CN108169197B

CN108169197B - 一种近红外检测次氯酸根的方法

Info

Publication number: CN108169197B
Application number: CN201711375474.4A
Authority: CN
Inventors: 高光芹; 谢普会; 黄家荣; 王志敏; 李明旻; 金显春; 孟彦羽; 苏惠
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2037-12-19
Also published as: CN108169197A

Abstract

本发明提供了一种近红外检测次氯酸根的方法，是基于一种商业可得的近红外染料甲酚紫（CVA）检测次氯酸根（OCl^‑）的方法。具体检测方法是：将CVA作为荧光试剂，在pH为7.4的PBS缓冲溶液中，高效选择性检测次氯酸根，探针用于定性和半定量目视检测微量次氯酸根。该检测方法，对次氯酸根显示了较高的灵敏性，检出限低至5.6×10^‑8mol/L，检测过程简便、抗干扰能力强、快速、灵敏，检测结果准确，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种近红外检测次氯酸根的方法

技术领域

本发明涉及次氯酸根（ClO^-）检测领域，具体涉及一种近红外检测次氯酸根的试剂和方法。

背景技术

次氯酸根及其质子化形式下的次氯酸，是生物体内最重要的一种活性氧，通常是在由过氧化氢与氯离子反应生成的，整个过程中需要髓过氧化物酶对反应进行催化。次氯酸根与我们的日常生活息息相关。例如生活中常见的漂白水、消毒液的主要成分就是次氯酸钠。日常生活中次氯酸（一般是其钠盐）被广泛用作漂白剂、除臭剂和消毒剂。作为一种重要的活性氧物种，次氯酸在维持细胞内的氧化还原平衡状态起着非常重要的作用，但是一旦细胞中次氯酸的浓度发生异常，就会引起包括风湿性关节炎、心血管疾病和癌症在内的多种疾病，检测生物体系中次氯酸的浓度已成为一个重要的课题。与传统的检测技术相比，荧光法作为一种非侵入性检测技术，以其众多的优势（如灵敏度高，选择性好，响应迅速，原位检测，实时监测等）越来越引起科研工作者的广泛关注。

但是，目前文献报道的大部分用于检测次氯酸根的荧光探针的最大吸收与发射波长都在可见光区域（400～600 nm）。在可见光区，环境中和生物体及组织中的一些内源性荧光团产生“自荧光”，同时生物机体组织对可见光的散射较强，对外源性荧光探针的荧光信号造成了严重干扰。而环境中和生物机体组织内在近红外区域（600～900 nm）的背景荧光明显减弱并且吸收系数最小，对近红外光的散射也较少，可以使近红外光能在生物体内具有较强的组织穿透性，大大降低了相关背景干扰，因而能增加荧光技术的灵敏度和穿透性。此外，近红外光还对生物体有着非常小的光损伤。综上所述：近红外光类荧光探针更有利于在生物体内检测识别相关活性物种。因此，开发近红外类荧光探针用于次氯酸根的快速检测在化学生物学和临床检验诊断方面有着广泛的应用前景。

发明内容

本发明克服现有技术次氯酸根检测中存在的问题，提出了一种近红外检测次氯酸根的试剂和方法，提供一种体系廉价、操作方便、选择性高、灵敏度高的近红外荧光探针检测次氯酸根的方法；以及该次氯酸根探针在检测细胞内次氯酸根的应用。

实现本发明的技术方案是：一种近红外检测次氯酸根的方法，步骤如下：

（1）配制pH为7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，并用乙醇配制浓度为1 mM的甲酚紫-乙醇溶液；

（2）用蒸馏水配置60 μmol/L浓度的ClO^-溶液，把3 mL的PBS缓冲溶液和30 μL的甲酚紫-乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，依次加入体积为0、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25μL的ClO^-溶液，同时在荧光光谱仪上测定627 nm处的荧光发射强度，以ClO^-的浓度为横坐标，以627 nm处的荧光发射强度为纵坐标，得到ClO^-浓度的工作曲线，线性回归方程为：F_{627 nm} =8775.810-684.324C，C的单位为μmol/L；

