CN108245687A

CN108245687A - 一种IpostC在抗肠再灌注损伤中所起作用的实验方法

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Publication number: CN108245687A
Application number: CN201611271893.9A
Authority: CN
Inventors: 贾中芝
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-12-29
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2018-07-06

Abstract

本发明公开了一种IpostC在抗肠再灌注损伤中所起作用的实验方法，包括以下步骤：肠IPostC对HIF‑1α和miR‑21表达的影响、HIF‑1α对miR‑21的调控、miR‑21在IPostC下的作用和HIF‑1α和miR‑21在IPostC下的作用机制。本发明针对临床上缺乏有效的防治肠再灌注损伤这一难点入手，从分子、细胞和组织水平，通过构建SD大鼠I/R损伤模型，充分证实了HIF‑1α和miR‑21在肠IPostC抗再灌注损伤中的作用和机制，为防治肠再灌注损伤提供新方法和新靶点。

Description

一种IpostC在抗肠再灌注损伤中所起作用的实验方法

技术领域

本发明涉及一种IpostC在抗肠再灌注损伤中所起作用的实验方法。

背景技术

肠缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤是临床上常见的危重疾病，病理表现主要为小肠上皮细胞凋亡。严重感染、烧伤、急性失血、创伤、休克、肠系膜动脉病变、肠移植等多种疾病均可导致肠I/R损伤。肠I/R损伤不仅可以引起肠粘膜屏障功能受损、肠坏死，而且可以激发机体免疫反应，造成大量相关炎症介质和细胞因子释放，导致全身性炎症反应综合征，甚至多器官功能障碍综合征，死亡率在60％～80％。在肠I/R损伤的救治过程中，所有患者均存在不同程度的再灌注损伤，部分患者出现肠坏死、感染性休克，甚至脓毒血症，最终危及患者生命。因此，肠再灌注损伤的防治一直以来都是医学研究领域中亟待解决的难题。

现有研究表明，HIF-1和miR-21在肾脏缺血中具有重要的抗再灌注损伤作用。HIF-1作为调节氧稳态的核心转录因子，广泛地表达于哺乳动物的各种组织细胞，能激活多种低氧反应性基因的表达，促进机体和细胞对缺氧缺血的耐受，在机体的病理和生理过程中起着关键作用。HIF-1是由缺氧敏感性的α-亚单位 (HIF-1α)和基础表达的β-亚单位(HIF-1β)形成的异二聚体，其中IF-1α是主要的功能亚基，对HIF-1的转录活性起关键作用。因此，目前有关HIF-1的研究大部分集中在其功能亚基HIF-1α上。HIF-1α对机体缺氧耐受具有至关重要的作用。研究证实，在缺血的肠粘膜组织中，HIF-1α表达明显增高。

而miR-21在众多肿瘤中呈现出癌基因样的作用，在肿瘤的发生发展、增殖、凋亡、耐药、侵袭、转移等多种生物学行为中发挥着重要的作用，同时它也是一个重要的预后预测因子。在缺血的肠粘膜组织中，HIF-1α表达明显增高，HIF-1 α可通过与启动子结合转录调控miR-21，miR-21通过抑制PDCD4、FasL等促凋亡靶点而实现抗凋亡作用。

因此推测，在IPostC抗肠再灌注损伤中，HIF-1α可能通过调控miR-21，靶作用于促凋亡基因PDCD4、FasL抑制凋亡，发挥抗再灌注损伤的保护作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种IpostC在抗肠再灌注损伤中所起作用的实验方法，以研究HIF-1α和miR-21在肠IPostC抗再灌注损伤中的作用和机制，为防治肠再灌注损伤提供新方法和新靶点。

本发明所采用的技术方案如下：

一种IpostC在抗肠再灌注损伤中所起作用的实验方法，包括以下步骤：

1)、肠IPostC对HIF-1α和miR-21表达的影响

构建SD大鼠I/R损伤模型，检测IPostC下HIF-1α和miR-21的表达情况；

2)、HIF-1α对miR-21的调控

CoCl₂处理小肠上细胞株IEC-6，观察HIF-1α、miR-21的表达情况

3)、miR-21在IPostC下的作用

利用SD大鼠构建I/R损伤模型，IPostC前用anti-miR-21或anti-scrambled 干预大鼠，观察标本大体，进行病理形态学、细胞凋亡水平、肠组织湿/干比重 (W/D)分析，检测miR-21的表达情况；

