CN108191918A - 卤代8-羟基喹啉铂(ii)配合物及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两个卤代8‑羟基喹啉铂(II)配合物及其合成方法和应用。所述的卤代8‑羟基喹啉铂(II)配合物的结构如下述式(I)所示，其合成方法为：取8‑羟基喹啉衍生物和二氯·二(二甲基亚砜)合铂在极性溶剂中进行配位反应，即得。申请人的试验表明，它们对某些肿瘤细胞株具有良好的增殖抑制活性，能够选择性抑制膀胱癌T‑24细胞的生长，且靶向干扰线粒体的功能来诱导该肿瘤细胞凋亡；同时其对人正常细胞HL‑7702的毒性较低。本发明所述的卤代8‑羟基喹啉铂(II)配合物的结构及8羟基喹啉衍生物的结构分别如下述式(I)和式(II)所示：

Description

卤代8-羟基喹啉铂(II)配合物及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及卤代8-羟基喹啉铂(II)配合物及其合成方法和应用。

背景技术

癌症作为第二大致死病因，严重威胁着人类的健康，每年全世界有超过1000万人被诊断患有癌症。据世界卫生组织报告，2012年，全球有1410千万人罹患癌症，其中820万人死于癌症。在我国每年约有221.3万人死于癌症，死亡率远高于西方发达国家。据WHO的估计，如果今后不采取有效的防治措施，2020年全球至少1500万人死于癌症，而这些病例的70％将出现在发展中国家(郑小辉,等.化学进展,2016,28:1029-1038.)。其中，以顺铂、卡铂等为代表的数种无机铂类抗癌药物对多种癌症类型有良好的治愈效果，尤其是对睾丸癌和卵巢癌的治疗更有效(Mao Z.-W.；et al.Inorg.Chem.Front.,2017,4:10-32.)。然而，顺铂类药物在临床治疗过程中容易产生肾毒性、神经毒性、耳毒性、胃肠道毒性、肝脏毒性、耳毒性及耐药性，致使它们在临床治疗上的使用受到了限制(Rosenberg,B.；et al.Nature,1965,205:698-699.)。因此，研发新型高效、低毒、高选择性的铂类抗肿瘤化疗药物迫在眉睫。

膀胱癌是全球第10位常见的恶性肿瘤，是泌尿系统第1位恶性肿瘤。近几十年来，我国膀胱癌的发病率和死亡率呈上升趋势。全球不同地区间膀胱癌发病率差异较大，发达国家远高于发展中国家。大量研究表明，吸烟、饮酒、有毒物质等职业暴露是膀胱癌的危险因素。中国人群尤其是男性人群吸烟、饮酒率较高，对膀胱癌影响明显(陈晓芳,等.中国肿瘤,2018,2:001.)。这就迫切地需要科研工作者们去设计和研发出系列靶向于膀胱癌的高活性、低毒性的新型抗肿瘤药物。近年来，以膀胱癌为瘤株的药物设计与研究取得了明显的成果。如张海蓉等人设计了两个8-羟基喹啉衍生物铑(III)配合物，它们选择性抑制T-24细胞中的生长，活性较高，IC₅₀值分别为13.42和18.91μM，但它们对人正常肝细胞HL-7702的毒性较高，IC₅₀值达25-30μM(Zhang H.R.；et al.New J.Chem.,2016,40:6005-6014.)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供对人膀胱癌细胞株T-24等癌细胞株活性高且对人正常肝细胞HL-7702毒性更低的卤代8-羟基喹啉铂(II)配合物及其合成方法和应用。

本发明所述的卤代8-羟基喹啉铂(II)配合物为具有下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁表示Cl或Br，R₁表示Cl或Br。

