CN116178281B - 一种双功能免疫抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双功能免疫抑制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双功能免疫抑制剂及其制备方法和应用，其通式如下式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐、消旋体，本发明还公开了所述杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体在制备具有免疫检查点抑制剂、具有PD‑1/PD‑L1抑制活性的抑制剂、具有VISTA抑制活性的抑制剂中的应用。本发明还公开了一种药用组合物，包含通式（I）化合物或其药学上可接受的盐、消旋体以及药学上可接受的载体。本发明所制备的化合物可以阻断PD‑1与PD‑L1蛋白的相互作用，并抑制VISTA通路，可用于治疗与PD‑1/PD‑L1及VISTA信号通路相关的疾病如癌症、感染和身免疫类疾病等。式（I）

Description

一种双功能免疫抑制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种化合物及其制法和应用，具体涉及一种治疗PD-1/PD-L1及VISTA信号通路相关疾病的杂环类化合物及其制备方法和在疾病治疗中的应用。
背景技术
免疫检查点（immune checkpoint）是调控免疫系统反应强度的一系列功能蛋白的统称。正常生理条件下，免疫系统通过免疫检查点等手段，调控免疫细胞的反应强度，防止免疫细胞的过度活化，避免对正常体细胞的杀伤。是维持人体内稳态的重要手段。
已有多个抑制性免疫检查点被发现，包括PD-1/PD-L1、VISTA、CTLA-4和TIM3等。PD-L1是一种Ⅰ型跨膜蛋白，在多种肿瘤细胞中高表达，在与其受体蛋白PD-1结合后，可以抑制T细胞的增殖与活化，降低T细胞清除肿瘤细胞的能力，已经被证明是一种与癌症高度相关的信号通路。激活该通路可以导致肿瘤细胞的免疫逃逸，而针对PD-1/PD-L1通路开发的抑制性单克隆抗体可以起到很好的治疗作用，全球已有超过10个PD-1/PD-L1单克隆抗体抑制剂上市，主要用于相关癌症的治疗。但是目前小分子抑制剂的开发还处于临床研究早期阶段。
VISTA是另一种抑制性免疫检查点，与PD-1具有一定的结构相似性，在临床前研究中，同样被发现具有免疫抑制功能，激活VISTA通路同样可以导致肿瘤细胞的免疫逃逸。并且与PD-1/PD-L1的功能并不完全一致，两者互为代偿通路。
现在已有一定数量的PD-1/PD-L1抑制剂，但是机制明确并能同时作用PD-L1及VISTA的小分子抑制剂仍未有报道。
发明内容
发明目的：PD-1/PD-L1与VISTA通路互为代偿通路，二者的抑制剂联用可以产生更好的疗效，同时靶向这两条通路的小分子抑制剂理论上会产生更优的治疗活性。本发明公布了一系列杂环化合物，具有明确的作用机制，可以同时阻断PD-1/PD-L1和VISTA信号通路，可作为免疫检查点抑制剂用于肿瘤等疾病的免疫治疗。本发明还提供了该系列化合物的制备方法和其在制备药物中的用途。
技术方案：本发明所述的通式如下式（I）所示的杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体：；
其中，环A选自苯环、芳环或杂芳环；
X1选自C、N、O、S；
X2、X3、X4选自C或N；
R1选自H、C1-C4烷基或环烷基、X取代的C1-C4烷基或环烷基；所述X选自F、Cl、Br、I、羟基、羧基、氨基、酰胺基；
R2选自：H或C1-C4烷基；
R3选自以下任意一种：
；
t是0、1、2、3或4；
R5选自：H、C1-C4烷基或苄基；R6选自：H、C1-C4烷基或苄基；
R7选自：H、C1-C4烷基或苄基；
R8选自：H、C1-C4烷基或苄基；
R9选自：H、C1-C4烷基、C1-C4烷氧羰基或苄基；
或者，R2和R3与它们所连接的N原子一起形成一个环，选自以下任意一种：；
s是0、1或2；
p是1、2或3；
Q选自：S、O、-NH、-NCH3、-NCH(CH3)2；
R10选自：氢、羟基、酰胺基、羧基或羟基取代的C1-C4烷基；
R11选自：氢、羟基、羧基、酰胺基、羟基取代的C1-C4烷基或-CHO；
R12选自：C1-C4烷氧羰基、卤素、C1-C6烷基、羧基、酰胺基、羟基、羟基取代的C1-C4烷基、-NRaRb或苯氧基羰基，其中，苯氧基羰基的苯基任选被卤素、-OH、-CN、-NO2、-NH2、-CF3、-CF2CF3、-OCF3、-OCF2CF3、-SO2NH2、-C(O)OH、-C(O)NH2或-NHC(O)NH2取代，Ra和Rb各自独立地选自：H、羧基、C1-C4烷氧羰基或C1-C4烷基羰基；
所述W选自：H、卤素、-CN、C1-C4烷基、X取代的C1-C4烷基或环烷基；所述X选自F、Cl、Br、I、羟基、羧基、氨基、酰胺基；
优选的，所述W选自-CN、甲基或卤素。
每个R4独立的选自：H、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-OH、-CF3、-CF2CF3、-OCF3或-OCF2CF3、-RC、-ORC、-SRC、-S(O)RC、-S(O)2RC、-C(O)RC、-C(O)OH、-C(O)ORC、-OC(O)RC、-NHRC、-N(RC)2、-C(O)NH2、-C(O)NHRC、-C(O)N(RC)2、-NH(CO)RC、-NRc(CO)RC、-NH(CO)ORC、-NRC(CO)ORC、-NH(CO)NH2、-NH(CO)NHRC、-NH(CO)N(RC)2、-NRC(CO)NHRC、-NRC(CO)N(RC)2、-SO2NH2、-SO2NHRC、-SO2N(RC)2、-NHSO2RC、-NRCSO2RC、-NHSO2NHRC、-NHSO2N(RC)2、-NRCSO2NHRC、-NRCSO2N(RC)2、-C(O)NHNOH、-C(O)NHNORC、-C(O)NHSO2RC、-C(NH)NH2、-C(NH)NHRC、-C(NH)N(RC)2；
n是0、1或2；
RC选自：苯基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、取代或非取代的C1-C4烷基、烯基或炔基；优选的，RC选自：苯基、杂芳基、C1-C4环烷基、环烯基、五元六元杂环烷基、杂环烯基、卤素或羟基取代或非取代的甲基、乙基、烯基或炔基。
或者，独立的两个R4之中的两个与它们所连接到的原子一起形成取代或非取代的苯环、取代或非取代的杂芳环、取代或非取代的环烷烃环、取代或非取代的杂环烷烃环或取代或非取代的杂环烯烃环。优选的，独立的两个R4之中的两个与它们所连接到的原子一起形成。
优选的，所述R3选自以下任意一种：
；
t是0、1、2、3或4；
R5选自：H或C1-C4烷基；
R6选自：H或C1-C4烷基；
R7选自：H或C1-C4烷基；
R8选自：H或C1-C4烷基；优选的，R8选自：H、C1-C2烷基；更优选的，R8选自：H、乙基；
R9选自：H、C1-C4烷基或C1-C4烷氧羰基；
优选的，所述化合物选自以下化合物：
。
本发明中所涉化合物的制备可参照实施例中的方法进行，特别的，当所述式（I）化合物中的X1、X2、X3均为N，X4为C时，所述化合物的合成包括以下步骤：
。
其中，式Ⅱ中A、R1、R2、R3、R4、W、n与所述式I中的定义一致，具体合成步骤如下：
（1）化合物C1和C2在碱的作用下反应生成C3；
（2）化合物C3经还原剂还原，得到化合物C4；
