3(4.90g,15.0mmol,3.0当量)溶解于干燥的DMF(50mL)中，加热至80℃反应3h，TLC监测反应完毕，加水稀释反应液，采用DCM/CH3OH(10mL/180mL)萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经柱层析分离后，得白色固体IIa 1.00g(收率48.9％)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm10.27(s,1H),8.01(s,1H),7.84(m,2H),7.73(d,1H,J＝8.6Hz),7.63(m,1H),7.46(m,3H),7.37(m,1H),7.30(m,3H),7.22(m,1H),6.96(s,1H),6.84(m,1H),5.36(s,2H),5.27(s,2H),2.20(s,3H)。
实施例4中间体1-(2-氨基乙基)-3-(2-(N-吗啉)乙基)脲的盐酸盐IIIa的制备
Figure BDA0001527420820000233
分别取IIIa-1(0.32g,2.0mmol,1.0当量)和TEA(0.85mL,6.0mmol,3.0当量)溶解于DCM(20mL)中。在冰浴下，加入CDI(0.34g,2.1mmol,1.1当量)并搅拌10min后，升至室温并继续搅拌30min。随后在室温下，将IIIa-2(0.26g,2.0mmol,1.0当量)滴加到前述反应液中，再继续搅拌3h后，浓缩溶剂得粘稠状液体。最后，将此粘稠状液体溶解于甲醇(10mL)中，滴加浓盐酸(con.HCl)(2mL)至反应中并加热回流2h，浓缩溶剂得无色透明粘稠状液体IIIa1.00g，粗品未经分离直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
LC-MS MS-ESI(m/z)217.1[M+H]+,239.1[M+Na]+。
实施例5中间体1-(2-氨基乙基)-3-(2-羟基乙基)脲的盐酸盐IIIb的制备
Figure BDA0001527420820000241
/>
分别取IIIa-1(1.60g,10.0mmol,1.0当量)和TEA(2.8mL,20.0mmol,2.0当量)溶解于DCM(40mL)中。在冰浴下，加入CDI(1.70g,10.1mmol,1.1当量)并搅拌10min后，升至室温并继续搅拌30min。随后在室温下，将IIIb-2(1.33g,10.0mmol,1.0当量)滴加到前述反应液中，再继续搅拌3h后，浓缩溶剂得粘稠状液体。最后，将此粘稠状液体溶解于甲醇(10mL)中，滴加浓HCl(2mL)至反应中并加热回流2h，浓缩溶剂得无色透明粘稠状液体IIIb4.00g，粗品未经分离直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
LC-MS MS-ESI(m/z)148.2[M+H]+,170.2[M+Na]+。
实施例6中间体1-(2-氨基乙基)-3-(2-叔丁基-O-叔丁基-L-丝氨酸酯-2-基)脲的盐酸盐IIIc的制备
Figure BDA0001527420820000242
分别取IIIa-1(0.32g,2.0mmol,1.0当量)，TEA(0.85mL,6.0mmol,3.0当量)溶解于DCM(20mL)中。在冰浴下，加入CDI(0.34g,2.1mmol,1.1当量)并搅拌10min后，升至室温并继续搅拌30min。随后在室温下，将IIIc-2(0.43g,2.0mmol,1.0当量)滴加到前述反应液中，再继续搅拌3h后，浓缩溶剂得粘稠状液体。最后，将此粘稠状液体溶解于甲醇(10mL)中，滴加浓HCl(2mL)至反应中并于室温搅拌3h，浓缩溶剂得无色粘稠状液体IIIc 1.00g，粗品未经分离直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
实施例7化合物1-((2-(2-(3-氰基苯基)甲氧基-4-(2-甲基-(1,1’-二苯基)-3-基-甲氧基))苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-(N-吗啉)乙基)脲I-1的制备
Figure BDA0001527420820000251
分别取IIa(0.04g,0.1mmol,1.0当量)和IIIa的粗品(0.25g,0.5mmol,5.0当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.06g,1.0mmol,10.0当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕。用DCM(20mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 7/1)，得浅黄色固体I-15.4mg(收率8.5％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)634.8[M+H]+,656.8[M+Na]+。
实施例8化合物1-((2-(2-(3-氰基苯基)甲氧基-4-(2-甲基-(1,1’-二苯基)-3-基-甲氧基))苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-羟基乙基)脲I-2的制备
Figure BDA0001527420820000252
分别取IIa(0.09g,0.2mmol,1.0当量)和IIIb的粗品(0.20mg,0.5mmol,2.5当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.06g,1.0mmol,10.0当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕。用DCM(20mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 7/1)，得浅黄色固体I-2 6.0mg(收率5.3％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)565.8[M+H]+,587.7[M+Na]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm8.00(s,1H),7.87(m,1H),7.82(m,1H),7.63(m,1H),7.36-7.48(m,5H),7.25-7.29(m,3H),7.19-7.21(m,1H),6.85(s,1H),6.75-6.77(m,1H),6.35(t,1H,J＝5.4Hz),6.24(t,1H,J＝5.4Hz),5.27(s,2H),5.16(s,2H),4.65(t,1H,J＝5.0Hz),4.12(s,2H),3.36(m,1H),3.25(m,2H),3.04(m,2H),2.95(m,2H),2.18(s,3H)。
实施例9化合物1-((2-(2-(3-氰基苯基)甲氧基-4-(2-甲基-(1,1’-二苯基)-3-基-甲氧基))苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-叔丁基-O-叔丁基-L-丝氨酸酯-2-基)脲I-3的制备
Figure BDA0001527420820000261
