CN108137662B - 制造膜联蛋白v的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于从具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达的细胞内蛋白质的方法，其中所述方法包括从宿主细胞中释放细胞内蛋白质，其特征在于：在包含非离子洗涤剂的匀化缓冲液的存在下执行释放细胞内AnxA5蛋白的步骤，并且优选地，其中所述方法不包括从宿主细胞中释放AnxA5蛋白之后回收和/或提纯AnxA5蛋白的任何离心步骤，并且/或者其中AnxA5蛋白除暂时地与任何色谱树脂时结合之外，在整个方法中保留在溶液中。

Description

制造膜联蛋白V的方法
技术领域
本申请涉及用于生产包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的蛋白质的方法。更具体地，所述方法用于AnxA5蛋白的回收和/或提纯，特别是从重组宿主细胞(如细菌宿主细胞)中。本文中所描述的方法是非常高效且具成本效益的，并且可以用于工业规模(例如，使用具有约1000L或以上的培养体积的重组宿主细胞培养物)从而快速且方便地生产医药级AnxA5蛋白产物。
背景技术
在本说明书中明显在先发表文件的列表或论述不应必须看作是承认该文件是现有技术水平的部分或者是公知常识。
动脉粥样硬化性血栓形成(形成于潜在动脉粥样硬化斑块上)是大多数临床上显而易见的缺血性心血管疾病(包括急性冠状动脉疾病、脑血管和周围动脉闭塞)的关键致病机制。如在Cederholm和Frostegard，2007，《药物新闻与视点(Drug News Perspect.)》，20(5)：321-6中所描述，膜联蛋白A5(以前被称为膜联蛋白V，是膜联蛋白超家族中的一员)是具有强大且独特抗血栓特性的蛋白质。由膜联蛋白A5所产生的抗血栓作用被认为主要是由于对磷脂类(尤其是磷脂酰丝氨酸)的结构屏蔽来减少它们对凝固反应的可利用性而导致。然而，报道了可能导致其抗血栓作用的膜联蛋白A5的其他令人感兴趣的特性，特别是表面表达的组织因子的下调，或者与和止血有关联的另外配体(如硫脑苷脂和肝素)的相互作用以及尿激酶型纤溶酶原激活物的上调。膜联蛋白A5在体内作为内源性抗血栓系统一员的的生物学意义已被建议用于大脉管系统和胚胎微循环。
实际上，已知膜联蛋白A5在医学中、在提供直接治疗效果中具有大范围的应用。例子包括膜联蛋白A5的下列应用：
用于预防动脉粥样硬化性血栓形成和/或斑块破裂，如在WO 2005/099744中所描述(所述专利的内容通过引用并入本文)；
用于治疗血管功能障碍、减轻缺血性疼痛和/或治疗血管病破裂，如在WO 2009/077764中所描述(所述专利的内容通过引用并入本文)；
用于预防或治疗再狭窄，如在WO 2009/103977中所描述(所述专利的内容通过引用并入本文)；
用于抑制氧化心磷脂(oxCL)的活性并用于治疗、预防和/或减少患上心血管疾病、自身免疫性疾病或炎症状态的风险，如在WO 2010/069605中所描述(所述专利的内容通过引用并入本文)；以及
用于预防和/或减少在手术干预之后的围手术期或手术后并发症，例如血管手术(特别是外周血管手术)之后的并发症，如在WO 2012/136819中所描述(所述专利的内容通过引用并入本文)。
因此，膜联蛋白A5代表具有高治疗利益和潜能的蛋白质。因此，迫切需要利用高效且具有成本效益的方法来生产治疗级膜联蛋白A5蛋白质的有效方法；所述方法可以被扩大并且方便地应用于工业规模生产(例如，从具有约1000L或以上培养体积的重组宿主细胞培养物中采集膜联蛋白A5蛋白质)。
一个具体的问题是，当在标准细菌宿主细胞，如大肠杆菌(E.coli)中重组地表达膜联蛋白A5时被来源于宿主细胞的成分(尤其是内毒素)所污染。内毒素是一种脂多糖(LPS)，所述脂多糖是由脂质和通过共价键连接的O抗原、外核以及内核所组成的多糖构成；LPS被发现于革兰氏阴性细菌的外膜中，并且在动物中引起强免疫应答。膜联蛋白A5的特征是其与含有带负电荷磷脂的生物膜的强结合，因此对内毒素有特别高的亲和力。这使得由内毒素产生宿主大规模地工业化生产膜联蛋白A5更加具有挑战性。
迄今为止，尚未提供这种方法以利用高效且具有成本效益的方法来生产治疗级膜联蛋白A5蛋白质，所述方法可以被扩大并且方便地应用于工业规模生产(例如，从具有约1000L或以上培养体积的重组宿主细胞培养物中采集膜联蛋白A5蛋白质)，更不用说以解决内毒素污染的方式。
1991年，Kumar报道了对用于膜联蛋白A5的生产和提纯的方法的开发(本科荣誉学院论文，标题为“人重组膜联蛋白V蛋白质的表达、提纯以及大规模生产”，呈递给阿肯色大学工学院化工学院，阿肯色州费耶特维尔市，可通过网址https：//uarkive.uark.edu/xmlui/handle/10826/981在线获得)。Kumar的方法包括：在100mL培养瓶中利用重组大肠杆菌宿主细胞来表达膜联蛋白A5，使细胞形成团块，在由50mM Tris HCl、10mM CaCl2(pH7.2)所组成的匀化/裂解缓冲液的存在下重悬细胞，然后利用超声处理使细胞破裂从而释放出膜联蛋白A5蛋白质。所加入的CaCl2导致膜联蛋白A5以钙依赖性方式结合到碎片中的细胞膜，然后使混合物经历20分钟的第一提纯离心步骤，其后将上清液丢弃并且将含有细胞碎片和结合的膜联蛋白A5的细胞团块加以回收。使用EDTA将膜联蛋白A5从团块中释放出，接着是20分钟的第二提纯离心步骤和采集上清液中的膜联蛋白A5。然后，在DEAE-琼脂糖凝胶柱上的阴离子交换和利用盐梯度对膜联蛋白A5进行洗脱的进一步的步骤之前，进行一夜透析从而将用于膜联蛋白A5的缓冲液改变为Tris HCl(pH 8.0)。
本发明申请人已意识到Kumar的方法中存在着许多限制和缺点。第一，其仅使用100mL培养物小规模进行，并且在提纯方法期间需要两个独立的离心步骤。这不可扩展到以高效方式使用大体积培养物(例如1000L或以上)的工业化方法。如下面进一步的描述，这种大体积流体的离心将会是非常耗时且昂贵的。然而，Kumar的方法必须采用离心，而离心依赖于作为初步捕获步骤的利用膜联蛋白A5与细胞碎片中膜的钙诱导结合。第二，本发明申请人已意识到Kumar的方法导致膜联蛋白A5蛋白质的高损失，例如由于对第一提纯离心步骤的产物上清液中未结合的可溶性膜联蛋白A5的处理。第三，Kumar的方法完全不能将内毒素去除到适合于治疗应用的水平，并且值得注意的是，没有对最后产物中的内毒素水平进行检查。因此，Kumar的方法不能以高效且有时效的方式扩展到工业生产，导致膜联蛋白A5蛋白质的高损失(即，低产率)并且导致不适合于治疗应用的低级蛋白质提纯。
2008年，位于华盛顿大学医学中心的实验室医学部的Tait研究实验室发表了标题为“由质粒pET12a-PAPI生产重组膜联蛋白V”的文件。其可通过网址https：//depts.washington.edu/labweb/Faculty/Tait/108.pdf在线获得。所描述的方法非常类似于由Kumar提出的方法。所述方法包括：在1L培养物中的重组大肠杆菌宿主细胞中表达膜联蛋白A5，使细胞形成团块，在由50mM Tris HCl、10mM CaCl2(pH 7.2)所组成的匀化/裂解缓冲液的存在下重悬细胞，然后利用超声处理使细胞破裂从而释放出膜联蛋白A5蛋白质。所加入的CaCl2导致膜联蛋白A5以钙依赖性方式结合到碎片中的细胞膜，然后使混合物经历20分钟的第一提纯离心步骤，其后将上清液丢弃并且将含有细胞碎片和结合的膜联蛋白A5的团块加以回收。利用EDTA将膜联蛋白A5从团块中释放出，接着是20分钟的第二提纯离心步骤和采集上清液中的膜联蛋白A5。然后，在Mono Q柱上的阴离子交换和利用盐梯度将膜联蛋白A5洗脱的进一步的步骤之前，执行透析步骤将用于膜联蛋白A5的缓冲液改变成TrisHCl(pH 8.0)。本发明的申请人已意识到Kumar的方法中的许多限制和缺点也适合于此方法。
2014年，在Marder等人，2014，《BMC生物技术(BMC Biotechnology)》，14：33中标题为“利用流加培养生产重组人膜联蛋白V”的文章中提出了用于膜联蛋白A5的提纯的另一个方法。Marder等人报告了其方法是用以大规模生产重组人膜联蛋白V的流加方法，并且提出了此方法可将用于重组人膜联蛋白A5的工业应用扩展到如体内成像研究的应用。
但是，Marder等人的方法非常类似于Kumar的1991方法和位于华盛顿大学医学中心的实验室医学部的2008方法。Marder等人在容纳于2L贮罐中的1L培养物中的重组大肠杆菌宿主细胞中表达膜联蛋白A5。如在Marder等人的方法的提纯部分中所描述，在由50mMTris HCl、10mM CaCl2(pH 7.2)所组成的匀化/裂解缓冲液(缓冲液A)的存在下重悬所采集的细胞，然后利用超声处理使细胞破裂从而释放出膜联蛋白A5蛋白质。所加入的CaCl2导致膜联蛋白A5以钙依赖性方式结合到碎片中的细胞膜，然后使混合物经历30分钟的第一提纯离心步骤，其后丢弃上清液并且将含有细胞碎片的团块和结合的膜联蛋白A5加以回收。利用EDTA将膜联蛋白A5从团块中释放出，接着是30分钟的第二提纯离心步骤和对上清液中的膜联蛋白A5的采集。然后，在20分钟的第三提纯离心步骤之前，执行透析步骤将用于膜联蛋白A5的缓冲剂改变为Tris HCl(pH 8.0)，以便去除残余的沉淀物，然后是在Mono Q柱上的阴离子交换和利用盐梯度将膜联蛋白A5洗脱的进一步的步骤。再一次地，本发明申请人已意识到Kumar的方法中的许多限制和缺点也适用于此方法。
Kumar的1997方法、华盛顿大学医学中心的实验室医学部的2008方法以及Marder等人的2014方法清楚地表明本技术领域已开发并确立了用于工业目的之膜联蛋白A5产物的生产和提纯的方法，尽管这些方法的限制和缺点在本技术领域不受欢迎的，但没有现成的替代方法。