本发明所述卤代8-羟基喹啉铂(II)配合物的合成方法为：取如下式(II)所示化合物和二氯·二(二甲基亚砜)合铂在极性溶剂中进行配位反应，即得目标产物；

其中，R₁表示Cl或Br，R₁表示Cl或Br。

具体合成路线如下(其中R₁和R₂如上述)：

本发明所述合成方法中涉及的式(II)所示化合物，当R₁＝R₂＝Cl时，式(II)所示化合物为5,7-二氯-8-羟基-2-甲基喹啉(在本申请中也简称为H-ClQ)，与二氯·二(二甲基亚砜)合铂进行配位反应得到的目标产物为一氯·二甲基亚砜·5,7-二氯-8-羟基-2-甲基喹啉合铂(II)，化学式为[Pt(ClQ)(DMSO)Cl](本申请中也简称为ClQ-Pt)；当R₁＝R₂＝Br时，式(II)所示化合物为5,7-二溴-8-羟基-2-甲基喹啉(在本申请中也简称为H-BrQ)，与二氯·二(二甲基亚砜)合铂进行配位反应得到的目标产物为一氯·二甲基亚砜·5,7-二溴-8-羟基-2-甲基喹啉合铂(II)，化学式为[Pt(BrQ)(DMSO)Cl](本申请中也简称为BrQ-Pt)。

本发明所述合成方法中涉及的二氯·二(二甲基亚砜)合铂为顺式二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，可参考现有文献(Al-Allaf T A K,et al.Transit.Met.Chem.，1998)进行制备，在本申请中也简称为cis-PtCl₂(DMSO)₂。

上述合成方法中，式(II)所示化合物和二氯·二(二甲基亚砜)合铂的摩尔比为化学计量比，在实际的操作中，式(II)所示化合物和二氯·二(二甲基亚砜)合铂的摩尔比通常可以是1：1～1.2。

上述合成方法中，所述的极性溶剂可以是选自水、甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜和乙腈中的任意一种或两种以上的组合。其中甲醇和乙醇的浓度均优选为15～100v/v％，更优选35～85v/v％。当极性溶剂的选择为上述选择中两种以上的混合物时，它们之间的配比可为任意配比。所述极性溶剂的用量可根据需要确定，通常情况下，1mmol的式(II)所示化合物和1mmol的二氯·二(二甲基亚砜)合铂用5～80mL的极性溶剂来溶解。在具体的溶解步骤中，可将式(II)所示化合物和二氯·二(二甲基亚砜)合铂分别用极性溶剂溶解，再混合在一起反应；也可将式(II)所示化合物和二氯·二(二甲基亚砜)合铂混合后再加极性溶剂。

上述合成方法中，所述配位反应可以在加热或不加热的条件下进行。优选反应是在加热条件下进行，当反应在加热条件下进行时，反应的温度低于极性溶剂的沸点温度，通常在50～80℃条件下进行。

本发明所述卤代8-羟基喹啉铂(II)配合物具体在合成时，可采用溶液法或溶剂热法进行合成。当采用溶液法进行合成时，反应是否完全可采用薄层层析(TLC)跟踪检测。当反应采用回流方式进行时，反应至完全大约需要4～72h的时间；反应完成后所得反应物冷却，静置析晶，收集晶体，即得目标产物。当前期加入的极性溶剂的量较大时，需要浓缩除去部分溶剂(通常是溶液加入量的40-80％)后再冷却、析晶。采用溶液合成法合成发明目标产物时，ClQ-Pt的产率为85～95％，BrQ-Pt的产率为75～90％。

本发明还包括上述卤代8-羟基喹啉铂(II)配合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。更具体是在制备抗膀胱癌、肝癌或胃癌药物中的应用。

本发明进一步包括一种药物组合物，该药物组合物中含有治疗上有效剂量的上述卤代8-羟基喹啉铂(II)配合物或其药学上可接受的盐。

与现有技术相比，本发明提供了两个结构新颖的卤代8-羟基喹啉铂(II)配合物及其合成方法和应用，申请人的试验表明，它们对某些肿瘤细胞株具有良好的增殖抑制活性，能够选择性抑制膀胱癌T-24细胞的生长，且靶向干扰线粒体的功能来诱导该肿瘤细胞凋亡；同时其对人正常细胞HL-7702的毒性较低，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的最终产物的晶体结构图；