分别取IIa(0.22g,0.5mmol,1.0当量)和IIIc的粗品(0.60g,1.0mmol,2.0当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.13g,2.0mmol,4.0当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕。用DCM(20mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 10/1)，得到浅黄色固体I-3 15.0mg(收率4.1％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)721.8[M+H]+,743.8[M+Na]+。
实施例10中间体2-氰基-3-氯苯甲酸甲酯IIb-1-2的制备
Figure BDA0001527420820000262
在冰浴下，将con.HCl(30mL)加入到IIb-1-1(10.00g,54.1mmol,1.0当量)的水(120mL)溶液中。在冰浴下并在15min内，将NaNO2(8.30g,120.0mmol,2.2当量)的水(120mL)溶液滴加到前述溶液中，滴毕，继续搅拌1h，随后用aq.Na2CO3中和至pH为6-7，得重氮盐反应液并维持在低温状态。另外，在室温下，制备CuSO4·5H2O(15.00g,60.0mmol,1.1当量)的蓝色水(120mL)溶液，向反应液中加入甲苯并冷却至0℃，随后加入KCN(14.70g,225.0mmol,4.2当量)，反应液转变为褐色，将该混合物加热至60℃，然后将已制备的重氮盐在15min内加入到褐色反应液中，并升温至70℃搅拌1h，TLC监测反应完毕，用EtOAc稀释反应液，硅藻土抽滤，合并有机相水洗(100mL×2)，饱和食盐水洗(100mL×2)，无水Na2SO4干燥，浓缩有机相。粗品经柱层析分离纯化，得固体IIb-1-210.00g(收率95％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm8.04(d,1H,J＝7.6Hz),7.74(d,1H,J＝8.0Hz),7.63(d,1H,J＝8.0Hz),4.02(s,3H)。
实施例11中间体2-氯-6-(羟甲基)苯甲腈IIb-1-3的制备
Figure BDA0001527420820000271
在-40℃下，将LiBH4(1.10g,49.0mmol,2.0当量)分批加入到IIb-1-2(4.80g,24.5mmol,1.0当量)的THF(150mL)溶液中，随后升温至室温并搅拌过夜，TLC监测反应完毕，用饱和的NH4Cl淬灭反应并用DCM萃取，合并有机相1.5N HCl洗(100mL×2)，饱和食盐水洗(100mL×2)，无水Na2SO4干燥，浓缩有机相。粗品用DCM/PE重结晶，得固体IIb-1-3 3.50g(收率85％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)168.0[M+H]+。
实施例12中间体2-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])-6-(羟甲基)苯甲腈IIb-1的制备
Figure BDA0001527420820000272
分别取IIb-1-3(0.50g,3.0mmol,1.0当量)、IIb-1-4(0.65g,3.6mmol,1.2当量)、Pd(OAc)2(0.13g,0.60mmol,0.2当量)、SPhos(0.61g,1.5mmol,0.5当量)及K3PO4(1.27g,6.0mmol,2当量)溶解于CH3CN/H2O(10/1,20mL)的混合溶剂中，氩气保护下回流2h，TLC监测反应完毕，浓缩反应液，粗品经柱层析分离纯化，得固体IIb-1 0.40g(收率50％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm7.59-7.61(m,2H),7.39(d,1H,J＝7.2Hz),7.02-7.05(m,2H),6.97(d,1H,J＝8.0Hz),4.98(d,1H,J＝5.2Hz),4.31(s,4H),2.11(s,1H)。
实施例13中间体2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲基甲磺酸酯IIb-2的制备
Figure BDA0001527420820000273
分别取IIb-1(0.63g,2.4mmol,1.0当量)和TEA(0.3mL,2.4mmol,1.0当量)溶解于DCM(20mL)中。在冰浴下，缓慢滴加MsCl(0.18mL,18.0mmol,1当量)至反应液中，滴毕，升至室温，继续反应1h，TLC监测反应完毕，浓缩反应液，粗品经柱层析分离纯化，得固体IIb-20.80g(收率98％)。
实施例14中间体2,4-二羟基-5-甲基苯甲醛IIb-3的制备
Figure BDA0001527420820000281
在0℃下，将POCl3(1.8mL)滴加到DMF(50mL)中。取IIb-3-1(1.00g,8.1mmol,1当量)用DMF(10mL)溶解，随后将其滴加到前述DMF溶液中，缓慢升至室温并继续搅拌3h，TLC监测反应完毕，将反应液倾倒水中并用EtOAc萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水Na2SO4干燥，浓缩有机相，粗品经柱层析分离纯化(洗脱剂：PE/EtOAc 40/1到30/1)，得黄色固体IIb-3 0.41g(收率33％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 11.27(s,1H),9.68(s,1H),6.35(s,1H),5.81(s,1H),2.21(s,3H)。
实施例15中间体2-羟基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基苯甲醛IIb-4的制备
Figure BDA0001527420820000282
分别取IIb-2(0.18g,0.5mmol,1.0当量)、IIb-3(0.07g,0.46mmol,0.9当量)及K2CO3(0.07g,0.5mmol,1当量)溶解于CH3CN，回流搅拌过夜，TLC监测反应完毕，浓缩反应液，粗品经柱层析分离纯化(洗脱剂：PE/EtOAc 10/1到3/1)，得固体IIb-4 0.11g(收率54％)。
实施例16中间体5-(羟甲基)-3-氰基吡啶IIb-5-2的制备
Figure BDA0001527420820000283
分别取IIb-5-1(5.00g,26.5mmol,1.0当量)、CuCN(6.00g,65.0mmol,2.5当量)溶解于Py中，并将其置于封管中加热至165℃，反应48h后，TLC监测反应完毕，冷却至室温，随后用aq.NH3和aq.NH4Cl稀释反应液并用CHCl3萃取(150mL×3)，合并有机相水洗(100mL×2)，饱和食盐水洗(100mL×2)，无水Na2SO4干燥，浓缩有机相。粗品经柱层析分离纯化，得固体IIb-5-2 1.50g(收率42％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm 8.81(s,1H),8.80(s,1H),8.03(s,1H),4.83(s,2H)。
实施例17中间体5-(氯甲基)-3-氰基吡啶IIb-5的制备
Figure BDA0001527420820000291