4)、HIF-1α和miR-21在IPostC下的作用机制

利用HIF-1α基因沉默的SD大鼠构建I/R损伤模型，IPostC前用 anti-miR-21或anti-scrambled干预大鼠，观察标本大体，进行病理形态学、细胞凋亡水平、肠组织湿/干比重(W/D)分析，检测对HIF-1α、miR-21的表达情况；检测对靶基因PDCD4、Fas-L表达情况的影响。

上述实验方法包括体外实验和体内实验。其中，体外实验选用大鼠小肠隐窝上皮细胞-IEC-6，包括如下主要步骤：

1)、IEC-6细胞体外培养

2)、CoCI₂化学缺氧法模拟缺氧环境

3)、IEC-6细胞基因转染

4)、IEC-6细胞凋亡水平检测

5)、IEC-6细胞基因表达测定

体内实验选用大鼠肠R/I损伤模型，包括如下步骤：

1)、SD大鼠I/R损伤模型构建

2)、标本制备

3)、检测指标

检测指标包括大体观察、病理形态学变化及细胞调亡水平，肠组织湿/干比重以及HIF-1α、miR-21、PDCD4、FasL及各通路蛋白表达检测。

进一步地，上述体内试验中SD大鼠I/R损伤模型构建具体如下：

复制大鼠肠R/I损伤模型：动物禁食12h，不禁水，称重，腹腔注射20％乌拉坦(1g/kg)麻醉。麻醉成功后肌肉松弛，角膜反射减弱，心跳呼吸平稳，仰卧固定于操作板上。具体方法如下：严格按无菌操作，消毒后取剑突下、腹正中切口长约3cm进腹，用温盐水纱布将小肠及结肠推向左下腹，轻柔分离周围组织，暴露右肾内上方的肠系膜根部，找到肠系膜上动脉，无创血管夹夹闭，观察到SMA搏动消失及肠壁色泽变苍白的同时开始肠缺血计时，缺血至预定的观察时间后准时松开血管夹，观察SMA搏动恢复、肠壁变潮红及坏死情况。待肠壁变潮红，再次丝线全层缝合暂时关腹。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

本发明针对临床上缺乏有效的防治肠再灌注损伤这一难点入手，从分子、细胞和组织水平，通过构建SD大鼠I/R损伤模型，充分证明了IpostC通过使 HIF-1α的表达升高-HIF-1α的高表达促进了miR-21的表达-miR-21的高表达靶作用于PDCD4、FasL基因来抑制肠上皮细胞凋亡而发挥抗缺血再灌注损伤的保护作用，从而为防治肠再灌注损伤提供新方法和新靶点。

具体实施方式

为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

如无具体说明，本发明的各种原料均可以通过市售得到；或根据本领域的常规方法制备得到。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练入员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。除非另外说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。

1)、肠IPostC对HIF-1α和miR-21表达的影响

2)、HIF-1α对miR-21的调控

CoCl₂处理小肠上细胞株IEC-6，观察HIF-1α、miR-21的表达情况

3)、miR-21在IPostC下的作用

4)、HIF-1α和miR-21在IPostC下的作用机制

上述实验方法包括体外实验和体内实验。

其中，体外实验选用大鼠小肠隐窝上皮细胞-IEC-6，包括如下步骤：

(1)IEC-6细胞体外培养

IEC-6细胞在37℃、10％CO₂、90％O₂、90％相对湿度的CO₂培养箱中培养，DMEM培养液，包含1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺和0.4mmol/L碳酸氢钠。将培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70％酒精并擦拭，移入无菌操作台内。取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿，否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1min内全部融化后，以70％ethanol擦拭冷冻管外部，移入无菌操作台内。当形成单层细胞后，进行定期传代，培养液每天更换1次。细胞经稳定传代20～40代后用于实验。