图2为ClQ-Pt(5.0μM)和BrQ-Pt(18.0μM)在T-24细胞内的细胞吸收和分布图；

图3为加入ClQ-Pt(5.0μM)前、后以及BrQ-Pt(18.0μM)前、后T-24细胞的线粒体膜电位图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

称取相同物质的量的H-ClQ和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，各1mmol，将H-ClQ溶解于50mL的100v/v％甲醇中，将二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶解于1.0mL的DMSO中，两种溶液混合后，在80℃下反应12小时，浓缩蒸发除去大部分溶剂(溶剂加入量的85％)后，冷却至室温，静置，析出黄色晶体，收集晶体，干燥，得到黄色固体产物(产率95.0％)。

对本实施所得产物进行红外光谱、核磁共振氢/碳谱、元素分析、电喷雾质谱和X-单晶衍射等表征，具体如下：

(1)红外光谱：

IR(KBr):3933,3846,3782,3696,3456,3011,2921,1584,1555,1500,1448,1370,1317,1268,1198,1138,1138,1026,971,947,922,865,828,771,691,537,517,438cm^-1.

(2)核磁共振氢谱：

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ8.55(d,J＝8.6Hz,1H),7.76(s,1H),7.67(d,J＝8.7Hz,1H),3.10(s,1H),2.51(s,6H).

(3)核磁共振碳谱：

¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ166.80,162.26,144.32,137.26,128.59,127.54,124.96,118.03,116.26,40.94,27.03.

(4)电喷雾质谱：

ESI-MS m/z:573.2[M-Cl+DMSO]⁺,其中M为化合物的分子量。

(5)元素分析，结果如下述表1所示：

表1：实施例1和2所得最终产物的元素分析结果

(6)X-射线单晶衍射谱：

取合适尺寸的橙红色晶体产物进行X射线单晶衍射分析，获得产物的晶体结构数据；其晶体学数据如下述表2所示，部分键长和键角如下述表3所示，所得产物的晶体结构如图1所示。

表2：产物的晶体学和结构修正数据

表3：产物的部分健长和键角[°]

因此，可以确定本实施例所得黄色固体产物即为目标产物一氯·二甲基亚砜·5,7-二氯-8-羟基-2-甲基喹啉合铂(II)(ClQ-Pt)，分子式为C₁₂H₁₂Cl₃NO₂PtS，分子量为533.93g/mol，其化学结构式如下：

实施例2

称取相同物质的量的H-BrQ和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，各1mmol，将H-BrQ溶解于25mL的75v/v％乙醇中，将二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶解于10.0mL的水中，两种溶液混合后，在65℃下反应24小时，浓缩蒸发除去大部分溶剂(溶剂加入量的70％)后，冷却至室温，静置，析出黄色晶体，收集晶体，干燥，得到黄色固体产物(产率90.0％)。

对本实施所得产物进行红外光谱、核磁共振氢/碳谱和电喷雾质谱等表征，具体如下：

(1)红外光谱：

IR(KBr):3913,3782,3697,3463,3006,2919,1552,1494,1443,1369,1315,1272,1195,1147,1026,948,869,825,768,680,595,530,510,438cm-1.

(2)核磁共振氢谱：

1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.50(d,J＝8.7Hz,1H),7.99(s,1H),7.69(d,J＝8.8Hz,1H),3.11(s,3H),2.51(s,6H).

(3)核磁共振碳谱：

13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ166.73,163.99,144.08,139.78,134.03,127.89,126.72,108.27,105.47,100.00,40.93,27.00.