（3）化合物C4与芳基/取代芳基硼酸经Suzuki偶联反应，得到化合物C5；
（4）化合物C5与二氯亚砜等试剂发生卤化反应，得到化合物C6；
（5）化合物C6与HNR2R3在碱性条件下，反应生成终产物Ia。
本发明还公开了所述杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体在制备具有免疫检查点抑制剂中的应用。
本发明还公开了所述杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体在制备具有PD-1/PD-L1抑制活性的抑制剂中的应用。
本发明还公开了所述杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体在制备具有VISTA抑制活性的抑制剂中的应用。
本发明所述的抑制剂治疗的疾病包括自身免疫性疾病、癌症及感染性疾病；所述的癌症选自肺癌、黑色素瘤、血液肿瘤、神经胶质肉瘤、消化系统肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、神经系统肿瘤、泌尿系肿瘤、皮肤癌；所述的感染性疾病选自细菌及病毒感染；所述的自身免疫性疾病选自器官特异性以及系统性自身免疫病。
本发明还提供了一种药物组合物，其中包含如本发明所述的式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐、消旋体以及药学上可接受的载体。可任意混合的载体根据剂型、给药形式等可以改变。载体的例子包括赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂和甜味剂等。所述药物组合物可以是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂和贴剂等制剂学上常规的制剂形式。
有益效果：与现有技术相比，本发明提供了一类免疫检查点小分子抑制剂，结构新颖，可以同时阻断PD-L1和VISTA两条信号通路，通过抑制两条代偿通路，更有利于激活免疫细胞，可用于癌症等多种疾病的治疗和预防。
附图说明
图1为实施例1-26制备的化合物对VISTA相互作用抑制效果。
实施方式
下文通过具体实施例说明本发明的内容
实施例1：2-(((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙基-1-醇
合成路线：
合成方法：
化合物M-2-1的合成：
取甲醇钠（5.76 g，105 mmol，1.05 eq）溶解于210 mL甲醇中，之后，用少量甲醇完全溶解化合物M-1-1（20.7 g，100 mmol，1.0 eq）后，缓慢滴加入甲醇钠甲醇溶液中，室温搅拌约15 min。TLC检测反应完毕后，加入适量水，并用乙酸乙酯萃取3次。合并有机相后减压干燥，硅胶柱色谱纯化后得到纯化的化合物M-2-1（16.56g，产率82%）。1H NMR (400 MHz,DMSO-d 6) δ 7.44 (s, 1H), 4.01 (s, 3H), 3.90 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 203.1 [M+H]+
化合物M-3-1的合成：
取化合物M-2-1（16.16g，80 mmol，1eq），3-溴-2-甲基苯胺(14.88g，80 mmol，1eq）和甲磺酸（11.53g，120mmol，1.5eq）于反应瓶中，加入400 mL二氧六环后，100℃回流反应过夜。TLC监测反应进程，原料反应完全后，加入饱和碳酸氢钠溶液，乙酸乙酯溶剂萃取3次。合并有机相，蒸干后硅胶柱层析得到纯化的化合物M-3-1 (11.27g，收率40%)。1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ 9.47 (s, 1H), 7.48 – 7.41 (m, 2H), 7.13 (t,J= 8.0 Hz, 1H),6.69 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 2.29 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 352.2 [M+H]+
化合物M-4-1的合成：
将化合物M-3-1 (10.57 g，30 mmol，1 eq)溶于150 mL四氢呋喃中，在氩气保护环境下，加入1.0 mol/L二异丁基氢化铝(120ml，4 eq)，冰浴条件下反应3个小时。滴加甲醇淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次后合并有机层。蒸干后硅胶柱层析纯化，得到纯化的化合物M-4-1(5.93 g，收率为61%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.93 (s, 1H), 7.56 – 7.26 (m,2H), 7.18 – 6.98 (m, 1H), 6.26 (s, 1H), 5.39 (s, 1H), 4.29 (s, 2H), 3.78 (s,3H), 2.27 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 324.2 [M+H]+
化合物M-5-1的合成：
将苯硼酸(2.195g，18 mmol，1.2 eq)、M-4-1(4.86g，15mmol，1eq)、Pd(dppf)Cl2 (0.65g，0.9mmol，0.06 eq)和碳酸钾(5.18g，37.5mmol，2.5 eq)依次加入单口瓶中，之后加入二氧六环/水混合溶剂75mL（体积比=4:1），氩气保护条件下，100℃反应16h。旋蒸除去二氧六环后，加入30mL水，并用乙酸乙酯萃取3次（30 mL*3）。合并有机相并旋干，硅胶柱分离得到纯化的化合物M-5-1 (3.90g，收率81%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.74 (s,1H), 7.53 – 7.49 (m, 1H), 7.48 – 7.41 (m, 2H), 7.39 – 7.33 (m, 1H), 7.32 –7.27 (m, 2H), 7.24 – 7.18 (m, 1H), 7.01 - 6.95 (m, 1H), 6.25 (s, 1H), 5.38(t,J= 5.9 Hz, 1H), 4.31 (d,J= 5.9 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.08 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 322.3 [M+H]+
化合物M-6-1的合成：
将M-5-1（3.21g，10mmol，1eq）放入单口瓶中，之后加入10 mL二氯亚砜，50℃搅拌2h。减压蒸除溶剂后硅胶柱层析，即得化合物M-6-1 (3.23g，收率95%)。1H NMR (400 MHz,DMSO-d 6) δ 9.67 (s, 1H), 7.55 – 7.51 (m, 1H), 7.48 – 7.42 (m, 2H), 7.39 -7.34 (m, 1H), 7.33 – 7.21 (m, 3H), 7.12 – 7.03 (m, 1H), 6.49 (s, 1H), 4.62(s, 2H), 3.86 (s, 3H), 2.12 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 340.3 [M+H]+
化合物1的合成：