(2)CoCI₂化学缺氧法模拟缺氧环境

将生长状态良好的IEC-6细胞以1×105/L密度接种于6孔板于37℃、5％

CO₂、饱和湿度培养箱中培养24h后，加入150μmol/L CoCl₂溶液，用于模拟缺氧环境。

(3)IEC-6细胞基因转染

①HIF-1α siRNA载体的构建：构建HIF-1α siRNA特异性载体，利用小分子RNA干扰技术沉默IEC-6细胞HIF-1α基因。根据前期实验研究，选择GenBank中大鼠HIF-1α基因编码区序列作为分析序列。采用RNAdraw分析软件对序列的二级结构进行预测，然后按照EIbashir等推荐的siRNA设计原则进行设计，并筛选出一条HIF-1α靶核苷酸序列(靶mRNA)：P1，5′-GAA ACU CUU CCAAGC AAU Utt-3′(SEQ ID NO：1)；P2，5′-AAU UGC UUG GAA GAGUUU Ctt-3′(SEQ ID NO：2)。参照siRNA的基本设计原理选择靶序列，针对目的基因的序列设计互补的siRNA表达载体核苷酸链，即HIF-1α siRNA 特异性干扰序列。将siRNA溶液与脂质体LipofectamineTM 2000载体试剂混合，形成siRNA/LipofectamineTM 2000载体复合物。

细胞转染：6孔板种植细胞1×10⁵/L，在含10％胎牛血清的BPMI-1640培养液中培养24h，细胞汇合度达到30％-50％，将稀释好的HIF-1α siRNA和脂质体LipofectamineTM2000载体试剂混合，形成HIF-1α siRNA/ LipofectamineTM 2000复合物。将HIF-1α siRNA转染载体加到含有细胞和培养基的培养板的孔中融合，然后放入37℃、CO₂培养箱培养。6h后换含10％血清的RPMI-1640培养液，20h恢复生长后，荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白的表达以检测转染效率。

转染分组：空白对照组(HIF-1α control组)：仅加入LipofectamineTM 2000 试剂。转染组(HIF-1α siRNA组)：转染HIF-1α siRNA序列入细胞。

②miR-21过表达与沉默：分别构建miR-21 mimic和inhibitor，参照上述

方法，利用LipofectamineTM 2000瞬时转染IEC-6细胞。转染分组：空白对照组(control组)：仅加入LipofectamineTM 2000试剂；转染组：转染miR-21 mimic组和转染miR-21 inhibitor组。

(4)IEC-6细胞凋亡水平检测

流式细胞仪分析细胞凋亡率，分别收集各组培养的IEC-6细胞，磷酸盐缓

冲液(PBS)洗涤后，用0.25％胰酶消化液制备单细胞悬液，以75％冷乙醇固定，置4℃保存。向固定的细胞悬液中加入PBS，轻轻混匀，1 000r/min离心5min，去除固定液。再以PBS洗一次。加入RNaseA和PI染色液4℃避光染色30min后，用流式细胞仪检测分析细胞DNA含量，计算凋亡细胞百分率和凋亡峰，此峰的大小即代表凋亡细胞的多少。

IEC-6细胞形态观察，Hoechst 33258染色法：吸尽培养液，加入0.5ml 4％多聚甲醛固定细胞10min；去除固定液，用M PBS洗2次；加入0.5ml Hoechst 33258染色液(10mg/L)37℃染色15min；去染色液，用M PBS洗2次，去除过多的染色背景；荧光显微镜下观察(激发波长为350nm，发射波长为460 nm)，细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染为凋亡阳性细胞。

(5)IEC-6细胞基因表达测定

①IEC-6细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达

Real-time RT-PCR检测mRNA水平：TRIzol法提取6孔板内各组细胞的总NSFC 2014RNA并定量；各样本取2ng-2μg总RNA，按TaKaRa公司试剂盒说明进行逆转录合成cDNA。应用RT-PCR检测，β-action作为内参照。 PCR引物，HIF-1α正义链ACT GCA CAG GCC ACA TTC AT(SEQ ID NO：3)，反义链CGA GGC TGT GTC GACTGA GA(SEQ ID NO：4)；β-action正义链CCTAGG CAC CAG GGT GTG AT(SEQ ID NO：5)，β-action反义链TTG GTG ACA ATG CCG TGT TC(SEQ ID NO：6)。反应体系为20μL总体系，反应条件95℃ 3min预变性，95℃ 10s，55℃ 30s，39个循环，扩增产物于 2％琼脂糖凝胶进行电泳，UVP扫描并分析结果。

Western blot检测蛋白水平：冷PBS洗涤细胞2次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10min收获蛋白。将抽提蛋白用BCA法定量后，于100V泳道进行 SDSPAGE；电泳结束后，以30mA、120min将蛋白转移至NC膜；封闭液 (5％BSA/TBST)封闭60min，加入相应的一抗4℃过夜，羊抗兔的二抗室温下杂交120min，TBST洗膜3次后，ECL试剂盒进行发光反应，压片、显影、定影，观察蛋白印迹，并进行图像分析。