所有用于膜联蛋白A5回收的这些现有技术方法已显示仅在实验室规模的方法下被证明并且不能应用于扩大或者考虑较大规模的工业标准或可用设备。这些方法具有固有的缺点，从而使它们不适用于大规模生产。特别地，这些现有技术方法的高度限制性特征是方法所要求的两次或(在Marder等人的2014方法的情况下)三次高G力离心，其中膜联蛋白A5可替代地是在溶液中或者作为沉淀物。可以合理地估计到，仅将两个离心步骤应用于1000L批次的处理，导致将会花费约12周并且任何装备精良的生物制造设备每日轮班12小时的过程，从而造成无法接受的高生产成本。参见比较实施例1。
因此，本发明的一个目的是提供用于膜联蛋白A5的提纯和回收的方法步骤，所述方法步骤对于以工业规模(例如具有约1000L或以上培养体积的重组宿主细胞培养)运行的生产方法而言是高效且具有成本效益的，并且进一步克服现有技术方法所具有的产率损失和低纯度(包括内毒素污染)的缺点。
本发明的另一个目的是提供利用本发明的方法生产的医药级膜联蛋白A5产物。
发明内容
本发明申请人已对用于生产包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的蛋白质的方法进行了许多开发和改进，并且已设计出若干非常高效的提纯步骤，这些提纯步骤可独立地和/或联合地用于改进现有方法。最优选地，用于生产膜联蛋白A5的方法包含全部开发的方法步骤。
特别地，本发明申请人的开发提供了用于通过一种方法回收AnxA5蛋白的非常高效的方法的可能性，其中在整个方法中AnxA5蛋白优选地停留在溶液中(除暂时结合到色谱树脂时)。也就是说，本发明申请人的开发工作提供了一种可以优选地执行而无需在将AnxA5蛋白从宿主细胞中释放出之后采用任何针对AnxA5蛋白的提纯离心步骤的用于回收AnxA5蛋白的方法。这具有巨大的工业效益，因为用于采集沉淀物的高G力离心对于应用于大规模生物药物生产车间而言是困难的、缓慢的且高成本的。此外，这意味着本发明的方法都可以在不依赖于膜联蛋白A5与膜(例如，宿主细胞膜和/或脂质体)结合能力的情况下而执行，所述结合能力会常常导致膜联蛋白A5与不期望的污染物(如内毒素)共同提纯。
因此，所述方法可以应用于以高度时效性的方式对大体积(例如，约100L、500L、1,000L、5,000L、10,000L、50,000L、100,000L或以上)宿主细胞培养物的处理，并且不存在由一个或多个提纯离心步骤所导致的瓶颈。例如，优选的是，所述提纯方法在每1,000L(或少1,000L)被处理宿主细胞培养物中进行5周、4周、3周、2周，最通常地小于1周。此外，出人意料地，所述方法可以用于提供与较慢的、较低效率的现有技术方法相比提高的产率和/或提高的纯度(包括例如改进的内毒素去除)。
因此，本发明的第一方面提供从宿主细胞中释放蛋白质的改进步骤。更具体地，提供一种用于从具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达细胞内蛋白质的方法，其中所述方法包括从宿主细胞中释放细胞内蛋白质，其特征在于释放细胞内AnxA5蛋白的步骤是在包含非离子洗涤剂的匀化缓冲液的存在下执行。优选地，所述非离子洗涤剂是聚山梨醇酯，更优选地选自吐温20和吐温80的聚山梨醇酯，最优选地吐温80。
本发明申请人也已发现(如在下面的实施例2中进一步描述)，与其中提纯步骤的相继添加导致不断增加的产率损失(因为产物是在各步骤中损失)的常规方法相反，阴离子交换步骤与肝素亲和色谱步骤的组合具有出人意料的益处，即获得由单独肝素亲和色谱步骤所实现的高纯度并具有大幅提高的产率(即，回收率从约30％至40％提高到约70％至90％)。这与通常将会从提纯步骤的组合中所预料的正好相反。
因此，本发明的第二方面提供一种用于从包含AnxA5蛋白和一种或多种杂质的溶液中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的蛋白质的方法，所述方法包括：
使包含AnxA5蛋白和一种或多种杂质的溶液经历阴离子交换树脂从而执行第一阴离子交换步骤，由此产生包含释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物；和
使第一阴离子交换产物直接地或间接地经历亲和色谱步骤，由此产生包含释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物。
优选地，根据本发明的第二方面的方法，亲和色谱步骤可包括使AnxA5蛋白与固定化肝素结合，任选地其中利用钙离子的存在促进结合，并且进而任选地，利用含有钙离子螯合剂(如EDTA)的洗脱缓冲液将AnxA5蛋白从固定化肝素中洗脱出。
此外，如在实施例3中所描述，本发明申请人已发现吐温80对于肝素亲和色谱步骤具有尤其有利的作用(与其他非离子洗涤剂相比，包括其他吐温，例如吐温20)。将吐温80例如以大约0.1％(w/v)的含量包含在肝素亲和色谱步骤所使用的缓冲液中，可以有助于在单个峰中洗脱AnxA5蛋白、减小压力以及防止沉淀。
因此，本发明的第三方面提供一种用于从包含AnxA5蛋白和一种或多种杂质的溶液中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的蛋白质的方法，所述方法包括在吐温80存在下(优选地在约0.1％w/v吐温80存在下)使包含AnxA5蛋白和一种或多种杂质(其可以是或者可以不是如本文中所描述的第一阴离子交换色谱捕获步骤的直接或间接产物)的溶液经历肝素亲和色谱步骤，由此产生包含释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物。
本发明的第四方面是基于本发明申请人对于钙金属离子螯合剂(例如EDTA)可以对阴离子交换步骤的效能产生负面影响的认识。游离的EDTA(或其他螯合剂)可以直接地与阴离子交换官能团结合，由此降低结合能力和由阴离子交换步骤所实现的分离。另一方面，试图在阴离子交换步骤之前去除钙金属离子螯合剂是耗时的，因此也增加成本。因此，包括用于缓冲剂置换的慢速透析步骤的现有技术方法是低效率的。此外，在阴离子交换步骤期间，AnxA5产物中包含的钙金属离子螯合剂可以是防止AnxA5蛋白与杂质(包括内毒素)的钙介导结合的重要成分。因此，导入阻止或减少钙离子螯合剂与阴离子交换树脂结合的添加剂将会是方便且有效的，这将会允许在没有不便之处和与透析相关成本的情况下执行阴离子交换步骤，并且在阴离子交换步骤期间不妨碍钙金属离子螯合剂的有利作用。
本发明申请人已意识到这可以通过在阴离子交换之前将一种或多种类型的其他所选择金属离子包含在AnxA5蛋白产物中而实现，其中对其他的所选择金属离子进行选择使得钙金属离子螯合剂对所选择金属离子的结合亲和力大于其对阴离子交换树脂的结合亲和力但小于其对钙离子的结合亲和力。适当的其他金属离子的选择将取决于钙离子螯合剂的性质和阴离子交换树脂的性质。例如，在使用EDTA作为钙离子螯合剂的情况下，Mg2+离子通常适合于实现本发明的目的，并且可以在阴离子交换步骤之前被加入到AnxA5蛋白产物中。
因此，本发明的第四方面提供一种用于从包含AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂的组合物中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的蛋白质的方法，
其特征在于，所述方法包括该组合物经过阴离子交换树脂从而执行阴离子交换步骤，并由此从组合物中回收和/或提纯AnxA5蛋白，并且
其特征还在于，阴离子交换步骤在其他所选择金属离子的存在下执行，
其中对其他的所选择金属离子进行选择使得钙金属离子螯合剂对所选择金属离子的结合亲和力大于其对阴离子交换树脂的结合亲和力但小于其对钙离子的结合亲和力。
本发明的第五方面提供一种包含AnxA5蛋白的组合物，其中所述组合物是根据本发明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的方法的直接或间接产物(或者可直接地或间接地获得)。任选地，所述组合物是药学上可接受的和/或兽医学上可接受的组合物。
本发明的第六方面还提供本发明第五方面的组合物在医学中的使用。换句话说，本发明的第六方面提供一种包括将治疗有效量的本发明第五方面的组合物施用于人或动物的方法。
可想到的是，本文中所描述的任何方法或组合物可以应用于本文中所描述的任何其他方法或组合物。
当在权利要求和/或说明书中结合术语“包括”而使用时，词语“一个”或“一种”的使用可表示“一个”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
此外，当结合以下的描述和附图考虑时，将更好地领会并理解本发明的各方面。然而，应当理解的是，以下的描述虽然说明了本发明的各种方面和实施方式以及其许多具体细节，但是通过说明而给出并非限制。可在不背离本发明的精神的前提下在本发明的范围内作出许多替换、修改、添加和/或重新布置，并且本发明包括所有的这种替换、修改、添加和/或重新布置。
附图说明
图1示出了序列SEQ ID NO：1，其是人膜联蛋白A5的序列。
图2示出了用于膜联蛋白A5的示例性完整生产方法的示意性流程图。
图3提供用于示例性AX捕获色谱的方法流程图。
图4示出了用于示例性中间亲和色谱的方法流程图。
图5示出了用于示例性AX精制色谱步骤的方法流程图。
图6示出了用于示例性的膜联蛋白A5的超滤/渗滤及配制的方法流程图。
图7示出了实施例3的结果，其示出了吐温80对膜联蛋白A5的肝素亲和色谱提纯的影响，其中图7A示出了测试1(没有吐温80)的结果，图7B示出了测试2(有吐温80)的结果。
具体实施方式
A.膜联蛋白A5蛋白质
本发明涉及用于提纯和/或回收包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的蛋白质的方法，和由此生产的包含AnxA5蛋白的产品和制剂。
根据本发明的一个实施方式，被提纯和/或回收的AnxA5蛋白可包括、基本上由或由以下组成：包含具有或没有N末端甲硫氨酸的人膜联蛋白A5序列(SEQ ID NO：1，如图1中所示)的蛋白质。