取IIb-5-2(1.50g,11.3mmol,1.0当量)溶解于DCM中(50mL)，向其中加入4N的盐酸二氧六环(10mL)，此混合物浓缩后，加入SOCl2(10mL)，并加热至60℃搅拌3h，TLC监测反应完毕，冷却至室温，浓缩反应液，粗品经柱层析分离纯化，得固体IIb-5 0.55g(收率32％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δppm8.85(s,1H),8.83(s,1H),8.04(s,1H),4.63(s,2H)。
实施例18中间体(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲醛IIb的制备
Figure BDA0001527420820000292
分别取IIb-4(1.00g,2.5mmol,1.0当量)、IIb-5(0.76g,5.0mmol,2当量)及Cs2CO3(1.22g,3.75mmol,1.5当量)溶解于干燥的DMF(20mL)中，加热至75℃反应2h，TLC监测反应完毕，冷却至室温，浓缩反应液，粗品经柱层析分离纯化(洗脱剂：PE/EtOAc 2/1)，得固体IIb 1.00g(收率78％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)518.2[M+H]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm10.27(s,1H),9.02(s,2H),8.53(s,1H),7.71-7.80(m,2H),7.56-7.61(m,2H),7.01-7.11(m,4H),5.47(s,2H),5.45(s,2H),4.31(s,4H),2.12(s,3H)。
实施例19化合物1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-羟基乙基)脲I-4的制备
Figure BDA0001527420820000301
分别取IIb(0.06g,0.12mmol,1.0当量)和IIIb的粗品(0.20g,0.5mmol,4.2当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.06g,1.0mmol,8.3当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕。用DCM(20mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 7/1)，得白色固体I-415.0mg(收率19.2％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)649.4[M+H]+,671.4[M+Na]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm9.00-9.03(m,2H),8.49(s,1H),7.75(m,1H),7.67(m,1H),7.57(m,1H),7.26(s,1H),7.10(s,1H),7.02-7.06(m,2H),6.98(s,1H),6.37(t,1H,J＝5.6Hz),6.24(t,1H,J＝5.6Hz),5.35(s,4H),4.65(m,1H),4.31(s,4H),4.10(s,2H),3.26(m,2H),3.00-3.09(m,4H),2.93(s,2H),2.13(s,3H)。
实施例20中间体1-(2-氨基乙基)-3-(1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基)脲的盐酸盐IIId的制备
Figure BDA0001527420820000302
分别取IIIa-1(0.32g,2.0mmol,1.0当量)和TEA(0.6mL,4.0mmol,2.0当量)溶解于DCM(20mL)中。在冰浴下，加入CDI(0.34g,2.1mmol,1.1当量)并搅拌10min后，升至室温并继续搅拌30min。随后在室温下，将IIId-2(0.67g,2.0mmol,1.0当量)滴加到前述反应液中，再继续搅拌3h后，浓缩溶剂得粘稠状液体。最后，将此粘稠状液体溶解于甲醇(10mL)中，滴加浓HCl(2mL)至反应中并加热回流2h，浓缩溶剂得无色透明粘稠状液体IIId1.20g，粗品未经分离直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
LC-MS MS-ESI(m/z)208.5[M+H]+,230.4[M+Na]+。
实施例21化合物1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基)脲I-5的制备
Figure BDA0001527420820000311
分别取IIb(0.06g,0.12mmol,1.0当量)和IIId的粗品(0.30g,0.5mmol,4.2当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.06g,1.0mmol,8.3当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕。用DCM(20mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 5/1)，得粘稠固体I-53.1mg(收率3.6％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)709.6[M+H]+,731.5[M+Na]+。
实施例22中间体1-(2-氨基乙基)-3-(2-丙烯酸-2-基)脲的盐酸盐IIIe的制备
Figure BDA0001527420820000312
分别取IIIa-1(0.32g,2.0mmol,1.0当量)，TEA(0.85mL,6.0mmol,3.0当量)溶解于DCM(20mL)中。在冰浴下，加入CDI(0.34g,2.1mmol,1.1当量)并搅拌10min后，升至室温并继续搅拌30min。随后在室温下，将IIIc-2(0.43g,2.0mmol,1.0当量)滴加到前述反应液中，再继续搅拌3h后，浓缩溶剂得粘稠状液体。最后，将此粘稠状液体溶解于甲醇(10mL)中，滴加浓HCl(2mL)至反应中并加热回流2h，浓缩溶剂得无色粘稠状液体IIIe 1.00g，粗品未经分离直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
LC-MS MS-ESI(m/z)175.05[M+H]+。
实施例23化合物1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-丙烯酸-2-基)脲I-6的制备
Figure BDA0001527420820000321
分别取IIb(0.06g,0.12mmol,1.0当量)和IIIe的粗品(0.25g,0.5mmol,4.2当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.06g,1.0mmol,8.3当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕。用DCM(20mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 7/1)，得粘稠固体I-610.0mg(收率12.4％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)675.5[M+H]+,697.4[M+Na]+。
实施例24中间体1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-3-(2-羟基乙基)脲的盐酸盐IIIf的制备