②IEC-6细胞miR-21的表达

③靶基因PDCD4、FasL及通路蛋白mRNA和蛋白表达

体内实验包括如下步骤：

(1)动物模型制备

无特殊病原菌级健康Sprague-Dawley(SD)成年雄性大鼠，体重220-250g，由同济大学医学院动物实验中心提供，HIF-1α基因沉默大鼠已经定购于南方模式动物中心。Anti-miR-21或Anti-scrambled干预处理组大鼠，在缺血后给予向运管的LNA-anti-miR处理。

(2)标本制备

各组动物分别于再灌注1h、6h、12h、24h，各取8只大鼠，乌拉坦麻醉后仰卧位固定于鼠台上，腹部消毒后剖腹。在无菌条件下，取距回盲部2cm以上的小肠组织约3cm：经10％福尔马林固定，HE染色，光学显微镜观察小肠组织的损伤程度。纵向剪开肠腔，用载波片轻轻刮取并收集小肠粘膜，立即-70℃分装冻存待测。

(3)检测指标及方法

检测指标包括大体观察、病理形态学变化及细胞调亡水平，肠组织湿/干比重(W/D)及HIF-1α、miR-21、PDCD4、FasL及各通路蛋白表达检测。

1)大体观察

肉眼观察大鼠一般体征及肠管色泽、水肿和蠕动等状况。

2)组织固定及HE染色

①取材、固定：将小肠从10％福尔马林溶液中取出、展平，取完整一圈小

肠放入10％福尔马林缓冲液中固定。

②脱水：70％酒精30min，80％酒精45min，95％酒精30min，95％酒精 40min，100％酒精30min，100％酒精40min，二甲苯I 10min，二甲苯II 10min 脱水。

③浸蜡：在软石蜡中30min，硬石蜡I中1h，硬石蜡II中1h浸蜡。

④包埋：倾石蜡于玻璃板上的包埋框内，标本按切面朝下置于包埋框内的溶蜡内，待蜡块冷却凝固。

⑤切片：石蜡切片机冠状连续切片，片厚5μm。

⑥染色：切片经蒸馏水洗涤后，移入Harris苏木素染液3min，浸染胞核，蒸馏水洗去多余染液；移入1％盐酸酒精15s，流水冲洗，5％伊红酒精溶液复染胞浆3-5min。

⑦脱水、透明、封片：梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

3)光镜观察和病理学评分

光学显微镜下观察小肠粘膜形态结构变化程度，评分采用Chiu氏6级评分法，采用双盲法对管腔园周所有绒毛逐个评分，取平均值，即为该标本得分。

4)细胞调亡水平的检测

采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测。

①采用免疫组化防脱载玻片捞片，置56℃烤箱烤片20min。

②切片经二甲苯I 10min，二甲苯II 10min，95％酒精I 5min，95％酒精 II 5min浸泡，蒸馏水洗；PBS液浸5min。

③配制0.01M梓檬酸钠缓冲液(0.1M梓檬酸三钠+0.1M梓檬酸，稀释 10倍)。

④切片置于缓冲液中，微波修复2min；室温中自然冷却；PBS浸5min。

⑤按试剂盒说明书新鲜配制TUNEL反应液。

⑥置切片于湿盒中，添加反应液，37℃标记1h；PBS洗3次。

⑦水溶性封片剂+中性树胶封片；显微镜检并拍照。

⑧TUNEL结果分析：以细胞核染色为阳性细胞，即调亡的肠粘膜细胞；

随机选取12个高倍视野(×400)，计数TUNEL阳性细胞数。

5)肠组织W/D比值测定

取肠组织，吸干表面水分后称重，为湿重(W)。置80℃恒温箱，干燥 24h至恒重后再称重，为干重(D)。计算肠组织湿重与干重比值(W/D)，表示肠组织水肿形成情况，间接反映肠粘膜毛细血管的通透性。

6)标本的HIF-1α、miR-21、PDCD4、Fas-L及各通路蛋白测定

组织总蛋白的提取及定量：大鼠于各实验时间点处死后，取标本用生理盐水冲洗并擦干表面血迹和水分。每100mg肠组织剪碎后匀浆器匀浆，加入 0.5ml裂解液于Eppendorf管中裂解30min，注意须冰上操作，然后4℃ 12000r/min离心10min，吸取上清转移至新Eppendorf管中，考马斯亮蓝法蛋白定量，保存于-70℃冰箱待用。