在另一个实施方式中，被提纯和/或回收的AnxA5蛋白可包括、基本上由或由以下组成：包含具有或没有N末端甲硫氨酸的人膜联蛋白A5序列(SEQ ID NO：1，如图1中所示)的蛋白质的变异体或突变体。例如，变异体或突变体可在任何一个或多个位置，例如在或多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160或以上的位置，不同于SEQ ID NO：1(具有或不具有N末端甲硫氨酸)。
因此，膜联蛋白A5的变异体或突变体可以是其中在一个或多个位置已存在氨基酸插入、缺失或替换(保守的或者非保守的)的蛋白质。优选地，这些变化导致基本特性以与未被显著改变的膜联蛋白A5相同方式起作用的蛋白质。在本发明的上下文中，“显著地”表示本领域技术人员将会说变异体的特性会仍然是不同的，但相对于原始蛋白质的特性将不会是不明显的。
优选地，与未变性的蛋白质相比，变异体或突变体的等电点(pI)未改变，或者未改变达到大于1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1pH单位。
在一个优选实施方式中，AnxA5蛋白能够与生物膜上的磷脂酰丝氨酸结合，优选地达到在相同条件下由人膜联蛋白A5(SEQ ID NO：1)所显示水平的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或约100％的水平。用于测量与生物膜上的磷脂酰丝氨酸结合的膜联蛋白A5的合适方法在本技术领域是已知的(Vermes等人(1995)，《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》，184(1)：第39至51页)。
“保守的替换”是指如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；以及Phe、Tyr的组合。
变异体和突变体可利用本技术领域公知的蛋白质工程和定点突变方法来制作。
在另一个实施方式中，被提纯和/或回收的AnxA5蛋白可以是蛋白质的二聚体，所述二聚体包括、或基本上由或由以下组成：包含具有或没有N末端甲硫氨酸的人膜联蛋白A5序列(SEQ ID NO：1，如图1中所示)的蛋白质，或者如上所述的其变异体或突变体。
在另一个实施方式中，被提纯和/或回收的AnxA5蛋白可以是融合蛋白，所述融合蛋白包括、基本上由或由以下组成：(a)包括与融合蛋白融合的融合伴侣的序列的一个或多个蛋白质序列；(b)包括、基本上由或由以下组成的一个或多个蛋白质序列：包含具有或没有N末端甲硫氨酸人膜联蛋白A5序列(SEQ ID NO：1，如图1中所示)的蛋白质或者其变异体或突变体或二聚体(如上所述)。例如但没有限制，所述融合蛋白质可具有从以下中选择的一般结构：
-在两个氨基酸序列融合的的情况下，例如：H2N--(a)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(a)-COOH；或者
-在三个氨基酸序列融合的情况下，例如：H2N-(a)-(b)-(a)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(b)-(a)-COOH；或H2N-(a)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(a)-COOH；或者
-在四个氨基酸序列融合的情况下，例如：H2N-(a)-(a)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(a)-(a)-(b)-(a)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(a)-(a)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(a)-(a)-COOH；或H2N-(a)-(a)-(b)-(b)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(b)-(a)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(b)-(a)-COOH；或H2N-(b)-(b)-(a)-(a)-COOH；或H2N-(b)-(b)-(b)-(a)-COOH；或H2N-(b)-(b)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(b)-(b)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(b)-(b)-COOH；或者
-在五个氨基酸序列融合的情况下，例如：H2N-(a)-(a)-(a)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(a)-(a)-(a)-(b)-(a)-COOH；或H2N-(a)-(a)-(b)-(a)-(a)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(a)-(a)-(a)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(a)-(a)-(a)-COOH；或H2N-(a)-(a)-(a)-(b)-(b)-COOH；或H2N-(a)-(a)-(b)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(a)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(a)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(a)-(a)-(b)-(b)-(a)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(a)-(b)-(a)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(a)-(b)-(a)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(b)-(a)-(a)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(b)-(a)-(a)-COOH；或H2N-(b)-(b)-(a)-(a)-(a)-COOH；或H2N-(a)-(a)-(b)-(b)-(b)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(a)-(b)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(a)-(b)-(b)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(b)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(b)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(b)-(a)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(b)-(b)-(a)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(b)-(b)-(a)-COOH；或H2N-(b)-(b)-(b)-(a)-(a)-COOH；或H2N-(a)-(b)-(b)-(b)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(a)-(b)-(b)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(b)-(a)-(b)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(b)-(b)-(a)-(b)-COOH；或H2N-(b)-(b)-(b)-(b)-(a)-COOH，
其中，(a)和(b)如在本节中的上面所定义。在多个融合伴侣蛋白质的情况下，如由(a)所定义，多个融合伴侣可以是相同的或不同的。可使用任何感兴趣的融合伴侣。例如，融合伴侣多肽序列可适合于延长患者循环系统内部的分子的半衰期和/或进一步增加分子功能，如增加其他的治疗特性(例如抗凝血、细胞抑制和/或杀伤等)。在包含包括具有或没有N末端甲硫氨酸的人膜联蛋白A5序列(SEQ ID NO：1，如图1中所示)的多个蛋白质序列的融合蛋白质或者其变异体或突变体或二聚体(如上所述)，如由(b)所定义的情况下，这些蛋白质可以是相同或不同的。
根据本发明的另一个实施方式，被提纯和/或回收的AnxA5蛋白可以是包括、基本上由或由以下组成：膜联蛋白A5的序列或者从以下中选择的其功能性变异体或突变体的蛋白质：
(a)具有或没有N末端甲硫氨酸的人膜联蛋白A5(SEQ ID NO：1)；
(b)人膜联蛋白A5的哺乳动物同源；
(c)(a)或(b)的等位基因或遗传变异体；
(d)与(a)、(b)或(c)中任一个的相似度大于50％、60％、70％、75％，如大于80％、85％、大于90％或者更优选地大于95％或99％的蛋白质；
(e)(a)、(b)、(c)或(d)中任一个的二聚体；或者
(f)包含融合到(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中任一个的一个或多个融合伴侣的融合蛋白质。
在各具体实施方式中，AnxA5蛋白是与具有或没有N末端甲硫氨酸的人膜联蛋白A5(SEQ ID NO：1)的相似度大于50％、60％、70％、75％、如大于80％、85％、大于90％或者更优选地大于95％或99％的膜联蛋白A5的功能性变异体或突变体。