(4)电喷雾质谱：

ESI-MS m/z:663.1[M-Cl+DMSO]+，其中M为化合物的分子量。

(5)元素分析，结果如上述表1所示。

因此，可以确定本实施所得产物即为一氯·二甲基亚砜·5,7-二溴-8-羟基-2-甲基喹啉合铂(II)(BrQ-Pt)，分子式为C₁₂H₁₂Br₂ClNO₂PtS，分子量为621.83g/mol，其化学结构式如下：

实施例3

称取相同物质的量的H-ClQ和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，各1mmol，将H-ClQ溶解于50mL的90v/v％甲醇中，将二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶解于10mL的75v/v％乙醇中，两种溶液混合，所得混合溶液在45℃下反应8小时，浓缩蒸发除去81％的溶剂后，冷却至室温，静置，析出黄色晶体，收集晶体，干燥，得到黄色固体产物，产率为85.3％。

对本实施所得产物进行红外光谱、核磁共振氢/碳谱、元素分析、X-单晶衍射和电喷雾质谱等表征，确定为目标产物ClQ-Pt。

实施例4

称取相同物质的量的H-ClQ和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，各1mmol，将H-ClQ溶解于30mL的38v/v％甲醇和75v/v％乙醇的混合液(甲醇和乙醇的体积比为5:1)中，将二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)溶解于5.0mL的水和乙腈的混合液(水和乙腈的体积比3:2)中，两种溶液混合，在100℃下反应72小时，浓缩蒸发除去90％的溶剂后，冷却至室温，静置，析出黄色晶体，收集晶体，干燥，得到黄色固体产物ClQ-Pt，产率为90.0％。

对本实施所得产物进行红外光谱、核磁共振氢/碳谱、元素分析、电喷雾质谱和X-单晶衍射等表征，确定为目标产物ClQ-Pt。

实施例5

称取相同物质的量的H-BrQ和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，各1mmol，将H-BrQ溶解于80mL的100v/v％甲醇中，然后加入二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，溶解后于50℃下反应4小时，浓缩蒸发除去70％的溶剂后，冷却至室温，静置，析出黄色晶体，收集晶体，干燥，得到黄色固体产物，产率为75％。

对本实施所得产物进行红外光谱、核磁共振氢/碳谱、电喷雾质谱和元素分析等表征，确定为目标产物BrQ-Pt。

实施例6

称取相同物质的量的H-BrQ和二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，各1mmol，将H-BrQ溶解于15mL的15v/v％甲醇和15v/v％乙醇的混合液(甲醇和乙醇的体积比为1:10)中，然后加入二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)，溶解后于70℃下反应36小时，浓缩蒸发除去81％的溶剂后，冷却至室温，静置，析出黄色晶体，收集晶体，干燥，得到黄色固体产物，产率为88％。

对本实施所得产物进行红外光谱、核磁共振氢/碳谱、电喷雾质谱和元素分析等表征，确定为目标产物BrQ-Pt。

实施例7

重复实施例1，不同的是，将溶解H-ClQ的极性溶剂甲醇改为水，体积不变；将溶解二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)的极性溶剂DMSO改为水，体积不变。