将M-6-1 (170 mg，0.5 mmol，1 eq)、乙醇胺 (61 mg，1 mmol，2 eq)溶解于2.5 mLDMF中，再加入DIPEA(97 mg，0.75 mmol，1.5 eq)，50℃反应12 h，TLC检测反应进程，M-6-1完全反应后终止反应。加入5 mL水，乙酸乙酯萃取三次（5 mL*3），合并有机相，硅胶柱层析得到纯化的化合物1（116 mg，收率32%，无色油状物）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.73(s, 1H), 7.56 – 7.50 (m, 1H), 7.48 – 7.41 (m, 2H), 7.39 – 7.34 (m, 1H), 7.33– 7.27 (m, 2H), 7.24 – 7.19 (m, 1H), 6.98 (dd,J= 7.5, 1.3 Hz, 1H), 6.26 (s,1H), 4.60 – 4.46 (s, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.58 (s, 2H), 3.51 – 3.44 (m, 2H),2.61 (t,J= 5.7 Hz, 2H), 2.09 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 365.4 [M+H]+
实施例2：N-(2-(((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙酰胺
参考实施例1的合成方法，将乙醇胺替换为N-乙酰基乙二胺，得到化合物2。1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.73 (s, 1H), 7.82 (t,J= 5.7 Hz, 1H), 7.52 (d,J= 8.0 Hz,1H), 7.48 – 7.41 (m, 2H), 7.39 – 7.33 (m, 1H), 7.32 – 7.27 (m, 2H), 7.26 –7.17 (t,J= 7.8 Hz, 1H), 7.01 – 6.95 (m, 1H), 6.26 (s, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.54(s, 2H), 3.12 (q,J= 6.3 Hz, 2H), 2.55 (t,J= 6.3 Hz, 2H), 2.09 (s, 3H), 1.78(s, 3H). MS(ESI)：m/z 406.4 [M+H]+
实施例3：N1-((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1′-联苯]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-N2,N2-二甲基-1,2-二胺
参考实施例1的合成方法，将乙醇胺替换为N,N-二甲基乙二胺，得到化合物3。1HNMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.74 (s, 1H), 7.55 – 7.49 (m, 1H), 7.49 – 7.41 (dd,J= 8.1, 6.7 Hz, 2H), 7.40 – 7.34 (d,J= 7.4 Hz, 1H), 7.34 – 7.26 (m, 2H), 7.25– 7.17 (m, 1H), 7.02 – 6.95 (m, 1H), 6.22 (s, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.54 (s,2H), 2.56 (t,J= 6.3 Hz,, 2H), 2.30 (d,J= 6.3 Hz, 2H), 2.10 (s, 6H), 2.09 (s,3H). MS(ESI)：m/z 392.5 [M+H]+
实施例4：2-(((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)(甲基)氨基)乙基-1-醇
参考实施例1的合成方法，将乙醇胺替换为N-甲基-2-羟基乙胺，得到化合物4。1HNMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9.03 (s, 1H), 7.52 – 7.46 (m, 3H), 7.44 – 7.37 (m,1H), 7.35 – 7.24 (m, 3H), 7.12 - 7.04 (m, 1H), 6.42 (s, 1H), 4.24 (s, 2H),3.90 (s, 3H), 3.74 (t,J= 5.2 Hz, 2H), 3.28 (t,J= 5.2 Hz, 2H), 2.89 (s, 3H),2.13 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 379.4 [M+H]+
实施例5：4-甲氧基-N-(2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)-6-(((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)甲基)嘧啶-2-胺
参考实施例1的合成方法，将乙醇胺替换为4-氨基四氢吡喃，得到化合物5。1H NMR(400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.72 (s, 1H), 7.52 - 7.491 (m, 1H), 7.47 – 7.42 (m, 2H),7.39 – 7.33 (m, 1H), 7.32 – 7.27 (m, 2H), 7.23 - 7.19 (m, 1H), 7.01 - 6.95(m, 1H), 6.27 (s, 1H), 3.85 – 3.76 (m, 5H), 3.58 (s, 2H), 3.29 -3.22 (m, 2H),2.63 – 2.54 (m, 1H), 2.09 (s, 3H), 1.78 - 1.69 (m, 2H), 1.30 – 1.23 (m, 2H).MS(ESI)：m/z 405.4 [M+H]+
实施例6：((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)甘氨酸甲酯
参考实施例1的合成方法，将乙醇胺替换为甘氨酸甲酯盐酸盐，得到化合物6。1HNMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.73 (s, 1H), 7.54 – 7.41 (m, 3H), 7.40 – 7.28 (m,3H), 7.25 – 7.18 (t,J= 7.8 Hz, 1H), 7.04 - 6.93 (m, 1H), 6.23 (s, 1H), 3.81(s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.58 (s, 2H), 3.39 (s, 2H), 2.09 (s, 3H). MS(ESI)：m/z393.4 [M+H]+
实施例7：((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)甘氨酸