两个氨基酸序列之间的一致性以如下方式确定。第一，利用来自包含BLASTN版本2.0.14和BLASTP版本2.0.14的BLASTZ的独立版本的BLAST2序列(Bl2seq)程序，将氨基酸序列与例如SEQ ID NO：1进行比较。BLASTZ的此独立版本可以从美国政府的国立生物技术中心网站ncbi.nlm.nih.gov.上获得。解释如何使用BI2seq程序的指导说明可以发现于BLASTZ附带的自述文件。Bl2seq利用BLASTP算法执行两个氨基酸序列之间的比较。为了对两个氨基酸序列进行比较，以如下方式设定BI2seq的选项：将-i设置到含有被比较的第一氨基酸序列的文件(例如，C：\seq1.txt)；将-j设置到含有被比较的第二氨基酸序列的文件(例如，C：\seq2.txt)；将-p设置到blastp；将-o设置到任何期望的文件名(例如，C：\output.txt)；并且所有其他选项保留它们的默认设置。例如，以下的命令可以用于生成含有两个氨基酸序列之间的比较的输出文件：C：\Bl2seq-i c：\seq1.txt-j c：\seq2.txt-pblastp-o c：\output.txt。如果这两个被比较序列有同源性，那么被指定的输出文件将以对齐序列的方式给出同源性的这些区域。如果两个被比较的序列没有同源性，那么被指定的输出文件将不给出对齐序列。一旦被对齐，则通过对其中相同的核苷酸或氨基酸残基存在于这两个序列中的位置的数量进行计数来确定匹配的数量。
一致性是通过将匹配的数量除以在被鉴定序列中所示序列的长度接着将所获得值乘以100而确定。例如，如果对一个序列与在SEQ ID NO：1中所示的序列进行比较(在SEQID NO：1中所示序列的长度为320)并且匹配的数量为288，那么该序列与在SEQ ID NO：1中所示的序列具有90(即，288÷320×100＝90)的一致性。
AnxA5蛋白可以是膜联蛋白A5的二聚体(例如DiAnnexin)或者其功能性变异体或突变体。DiAnnexin A5公开于WO 02/067857中。
优选地，AnxA5蛋白不包含组氨酸标签，并且其回收和提纯不是利用与组氨酸标签序列的亲和结合的步骤来实现。
组氨酸标签(His-tag)是蛋白质中的聚组氨酸氨基酸基序，其通常由至少六个组氨酸(His)残基组成并且常常(尽管不一定)是在蛋白质的N端或C端。聚组氨酸标签常常用于通过使用含有结合的二价镍或钴离子的亲和树脂(不同的品种可从市场上购得)的保温培养对在大肠杆菌(Escherichia coli)和其他原核表达系统中所表达聚组氨酸标记的重组蛋白质进行亲和提纯。这些树脂通常是用螯合剂(例如用于镍的亚氨基二乙酸(Ni-IDA)和次氮基三乙酸(Ni-NTA)以及用于钴的羧甲基天门冬氨酸(Co-CMA))而官能化的琼脂糖凝胶/琼脂糖，其中聚组氨酸标签以微摩尔亲和力结合。然后，通常用磷酸盐缓冲液清洗树脂，以去除不特异性地与钴或镍离子相互作用的蛋白质。利用基于Ni的方法，可以通过添加20mM咪唑(通常用150mM至300mM咪唑对蛋白质进行洗脱)来提高清洗效率。
尽管组氨酸标签方法可方便地用于提纯，但在治疗性蛋白质(包括AnxA5蛋白)中非天然聚组氨酸基序的存在是不期望的，因为这会导致患者的不良反应，例如免疫应答。可替代地，在蛋白质生产后试图去除组氨酸标签基序是繁琐、耗时且高成本的，并且实际上从其中已将组氨酸标签去除的蛋白质制剂通常会保留一个或多个外来的组氨酸残基。
因此，优选地，AnxA5蛋白不包含组氨酸标签，并且其回收和提纯不是利用与组氨酸标签序列的亲和结合的步骤来实现。
本发明的AnxA5蛋白可以是或可以不是(优选地不是)被修改从而包括一个或多个，如多达二十个的RGD(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)基序的、具有人膜联蛋白A5序列的蛋白质的变异体或突变体，如在WO 2010/140886中所公开，所述专利的内容通过引用并入本文。如WO 2010/140886中所描述，一个或多个RGD基序的加入可以用于利用与凋亡细胞上的磷脂酰丝氨酸(PS)结合的AnxA5变异体增强吞噬作用，并且激活吞噬细胞从而吞食凋亡细胞而不是抑制吞噬作用。
B.宿主细胞培养
可以在宿主细胞培养物中重组地表达AnxA5蛋白。根据本发明，表达AnxA5蛋白的优选宿主细胞培养物是用于AnxA5蛋白生产的工业规模的培养物，例如具有约100L、约200L、约300L、约400L、约500L、约600L、约700L、约800L、约900L、约1,000L、约2,000L、约3,000L、约4,000L、约5,000L、约6,000L、约7,0000L、约8,0000L、约9,0000L、约10,000L、约20,000L、约30,000L、约40,000L、约50,000L、约60,000L、约70,0000L、约80,0000L、约90,0000L、约100,000L或以上的培养体积的培养物。在本上下文中，术语“约”可以包括指定体积的±50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的含义。
用于感兴趣基因的重组表达的方法在本技术领域是公知的。
通常，编码AnxA5蛋白的核苷酸序列将在宿主细胞培养物中被重组表达。例如，可通过利用质粒或包含编码AnxA5蛋白的序列的其他载体对宿主细胞进行转化，将编码AnxA5蛋白的序列导入宿主细胞中，并且任选地编码AnxA5蛋白的序列将被整合到宿主细胞染色体(或质体基因组)中或者被保持在可复制染色体外载体上。
因此，可以利用包含编码AnxA5蛋白的序列的多核苷酸载体构建体对宿主细胞进行转化。
宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞。
在本发明的上下文中，细菌细胞是优选的原核宿主细胞。细菌宿主细胞可以是例如革兰氏阳性或革兰氏阴性宿主细胞(尽管也可使用革兰氏中性和革兰氏不定细菌)。革兰氏阴性细菌的例子包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(higella)、假单胞菌(Pseudomonas)、奈瑟氏菌(Neisseria)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)以及霍乱弧菌(Vibrio cholera)。
至少在本发明第一方面的上下文中和任选地在本发明所有方面的上下文中，宿主细胞是具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞，因此通常是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌，例如从贝塞斯达Research Laboratories有限公司(贝塞斯达，马里兰州，美国)获得的大肠杆菌菌株DH5、和从(罗克维尔，马里兰州，美国)的美国模式培养物保藏所(ATCC)(NoATCC31343)获得的RR1。
为免存疑，术语“具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞”可以被理解成排除酵母菌(如酿酒酵母)和其他真核细胞。
另一个特别优选的大肠杆菌的内毒素产生菌株包括菌株BL21(DE3)(例如在市场上广泛出售的，和如在Marder等人，2014，BMC Biotechnology，14：33中所描述的)。然而，本发明申请人已发现从菌株BL21(DE3)中所表达的膜联蛋白A5出人意料地显示出乎预料地高水平的不期望的转译后葡糖基化，使得约40％的膜联蛋白A5蛋白质被葡萄糖酸化。这比在通常显示约仅5％至10％葡糖基化水平的BL21(DE3)中的大部分其他重组表达的蛋白质的葡糖基化水平高得多。因此，更优选的是大肠杆菌的内毒素产生菌株是被设计成降低AnxA5蛋白的葡糖基化水平的BL21(DE3)的菌株，例如通过过量表达磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)，如在Aon等人(应用与环境微生物学(Appl.Env.Microbiol.)，2008，74(4)：950-958中所描述；所述文献的内容通过引用并入本文)由此抑制重组表达蛋白质的转译后葡糖基化，因此抑制AnxA5蛋白的葡萄糖酸化变异体的形成达到低于40％，例如低于30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％，并且优选地大致为0％的水平。
通常，使用于本发明的细菌宿主细胞是具有细胞壁的细菌宿主细胞，并因此优选地排除缺乏细胞和(在革兰氏阴性细菌的情况下)外膜的细胞，如原生质球(如在Liu等人，2006，《实验微生物学杂志(J.Exp.Microbiol.)》，9：81-85中所描述；所述文献的内容通过引用并入本文)。在本申请的上下文中，原生质球不是内毒素产生宿主细胞并且不具有细胞壁。原生质球完全不适用于工业规模生产，特别是由于其在没有细胞壁情况下的敏感性和脆弱性，这严重地限制了它们的在大体积培养物中有效地生长的能力。
任选地，所述宿主细胞是不能利用渗透压冲击和/或冻结/解冻处理而溶解的具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞。
在另一个选项中，宿主细胞培养物是其中不在不具有耐药性的抗生素存在下并且任选地不在任何抗生素存在下培养宿主细胞的培养物。在一个实施方式中，避免使用的特定抗生素是导致原生质球的形成的抗生素，如氨苄青霉素。
真核宿主细胞可包括酵母菌和哺乳动物细胞，优选地脊椎动物的细胞，如来自小鼠、大鼠、猴或人成纤维细胞系的细胞。酵母菌宿主细胞包括通常从Stratagene克隆系统(拉由拉市，加利福尼亚州92037，美国)获得的YPH499、YPH500以及YPH501。优选的哺乳动物宿主细胞包括以CCL61从ATCC获得的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、以CRL1658从ATCC获得的NIH瑞士大鼠胚胎细胞NIH/3T3以及以CRL1650从ATCC获得的来源于猴肾的COS-1细胞。优选的昆虫细胞是可以用杆状病毒表达载体所转染的Sf9细胞。