（3）将3000 μL的PBS缓冲溶液和30 μL的甲酚紫乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取V μL待测样品溶液，加入到荧光比色皿中，在荧光光谱仪上测试，将测得的F_{627 nm}值代入步骤（3）的线性回归方程中，得到浓度C，待测样品的浓度C_待测样=3000μL*C*/VμL， C的单位为μmol/L。

所述的近红外检测次氯酸根的方法，甲酚紫的结构式如下：

所述甲酚紫探针检测次氯酸根的浓度为0-0.5 µM，最低检出限为5.6×10^-8 mol/L。

所述的近红外检测次氯酸根的方法在检测细胞内次氯酸根的应用。

所述的甲酚紫作为荧光试剂在检测次氯酸根中的应用。

本发明的有益效果是：1. 检测体系成本低廉，试剂商业可得且廉价；2. 本发明的检测方法对次氯酸根显示了高的灵敏性和选择性；3. 近红外探针甲酚紫（CVA）是肉眼可见红色且发出近红外荧光物质，能与检测体系中次氯酸根发射高灵敏、高选择性反应，生产无色且不发出近红外荧光的衍生物。通过本发明可实现：（1）通过目视测试样品中次氯酸根的存在；（2）通过分析仪器对检测体系的荧光发射强度的测量可以对样品中次氯酸根的含量进行定量测量。本发明是一种简单，快速，灵敏的次氯酸根特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的荧光探针甲酚紫（CVA）荧光选择性图，激发波长580 nm，插图为溶液颜色变化图。

图2为本发明的荧光探针甲酚紫（CVA）识别ClO^-的荧光滴定图，激发波长580 nm。

图3为本发明的荧光探针甲酚紫（CVA）识别ClO^-的抗阴离子和活性物质干扰性图（柱状图），激发波长580 nm，发射波长627 nm。

图4为本发明的工作曲线，激发波长580 nm，发射波长627 nm。

图5为本发明的荧光探针甲酚紫（CVA）应用于细胞中对外源性ClO^-进行荧光成像。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

配制pH为7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，并用乙醇配制浓度为1 mM的甲酚紫（CVA）乙醇溶液。用荧光光谱仪考察了探针甲酚紫（CVA）对次氯酸根（ClO^-）的选择性。如图1所示，在580 nm处激发条件下，单独的探针甲酚紫（CVA）(10 µM)在PBS缓冲溶液中在627 nm处具有较强的荧光发射强度，当加入次氯酸根（ClO^-）(10 eq.)后，在627 nm处的荧光发射强度明显降低，但是加入其它物质 (100 µM) 时，溶液体系的荧光发射强度与单独探针体系的荧光发射强度相比没有明显变化。同时，观察到单独的探针甲酚紫（CVA）在PBS缓冲溶液中为紫色，次氯酸根的加入使其颜色变为无色（附图1插图），说明探针甲酚紫（CVA）对次氯酸根的选择可以达到裸眼识别效果。在PBS缓冲溶液中，固定探针甲酚紫（CVA）浓度为10µM，测定其对不同浓度的ClO^-的响应强度，随着ClO^-浓度的增加，体系荧光发射强度在627nm处不断降低（附图2）。

配制pH为7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，并用乙醇配制浓度为1 mM的甲酚紫（CVA）乙醇溶液。在23个干净的荧光比色皿中，分别加入3000 μL的PBS缓冲溶液和30 μL的甲酚紫（CVA）乙醇溶液，再分别加入10个摩尔当量的ClO^-和10个摩尔当量的其他分析物（Br^-, Cl^-, F^-, I^-, CO₃ ^2-, HCO₃ ^-, PO₄ ^3-, HPO₄ ^2-, H₂PO₄ ^-, HS^-, S₂O₃ ^2-, HSO₄ ^-, HSO₃ ^-,NO₂ ^-, NO₃ ^-, MnO₄ ^-, SO₄ ^2-, H₂O₂, KO₂, TBHP, Cys, GSH），在荧光光谱仪上检测，绘制不同分析物对应的627 nm荧光强度的柱状图，得到荧光发射柱状图（附图3）。