Figure BDA0001527420820000322
分别取IIIf-1(0.20g,1.0mmol,1.0当量)和TEA(0.4mL,3.0mmol,3.0当量)溶解于DCM(40mL)中。在冰浴下，加入CDI(0.17g,1.1mmol,1.1当量)并搅拌10min后，升至室温并继续搅拌30min。随后在室温下，将IIIb-2(0.13g,1.0mmol,1.0当量)滴加到前述反应液中，再继续搅拌3h后，浓缩溶剂得粘稠状液体。最后，将此粘稠状液体溶解于甲醇(10mL)中，滴加浓HCl(2mL)至反应中并加热回流2h，浓缩溶剂得无色透明粘稠状液体IIIf 0.50g，粗品未经分离直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
LC-MS MS-ESI(m/z)192.3[M+H]+,214.2[M+Na]+。
实施例25化合物1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-(2-氨基乙氧基)乙基)-3-(2-羟基乙基)脲I-7的制备
Figure BDA0001527420820000331
分别取IIb(0.06g,0.12mmol,1.0当量)和IIIf的粗品(0.25g,0.5mmol,4.2当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.06g,1.0mmol,8.3当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕。用DCM(20mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 7/1)，得浅黄色固体I-78.0mg(收率9.6％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)693.8[M+H]+,715.7[M+Na]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm9.03(m,2H),8.49(s,1H),7.75(m,1H),7.68(m,1H),7.57(m,1H),7.28(s,1H),7.10(s,1H),7.00-7.05(m,2H),6.99(s,1H),6.0(m,2H),5.35(m,4H),4.63(t,1H,J＝5.2Hz),4.31(s,4H),4.11(s,2H),3.63(t,2H,J＝5.0Hz),3.36(m,2H),3.15(m,2H),3.03-3.10(m,4H),3.00(m,2H),2.13(s,3H)。
实施例26中间体1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-3-(2-(甲磺酰基)乙基)脲的盐酸盐IIIg的制备
Figure BDA0001527420820000332
/>
分别取IIIf-1(0.20g,1.0mmol,1.0当量)和TEA(0.4mL,3.0mmol,3.0当量)溶解于DCM(40mL)中。在冰浴下，加入CDI(0.17g,1.1mmol,1.1当量)并搅拌10min后，升至室温并继续搅拌30min。随后在室温下，将IIIg-2(0.16g,1.0mmol,1.0当量)滴加到前述反应液中，再继续搅拌3h后，浓缩溶剂得粘稠状液体。最后，将此粘稠状液体溶解于甲醇(10mL)中，滴加浓HCl(2mL)至反应中并加热回流2h，浓缩溶剂得无色透明粘稠状液体IIIg 0.50g，粗品未经分离直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
LC-MS MS-ESI(m/z)254.4[M+H]+,276.3[M+Na]+。
实施例27中间体1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-3-(2-(N,N’-二甲胺基)乙基)脲的盐酸盐IIIh的制备
Figure BDA0001527420820000341
分别取IIIf-1(0.20g,1.0mmol,1.0当量)和TEA(0.4mL,3.0mmol,3.0当量)溶解于DCM(40mL)中。在冰浴下，加入CDI(0.17g,1.1mmol,1.1当量)并搅拌10min后，升至室温并继续搅拌30min。随后在室温下，将IIIh-2(0.09g,1.0mmol,1.0当量)滴加到前述反应液中，再继续搅拌3h后，浓缩溶剂得粘稠状液体。最后，将此粘稠状液体溶解于甲醇(10mL)中，滴加浓HCl(2mL)至反应中并加热回流2h，浓缩溶剂得无色透明粘稠状液体IIIh 0.50g，粗品未经分离直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
LC-MS MS-ESI(m/z)219.1[M+H]+,241.1[M+Na]+。
实施例28中间体1-(2-氨基乙基)-3-(2-(N,N’-二甲胺基)乙基)脲的盐酸盐IIIi的制备
Figure BDA0001527420820000342
分别取IIIa-1(0.32g,2.0mmol,1.0当量)和TEA(0.85mL,6.0mmol,3.0当量)溶解于DCM(20mL)中。在冰浴下，加入CDI(0.34g,2.1mmol,1.1当量)并搅拌10min后，升至室温并继续搅拌30min。随后在室温下，将IIIh-2(0.18g,2.0mmol,1.0当量)滴加到前述反应液中，再继续搅拌3h后，浓缩溶剂得粘稠状液体。最后，将此粘稠状液体溶解于甲醇(10mL)中，滴加浓HCl(2mL)至反应中并加热回流2h，浓缩溶剂得无色透明粘稠状液体IIIi 1.00g，粗品未经分离直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
LC-MS MS-ESI(m/z)175.05[M+H]+,197.02[M+Na]+。
实施例29中间体1-(2-氨基乙基)-3-(2-(甲磺酰基)乙基)脲的盐酸盐IIIj的制备
Figure BDA0001527420820000343
分别取IIIa-1(0.32g,2.0mmol,1.0当量)和TEA(0.85mL,6.0mmol,3.0当量)溶解于DCM(20mL)中。在冰浴下，加入CDI(0.34g,2.1mmol,1.1当量)并搅拌10min后，升至室温并继续搅拌30min。随后在室温下，将IIIg-2(0.32g,2.0mmol,1.0当量)滴加到前述反应液中，再继续搅拌3h后，浓缩溶剂得粘稠状液体。最后，将此粘稠状液体溶解于甲醇(10mL)中，滴加con.HCl(2mL)至反应中并加热回流2h，浓缩溶剂得无色透明粘稠状液体IIIj 1.00g，粗品未经分离直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
LC-MS MS-ESI(m/z)209.98[M+H]+,232.01[M+Na]+。
实施例30化合物1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-(N-吗啉)乙基)脲I-8的制备
Figure BDA0001527420820000351