典型的原核载体质粒是：从伯乐实验室(Biorad Laboratories)(里士满，加利福尼亚州，美国)获得的pUC18、pUC19、pBR322以及pBR329；从法玛西亚(Pharmacia)(皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)获得的pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540以及pRIT5；从Stratagene克隆系统(拉由拉市，加利福尼亚州92037，美国)获得的pBS载体、噬菌体脚本载体、质粒载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A。
典型的哺乳动物细胞载体质粒是从法玛西亚(Pharmacia)(皮斯卡塔韦，新泽西州，美国)获得的pSVL。此载体利用SV40晚期启动子来驱动克隆化基因的表达，最高水平的表达发现于T抗原产生细胞中，例如COS-1细胞。可诱导哺乳动物表达载体的一个例子是pMSG，也从法玛西亚(Pharmacia)公司获得(皮斯卡塔韦市，新泽西州，美国)。此载体利用小鼠乳腺癌病毒长末端重复序列的糖皮质激素可诱导启动子来驱动克隆化基因的表达。
有用的酵母菌质粒载体是pRS403-406和pRS413-416，并且通常是从Stratagene克隆系统获得(拉由拉市，加利福尼亚州92037，美国)。质粒spRS403、pRS404、pRS405以及pRS406是酵母菌整合质粒(YIps)并且包含酵母菌可选择标志HIS3、TRP1、LEU2以及URA3。质粒pRS413-416是酵母菌着丝粒质粒(YCps)。
本领域技术人员公知的方法可以用于构建含有AnxA5蛋白编码序列和例如适当的转录或翻译控制的表达载体。一种这样的方法包括经由同聚物尾部的连接。同聚物polydA(或polydC)尾部被加入到在待被末端脱氧核苷酸转移酶克隆化的DNA片段上的暴露的3'-OH基。然后片段能够退火到被加入到线性化质粒载体的端部的polydT(或polydG)尾部。可以利用DNA聚合酶和由DNA连接酶连接的游离端部将退火后留下的缺口加以填充。
另一个方法包括经由黏端的连接。可以通过合适的限制性酶的作用在DNA片段和载体上产生配伍的黏端。这些端部将经过互补碱基配对快速地退火，并且可以通过DNA连接酶的作用将剩余的切口闭合。
再一个方法使用被称为接头和连接物的合成分子。利用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I产生具有平端的DNA片段，其去除突出的3'末端并填充凹形的3'端部。可以利用T4DNA连接酶将合成接头(其是含有用于所定义限制性酶的识别序列的平端双链DNA的部分)连接到平端DNA片段。随后，利用适当的限制性酶将它们消化以形成黏端并且连接到具有配伍末端的表达载体。连接物也是化学合成的DNA片段，其含有一个用于连接的平端但也具有一个预先形成的黏端。
含有多种限制性内切核酸酶位点的合成接头从多个来源购得，包括International Biotechnologies有限公司，纽黑文市，CN，美国。
修饰编码AnxA5蛋白的DNA的理想方法是利用聚合酶链反应，如由Saiki等人(1988)《科学(Science)》239,487-491所公开。在此方法中，利用两个特异性的寡核苷酸引物与被酶扩增的DNA旁侧连接，使得这两个寡核苷酸引物自身被并入扩增的DNA中。所述特定引物可含有限制性内切核酸酶识别位点，这些位点可以用于利用本技术领域已知的方法进行克隆进入表达载体。
具有含编码AnxA5蛋白序列的DNA构建体的适当细胞宿主的转化利用公知方法完成，所述方法通常取决于所使用载体的类型。
关于原核宿主细胞的转化，参见例如Cohen等人(1972)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》69，2110和Sambrook等人(2001)《分子克隆实验指南(Molecular Cloning，ALaboratory Manual)》，第3版。冷泉港实验室(Cold Spring HarborLoabortory)，冷泉港，NY。酵母菌细胞的转化描述于Sherman等人(1986)《酵母遗传学方法实验指南(Methods In Yeast Genetics，A Laboratory Manual)》，冷泉港，NY。Beggs的方法(1978)《自然(Nature)》275，104-109也是有用的。就脊椎动物细胞而言，可用于转染这种细胞的试剂，例如钙磷酸盐和DEAE-葡聚糖或脂质体制剂，是从Stratagene克隆系统或者生命科技有限公司(Life Technologies Inc.)，盖瑟斯堡市，马里兰州20877，美国获得。
电穿孔法也可用于转化细胞并且在转化酵母菌细胞、细菌细胞以及脊椎动物细胞的技术领域中是公知的。
例如，许多细菌种可以化利用Luchansky等人(1988)《分子微生物学(Mol.Microbiol.)》2，637-646中所描述方法进行转化，所述文献的内容通过引用并入本文。在25μFD使用6250V/cm悬浮于2.5X PEB中的DNA细胞混合物的电穿孔之后，始终地回收最大数量的转化体。
利用电穿孔对酵母菌进行转化的方法公开于Becker和Guarente(1990)，《酶学方法(Methods Enzymol.)》194，182。
物理方法可用于将DNA导入动物和植物细胞。例如，显微注射利用非常细的吸管将DNA分子直接地注入被转化细胞的细胞核中。另一个例子包括利用高速微弹(通常是用DNA所覆盖的金或钨的粒子)对细胞进行轰击。
成功转化的细胞，即具有包含编码AnxA5蛋白序列的DNA构建体的细胞，可以利用公知的技术加以鉴定。例如，一个选择技术包括将编码被转化细胞中的可选择性状的DNA序列(标志)并入表达载体中。这些标志包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性基因，和用于在大肠杆菌和其他细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素耐性基因。可替代地，用于这种可选择性状的基因可以是在另一种载体上，所述载体用于所期望宿主细胞的共同转化。
标志基因可以用于鉴定转化体，但理想的是确定细胞中的哪些含有重组DNA分子和哪些含有自身连接的载体分子。这可以通过使用克隆载体而实现，其中DNA片段的插入破坏存在于分子上的基因之一的完整性。因此，可以基于基因的功能损失鉴定重组体。
鉴定成功转化细胞的另一个方法包括使由包含编码AnxA5蛋白序列的表达构建体的导入而获得的细胞生长以产生本发明的多肽。可以将细胞收集并溶解，并且利用例如由Southern(1975)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》98,503或Berent等人(1985)《生物技术(Biotech.)》3，208所描述的方法对它们的DNA含量进行检查以判断DNA的存在。可替代地，可以利用抗体检测蛋白质在上清液中的存在，如下面所描述。
除了直接地测定重组DNA的存在以外，当重组DNA能够指导蛋白质的表达时，可以利用公知的免疫学方法来确认成功的转化。例如，用表达载体成功转化的细胞产生显示适当抗原性的蛋白质。将怀疑被转化细胞的样品进行收集，并且利用合适的抗体对蛋白质进行测定。
因此，可以对转化的宿主细胞自身进行培养以提供表达AnxA5蛋白的培养物转化宿主细胞。培养物可以是营养培养基中的单克隆(克隆均匀)培养物或者从单克隆培养物获得的培养物。
在合适的生长条件下使表达AnxA5蛋白的转化宿主细胞的培养物生长，直到实现期望的细胞密度，通常对细胞密度进行选择从而使生产率与时间和与培养相关的成本达到平衡，然后通常将细胞收集。对于任何给定的培养物，可以凭经验确定细胞收集的最佳时间。
收集可例如包括从培养基中采集宿主细胞(这些宿主细胞通常是完好的，并且通常在细胞内保留大体上全部的(例如，大于80％、90％、95％、99％或100％)的AnxA5蛋白)。这通常可以通过离心或过滤而实现，以便以生物质的形式采集培养的宿主细胞。在离心的情况下，可以将上清液丢弃，可以将细胞团块直接地或间接地(例如在储存后，如冷冻)转移到细胞培养匀化阶段。
C.细胞培养物匀化
如上所述，本发明的第一方面提供一种从宿主细胞中释放蛋白质的改进步骤。更具体地，提供一种用于从具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达细胞内蛋白质的方法，其中所述方法包括从宿主细胞中释放细胞内蛋白质，其特征在于释放细胞内AnxA5蛋白的步骤是在包含非离子洗涤剂的匀化缓冲液的存在下执行。
优选地，非离子洗涤剂是聚山梨醇酯，更优选地选自吐温20和吐温80的聚山梨醇酯，最优选地吐温80。可替代地，尽管较不优选地，可使用其他非离子洗涤剂，但是因为会干扰在回收过程期间UV吸收监测蛋白质的存在的能力，所以优选的是避免(在细胞培养匀化步骤和所述方法的任何其他步骤中)使用非离子洗涤剂，所述洗涤剂具有类似于蛋白质最大吸收的在275nm和280nm之间的UV吸收λmax。在本上下文中，“类似的”可以包括λmax是在被提纯的AnxA5蛋白的最大吸收的10mn、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm或1nm内的含义。因此，例如优选的是非离子洗涤剂不是Triton X-100，其具有λmax＝275nm，因此优选的是Triton X-100不用于细胞培养物匀化步骤和/或本发明方法的任何其他步骤。
应当指出的是，可将非离子洗涤剂包含在被加入到细胞中的匀化缓冲液中(例如，匀化缓冲液可以是“预先形成的”并且含有非离子洗涤剂)；或者将细胞悬浮于没有非离子洗涤剂的匀化缓冲液中，然后可以在细胞匀化之前将非离子洗涤剂加入到匀化缓冲液中的悬浮细胞并且混合，以释放细胞内AnxA5蛋白。
优选地，释放细胞内AnxA5蛋白的步骤是在包含一定量的非离子洗涤剂的匀化缓冲液存在下执行，所述非离子洗涤剂有效地减小(例如达50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或以上)或防止膜联蛋白A5与内毒素之间的结合。利用本技术领域公知并确立的方法来测定内毒素水平，例如通过鲎变形细胞溶解物(LAL)试验。