经实验证明，其他分析物不干扰体系对ClO^-的测定。

配制pH为7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，并用乙醇配制浓度为1 mM的甲酚紫（CVA）乙醇溶液。用蒸馏水配置60 μmol/L浓度的ClO^-溶液，把3 mL的PBS缓冲溶液和30 μL的甲酚紫（CVA）乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，逐渐加入ClO^-溶液的体积分别为0，5 μL，10 μL，15 μL，20 μL，25 μL，同时在荧光光谱仪上测定627 nm处的荧光发射强度，以ClO^-的浓度为横坐标，以627 nm处的荧光发射强度为纵坐标，得到ClO^-浓度的工作曲线，线性回归方程为：F_{627 nm} =8775.810-684.324，C的单位为μmol/L（附图4）。

最低检出限实验：

良好的检出限是检验一个探针分子是否具有应用价值的标准之一。配制pH为7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，并用乙醇配制浓度为1 mM的甲酚紫（CVA）乙醇溶液。固定探针甲酚紫（CVA）浓度为10 µM，测定其对不同浓度的ClO^-的响应强度，随着ClO^-浓度的增加，体系荧光发射强度在627 nm处不断降低，研究发现溶液荧光发射强度在ClO^-浓度为0-0.5 µM间呈线性（R² = 0.984），经计算(3σ/k)得出该探针分子对ClO^-的检出限为5.6×10^-8mol/L，该检出限可满足国家对城市自来水中次氯酸根含量的限量要求，表明该探针甲酚紫（CVA）在城市自来水质量安全方面具有潜在的应用价值。

探针甲酚紫（CVA）对细胞外源性次氯酸根荧光成像

将本发明探针甲酚紫（CVA）应用于Eca109（食管癌细胞），对外源性的次氯酸根进行荧光成像，具体步骤如下：

a) 将10 µM探针甲酚紫（CVA）溶液加入到育有Eca109细胞的培养液（2 mL）中，在二氧化碳培养箱中培养20 min，用PBS缓冲溶液洗涤2次，明场成像，如图（A），可以看到细胞大致的轮廓；

b) 将 a)中细胞用580 nm激光激发，红光通道成像，得到具有较强红色荧光的图（B）；

c) 将10 µM探针甲酚紫（CVA）溶液加入到育有Eca109细胞的培养液（2 mL）中，在二氧化碳培养箱中培养20 min，加入10 µM的次氯酸钠水溶液后，在二氧化碳培养箱中培养20 min，用PBS缓冲溶液洗涤2次，明场成像，如图（C），可以看到细胞大致的轮廓；

d) 将 c)中细胞用580 nm激光激发，红光通道成像，得到具有没有荧光的图（D）；

根据附图5所示，没有加入次氯酸钠溶液的细胞在580 nm的激发下在红光通道有较强的红色荧光发出。然而，另一份在加入次氯酸钠溶液后，在580 nm的激发下在红光通道几乎观察不到荧光发出。这说明本发明探针甲酚紫（CVA）可以对细胞中外源性的次氯酸根进行荧光成像。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种近红外检测次氯酸根的方法，其特征在于步骤如下：

（2）用蒸馏水配置60 μmol/L浓度的ClO^-溶液，把3 mL的PBS缓冲溶液和30 μL的甲酚紫-乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，依次加入体积为0、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL的ClO^-溶液，同时在荧光光谱仪上测定627 nm处的荧光发射强度，以ClO^-的浓度为横坐标，以627 nm处的荧光发射强度为纵坐标，得到ClO^-浓度的工作曲线，线性回归方程为：F_{627 nm} =8775.810-684.324C，C的单位为μmol/L；

（3）将3000 μL的PBS缓冲溶液和30 μL的甲酚紫乙醇溶液加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取V μL待测样品溶液，加入到荧光比色皿中，在荧光光谱仪上测试，将测得的F_{627 nm}值代入步骤（3）的线性回归方程中，得到浓度C，待测样品的浓度C_待测样=3000μL*C*/VμL，C的单位为μmol/L；

2.根据权利要求1所述的近红外检测次氯酸根的方法，其特征在于：甲酚紫的结构式如下：

。

3.权利要求1-2任一项所述的近红外检测次氯酸根的方法在检测细胞内次氯酸根的应用。

4.权利要求1-2任一项所述的甲酚紫作为荧光试剂在检测次氯酸根中的应用。