分别取IIb(0.06g,0.12mmol,1.0当量)和IIIa的粗品(0.25g,0.5mmol,4.2当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.06g,1.0mmol,8.3当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕。用DCM(20mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 7/1)，得浅黄色固体I-810.0mg(收率11.6％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)718.5[M+H]+,740.4[M+Na]+。
实施例31化合物1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-(2-氨基乙氧基)乙基)-3-(2-(甲磺酰基)乙基)脲I-9的制备
Figure BDA0001527420820000352
/>
分别取IIb(0.06g,0.12mmol,1.0当量)和IIIg的粗品(0.25g,0.5mmol,4.2当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.06g,1.0mmol,8.3当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕。用DCM(20mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 10/1)，得浅黄色固体I-9 12.0mg(收率13.3％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)755.5[M+H]+,777.5[M+Na]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm9.03(s,1H),9.01(s,1H),8.52(s,1H),7.75(m,1H),7.69(m,1H),7.57(m,1H),7.33(s,1H),7.00-7.10(m,4H),6.54(t,1H,J＝5.6Hz),6.34(t,1H,J＝5.6Hz),5.36(s,4H),4.31(s,4H),4.11(s,2H),3.64(t,2H,J＝5.0Hz),3.32-3.40(m,4H),3.03-3.19(m,6H),2.97(s,3H),2.13(s,3H)。
实施例32化合物1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-(2-氨基乙氧基)乙基)-3-(2-(N,N’-二甲胺基)乙基)脲I-10的制备
Figure BDA0001527420820000361
分别取IIb(0.06g,0.12mmol,1.0当量)和IIIh的粗品(0.25g,0.5mmol,4.2当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.06g,1.0mmol,8.3当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕。用DCM(20mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 5/1)，得浅黄色固体I-10 6.0mg(收率6.9％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)720.5[M+H]+,742.4[M+Na]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm9.02(s,2H),8.50(s,1H),7.69-7.75(m,2H),7.58(s,1H),7.28(s,1H),6.98-7.20(m,4H),6.37(S,1H),6.11(s,1H),5.34(s,4H),4.31(s,4H),4.02(s,2H),3.60(s,2H),3.32-3.40(m,4H),3.03-3.19(m,6H),2.33(s,6H),2.13(s,3H)。
实施例33化合物1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-(N,N’-二甲胺基)乙基)脲I-11的制备
Figure BDA0001527420820000371
分别取IIb(0.06g,0.12mmol,1.0当量)和IIIi的粗品(0.25g,0.5mmol,4.2当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.06g,1.0mmol,8.3当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕。用DCM(20mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 5/1)，得浅黄色固体I-11 5.5mg(收率6.7％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)676.6[M+H]+,698.6[M+Na]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm9.04(s,2H),8.52(s,1H),7.75(s,1H),7.68(s,1H),7.57(s,1H),7.33(s,1H),7.19(s,1H),7.02-7.10(m,2H),6.99(s,1H),6.64(t,1H,J＝6.0Hz),6.57(t,1H,J＝6.0Hz),5.36(s,4H),4.31(s,4H),4.10(s,2H),3.05-3.07(m,6H),2.93(s,2H),2.74(s,6H),2.12(s,3H)。
实施例34化合物1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-(甲磺酰基)乙基)脲I-12的制备
Figure BDA0001527420820000372
分别取IIb(0.06g,0.12mmol,1.0当量)和IIIj的粗品(0.25g,0.5mmol,4.2当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.06g,1.0mmol,8.3当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕。用DCM(20mL)稀释反应液，加水萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 7/1)，得浅黄色固体I-12 7.0mg(收率8.2％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)711.5[M+H]+,733.5[M+Na]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm9.00(m,2H),8.46(s,1H),7.75(m,1H),7.68(m,1H),7.57(m,1H),7.21(s,1H),7.10(m,1H),7.00-7.06(m,2H),6.95(s,1H),6.40(t,1H,J＝5.6Hz),6.34(t,1H,J＝5.6Hz),5.32(s,4H),4.31(s,4H),3.91(s,2H),3.37-3.42(m,2H),3.18-3.21(m,4H),2.97(s,3H),2.76(m,2H),2.12(s,3H)。
实施例35中间体1-(2-N-(苄氧羰基)氨基乙基)-3-(O-苄基-L-丝氨酸酯-2-基)脲IIIk-3的制备