组织mRNA的提取及定量：取出肠组织，在液氮中研磨成细粉末状，趁液

氮尚未完全挥发时，迅速将研磨好的肠组织装入经过DEPC处理的EP(2.0 ml)管中。每100mg肠组织加入1ml裂解液，剧烈震荡混匀，室温下孵育10 min。4℃离心：12 000r/min，离心10min，小心取上清液转入一个新的RNase free EP管中。每1ml裂解液加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，剧烈震荡15s后，在室温下孵育3min。加入等体积异丙醇(约400-500μl)，混匀后室温放置20 min。4℃，12 000r/min，离心10min。样品分成三层：下层有机相，中间层和上层无色水相，RNA存在于上层水相中。水相容积大约是所加裂解液体积的 60％，把上层水相转移到新的RNase free EP管中。加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀，将EP管中的液体转移到吸附柱中(吸附柱套在收集管内)。4℃，1 2000 r/min，离心1min，弃掉废液。将吸附柱重新套回收集管。加入500μl漂洗液， 4℃，12000r/min，离心1min，弃掉废液。将吸附柱放回空收集管中，4℃，13 000 r/min，离心2min，尽量去除漂洗液。加入500μl漂洗液，4℃，12000r/min，离心1min，弃掉废液。重复该步骤1次。取出吸附柱放入一个新的RNase free EP管中，根据沉淀的多少，加入30-50μl DEPC处理的双蒸水溶解RNA。室温下放置2min，4℃，12000r/min，离心2min。取出5μl洗脱液(含RNA) 进行光密度值(OD值)测量，另取5μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。余下的RNA 放入-70℃冰箱中备用。

Claims

1.IpostC在抗肠再灌注损伤中所起作用的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、肠IPostC对HIF-1α和miR-21表达的影响

2)、HIF-1α对miR-21的调控

CoCl₂处理小肠上细胞株IEC-6，观察HIF-1α、miR-21的表达情况

3)、miR-21在IPostC下的作用

利用SD大鼠构建I/R损伤模型，IPostC前用anti-miR-21或anti-scrambled干预大鼠，观察标本大体，进行病理形态学、细胞凋亡水平、肠组织湿/干比重分析，检测miR-21的表达情况；

4)、HIF-1α和miR-21在IPostC下的作用机制

利用HIF-1α基因沉默的SD大鼠构建I/R损伤模型，IPostC前用anti-miR-21或anti-scrambled干预大鼠，观察标本大体，进行病理形态学、细胞凋亡水平、肠组织湿/干比重分析，检测对HIF-1α、miR-21的表达情况；检测对靶基因PDCD4、Fas-L表达情况的影响。

2.如权利要求1所述的一种IpostC在抗肠再灌注损伤中所起作用的实验方法，其特征在于，所述实验方法包括体外实验和体内实验。

3.如权利要求2所述的一种IpostC在抗肠再灌注损伤中所起作用的实验方法，其特征在于，所述体外实验选用大鼠小肠隐窝上皮细胞-IEC-6，包括如下步骤：

1)、IEC-6细胞体外培养

2)、CoCI₂化学缺氧法模拟缺氧环境

3)、IEC-6细胞基因转染

4)、IEC-6细胞凋亡水平检测

5)、IEC-6细胞基因表达测定。

4.如权利要求2所述的一种IpostC在抗肠再灌注损伤中所起作用的实验方法，其特征在于，所述体内实验选用大鼠肠R/I损伤模型，包括如下步骤：

1)、SD大鼠I/R损伤模型构建

2)、标本制备

3)、检测指标

5.如权利要求4所述的一种IpostC在抗肠再灌注损伤中所起作用的实验方法，其特征在于，所述SD大鼠I/R损伤模型构建如下：

大鼠禁食后腹腔注射20％乌拉坦麻醉；麻醉成功后肌肉松弛，角膜反射减弱，心跳呼吸平稳，仰卧固定于操作板上；严格按无菌操作，消毒后取剑突下、腹正中切口长3cm进腹，用温盐水纱布将小肠及结肠推向左下腹，轻柔分离周围组织，暴露右肾内上方的肠系膜根部，找到肠系膜上动脉，无创血管夹夹闭，观察到SMA搏动消失及肠壁色泽变苍白的同时开始肠缺血计时，缺血至预定的观察时间后准时松开血管夹，观察SMA搏动恢复、肠壁变潮红及坏死情况；待肠壁变潮红，再次丝线全层缝合暂时关腹。