本实施例最终得到黄色固体产物，产率为86.2％。

对本实施所得产物进行红外光谱、核磁共振氢/碳谱、元素分析、电喷雾质谱和X-单晶衍射等表征，确定为目标产物ClQ-Pt。

实施例8

重复实施例1，不同的是，将溶解H-ClQ的极性溶剂甲醇改为丙酮，体积不变；将溶解二氯·二(二甲基亚砜)合铂(II)的极性溶剂DMSO改为丙酮，体积不变。

本实施例最终得到黄色固体产物，产率为90.0％。

对本实施所得产物进行红外光谱、核磁共振氢/碳谱、元素分析、电喷雾质谱和X-单晶衍射等表征，确定为目标产物ClQ-Pt。

实施例9

重复实施例5，不同的是，将溶解H-BrQ的极性溶剂甲醇改为乙腈，体积不变。

本实施例最终得到黄色固体产物，产率为79.1％。

对本实施所得产物进行红外光谱、核磁共振氢/碳谱、电喷雾质谱和元素分析等表征，确定为目标产物BrQ-Pt。

实验例1：配合物ClQ-Pt和BrQ-Pt对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性实验

1、细胞株与细胞培养

本实验选用人膀胱癌细胞株T-24、肝癌细胞Hep-G2和BEL-7402、胃癌细胞株MGC80-3等4种人类肿瘤细胞株和人正常肝细胞HL-7702。

所有细胞株均培养在含10wt％小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的RPMI-1640培养液内，置37℃含体积浓度5％CO₂孵箱中培养。

2、待测化合物的配制

所用的配合物ClQ-Pt和BrQ-Pt的纯度≥95％(分别由本发明实施例1和2制得)，将其DMSO储液用生理缓冲液稀释后配制成20μmol/L的终溶液，其中助溶剂DMSO的终浓度≤1％，测试该浓度下配合物对各种肿瘤细胞生长的抑制程度。

3、细胞生长抑制实验(MTT法)

(1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配制成个数浓度为5000/mL的细胞悬液，以每孔190μL接种于96孔培养板中，使待测细胞密度至1000～10000孔(边缘孔用无菌PBS填充)；

(2)5％CO₂，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物10μL，每个浓度梯度设4个复孔；

(3)5％CO₂，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察；

(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，继续培养4h；

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；

(6)同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMSO)。

(7)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用公式：

计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，再以Bliss法分别计算配合物ClQ-Pt和BrQ-Pt对上述几种细胞株的IC₅₀值。其结果如表5所示。

表4：配合物ClQ-Pt和BrQ-Pt对不同肿瘤细胞株的IC₅₀值(μM)

从IC₅₀的结果来看，ClQ-Pt和BrQ-Pt对4种人肿瘤细胞株均表现出一定的增殖抑制活性，尤其是ClQ-Pt对所选的肿瘤细胞株的抑制活性要明显高于顺铂和其他化合物。但值得说明的是，配合物ClQ-Pt和BrQ-Pt选择性的抑制人膀胱癌细胞株T-24的生长，其IC₅₀分别为5.02±0.62和18.02±1.05μM，明显低于顺铂的IC₅₀值(19.56±0.60μM)。另一方面，配合物ClQ-Pt和BrQ-Pt对人正常肝细胞HL-7702细胞毒性很小，这是一个有积极意义的结果，表明配合物ClQ-Pt和BrQ-Pt在表现一定的广谱抗肿瘤活性的同时，还具有较低的肝脏毒性，即配合物ClQ-Pt和BrQ-Pt具有一定的细胞毒性选择性。

综上所述，本发明所述的配合物ClQ-Pt和BrQ-Pt，总体表现出了明显的体外抗肿瘤活性和毒性选择性，具有良好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

实验例2：配合物ClQ-Pt和BrQ-Pt的吸收和分布实验

1、细胞吸收配合物的总量

培养瓶中培养大约2×10⁶个T-24细胞，细胞贴壁长至孔面积的2/3后，加入顺铂(20.0μM)、配合物ClQ-Pt(5.0μM)和BrQ-Pt(18.0μM)作用24h，培养一定的时间后，用PBS(5mL)洗涤2次后，收集细胞，离心10min(2500rpm)，移除PBS洗涤液；将收集好的细胞用1M的NaOH(1.0mL)破碎30min，破碎完全后用2％(v/v)HNO₃(5mL)中和NaOH，应用ICP-MS测定各金属在细胞内的总吸收量(设置顺铂和空白作为对照)。或将收集好的细胞直接加入2％(v/v)HNO₃(5.0mL)进行微波消解60min，并应用ICP-MS测试消解液。