Figure BDA0001527420820000381
分别取IIIk-1(0.97g,5.0mmol,1.0当量)，TEA(2.8mL,20.0mmol,4.0当量)溶解于DCM(20mL)中。在冰浴下，加入CDI(0.86g,5.3mmol,1.1当量)并搅拌10min后，升至室温并继续搅拌30min。随后在室温下，将IIIk-2(1.16g,5.0mmol,1.0当量)滴加到前述反应液中，搅拌过夜至反应完毕，用DCM/CH3OH 10/1(80mL)萃取，合并有机相水洗(50mL×2)，饱和食盐水洗(50mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经柱层析分离(洗脱剂：EtOAc)，得白色固体IIIk-3 0.40g(收率19.2％)。
实施例36中间体1-(2-N-(苄氧羰基)氨基乙基)-3-(O-苄基-L-丝氨酸酯-2-基)脲IIIk的制备
Figure BDA0001527420820000382
将IIIk-3(0.40g,1.0mmol)溶解于CH3OH(15mL)中，加入Pd/C(5％,0.10g)，氢气条件下搅拌过夜，反应完毕，抽滤，滤液旋干后得白色固体0.18g，粗品未经分离直接用于下一步反应(收率94.7％)。
实施例37化合物1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(L-丝氨酸-2-基)脲I-13的制备
Figure BDA0001527420820000391
分别取IIb(0.11g,0.2mmol,1.0当量)和IIIk的粗品(0.10g,0.5mmol,2.5当量)溶解于CH3OH中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.06g,1.0mmol,5.0当量)，继续搅拌2h，LC-MS监测反应完毕，加水淬灭，用DCM/CH3OH 5/1(60mL)萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 5/1)，得白色固体I-13 8.0mg(收率5.8％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)693.7[M+H]+,715.7[M+Na]+。
实施例38中间体1-(2-N-(叔丁氧羰基)氨基乙基)-3-(2-N-(9-芴甲氧羰基)氨基乙基)脲IIIl-3的制备
Figure BDA0001527420820000392
分别取IIIa-1(0.32g,2.0mmol,1.0当量)和TEA(0.85mL,6.0mmol,3.0当量)溶解于DCM(20mL)中。在冰浴下，加入CDI(0.34g,2.1mmol,1.1当量)并搅拌10min后，升至室温并继续搅拌30min。随后在室温下，将IIIl-2(0.32g,2.0mmol,1.0当量)滴加到前述反应液中，搅拌过夜至反应完毕，用DCM/CH3OH 10/1(50mL)萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经柱层析分离(洗脱剂：PE/EtOAc 1/1到EtOAc)，得白色固体IIIl-3 0.50g(收率21.2％)。
实施例39中间体1-(2-氨基乙基)-3-(2-N-(9-芴甲氧羰基)氨基乙基)脲的盐酸盐IIIl的制备
Figure BDA0001527420820000393
将IIIl-3(0.50g,1.0mmol)溶解于CH3OH(10mL)中，滴加con.HCl(2mL)，置于室温下反应3h，反应完毕并浓缩溶剂，得白色固体IIIl 0.45g，未经纯化直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
实施例40中间体1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)-N-(叔丁氧羰基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-N-(9-芴甲氧羰基)氨基乙基)脲I-14-1的制备
Figure BDA0001527420820000401
分别取IIb(0.30g,0.58mmol,1.0当量)和IIIl的粗品(0.45g,1.0mmol,1.7当量)溶解于CH3OH/DCM(15mL/2mL)的混合溶剂中，滴加TEA(2mL)，然后加入无水MgSO4(1.00g)，室温搅拌过夜，加入NaBH3CN(0.19g,3.0mmol,3.0当量)，继续搅拌3h，LC-MS监测反应完全，随后直接加入(Boc)2O(0.43g,2.0mmol,2.0当量)，继续室温搅拌过夜，反应完毕，用DCM/CH3OH10/1(80mL)萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经柱层析分离(洗脱剂：EtOAc)，得白色固体I-14-1 0.20g(收率35.6％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)970.7[M+H]+,992.6[M+Na]+。
实施例41中间体1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)-N-(叔丁氧羰基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-氨基乙基)脲I-14-2的制备
Figure BDA0001527420820000402
在室温下，将I-14-1(0.20g,0.2mmol)溶解于DCM(10mL)中，加入四丁基溴化铵(TBAF,1M inTHF,2mL)，搅拌3h至反应完毕，用DCM/CH3OH 10/1(60mL)稀释反应液，水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相，得粘稠状固体I-14-20.15g，未经纯化直接用于下一步反应(收率按100％计算)。
实施例42化合物1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)-苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-丙烯酰胺乙基)脲I-14的制备
Figure BDA0001527420820000411
将I-14-2(0.15g,0.2mmol,1.0当量)溶解于DCM(10mL)中，加入DIPEA(0.2mL,2.0mmol,10.0当量)，在冰浴下，滴加丙烯酰氯(32μL,0.4mmol,2.0当量)，而后升温至室温搅拌过夜，反应完毕，加水淬灭，用DCM/CH3OH 5/1(60mL)萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相，得粘稠状固体。随后，将此粘稠状固体溶解于DCM(3mL)中，滴加TFA(2mL)，室温搅拌2h，反应完毕，加水稀释，用DCM萃取，合并有机相水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL×2)，无水MgSO4干燥，浓缩有机相。粗品经制备TLC纯化(展开剂：DCM/CH3OH 7/1)，得白色固体I-14 7.5mg(收率5.3％)。
LC-MS MS-ESI(m/z)702.6[M+H]+,724.5[M+Na]+。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm8.98-8.99(m,2H),8.43(s,1H),8.18(s,1H),7.75(m,1H),7.67(m,1H),7.56(m,1H),7.17(s,1H),7.10(s,1H),7.02-7.09(m,3H),6.92(s,1H),6.17(m,2H),6.07(m,1H),5.60(m,1H),5.32(s,4H),4.31(s,4H),3.78(m,2H),3.44(m,2H),3.04-3.13(m,4H),2.65(m,2H),2.11(s,3H)。
体外生物学评价
本检测方法用于本发明所述化合物的体外活性评价，包括体外蛋白水平结合抑制活性评价方法和细胞水平生物学功能活性评价方法。
本检测的目的在于综合评价不同化合物对PD-1/PD-L1结合抑制活性特点和对细胞模型的生物学活性影响，包括对特定模型细胞的生长活性以及对原代T细胞的生物活性影响。
实施例A体外PD-1/PD-L1结合抑制筛选方法
实验主要原理(HTRF)
均相时间分辨荧光法(HTRF)：PD-1蛋白带His标签，其配体PD-L1的Fc融合蛋白带hFc标签。分别用Eu元素的鳌合标记物标记的抗hFc抗体和XL665标记的抗His抗体与两个对应标签结合，激光激发(320nm)后，能量能够从供体Eu上，转移到受体XL665，使得XL665发光(665nm)。当加入小分子化合物抑制剂后，阻断PD-1与PD-L1的结合，使得Eu和XL665距离较远，能量不能转移，XL665不会发光。基本的检测原理如下所示(见图3)：
实验材料与设备
带His标签的人重组PD-1蛋白(Cat#：80448-R08H-100)、人重组PD-L1-Fc融合蛋白(Cat#：90251-C02H-100)购自义翘神州(Sino BiologicalInc.)公司，抗hFc-Eu3+、抗His-XL665抗体购自Cisbio公司，其它相关试剂如稀释缓冲液、检测缓冲液等均从Cisbio公司购买。荧光检测仪器Tecan(Spark 10M)从瑞士Tecan公司购买。
实验主要过程
实验过程按照检测试剂使用说明书要求的流程进行(Invitrogen)。流程如下：
(1)实验准备：用稀释缓冲液将测试化合物稀释成不同浓度梯度(在20μL最终反应体系中最高终浓度为10μM)，将His-PD-1蛋白稀释成800nM(在20μL最终反应体系中终浓度100nM)，PD-L1-Fc融合蛋白稀释成16nM(终浓度为2nM)；用检测稀释液分别按试剂要求将抗His-XL665抗体和抗hFc-Eu3+抗体稀释20倍和100倍。
(2)先将5μL测试化合物、2.5μL PD-L1蛋白和2.5μL PD-1蛋白溶液混匀后，室温反应15min；随后向该体系加入5μL anti-His-XL665抗体和5μLanti-hFc-Eu3+抗体，继续孵育3h后检测。
(3)检测反应同时设置有对照组，包括未添加测试化合物的0抑制阳性对照、未添加PD-1蛋白的阴性对照。所有检测采用复孔进行。
(4)使用荧光检测仪Tecan(Spark 10M)检测每孔的荧光信号，激发波长为320nm，检测的发射波长分别为620nm和665nm。PD-1/PD-L1相互结合的强度参照荧光信号比值Em665/Em620。
(5)测试化合物的结合抑制率计算公式：抑制率(％)＝[1–(检测孔荧光信号比值–阴性对照)/(0抑制阳性对照荧光信号比值–阴性对照)×100％。不同浓度梯度的测试化合物分别计算结合抑制率后，进一步计算50％抑制浓度(IC50)。数据见下表3。
表3本发明代表性化合物抑制体外PD-1/PD-L1结合的IC50数据
化合物 IC50(nM) 化合物 IC50(nM) 化合物 IC50(nM)
I-1 1,710 I-2 580.5 I-3 3,120
I-4 37.48 I-5 36.43 I-6 70.20
I-7 43.69 I-8 60.97 I-9 28.07
I-10 73.31 I-11 76.13 I-12 49.15
I-13 15.78 I-14 197.1 - -
由上述结果可见，本发明化合物具有良好的体外PD-1/PD-L1结合抑制活性。
实施例B化合物的细胞毒活性检测
为了排除化合物本身具有细胞毒性作用而造成T细胞生物学功能变化，使用MTS检测作为常规细胞毒检测方法。其基本原理是活细胞线粒体中的脱氢酶能够代谢还原黄色的新型甲臢化合物MTS为甲臜，在490nm吸收值(OD)测量的甲臢产物的量直接与培养物中活细胞的数量成正比，因此可根据OD值判断测试化合物本身是否具有抑制细胞生长或杀伤细胞的能力。
本实验依据MTS检测方法对T细胞白血病细胞系(Jurkat细胞)进行化合物对细胞生长活性的评价。
实验主要过程
MTS按常规实验操作流程，实验在96孔板中进行。
细胞系按照适当的浓度(约20,000个/每孔)接种到96孔培养板中，加入测试化合物(终浓度2μM)，同时设置溶剂对照(DMSO)和阴性对照孔，按照3次重复孔设置。细胞继续培养72h后进行检测。
培养结束后，直接向培养孔中加入20μL预先配制的MTS和PMS混合液(按照20:1的比例混和)，37℃温箱培养2h后，用酶标仪进行检测(490nm)。
扣除阴性对照的背景值后，测试化合物对细胞生长的相对细胞活性(％)＝(测试孔OD值/溶剂对照孔的OD值)×100％。数据见下表4。
表4本发明代表性化合物在T细胞株中的细胞活性结果
Figure BDA0001527420820000431
Figure BDA0001527420820000441
由上述结果可见，本发明化合物的情况下，T细胞活性均保持良好。
实施例C细胞水平PD-1信号抑制的生物活性检测
作为免疫检查点分子，PD-1主要表达于活化的T细胞表面，而其配体PD-L1则表达广泛。除了抗原递呈细胞如树突状细胞、巨噬细胞、B细胞外，许多肿瘤细胞也可通过上调PD-L1的表达来实现抑制抗肿瘤免疫效应。对于正常免疫应答而言，抗原递呈细胞除了通过免疫共刺激分子激活T细胞外，还表达PD-L1配体分子等，与活化T细胞表面PD-1分子结合，从而抑制T细胞活化，下调T细胞分泌的细胞因子如IL-2等，最终避免了T细胞过度增殖活化而造成对周围正常组织的损伤。
实验主要原理
为了检测PD-1/PD-L1相互作用对免疫反应中T细胞活性的影响，以超抗原金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)刺激人外周单个核细胞(PBMC)为例，检测上清中T细胞激活后所分泌的T细胞特异性细胞因子IL-2，而阻断或抑制PD-1/PD-L1相互作用会增强T细胞的活性和IL-2的分泌。实验采用该体外SEB刺激T细胞活化体系，与测试化合物共孵育指定时间后，利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测上清中化合物对IL-2含量的影响。
实验材料与设备
金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB：SL008-1MG)购自军事医学科学院，分离志愿者外周血PBMC所用的试剂Ficoll-PaqueTM(Cat#：17-5442-02)购自GE Healthcare公司，抗人PD-1抗体(Cat#：0330300)购自近岸蛋白质科技有限公司。以HTRF技术为基础检测人IL-2的ELISA试剂盒(64IL2PEB)购自Cisbio公司。
实验主要过程
按常规细胞培养实验操作流程，实验在96孔板中进行。
用密度梯度离心法分离志愿者外周血PBMC细胞，按照适当的浓度(约200,000个/每孔)接种到96孔培养板中，加入SEB(200ng/mL)，同时加入测试化合物(终浓度2μM)。同时设置溶剂对照(DMSO)和抗人PD-1抗体(5μg/mL)阳性对照孔。培养96h后，收集上清，按试剂盒操作步骤检测IL-2含量。
以抗人PD-1抗体作为阳性对照，计算测试化合物的PD-1/PD-L1结合抑制率(％)＝(化合物处理孔IL-2含量–溶剂对照组)/(抗体处理孔组–溶剂对照组)×100％。
根据上述实验方法，将本发明所述化合物进行细胞学评价(测试化合物浓度为2μM)。数据小结见下表5。
表5本发明代表性化合物促进人T细胞因子IL-2分泌的数据(相比PD-1抗体)
化合物 促IL-2活性(％)
I-5 53
I-6 56.3
I-7 58.1
I-11 51.7
由上述结果可见，本发明化合物具有明显促进人T细胞分泌IL-2的活性(>50％)。
此外，附图4示出了本发明化合物I-5对多个志愿者PBMC细胞的促IL-2分泌结果。

Claims (17)

1.一种式I化合物，
Figure FDA0004184310980000011
或其立体异构体或药学上可接受的盐，
其中，
R1选自CH3、CN和Ar1；
其中，
Ar1选自
Figure FDA0004184310980000012
其中，
R4为H；
i为1到3的整数；
Z选自O；
R2为-(CH2)k-Ar2；
其中，
k为1；
Ar2为
Figure FDA0004184310980000013
其中，
R5为CN；
v为1；
R3为CH3；
X为C；
Y选自NH和O；
A选自
Figure FDA0004184310980000014
Figure FDA0004184310980000021
或者A为/>
Figure FDA0004184310980000022
其中，
R6为H；
w为1；
m为2；
n为1到2的整数；
p为0；
q为0到1的整数。
2.化合物，选自：
1-((2-(2-(3-氰基苯基)甲氧基-4-(2-甲基-(1,1’-二苯基)-3-基-甲氧基))苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-(N-吗啉)乙基)脲；
1-((2-(2-(3-氰基苯基)甲氧基-4-(2-甲基-(1,1’-二苯基)-3-基-甲氧基))苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-羟基乙基)脲；
1-((2-(2-(3-氰基苯基)甲氧基-4-(2-甲基-(1,1’-二苯基)-3-基-甲氧基))苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-叔丁基-O-叔丁基-L-丝氨酸酯-2-基)脲；
1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-羟基乙基)脲；
1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基)脲；
1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-丙烯酸-2-基)脲；
1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-(2-氨基乙氧基)乙基)-3-(2-羟基乙基)脲；
1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-(N-吗啉)乙基)脲；
1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-(2-氨基乙氧基)乙基)-3-(2-(甲磺酰基)乙基)脲；1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-(2-氨基乙氧基)乙基)-3-(2-(N,N’-二甲胺基)乙基)脲；
1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-(N,N’-二甲胺基)乙基)脲；
1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-(甲磺酰基)乙基)脲；
1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)苯甲胺基)-2-乙基)-3-(L-丝氨酸-2-基)脲；和
1-((2-(2-(5-氰基吡啶-3-基)甲氧基-4-(2-氰基-3-(2,3-二氢苯并[b][1,4-二噁英-6-基])苯甲氧基)-5-甲基)-苯甲胺基)-2-乙基)-3-(2-丙烯酰胺乙基)脲。
3.制备根据权利要求1所述的式I化合物的方法，包括使式II化合物与式III化合物在还原剂存在下进行还原胺化反应，
Figure FDA0004184310980000031
其中各变量如权利要求1所定义。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中所述还原剂选自NaBH4、NaBH3CN及NaBH3OAc。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的制备方法，其中所述还原胺化反应在碱性催化剂存在下进行，并且所述碱性催化剂选自TEA和DIPEA。
6.根据权利要求3-4中任一项所述的制备方法，其中所述制备方法在干燥剂存在下进行，并且所述干燥剂选自无水MgSO4、无水Na2SO4及分子筛。
7.根据权利要求3-4中任一项所述的制备方法，其中所述还原胺化反应在溶剂中进行，并且所述溶剂选自CH3OH、CH2Cl2及1,2-二氯乙烷。
8.根据权利要求3-4中任一项所述的制备方法，其中所述式III化合物由式III-1化合物在碳酰二咪唑(CDI)作用下形成的活性中间体与式III-2化合物经一锅法制得，
Figure FDA0004184310980000041
其中，各变量如权利要求1中所定义。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中所述式III化合物的制备在选自TEA和DIPEA的碱性催化剂存在下进行。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其中所述式III化合物的制备在选自浓HCl、TFA及HOAc的酸性催化剂的存在下进行。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的制备方法，其中所述式III化合物的制备在选自CH2Cl2、CH3OH及CH3CN的溶剂的存在下进行。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1至2中任一项所述的化合物以及任选的可药用辅料。
13.权利要求1至2中任一项所述的化合物在制备用于治疗或预防与PD-1/PD-L1信号通路相关的疾病的药物中的应用。
14.根据权利要求13的应用，其中所述与PD-1/PD-L1信号通路相关的疾病选自癌症、自身免疫性疾病和慢性感染性疾病。
15.权利要求12所述的药物组合物在制备用于治疗或预防与PD-1/PD-L1信号通路相关的疾病的药物中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其中所述与PD-1/PD-L1信号通路相关的疾病选自癌症、自身免疫性疾病和慢性感染性疾病。
17.根据权利要求12所述的药物组合物，其以制剂形式存在并且单位剂量为0.0001～200mg。
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