取化合物5（196 mg，0.5 mmol，1 eq）放入单口瓶中，加入甲醇/水混合溶液（体积比1:1）2.5 mL与氢氧化钠（40mg，1 mmol，2 eq），室温条件下搅拌2 h，TLC监测到化合物6原料消失，反应结束。稀盐酸条件溶剂pH值至4-5，乙酸乙酯萃取3次（10 mL×3），合并有机相。减压蒸干溶剂，硅胶柱层析得到化合物7（172 mg，收率91%）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ8.82 (s, 1H), 7.56 – 7.50 (m, 1H), 7.47 – 7.41 (m, 2H), 7.39 – 7.29 (m, 3H),7.25 -7.19 (t,J= 7.8 Hz, 1H), 7.02 - 6.97 (m, 1H), 6.25 (s, 1H), 3.82 (s,3H), 3.74 (s, 2H), 3.29 (s, 2H), 2.09 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 379.3 [M+H]+
实施例8：((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-D-丝氨酸乙酯
参考实施例1的合成方法，将乙醇胺替换为D-丝氨酸乙酯盐酸盐，得到化合物8。1HNMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.77 (s, 1H), 7.58 – 7.52 (m, 1H), 7.51 - 7.43 (m,2H), 7.43 – 7.30 (m, 3H), 7.28 – 7.21 (m, 1H), 7.05 – 6.99 (m, 1H), 6.29 (s,1H), 4.89 (t,J= 5.7 Hz, 1H), 4.12 (q,J= 7.1 Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.74 –3.59 (m, 3H), 3.57 - 3.47 (d,J= 15.6 Hz, 1H), 3.34 – 3.28 (m, 1H), 2.12 (s,3H), 1.21 (t,J= 7.1 Hz, 3H). MS(ESI)：m/z 437.4 [M+H]+
实施例9：((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-D-丝氨酸
参考实施例7的合成方法，将化合物8水解，得到化合物9。1H NMR (400 MHz,DMSO-d 6) δ 8.83 (s, 1H), 7.57 – 7.51 (m, 1H), 7.48 – 7.42 (m, 2H), 7.40 –7.35 (m, 1H), 7.34 – 7.29 (m, 2H), 7.25 – 7.20 (m, 1H), 7.02 – 6.98 (m, 1H),6.30 (s, 1H), 3.86 – 3.78 (m, 4H), 3.74 – 3.61 (m, 3H), 3.30 (t,J= 5.0 Hz,1H), 2.10 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 409.4 [M+H]+
实施例10：((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-L-丝氨酸乙酯
参考实施例1的合成方法，将乙醇胺替换为L-丝氨酸乙酯盐酸盐，得到化合物10。1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.76 (s, 1H), 7.54 – 7.48 (m, 1H), 7.48 - 7.41 (m,2H), 7.41 – 7.34 (m, 1H), 7.34 – 7.26 (m, 2H), 7.25 – 7.17 (m, 1H), 7.02 –6.95 (m, 1H), 6.26ki (s, 1H), 4.87 (t,J= 5.7 Hz, 1H), 4.08 (q,J= 7.1 Hz, 2H),3.81 (s, 3H), 3.69 – 3.56 (m, 3H), 3.54 - 3.44 (m, 1H), 3.31 – 3.24 (m, 1H),2.08 (s, 3H), 1.17 (t,J= 7.1 Hz, 3H). MS(ESI)：m/z 437.4 [M+H]+
实施例11：((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-L-丝氨酸
参考实施例7的合成方法，将化合物10水解，得到化合物11。1H NMR (400 MHz,DMSO-d 6) δ 8.86 (s, 1H), 7.55 – 7.50 (m, 1H), 7.47 – 7.42 (m, 2H), 7.39 –7.34 (m, 1H), 7.33 – 7.29 (m, 2H), 7.24 – 7.19 (m, 1H), 7.02 - 6.97 (m, 1H),6.29 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.77 – 3.61 (m, 4H), 3.36 (t,J= 4.9 Hz, 1H), 2.09(s, 3H). MS(ESI)：m/z 409.4 [M+H]+
实施例12：((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-D-丙氨酸乙酯
参考实施例1的合成方法，将乙醇胺替换为D-丙氨酸乙酯盐酸盐，得到化合物12。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.77 (s, 1H), 7.54 – 7.49 (m, 1H), 7.49 – 7.43 (m,2H), 7.43 – 7.35 (m, 1H), 7.35 – 7.27 (m, 2H), 7.26 – 7.17 (m, 1H), 7.03 -6.96 (m, 1H), 6.24 (s, 1H), 4.15 – 4.03 (m, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.64 - .3.56(m, 1H), 3.52 – 3.43 (m, 1H), 3.33 – 3.28 (m, 1H), 2.09 (s, 3H), 1.23 – 1.14(m, 6H). MS(ESI)：m/z 421.5 [M+H]+
实施例13：((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-D-丙氨酸
参考实施例7的合成方法，将化合物12水解，得到化合物13。1H NMR (400 MHz,DMSO-d 6) δ 8.91 (s, 1H), 7.56 - 7.50 (m, 1H), 7.47 – 7.42 (m, 2H), 7.39 –7.34 (m, 1H), 7.34 – 7.28 (m, 2H), 7.26 – 7.20 (m, 1H), 7.04 – 6.99 (m, 1H),6.32 (s, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.75 – 3.70 (m, 1H), 2.10 (s, 3H),1.36 (d,J= 7.1 Hz, 3H). MS(ESI)：m/z 393.4 [M+H]+
实施例14：((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-L-丙氨酸乙酯