2、配合物在细胞内的分布

按照上述的方法培养细胞、给药和收集细胞，之后按照各试剂盒的提取方法进行提取；将得到的细胞用1M的NaOH(1.0mL)破碎30min，破碎完全后用5mL 2％(v/v)HNO₃中和NaOH溶液，最后用ICP-MS测定金属在细胞内的分布情况(设置顺铂加药组和空白对照组)。或将收集好的细胞直接加入2％(v/v)HNO₃(5mL)进行微波消解60min，最终得到测试液，所得的溶液应用ICP-MS进行测试。

结果如图2所示，图2为配合物ClQ-Pt(5.0μM)和BrQ-Pt(18.0μM)在T-24细胞的吸收和分布情况。由图可知，配合物ClQ-Pt(5.0μM)和BrQ-Pt(18.0μM)在T-24细胞的吸收和分布可以看出，配合物ClQ-Pt(5.0μM)和BrQ-Pt(18.0μM)主要分别在T-24细胞的线粒体中，尤其是配合物ClQ-Pt(5.0μM)在T-24细胞的含量及其在线粒体的分布情况远远大于顺铂(20.0μM)，该实验结果为这两个配合物靶向线粒体提供一定实验基础。

3、线粒体膜电位的检测

JC-1染料是一种常见的荧光探针，广泛用于线粒体膜电位(ΔΨm)的检测。用该染料染色研究细胞的凋亡情况，详细的实验步骤如下，最后采用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。其简单的实验过程如下：

①取对数期细胞进行消化，离心10min(1000r/min)，收集细胞，将1×10⁶个细胞悬液(2mL)接种于六孔板中，置于培养箱中培养(5％CO₂、37℃)；

②细胞贴壁后，加入一定浓度的化合物，培养一定时间后，开始收集细胞；

③PBS洗涤3次，用1mL的培养液重悬细胞；加入1mL的染色液(JC-1，5.0μg/mL)，混匀，室温条件下避光孵育20-40分钟；

④染色结束后，用PBS缓冲液洗涤(3次)，根据细胞数加入一定体积的培养液(2mL)，应用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化情况。

结果如图3所示，其中图3A为未加入BrQ-Pt的T-24细胞的线粒体膜电位空白对照图，图3B为加入18.0μM的BrQ-Pt后T-24细胞的线粒体膜电位图，图3C为未加入ClQ-Pt的T-24细胞的线粒体膜电位空白对照图，图3D为加入5.0μM的ClQ-Pt后T-24细胞的线粒体膜电位图。由图3可知，加入配合物ClQ-Pt(5.0μM)和BrQ-Pt(18.0μM)后，T-24细胞的线粒体膜电位分别降低了75.20％和11.00％，说明这两个通过紊乱线粒体功能来诱导细胞凋亡；结合ICP-MS实验结果可知，这两个配合物在T-24细胞株中靶向作用线粒体，最终诱导该细胞凋亡。

综上所述，本发明所述的配合物ClQ-Pt和BrQ-Pt，总体表现出了明显的体外抑制膀胱癌细胞T-24的增殖或生长，并定位靶向于该细胞的线粒体，具有良好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

Claims (9)

1.下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁表示Cl或Br，R₂表示Cl或Br。

2.权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于：取如下式(II)所示化合物和二氯·二(二甲基亚砜)合铂在极性溶剂中进行配位反应，即得目标产物；

其中，R₁表示Cl或Br，R₂表示Cl或Br。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述的极性溶剂为选自水、甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜和乙腈中的任意一种或两种以上的组合。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：所述反应在加热或不加热的条件下进行。

5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于：当反应在加热条件下进行时，反应温度低于极性溶剂的沸点温度。

6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于：所述反应在50～80℃条件下进行。

7.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：是在制备抗膀胱癌、肝癌或胃癌药物中的应用。

9.一种药物组合物，含有治疗上有效剂量的权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐。