CN108220353B - 一种利用重组枯草芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用重组枯草芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法，属于微生物基因工程技术领域。本发明通过敲除枯草芽孢杆菌电子传递链中低能量耦合的细胞色素bd基因cydA或使细胞色素bd基因编码蛋白的功能失活，从而提高了枯草芽孢杆菌能量再生效率，使细胞内的ATP浓度获得了明显提高，从而显著提高了聚谷氨酸的产量，具有重要的工业应用前景。

Description

一种利用重组枯草芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法
技术领域
本发明属于微生物基因工程与发酵技术领域，具体地说，涉及一种利用重组枯草芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法。
背景技术
聚谷氨酸是由L-或者D-谷氨酸通过γ-酰胺键聚合而成的高分子物质，具有良好的成模性和极强的吸水性。与其他的生物材料相比，聚谷氨酸具有及其良好的生物可降解性，对人体和环境无害等优点，因此其广泛地应用于食品、化妆品、医药、农业和水处理等领域。目前，聚谷氨酸的生产主要是通过微生物发酵法，典型的聚谷氨酸发酵微生物包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。在聚谷氨酸的生物合成过程中，L-谷氨酸主要在谷氨酸异构酶的作用下转变成D-型谷氨酸，再通过聚谷氨酸合成酶的催化下形成γ-聚谷氨酸。谷氨酸聚合成聚谷氨酸的过程需要消耗大量的ATP，因此提高ATP的合成对于提高聚谷氨酸的产量具有重要的意义。
在有氧条件下，枯草芽孢杆菌ATP的合成主要是通过电子传递链来实现的。在电子传递链过程中，枯草芽孢杆菌拥有终端的电子氧化酶：细胞色素aa3，细胞色素caa3，和细胞色素bd。其中细胞色素bd的电子能量耦合效率最低。
发明内容
本发明目的是提供一种利用重组枯草芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法。
本发明提供的一种利用重组芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法，是利用重组芽孢杆菌发酵培养基生产聚谷氨酸，所述重组芽孢杆菌的细胞色素bd的功能失活。
所述重组芽孢杆菌的细胞色素bd基因cydA被敲除。
进一步地，本发明的重组芽孢杆菌的通过以下步骤构建得到：
(1)以芽孢杆菌的基因组为模板，以SEQ ID NO.2-3所示的引物进行PCR，扩增获得约0.5kb的cydA基因片段；
(2)将该片段双酶切，并与同样进行双酶切的自杀性质粒进行连接，获得的重组质粒；
(3)将该质粒电转入芽孢杆菌中，筛选获得cydA基因被单交换插入失活的重组菌。
所述培养基其1L的配方为：葡萄糖0-80g/L，甘油0-80g/L，柠檬酸10-20g/L，谷氨酸10-20g/L，NH4Cl 5-10g/L，K2HPO4 0.1-0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2g/L，MnSO4·H2O 0.1-0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.1-0.5g/L，FeCl3·6H2O 0.1-0.5g/L。
本发明的利用重组芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法中，发酵条件为：温度为30-37℃，pH值为6.0-7.0，发酵时间为36-96h。
进一步地，所述芽孢杆菌包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌。
本发明提供了上述方法在提高聚谷氨酸产量中的应用。
本发明还提供了一种提高微生物菌株胞内ATP含量的方法，是通过使细胞色素bd的功能失活来提高微生物菌株胞内ATP含量。
进一步地，本领域技术人员可选择敲除微生物菌株中细胞色素bd基因cydA使细胞色素bd的功能失活。应当理解，本领域技术人员还可选用本领域公知的其他方法来实现细胞色素bd的功能失活，因此凡是通过使细胞色素bd的功能失活来实现提高微生物菌株胞内ATP含量的方法均属于本发明的保护范围。
进一步地，所述的微生物菌株为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌。
本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌在提高聚谷氨酸产量中的应用，所述重组枯草芽孢杆菌细胞色素bd的功能失活或细胞色素bd基因cydA被敲除。
另一方面，本发明提供了一种重组微生物在提高微生物菌株胞内ATP含量中的应用，所述微生物细胞色素bd的功能失活或细胞色素bd基因cydA被敲除。
本发明的有益效果在于，通过敲除枯草芽孢杆菌电子传递链中低能量耦合的细胞色素bd基因cydA或使细胞色素bd基因编码蛋白的功能失活，从而提高了枯草芽孢杆菌能量再生效率，使细胞内的ATP浓度获得了明显提高，从而显著提高了聚谷氨酸的产量，极大地降低生产成本，提高产业效率，具有重要的工业应用前景。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1构建敲除cydA的重组枯草芽孢杆菌
以枯草芽孢杆菌CICC 20643的基因组为模板，以cydA-F(agaggtcgactttcgcttggaacgatcatgtcggc)和cydR-R(actggaatttgaattgtttataagccaaatagctgagcg)为引物进行PCR，扩增获得约0.5kb的cydA片段(序列如SEQ ID NO.1所示)。
将该片段用SalI/EcoRI进行双酶切，并与同样进行SalI/EcoRI双酶切的pSTV29质粒(Takara)进行连接，获得的重组质粒命名为pSTV-cydA。将该质粒电转入枯草芽孢杆菌CICC 20643，在10μg/ml氯霉素的LB固体培养基上筛选具有氯霉素抗性的菌株。电击条件为电压2.0KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为1mm)。
挑取不同的菌落，以引物check-1(ggtcacccttttgtctgtgatcatattca)和check-2(caccggaaggagctaccggaca)进行菌落PCR，能够扩增出约1.2kb条带的即为cydA基因被单交换插入失活的重组菌，将该菌株命名为S.bacillus-cydA。
实施例2利用重组菌发酵生产聚谷氨酸
利用实施例1中获得的重组枯草芽孢杆菌S.bacillus-cydA和野生的枯草芽孢杆菌CICC 20643进行发酵培养测定聚谷氨酸的产量。将两株菌株分别接种到500ml含有50ml发酵培养基的摇瓶中进行培养，发酵过程温度控制在37℃，摇床转速为200rpm，用氨水控制pH在7.0，连续培养96h。发酵培养基为：甘油(80g/L)，柠檬酸(12g/L)，谷氨酸(20g/L)，NH4Cl(7g/L),K2HPO4(0.5g/L),MgSO4·7H2O(0.5g/L),MnSO4·H2O(0.104g/L),CaCl2·2H2O(0.15g/L),FeCl3·6H2O(0.5g/L)。
发酵96h时，取样用高效液相色谱测定聚谷氨酸的产量。检测条件为：色谱柱：Hypersil BDS C18(5μm,4.6mm×250mm)；流动相：磷酸氢二钠-磷酸二氢钾，pH6.98；流速：1ml/min；柱温30℃；波长220nm。结果显示，重组枯草芽孢杆菌S.bacillus-cydA的聚谷氨酸产量为36g/L，比野生的枯草芽孢杆菌CICC 20643产量(30g/L)提高了20％,说明敲除cydA基因可以显著提高聚谷氨酸的产量。
用ATP检测试剂盒(碧云天)检测96h时重组枯草芽孢杆菌S.bacillus-cydA和野生的枯草芽孢杆菌CICC 20643的胞内ATP含量，结果显示两株菌的胞内ATP含量分别为3.2μmol/g细胞干重和2.4μmol/g细胞干重，说明敲除cydA基因可以显著提高枯草芽孢杆菌ATP的含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 清华大学
<120> 一种利用重组枯草芽孢杆菌生产聚谷氨酸的方法
<130> KHP171119351.9
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttcgcttgg aacgatcatg tcggcgtttt ggattttagc ggccaactcg tttatgcagg 60
agcctgtcgg attcgcgatc aaaaacggcc gcgcggaaat gaccgatttc tttgcgatta 120
ttaaaaatcc gcagctatgg gttgaatttc cgcacgtcat tttcggtgcg cttgccaccg 180
gagcgttttt cattgccggt gtcagcgcgt ataaaatgct gaaaaaacag gaattgctct 240
tttttaaaaa atcctttcaa atcgcgatga ttgtggcgct tgtttccggc atcggcgtag 300
cgttcagcgg acatgagcag gcccagcatc tgatgaagag ccagccgatg aaaatggctg 360
ccagcgaagc gctttgggat gacagcggcg atcctgcagc ttggacggtg cttgcgaaca 420
ttgacgcgga caagcaggaa aacaaatcag agctcagcat cccgtatgcg ctcagctatt 480
tggcttataa acaattca 498
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agaggtcgac tttcgcttgg aacgatcatg tcggc 35
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actggaattt gaattgttta taagccaaat agctgagcg 39
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtcaccctt ttgtctgtga tcatattca 29
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccggaagg agctaccgga ca 22

Claims (6)

1.一种利用重组枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生产聚谷氨酸的方法，其特征在于，利用重组枯草芽孢杆菌发酵培养基生产聚谷氨酸，所述重组枯草芽孢杆菌的细胞色素bd基因cydA被敲除；所述细胞色素bd基因cydA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组枯草芽孢杆菌的通过以下步骤构建得到：
（1）以枯草芽孢杆菌的基因组为模板，以SEQ ID NO.2-3所示的引物进行PCR，扩增获得如SEQ ID NO.1所示的cydA基因片段；
（2）将该片段双酶切，并与同样进行双酶切的自杀性质粒进行连接，获得的重组质粒；
（3）将该质粒电转入枯草芽孢杆菌中，筛选获得cydA基因被单交换插入失活的重组菌。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培养基其1L的配方为：葡萄糖0-80g/L，甘油0-80 g/L，柠檬酸10-20 g/L，谷氨酸10-20 g/L，NH4Cl 5-10g/L，K2HPO4 0.1-0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2 g/L，MnSO4·H2O 0.1-0.5 g/L，CaCl2·2H2O 0.1-0.5 g/L，FeCl3·6H2O 0.1-0.5 g/L。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，发酵条件为：温度为30-37 ℃，pH值为6.0-7.0，发酵时间为36-96 h。
5.权利要求1-4任一所述的方法在提高聚谷氨酸产量中的应用。
6.一种重组枯草芽孢杆菌在提高聚谷氨酸产量中的应用，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌细胞色素bd基因cydA被敲除；所述细胞色素bd基因cydA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
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