参考实施例1的合成方法，将乙醇胺替换为L-丙氨酸乙酯盐酸盐，得到化合物14。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.76 (s, 1H), 7.53 – 7.47 (m, 1H), 7.47 – 7.40 (m,2H), 7.40 – 7.33 (m, 1H), 7.33 – 7.27 (m, 2H), 7.25 – 7.17 (m, 1H), 7.02 -6.95 (dd,J= 7.6, 1.3 Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 4.13 – 4.03 (m, 2H), 3.81 (s,3H), 3.64 - 3.55 (m, 1H), 3.51 – 3.42 (m, 1H), 3.32 – 3.25 (m, 1H), 2.08 (s,3H), 1.24 – 1.14 (m, 6H). MS(ESI)：m/z 421.5 [M+H]+
实施例15：((6-甲氧基-2-((2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-L-丙氨酸
参考实施例7的合成方法，将化合物14水解，得到化合物15。1H NMR (400 MHz,DMSO-d 6) δ 8.84 (s, 1H), 7.57 – 7.49 (m, 1H), 7.48 – 7.42 (m, 2H), 7.39 –7.34 (m, 1H), 7.34 – 7.29 (m, 2H), 7.25 – 7.20 (m, 1H), 7.02 – 6.97 (m, 1H),6.27 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.77 – 3.72 (m, 1H), 3.67 – 3.62 (m, 1H), 3.27 –3.22 (m, 1H), 2.10 (s, 3H), 1.24 (d,J= 6.9 Hz, 3H). MS(ESI)：m/z 393.4 [M+H]+
实施例16：2-(((2-(2-氟-[1,1'-联苯]-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙基-1-醇
合成方法：
化合物M-3-2的合成：
参考实施例1中化合物M-3-1的合成方法，将3-溴-2-氟甲基苯胺替换为3-溴-2-氟苯胺，反应生成化合物M-3-2。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.72 (s, 1H), 7.83 – 7.77(m, 1H), 7.47 – 7.41 (m, 1H), 7.18 – 7.11 (m , 1H), 6.78 (s, 1H), 3.86 (s,3H), 3.86 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 356.2 [M+H]+
化合物M-4-2的合成：
参考实施例1中化合物M-4-1的合成方法，将M-3-1替换为M-3-2，反应生成化合物M-4-2。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.14 (s, 1H), 7.89 – 7.82 (m, 1H), 7.40 -7.33 (m, 1H), 7.14 – 7.08 (m, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.42 (t,J= 5.9 Hz, 1H), 4.34(d,J= 5.9, 2H), 3.83 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 328.2 [M+H]+
化合物M-5-2的合成：
参考实施例1中化合物M-5-1的合成方法，将M-4-1替换为M-4-2，反应生成化合物M-5-2。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.94 (s, 1H), 7.91 – 7.85 (m, 1H), 7.56 –7.47 (m, 4H), 7.44 – 7.38 (m, 1H), 7.26 – 7.17 (m, 2H), 6.33 (s, 1H), 5.41(t,J= 5.7 Hz, 1H), 4.36 (d,J= 5.7 Hz, 2H), 3.86 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 326.3 [M+H]+
化合物M-6-2的合成：
参考实施例1中化合物M-6-1的合成方法，将M-5-1替换为M-5-2，反应生成化合物M-6-2。1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9.36 (s, 1H), 7.87 – 7.77 (m, 1H), 7.58 –7.41 (m, 4H), 7.30 – 7.22 (m, 3H), 6.46 (s, 1H), 4.57 (s, 2H), 3.88 (s, 3H).MS(ESI)：m/z 344.3 [M+H]+
化合物16的合成
参考实施例1中化合物1的合成方法，将M-6-1替换为M-6-2，反应生成化合物16。1HNMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.96 (s, 1H), 7.94 – 7.85 (m, 1H), 7.58 – 7.48 (m,4H), 7.45 – 7.38 (m, 1H), 7.28 – 7.14 (m, 2H), 6.35 (s, 1H), 3.85 (s, 3H),3.64 (s, 2H), 3.48 (t,J= 5.7 Hz, 2H), 2.63 (t,J= 5.7 Hz, 2H). MS(ESI)：m/z369.4 [M+H]+
实施例17：N-(2-(((2-((2-氟-[1,1'-联苯基]-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙基)乙酰胺
参考实施例16的合成方法，将乙醇胺替换为N-乙酰基乙二胺，反应生成化合物17。1HNMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.94 (s, 1H), 7.92 - 7.86 (m, 1H), 7.84 – 7.77 (m,1H), 7.58 – 7.45 (m, 4H), 7.44 – 7.35 (m, 1H), 7.27 – 7.11 (m, 2H), 6.36 (s,1H), 3.85 (s, 3H), 3.59 (s, 2H), 3.17 – 3.09 (m, 2H), 2.57 (t,J= 6.5 Hz, 2H),1.79 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 410.4 [M+H]+
实施例18：3'-((4-(((2-羟乙基)氨基)甲基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-2'-甲基-[1,1'-联苯]-3-醇
合成方法：
化合物M-5-2的合成：
参考实施例1中化合物M-6-1的合成方法，将M-5-1替换为M-4-1，反应生成化合物M-5-2。1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9.23 (s, 1H), 7.56 – 7.30 (m, 2H), 7.21 –7.03 (m, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.49 (s, 2H), 3.79 (s, 3H), 2.27 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 342.2 [M+H]+
化合物M-6-2的合成：
参考实施例1中化合物1的合成方法，将M-6-1替换为M-5-2，反应生成化合物M-6-2。1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9.23 (s, 1H), 7.56 – 7.30 (m, 2H), 7.21 – 7.03(m, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.49 (s, 2H), 3.79 (s, 3H), 2.27 (s, 3H). MS(ESI)：m/z367.3 [M+H]+
将3-羟基苯硼酸(83 mg，0.6 mmol，1.2 eq)、M-5-2 (184 mg，0.5 mmol，1 eq)、Pd(dppf)Cl2 (22 mg，0.03mmol，0.06 eq)和碳酸钾(173 mg，1.25 mmol，2.5 eq)依次加入单口瓶中，之后加入二氧六环/水混合溶剂5 mL （体积比=4:1），氩气保护条件下，100℃反应16h。旋蒸除去二氧六环后，加入3 mL水，并用乙酸乙酯萃取3次（5 mL*3）。合并有机相并旋干，硅胶柱分离得到纯化的化合物18 (148 mg，收率78%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ9.50 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 7.54 – 7.47 (m, 1H), 7.25 – 7.16 (m, 2H), 6.98 –6.92 (m, 1H), 6.78 – 6.73 (m, 1H), 6.71 – 6.65 (m, 2H), 6.25 (s, 1H), 4.56(t,J= 5.5 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.59 (s, 2H), 3.48 (q,J= 5.5 Hz, 2H), 2.62(t,J= 5.5 Hz, 2H), 2.09 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 381.4 [M+H]+
实施例19：2-(((6-甲氧基-2-((3'-甲氧基-2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙基-1-醇
参考实施例18的合成方法，将3-羟基苯硼酸替换为3-甲氧基苯硼酸，反应生成化合物19。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.73 (s, 1H), 7.55 – 7.49 (m, 1H), 7.40 -7.35 (m, 1H), 7.24 – 7.17 (m, 1H), 7.02 - 6.96 (m, 1H), 6.96 - 6.90 (m, 1H),6.89 – 6.83 (m, 1H), 6.83 – 6.79 (m, 1H), 6.25 (s, 1H), 4.52 (brs, 1H), 3.80(s, 2H) 3.78 (s, 6H), 3.56 (s, 2H), 3.47 (q,J= 5.5 Hz, 2H), 2.59 (t,J= 5.5Hz, 2H), 2.09 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 395.4 [M+H]+
实施例20：2-(((2-((4'-氟-2-甲基-[1,1'-联苯]-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙基-1-醇
参考实施例18的合成方法，将3-羟基苯硼酸替换为4-氟苯硼酸，反应生成化合物20。1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.78 (s, 1H), 7.57 – 7.48 (mz, 1H), 7.39 – 7.28(m, 3H), 7.27 – 7.18 (m, 2H), 7.02 - 6.93 (m, 1H), 6.26 (s, 1H), 3.80 (s,3H), 3.59 (s, 2H), 3.51 – 3.46 (m, 2H), 2.62 (t,J= 5.7 Hz, 2H), 2.08 (s, 3H).MS(ESI)：m/z 383.4 [M+H]+
实施例21：2-(((2-((2,2'-二甲基-[1,1'-联苯基]-3-基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙基-1-醇
参考实施例20的合成方法，将3-羟基苯硼酸替换为2-甲基苯硼酸，反应生成化合物21。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.73 (s, 1H), 7.53 – 7.47 (m, 1H), 7.31 –7.17 (m, 4H), 7.09 – 7.03 (m, 1H), 6.89 - 6.83 (m, 1H), 6.25 (s, 1H), 4.52(brs, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.56 (s, 2H), 3.50 -3.46 (m, 2H), 2.59 (t,J= 5.7 Hz,2H), 2.02 (s, 3H), 1.87 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 379.4 [M+H]+
实施例22：2-(((2-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二恶英-6-基)-2-甲基苯基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙基-1-醇
参考实施例18的合成方法，将3-羟基苯硼酸替换为苯并-1,4-二氧六环-6-硼酸，反应生成化合物22。1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.73 (s, 1H), 7.53 – 7.44 (m,1H), 7.17 (t,J= 7.8 Hz, 1H), 6.99 – 6.87 (m, 2H), 6.77 – 6.69 (m, 2H), 6.25(s, 1H), 4.27 (s, 4H), 3.80 (s, 3H), 3.59 (s, 2H), 3.51 – 3.45 (m, 2H), 2.62(t,J= 5.7 Hz, 2H), 2.09 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 423.5 [M+H]+
实施例23：N-(2-(((2-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二恶英-6-基)-2-甲基苯基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙基)乙酰胺
参考实施例18的合成方法，将乙醇胺替换为N-乙酰基乙二胺，反应生成化合物23。1HNMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 8.71 (s, 1H), 7.89 – 7.79 (m, 1H), 7.53 - 7.43 (m,1H), 7.17 (t,J= 7.8 Hz, 1H), 6.99 – 6.85 (m, 2H), 6.78 -6.69 (m, 2H), 6.26(s, 1H), 4.27 (s, 4H), 3.80 (s, 3H), 3.55 (s, 2H), 3.13 (q,J= 6.3 Hz, 2H),2.57 (t,J= 6.3 Hz, 2H), 2.09 (s, 3H), 1.79 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 464.5 [M+H]+
实施例24：5-(3-((4-(((2-羟乙基)氨基)甲基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-2-甲基苯基)-2,3-二氢-1H-茚酮-1-酮
参考实施例18的合成方法，将3-羟基苯硼酸替换为5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)-2,3-二氢-1H-茚-1-酮，反应生成化合物24。1H NMR (400 MHz,DMSO-d 6) δ 8.78 (s, 1H), 7.70 – 7.64 (m, 1H), 7.63 – 7.59 (m, 1H), 7.58 –7.54 (m, 1H), 7.50 – 7.46 (s, 1H), 7.26 – 7.20 (m, 1H), 7.03 – 6.97 (m, 1H),6.26 (s, 1H), 5.76 (s, 1H), 4.53 (brs, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.57 (s, 2H), 3.51- 3.44 (m, 2H), 3.18 – 3.13 (m, 2H), 2.72 – 2.67 (m, 2H), 2.60 (t,J= 5.7 Hz,2H), 2.08 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 419.4 [M+H]+
实施例25：7-(3-((4-(((2-羟乙基)氨基)甲基)-6-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-2-甲基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮
参考实施例18的合成方法，将3-羟基苯硼酸替换为7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯并二氢吡喃-4-酮，反应生成化合物25。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6)δ 8.79 (s, 1H), 7.78 – 7.74 (d,J= 2.0 Hz, 1H), 7.56 – 7.49 (m, 2H), 7.47 –7.41 (m, 1H), 7.26 - 720 (m, 1H), 7.00 - 6.96 (m, 1H), 6.26 (s, 1H), 4.51 (t,J= 5.4 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.56 (s, 2H), 3.47 (q,J= 5.4 Hz, 2H), 3.00 (t,J= 6.0 Hz, 2H), 2.66 – 2.61 (m, 2H), 2.59 (t,J= 5.4 Hz, 2H), 2.14 - 2.08 (m,2H), 2.08 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 435.4 [M+H]+
实施例26：2-(((2-((3-(1H-吲唑-4-基)-2-甲基苯基)氨基)-6-甲氧基嘧啶-4-基)甲基)氨基)乙基-1-醇
参考实施例18的合成方法，将3-羟基苯硼酸替换为4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吲唑，反应生成化合物26。1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 13.20 (s,1H), 8.77 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.64 – 7.50 (m, 2H), 7.48 – 7.37 (m, 1H),7.32 – 7.21 (m, 1H), 7.13 – 7.04 (m, 1H), 7.02 - 6.94 (m, 1H), 6.28 (s, 1H),4.56 (brs, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.62 (s, 2H), 3.52 – 3.45 (m, 2H), 2.63 (t,J=5.7 Hz, 2H), 2.01 (s, 3H). MS(ESI)：m/z 405.4 [M+H]+
实施例27
生物活性评估
2.1本发明的化合物对PD-1/PD-L1蛋白-蛋白相互作用的抑制活性评价
采用TR-FRET assay(Time-Resolved Fluorescence Resonance EnergyTransfer，时间分辨荧光共振能量转移)的方法，对本发明所有合成的实施例化合物进行了PD-1/PD-L1蛋白-蛋白相互作用的抑制活性测试，确定各个化合物的抑制活性。检测试剂盒购买于BPS Bioscience公司。
实验材料：PD-1-Eu、PD-L1-Biotin及Dye labeled acceptor购自于BPSBioscience公司；384孔细胞培养板购自Perkin Elmer公司。
实验步骤：
受试化合物的起始测试浓度为10uM，3倍稀释，得到10个浓度梯度溶液，加入384孔板中作为实验组，等量的DMSO加入至阴性对照孔和阳性对照孔中，复孔检测。在化合物孔和阳性对照孔分别加5μL的4倍终浓度的PD-L1-Biotin溶液（用1×modified TR-FRET assaybuffer配制）；在阴性对照孔中加5μL的1×modified TR-FRET assay buffer。1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育15分钟。每孔加入PD-1-Eu（含5μL的4倍终浓度的PD-1-Eu，用1×modified TR-FRET assay buffer配制）和2倍终浓度的Dye labeled acceptor混合溶液（含10μL 2倍终浓度的Dye labeled acceptor，用1×modified TR-FRET assay buffer配制）。1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育90分钟。将384孔板1000rpm离心30秒，振荡混匀后用EnVision酶标仪读取665nm和620nm的荧光强度，并计算TR-FRET ratio (665 nmemission/620 nm emission)。使用Graphpad prism软件计算化合物的IC50。活性测试结果见表1。
下表为化合物阻断PD-1/PD-L1相互作用的活性范围（编号1-26代表实施例1-26制备的化合物）。范围如下：A＝1-100 nM；B＝100.01-1000 nM；C＝1001-3000 nM。
表1 化合物阻断PD-1/PD-L1的相互作用
编号 PD-L1 (nM) 编号 PD-L1 (nM)
1 A 14 C
2 A 15 B
3 B 16 A
4 B 17 A
5 B 18 B
6 B 19 B
7 A 20 C
8 B 21 A
9 B 22 A
10 B 23 B
11 B 24 C
12 C 25 B
13 B 26 B
2.2 本发明的化合物对VISTA蛋白的亲和力测试
采用微量热泳动法（Microscale thermophoresis，MST），测试本发明所有合成的实施例化合物与VISTA蛋白的亲和力。
实验材料：试剂盒：Monolith TM Series Protein Labeling Kit RED-NHS 2ndGeneration；毛细管：MO-K022 Monolith NT.115 Capillaries Lot: 899917；缓冲液：pH7.4， 10 mM HEPES，150 mM NaCl；蛋白：糖基化修饰的VISTA蛋白（将带有天然信号肽的人源VISTA胞外区(Met1-Ala194)克隆到含C端6xHis-Tag的真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建hVISTA-His表达质粒，并转化至E.coli TOP10感受态细胞（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成转化）。将无内毒素大提的pcDNA3.1(+)-hVISTA-His质粒（南京诺唯赞生物科技有限公司，Cat. DC 202-01）转染到Expi293F细胞（南京大学提供）中，置于37℃，5% CO2培养箱中120 rpm振荡培养96 h。将培养96 h后的细胞混悬液2000 rpm离心20 min后收集上清并浓缩至100 mL。将浓缩后的上清进行His-tag镍柱纯化以及分子筛（HiLoadTM16/600SuperdexTM200 pg）纯化，得到糖基化的VISTA蛋白。
实验机型：Monolith NT.115
实验步骤：
用缓冲液配置10 µM浓度的VISTA蛋白溶液，并按照MonolithTM RED-NHS二代蛋白标记试剂盒说明书标记蛋白。小分子化合物经过倍比稀释，配置成浓度范围从500 µM至0.0153 µM的化合物溶液，室温条件下，将化合物溶液与标记好的蛋白溶液按 1:1 比例混合均匀并孵育 10min，随后将样品加入毛细管中，开始实验。采用 MO. Affinity Analysisv2.2.4 软件（Nano Temper Technologies）进行数据处理，得到化合物与VISTA蛋白的亲和力数值，见表2。下表为化合物与VISTA蛋白亲和力的活性范围（编号1-26代表实施例1-26制备的化合物）。范围如下：A＝0.001-1 μM；B＝1.01-20 μM；C＝20.01-100 μM。
表2 化合物与VISTA蛋白的亲和力
编号 VISTA (μM) 编号 VISTA (μM)
1 A 14 C
2 B 15 A
3 A 16 A
4 B 17 B
5 C 18 C
6 B 19 B
7 A 20 B
8 B 21 B
9 A 22 B
10 B 23 B
11 A 24 B
12 C 25 B
13 A 26 C
2.3 化合物对VISTA相互作用抑制效果的测定：
实验材料：ELISA试剂盒购于北京四正柏生物科技有限公司（Cat. CHE0017），用于检测IFN-γ的释放量；抗人源CD3抗体采购于Thermo Fisher Scientific；重组人源VISTA-Fc蛋白及IgG-Fc蛋白由本课题组表达纯化获得（将无内毒素大提的pcDNA3.1-VISTA-Fc质粒和 pcDNA3.1-IgG-Fc质粒（南京诺唯赞生物科技有限公司，Cat. DC 202-01）转染到Expi293F（南京大学提供）细胞中，置于37℃，5% CO2培养箱中120 rpm振荡培养96 h。将培养96 h后的细胞混悬液2000 rpm，离心20 min后收集上清并浓缩至100 mL。将浓缩后的上清进行protein A柱纯化以及分子筛（HiLoadTM16/600 SuperdexTM200 pg）纯化，得到最终的重组人源VISTA-Fc蛋白及IgG-Fc蛋白）；PBMC细胞购自妙顺（上海）生物科技有限公司；96孔板。
实验仪器：多功能酶标仪
实验步骤：
1、用无菌PBS（南京凯基生物科技发展有限公司，Cat No:KGB5001）配制含有CD3与VISTA-Fc或IgG-Fc（对照）混合液。加入96孔板中4℃过夜孵育。
2、用移液枪吸出混合液，轻轻加入1640培养基清洗两次，弃去培养基。
3、用培养基分别稀释实施例1、3、11、13制备的化合物，在96孔板中分别加入DMSO对照以及含化合物（500 nM）的培养基。
4、1 h后向96孔板中加入含有CD28抗体的PBMC细胞悬液。
5、经37℃，5% CO2培养72 h，采用Elisa试剂盒检测INF-γ确定其分泌水平的变化。
实验结果：由图1可见，制备得到的化合物可阻断VISTA通路，恢复IFN-γ的释放。

Claims (8)

1.一种通式如下式（I）所示的杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体：
，
（I）
其中，环A为苯环；
X1为N；
X2、X3为N ；
X4为C；
R1为C1-C4烷基；
R2选自H或C1-C4烷基；
R3选自以下任意一种：
，
t是0、1、2、3或4；
R5选自：H或C1-C4烷基；
R6选自：H或C1-C4烷基；
R7选自：H或C1-C4烷基；
R8选自：H或C1-C4烷基；
所述W选自：卤素或C1-C4烷基；
每个R4独立的选自：卤素、-OH、-RC、-ORC；
n是0、1或2；
RC为非取代的C1-C4烷基。
2.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、消旋体，其特征在于，所述W选自甲基或卤素。
3.化合物或其药学上可接受的盐、消旋体，其特征在于，所述化合物如下所示：
。
4.一种权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、消旋体的制备方法，其特征在于，当所述式（I）化合物中的X1、X2、X3均为N，X4为C时，所述化合物的合成包括以下步骤：
，
Ⅱ
（1）化合物C1和C2在碱的作用下反应生成C3；
（2）化合物C3经还原剂还原，得到化合物C4；
（3）化合物C4与芳基/取代芳基硼酸经Suzuki偶联反应，得到化合物C5；
（4）化合物C5与二氯亚砜等试剂发生卤化反应，得到化合物C6；
（5）化合物C6与HNR2R3在碱性条件下，反应生成终产物Ia。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体在制备具有PD-1/PD-L1抑制活性的抑制剂中的应用。
6.一种如权利要求1-3任一项所述的杂环类化合物或其药学上可接受的盐、消旋体在制备具有VISTA抑制活性的抑制剂中的应用。
7.根据权利要求5-6任一项所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂治疗的疾病包括自身免疫性疾病、癌症及感染性疾病；所述的癌症选自肺癌、血液肿瘤、消化系统肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、神经系统肿瘤、泌尿系肿瘤、皮肤癌；所述的感染性疾病选自细菌及病毒感染；所述的自身免疫性疾病选自器官特异性以及系统性自身免疫病。
8.一种药用组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的通式（I）化合物或其药学上可接受的盐、消旋体以及药学上可接受的载体。
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