例如，匀化缓冲液可包含0.01至10％(w/w)的非离子洗涤剂，如0.02％至5％(w/w)、0.05％至2％(w/w)或约1％(w/w)的非离子洗涤剂。在上下文中，术语“约”可以包括±0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％(w/w)的含义。
优选的是，钙离子或可离子化钙化合物(如CaCl2)不被加入或包含于匀化缓冲液中。因此，优选的是，从宿主细胞中释放细胞内AnxA5蛋白时，匀化缓冲液中的游离钙离子浓度低于10mM，优选地低于5mM、4mM、3mM、2mM或1mM，更优选地低于500μM、400μM、300μM、200μM、100μM、50mM、40μM、30μM、20μM、10μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM或大致为零。
在一个实施方式中，匀化缓冲液可包含钙金属离子螯合剂。优选的是，考虑包括酶处理的可选的随后步骤(其中这种酶使用Mg2+作为辅因子)，来选择不强烈结合Mg2+的钙离子螯合剂，如乙二醇四乙酸(EGTA)。可替代地，包括酶处理的可选的随后步骤(其中这种酶使用Mg2+作为辅因子)可被不需要Mg2+的其他步骤替代。在此情况下，可将任何钙离子螯合剂，如EGTA或乙二胺四乙酸(EDTA)包含在匀化缓冲液中。
任选地，匀化缓冲液中游离钙离子的浓度和/或钙金属离子螯合剂的量是有效地减少(例如达50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或以上)或防止膜联蛋白A5与宿主细胞的细胞膜和/或细胞壁成分之间结合的量，如与在pH为7.2的由50mM Tris HCl、10mMCaCl2组成的匀化缓冲液存在下将会观测的结合水平相比。
例如，根据本发明第一方面的匀化缓冲液可包含0.01至500mM，如0.05至100mM、0.5至20mM、1至15mM、2至10mM或约4mM钙金属离子螯合剂，并且优选地其中钙金属离子螯合剂是EDTA或EGTA。
如上所述，根据本发明第一方面的细胞培养物匀化的步骤不包括用于从宿主细胞碎片中提纯和分离释放的AnxA5蛋白的离心的步骤。然而，为了确定对匀化缓冲液中游离钙离子和/或有效量的钙金属离子螯合剂的耐受性，可以利用对溶解细胞等分试样的离心步骤执行简单的测试。在细胞匀化后，使溶解细胞等分试样(例如100mL)经历离心(例如以38,900g达30分钟)，然后将上清液与团块分离。测定上清液中AnxA5蛋白的量从而提供“游离”AnxA5蛋白的水平。使团块重悬于50mM Tris HCl、20mM EDTA(pH7.2)中，并且在4℃下搅拌30分钟，以释放任何结合的AnxA5蛋白，然后在4℃以38,900g离心30分钟，并且测定释放进入上清液的结合的AnxA5蛋白的量从而提供“结合的”AnxA5蛋白的水平。在本上下文中，AnxA5与宿主细胞的细胞膜和/或细胞壁成分的结合百分率＝(“结合的”AnxA5蛋白的水平/(“结合的”AnxA5蛋白的水平+“游离的”AnxA5蛋白的水平))x100。
优选地，如通过前述方法所测定，所形成生物质匀化产物中结合的AnxA5的百分率小于50％、40％、30％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或大致0％。
尽管在本文中被称为“匀化缓冲液”，但这对于是pH缓冲液的溶液而言不一定是必需的。然而，任选地，匀化缓冲液还可包含其他成分，包括缓冲剂(例如Tris)，并且可任选地根据需要将pH调节到例如大约pH 6至8，更优选地在pH 7至8.5的范围内，如约pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。在一个实施方式中，可选择使用pH 7.4。
如上所述，也优选的是，在一些随后的步骤包括使用需要辅因子(如Mg2+)的酶的酶处理选项中，将辅因子包含在匀化缓冲液中。
在一个示例性实施方式中，用于根据本发明第一方面的匀化缓冲液包括、基本上由或由以下组成：50mM Tris(pH 7.4)、1mM MgCl2以及1％(w/w)吐温80的水溶液。
本发明第一方面的方法可包括以下步骤：在匀化缓冲液中以每升匀化缓冲液约1g至300g生物质(湿重量)，如以每升匀化缓冲液约10g至200g生物质的浓度，将来自宿主细胞培养物的生物质加以混合。示例性浓度可以是约10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L或200g/L。每升匀化缓冲液约100g生物质的重悬比率会是尤其优选的。在本上下文中，术语“约”意图包括规定值的±5g/L、4g/L、3g/L、2g/L或1g/L。
混合通常是在室温左右进行，即通常大约18℃至28℃，如在约19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃或27℃下。优选的是，在混合过程期间控制温度从而将温度维持在选自前面列表的温度或其左右(例如±5℃、4℃、3℃、2℃或1℃)，尽管此阶段主动温度控制通常是不需要的。
任选地，匀化缓冲液也可在与生物质但混合之后但在宿主细胞匀化之前包含可用于酶处理的一个或多个酶或者加入其中。例如，适合的是在匀化之后包括或加入一个或多个核酸酶从而有助于核酸(包括DNA和/或RNA)从宿主细胞中降解。这将降低随后产生的匀化产物的粘度，并由此有助于下游处理步骤。可使用任何合适的酶。酶可以是例如核酸酶，如核酸酶A，优选地来自粘质沙雷氏菌的核酸酶A。一个这种感兴趣的示例性酶是全能核酸酶(来自粘质沙雷氏菌的内切核酸酶)，其可从商业来源获得，包括默克(Merk)/Novagen、西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)等，所述酶可用于使所有形式的DNA和RNA降解同时不具有蛋白水解活性。所述酶在大范围的条件下有效，并且具备高特异性的活性。所述酶完全将核酸消化成5′-单磷酸封端的寡核苷酸长度为2至5个碱基(低于杂交限值)，这对于从重组蛋白质中去除核酸是理想的，从而符合关于核酸污染的FDA指导原则。所述全能核酸酶需要1-2mM Mg2+用于激活，并且在离子和非离子洗涤剂、还原剂、蛋白酶抑制剂MSF(1mM)，螯合剂EDTA(1mM)以及尿素存在下仍然具有活性(相对活性取决于特定的条件)。本领域技术人员将能够容易地确定这种核酸酶的有效浓度，尽管本发明申请人已确定所述全能核酸酶至少当以约每升宿主细胞培养物3.3U或约每升重悬生物质1.85U下预先稀释使用时是有效的。在本上下文中，术语“约”可包括指定单位数的±90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％。
在匀化缓冲液中从宿主细胞中释放细胞内AnxA5蛋白的步骤可以包括用于细胞匀化或溶解的任何合适的方法。例如，所述步骤可包括对宿主细胞进行溶解、破裂或者匀化、超声处理或压力处理，使得宿主细胞的细胞壁和细胞膜屏障破裂，并由此释放出细胞内AnxA5蛋白。在本发明第一方面的某些选项中，此步骤不包括渗透压冲击和/或冻结-解冻步骤的使用。
在本发明第一方面的一个优选实施方式中，从宿主细胞中释放细胞内AnxA5蛋白的步骤包括高压匀化，如在约400巴和约2,500巴之间的一个或多个循环的高压匀化，优选地约600巴的三个匀化循环，或者约800巴的两个匀化循环。在本上下文中，术语“约”可以包括规定值的±500巴、400巴、300巴、200巴、100巴、50巴、40巴、30巴、20巴或10巴。
任选地，例如在其中未将核酸酶加入以使核酸降解(例如，其中匀化缓冲液中Mg2+的浓度过低，如由于包含Mg2+螯合剂)的情况下，有利的是包括多个其他的回合的高压匀化(例如2至4回合，在约600至2500巴范围内的压力下)从而使核酸降解并且减小匀化产物的粘度。
因此，在细胞匀化之后，释放细胞内AnxA5蛋白的步骤可产生包含释放的AnxA5蛋白的生物质匀化产物。优选地，生物质匀化产物是匀化的，由此包括至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、96％、97％、98％、99％或大致100％的生物质的细胞被分解的含义。
基于所采用的细胞匀化方法，所述技术可导致匀化产物的温度升高。优选的是以这种方式执行细胞匀化技术并且/或者应用温度控制，以防止不期望的温度升高。然而，例如在匀化产物含有酶处理如全能核酸酶的情况下，有利的是利用温升而移动到接近于酶的最佳温度范围，并且优选地在该温度范围内。在全能核酸酶的情况下，在约36℃至40℃范围内的温度会是尤其合适的。
在细胞匀化过程包括利用需要金属离子辅因子(例如Mg2+)的酶的酶处理的情况下，并且进一步在匀化缓冲液不包含钙金属离子螯合剂的情况下，则在一个选项中，可在酶处理完成之后加入钙离子螯合剂。这可在澄清处理步骤之前或之后进行，如下所述。
在细胞匀化之后，生物质匀化产物通常还包含一个或多个(通常全部的)杂质，所述杂志选自由以下组成的群组：宿主细胞蛋白质、宿主细胞壁成分、宿主细胞膜成分、宿主细胞核酸以及内毒素。
优选的是，匀化产物的粘度足够低低从而有助于下游处理步骤。
D.匀化产物的澄清处理
任选地，并且在一个优选实施方式中，在生物质匀化产物的生成之后利用澄清处理步骤进行处理。
因此，在本发明第一方面的另一个实施方式中，所述方法还包括使生物质匀化产物澄清，并由此产生包含释放的AnxA5蛋白的澄清化产物的步骤。执行此步骤以降低核酸的含量，此外获得颗粒减少的溶液，所述溶液可以应用于随后的提纯步骤(如捕获色谱)，如下面进一步的描述。
可以执行任何合适的澄清处理步骤或各步骤的组合。例如，澄清处理方法可包括(优选地，在核酸酶处理后)以下步骤：使包含释放的AnxA5蛋白的生物质匀化产物通过过滤器(如纤维素或聚丙烯过滤器)，其中过滤器流出物是包含释放的AnxA5蛋白的澄清化产物。
优选地，过滤器是深度过滤器，并且/或者优选地，过滤器具有小于4μM，如小于3mm、2mm或1mm的截留，最优选地在0.2mm至0.6mm范围内的截留。例如，可以使用0.6μm至0.2μm截留深度过滤器的过滤使匀浆澄清化，过滤器的例子是可商业获得的，例如可获得的基于纤维素的Cuno60SP深度过滤器。发现的其它提供良好的性能(即良好的过滤并且没有产物损失)的深度过滤器，尽管不如优选的纤维素Cuno60SP深度过滤器(具有0.6μm至0.2μm截留)，包括具有0.5μM截留的纤维素+硅藻土过滤器(例如，从德国贝舸(Begerow)获得的PR12UP)；具有1.2μM截留的聚丙烯过滤器(例如从赛多利斯(Sartorius)获得的SartopurePP2)；具有0.1μM截留的纤维素过滤器(例如，从赛多利斯获得的Sartopure S9)；具有0.65μM截留的聚丙烯过滤器(例如，从赛多利斯获得的Sartopure PP2)；以及具有0.2μM至0.5μM截留的纤维素过滤器(例如从颇尔(Pall)获得的EK 1P或EKM-P，这两个性能良好但速度慢)。进一步的测试表明具有较大截留(例如>4μM)的过滤器仅实现中等的颗粒去除，因此是较不优选的。
本发明申请人也已发现，基于带正电荷纤维素的过滤器另外还降低在澄清化匀化产物中的DNA含量，并因此可代表尤其优选类型的用于澄清处理步骤的过滤器。
此外，已发现基于纤维素的过滤器需要较小的过滤面积，用以提供与相应的聚丙烯过滤器相比更有效的澄清处理。这会是尤其优先地使用用于澄清处理步骤的基于纤维素类型的过滤器的另一个原因。
过滤器的选择也可以取决于所采用匀化的程度和性质。例如，本发明申请人已发现，在通过约600巴的三次匀化循环而执行细胞匀化的情况下，每1L匀化产物约60cm2的过滤面积是合适的，而在通过约800巴的两次匀化循环而执行细胞匀化的情况下，具有每1L匀浆约180cm2的面积是合适的。因此，可任选地将深度过滤选择成具有每升澄清化匀化产物10cm2至500cm2，例如30cm2/L至400cm2/L、40cm2/L至250cm2/L、50cm2/L至200cm2/L或60cm2/L至180cm2/L，例如50cm2/L至100cm2/L或60cm2/L至80cm2/L；或者120cm2/L至240cm2/L或150cm2/L至210cm2/L。
在澄清处理后，可通过一个或多个其他添加剂的添加对澄清化产物进行进一步调节，以便于随后的步骤。例如，适合的是通过以下的一个或两个的添加对澄清化产物进行调节：(a)非离子洗涤剂，如聚山梨醇酯，最优选地吐温80；和(b)钙金属离子螯合剂，如EDTA，除非澄清化产物因包含于匀化缓冲液中和/或在酶处理步骤后添加已含有充分水平的螯合剂。
在一个示例性实施方式中，用1％非离子洗涤剂(最优选地吐温80)将澄清化产物稀释约2倍，并且加入钙离子螯合剂(最优选地EDTA)以达到约2mM的最终浓度。
本发明方法的另一个有利特征是在进一步的色谱捕获步骤之前无需对澄清化产物执行任何耗时的透析步骤，例如如下所述的阴离子交换捕获。因此，在本发明的一个实施方式中，在AnxA5蛋白的色谱捕获之前，澄清化产物不经历透析。
E.阴离子交换捕获
根据本发明第一方面的方法还可包括以下步骤：使释放的AnxA5蛋白经历阴离子交换树脂从而执行第一阴离子交换产物捕获步骤，并由此产生包含释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物。
通常，利用阴离子交换色谱从细菌(例如大肠杆菌)匀化产物/溶解产物中捕获的蛋白质不是第一选择方案，因为与捕获树脂结合的大量宿主细胞蛋白(HCP)和DNA影响对目标产物的结合能力，并且甚至降低树脂性能。然而，本发明申请人已确认，根据本发明第一方面的前述细胞匀化和澄清处理程序可有效地提供一种可以利用阴离子交换色谱而有效地被进一步提纯的AnxA5蛋白产物。
因此，在一个实施方式中，使包含由匀化产物/溶解产物的澄清处理步骤和/或核酸的降解所产生的释放的AnxA5蛋白的澄清化产物(如上所述)经历第一阴离子交换捕获步骤，由此产生包含释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物。
任选地，在第一阴离子交换产物步骤之前，对释放的AnxA5蛋白的环境的一个或多个参数进行调节，所述参数选自由以下组成的群组：pH、电导率、钙离子螯合剂的水平以及非离子洗涤剂的水平。例如，经历阴离子交换步骤的AnxA5蛋白组合物可在约6.9的pH值，任选地±1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1pH单位(在一个选项中，优选的范围是pH6至pH8.5，更优选地pH6.5至pH7.5，最优选地pH 6.9)下进行配制。本发明申请人已发现，在此范围附近的低pH值(例如pH 6)往往会导致可检测宿主细胞蛋白质的存在于洗脱产物中；而在pH 8或以上时分离度略微下降。可任选地对经历阴离子交换步骤的AnxA5蛋白组合物进行调节，从而具有约2.8mS/cm，±1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1mS/cm的电导率。在澄清处理之后，可通过添加一个或多个另外的添加剂进一步对澄清化产物进行调节，以便于随后的步骤。如上所述，合适的是在第一阴离子交换产物步骤之前通过添加以下一个或两个对经历阴离子交换步骤的AnxA5蛋白组合物进行调节：(a)非离子洗涤剂，如聚山梨醇酯，最优选地吐温80；和(b)钙金属离子螯合剂(如EDTA)，除非澄清化产物因包含于匀化缓冲液中和/或在酶处理步骤后添加已含有充分水平的螯合剂。在一个示例性实施方式中，用1％非离子洗涤剂(最优选地吐温80)将经历阴离子交换步骤的AnxA5蛋白组合物稀释约2倍，并且加入钙离子螯合剂(最优选地EDTA)以达到约2mM的最终浓度。
在本上下文中，将非离子洗涤剂和/或钙金属离子螯合剂用于调节经历第一阴离子交换产物捕获步骤的AnxA5蛋白组合物对利用第一阴离子交换捕获步骤来增强AnxA5蛋白与源于宿主细胞的杂质(包括细胞壁成分、细胞膜成分、内毒素、核酸等)的分离会非常有利。例如，本发明申请人已证明，当在非离子洗涤剂和钙金属离子螯合剂存在下执行时，第一捕获阴离子交换步骤非常高效地去除内毒素(大约减少99％)。
尽管主要在下面的第二阴离子交换精制步骤的上下文中进行描述，但在其中钙金属离子螯合剂(例如EDTA)存在于经历第一阴离子交换捕获步骤的AnxA5蛋白组合物中的选项中，对第一阴离子交换捕获步骤的操作包含一种或多种类型的其他所选择金属离子(不是钙)也是有利的，其中对其他所选择金属离子进行选择使得钙金属离子螯合剂对所选择金属离子的结合亲和力大于其对阴离子交换树脂的结合亲和力但小于其对钙离子的结合亲和力。一个示例性金属离子是Mg2+。
通常，在阴离子交换树脂于与AnxA5产物接触之前，使阴离子交换树脂平衡。可采用任何合适的平衡。例如，可利用缓冲液(例如20mM Tris，pH 7.4)、非离子洗涤剂(例如0.1％聚山梨醇酯，优选地吐温80)以及盐(例如25mM NaCl)使阴离子交换树脂平衡。可采用任何合适的平衡体积；没有限制，本发明申请人已发现在示例性实施方式中，3个柱体积(CV)是合适的体积。
优选地，就AnxA5蛋白而言，第一阴离子交换捕获步骤在正模式下执行，因此在阴离子交换步骤期间，AnxA5蛋白暂时地与阴离子交换器结合，通常使清洗溶液在柱上方通过以便从结合的AnxA5蛋白中去除杂质，然后通过将洗脱缓冲液加到阴离子交换树脂中以释放结合的AnxA5蛋白而产生包含释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物。
强阴离子交换树脂是优选的，因为本发明申请人已发现这些提供可接受的AnxA5蛋白捕获能力，而使用弱阴离子交换树脂的性能则较不可接受。强阴离子交换树脂在本技术领域是公知的，例子包括具有季铵官能团的树脂，例如具有三烷基氯化铵或三烷基氢氧化铵的I型树脂，或者具有二烷基2-羟乙基氯化铵或氢氧化铵的II型树脂(例如，通用电气医疗集团的Q琼脂糖凝胶XL、通用电气医疗集团的Capto Q、伯乐公司的Unosphere Q或默克公司的Eshmuno Q)。弱阴离子交换树脂不是优选的，例子包括具有二乙氨基乙基官能团的DEAE树脂。Q琼脂糖凝胶XL树脂(例如，由通用电气医疗集团提供)可以是最优选的。
在加载到阴离子交换树脂上之后，在正模式下，AnxA5蛋白暂时地与树脂结合，并且可以进行清洗以减少/去除杂质。可以采用任何合适的清洗条件。例如，该清洗溶液可包括、基本上由或由以下组成：缓冲液(例如20mM Tris，pH 7.4)、非离子洗涤剂(例如，0.1％聚山梨醇酯，优选地吐温80)以及盐(例如，25mM NaCl)的水溶液。可采用任何合适的清洗体积；没有限制，本发明申请人已发现在示例性实施方式中10柱体积(CV)是合适的体积。
然后，利用洗脱缓冲液将结合的AnxA5蛋白从阴离子交换树脂中释放出。可以采用任何合适的洗脱缓冲液。例如，洗脱缓冲液可包括、基本上由或由以下组成：缓冲剂的水溶液(例如20mM Tris，pH 7.4)、非离子洗涤剂(例如0.01％至1％(w/v)更优选地0.1％(w/v)的聚山梨醇酯，优选地吐温80)以及盐(以高于清洗溶液的浓度(例如300mM NaCl，任选地±100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM或5mM)。可采用任何合适的洗脱体积；没有限制，本发明申请人已发现，在示例性实施方式中9个柱体积(CV)对于洗脱而言是合适的体积。
因此，将AnxA5蛋白在洗脱缓冲液中捕获，从而提供第一阴离子交换产物。
然后可将阴离子交换树脂再生和清洗。用于再生和清洗的合适的方法在本技术领域是已知的，并且在实施例中描述了一种这样合适的方案。
通常，包含释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物含有大致50％过量的从宿主细胞中释放出的AnxA5蛋白。优选地，第一阴离子交换产物包括大于60％、70％或80％的来自宿主细胞的AnxA5蛋白。通过与Marder等人(supra)的方法相比较，显然现有技术方法显示大约50％或以上的高产物损失。例如，Marder等人的方法(supra)包括初始提纯离心步骤，其中丢弃上清液并采集与团块结合的膜联蛋白A5。丢弃的上清液中和从团块中回收的膜联蛋白A5的相对量分别示于图3中的线道2和3，Marder等人(supra)。从图可看到在Marder等人(supra)的方法中释放的膜联蛋白A5的约一半被丢弃，从而导致低产率的方法。
作为进一步的比较，本发明申请人已发现，在第一阴离子交换色谱捕获步骤的结束时，示例性方法的产率为每升培养物约5g AnxA5蛋白，该产率远高于由Marder等人(supra)报告的每升培养物0.983g提纯膜联蛋白A5的产率。
因此，根据本发明的第一方面，优选的是，第一阴离子交换产物包含每升培养物大于1g、大于2g、大于3g、大于4g或约5g的AnxA5蛋白。
任选地，使第一阴离子交换产物直接地或间接地经历过滤步骤(如无菌过滤步骤)。例如，没有限制，已发现0.45μM至0.2μM过滤步骤是合适的。
F.亲和色谱
本发明申请人也已发现(例如参见下面的实施例2)，与其中提纯步骤的相继添加导致不断增加的产率损失(因为产物是在各步骤中损失)的常规方法相反，阴离子交换步骤与肝素亲和色谱步骤组合具有出人意料的益处，即获得由单独肝素亲和色谱步骤所实现的高纯度并具有大幅提高的产率(即，回收率从约30％至40％提高到约70％至90％)。与提纯步骤加入相关的大产率增加与通常将会基于提纯步骤的组合中所预料的正好相反。
因此，本发明的第二方面提供一种用于从包含AnxA5蛋白和一种或多种杂质(杂质可以是或者可以不是如上所述的澄清处理步骤的产物)的溶液中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的蛋白质的方法，所述方法包括：
使包含AnxA5蛋白和一种或多种杂质(杂质可以是或者可以不是细胞匀化、澄清处理和/或第一阴离子交换色谱捕获步骤的直接或间接产物，如上所述)的溶液经历阴离子交换树脂从而执行第一阴离子交换步骤，并由此产生包含AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物；和
使第一阴离子交换产物直接地或间接地经历亲和色谱步骤，由此产生包含释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物。
优选地，根据本发明的第二方面的方法，亲和色谱步骤可包括使AnxA5蛋白与固定化肝素结合，并且任选地其中利用钙离子的存在促进结合，并且另外任选地，利用含有钙离子螯合剂(如EDTA)的洗脱缓冲液将AnxA5蛋白从固定化肝素中洗脱出。
此外，如在实施例3中所描述，本发明申请人已发现，吐温80对于肝素亲和色谱步骤具有特别有利的作用(与其他非离子洗涤剂相比，包括其他的吐温，如吐温20)。将吐温80例如以大约0.1％(w/v)包含在肝素亲和色谱步骤使用的缓冲液中可以有助于在单个峰中洗脱AnxA5蛋白、降低压力并防止沉淀。
因此，本发明的第三方面提供一种用于从包含AnxA5蛋白和一种或多种杂质的溶液中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的蛋白质的方法，该所述方法包括在吐温80存在下(优选地在0.1％吐温80存在下)使包含AnxA5蛋白和一种或多种杂质(杂质可以或者可以不是细胞匀化、澄清处理和/或第一阴离子交换色谱捕获步骤的直接或间接产物，如上所述)的溶液经历肝素亲和色谱步骤，由此产生包含释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物。
因此，本发明的第二和第三方面，可以彼此独立地或者组合地操作(即，在本发明第二方面中的肝素亲和色谱步骤可以在使用于肝素亲和色谱步骤的缓冲液中包含吐温80(例如以大约0.1％(w/v))。
然而，更概括地，本发明的第一方面可包括以下步骤：使释放的AnxA5蛋白经历亲和色谱步骤，由此产生包含释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物。尤其优选的是，可使第一阴离子交换产物中的AnxA5蛋白，例如由如上所述方法所产生直接地或间接地(例如在无菌过滤和/或其他成分的添加之后)经历亲和色谱步骤。
因此，在本发明第一方面的一个实施方式中(所述实施方式可与本发明的第二方面和第三方面的任一个或两个特征结合)，所述方法包括以下步骤，其中：
(a)利用如上所述的澄清处理方法使包含如上所述释放的AnxA5蛋白的生物质匀化产物澄清化，并由此产生包含释放的AnxA5蛋白的澄清化产物，和
(b)使澄清化产物中的AnxA5蛋白经历阴离子交换树脂从而执行如上所述第一阴离子交换步骤，并由此产生包含AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物，以及
(c)其中使第一阴离子交换产物中的AnxA5蛋白经历(直接地或间接地)亲和色谱步骤。
优选地，亲和色谱步骤包括使AnxA5蛋白与固定化肝素结合，并且任选地利用钙离子的存在促进结合。
因此，在肝素亲和步骤之前，可通过添加任何一个或多个钙离子(例如CaCl2)、非离子洗涤剂(优选地吐温80)对AnxA5产物进行调节，并且任选地进行缓冲(例如，Tris缓冲液，pH 7.4)。没有限制，本发明申请人已证明了当用含有20mM Tris(pH 7.4)、0.1％吐温80以及2mM CaCl2的稀释缓冲液将过滤阴离子交换产物稀释约8倍时的有利作用。
因此，优选的是用聚山梨醇酯80对AnxA5产物进行调节，并且更优选地其中聚山梨醇酯80的最终浓度为大于约0.01％至高达约10％(w/v)，如约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在本上下文中，术语“约”是指规定值的±50％、40％、30％、20％、10％、或5％。
用钙稀释允许膜联蛋白A5与固定化肝素色谱结合。与离子相互作用的比较，此相互作用较低。接触时间是重要的，因此色谱优选地以≤100cm/h执行。
用于亲和色谱柱(例如肝素亲和色谱柱)的加载的条件允许AnxA5蛋白与肝素结合。亦即，就AnxA5蛋白而言，亲和色谱是通常是在正模式下执行。
可以用期望水平的AnxA5产物加载亲和色谱柱(例如，肝素亲和色谱柱)。例如，加载可以约或者大于每升柱树脂体积5g，例如约10g/L、约15g/L、约20g/L、约25g/L、约30g/L或以上执行。在本上下文中，术语“约”是指规定值的±50％、40％、30％、20％、10％或5％。实际上，本发明申请人已发现，以每升柱树脂体积约20g至30g AnxA5产物进行加载在方法效率和产物提纯和回收方面提供非常令人满意的结果。在这种高加载的上下文中，本发明申请人已发现，聚山梨醇酯80在被加载混合物中的存在对于避免AnxA5蛋白沉淀或不溶是尤其有利的。在不使用聚山梨醇酯80的情况下，观察到沉淀和背压的增加，并且亲和色谱步骤变得效率较低。请参见实施例3和实施例4。
在AnxA5蛋白的加载之后，通常将柱清洗一次或多次以除去杂质。可采用任何合适的清洗方案。本发明申请人已发现，没有限制，合适的清洗方案包括两阶段清洗。例如，在清洗的第一阶段，可使用用含有钙(例如20mM Tris，pH 7.4；0.1％吐温80；2mM CaCl2)的第一清洗缓冲液执行清洗。第一阶段清洗的体积可基于期望结果和所使用清洗溶液的确切性质而变化。没有限制，本发明申请人已发现，例如，上述示例性清洗缓冲液可以成功用于15CV的清洗。在第二阶段清洗中，清洗缓冲液可以低于第一次清洗的量含有钙，或者优选地不含有钙(例如20mM Tris，pH 7.4；0.1％吐温80)。第二阶段清洗的体积可基于期望结果和第二阶段所使用的清洗溶液的确切性质而变化。没有限制，本发明申请人已发现，例如示例性第二阶段清洗缓冲液可以成功用于2CV的清洗。
其后，利用洗脱缓冲液将AnxA5蛋白从亲和色谱柱中洗脱出，并由此提供包含释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物。在使用肝素亲和色谱柱的情况下，优选的是，使用包含钙金属离子螯合剂(如EDTA或EGTA)的洗脱缓冲液。
例如，没有限制，本发明申请人已发现，合适的洗脱缓冲液是20mM Tris pH 7.4；0.1％吐温80；10mM EDTA；25mM NaCl，所述洗脱缓冲液螯合钙离子。在钙的存在下，螯合反应特异性地洗脱仅可与肝素结合的膜联蛋白A5。
优选的是，在洗脱期间，将流率降低到小于100cm/h以提高产物的浓度。例如，没有限制，在该实施例中，本发明申请人通过在洗脱中将流率减小到≤60cm/h而实现浓缩洗脱。完整的洗脱峰可以例如从0.05AU处的UV信号上升开始到代表约7CV的下降峰的0.05AU处采集。优选地，洗脱曲线显示单个峰，最理想的是尖锐峰。
因此，第一亲和色谱产物包含释放的AnxA5蛋白和钙离子螯合剂，如EDTA或EGTA，任选地其中钙离子螯合剂是以在从约0.1mM至500mM，如从约1mM至约100mM的范围内，更通常地在从约2mM至约50mM的范围内，更优选地在从约5mM至约15mM的范围内，最优选地以约10mM而存在。在本上下文中，术语“约”可以包括规定浓度的±50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的含义。
在所述方法方案中，亲和色谱步骤可能是最有效的提纯步骤。AnxA5蛋白与钙离子结合，并且在此钙结合状态中，产物可以与肝素形成高度特异性的结合。通常，仅具有与钙复合能力的正确折叠的AnxA5蛋白形式可以与肝素结合。由此亲和色谱步骤可用于帮助在正确折叠产物与错误折叠产物之间进行辨别。另外，中间步骤达到高消除因子，因为高度特异性的相互作用通过钙与EDTA的螯合反应而与特异性的洗脱模式结合。因此，观察到内毒素和HCP的强减少与DNA含量的中等减少相结合。通常在前述阴离子交换捕获步骤期间已被减少(优选地达约97％)的内毒素被进一步减少(优选地达约99％)，并且这优选地在第一阴离子交换捕获步骤之前使内毒素水平达到在澄清化产物中水平的约0.03％。
G.阴离子交换精制
在本发明第一、第二和/或第三方面的另一个实施方式中，可利用阴离子交换精制步骤直接地或间接地对AnxA5产物(例如，如由亲和色谱步骤产生)进行进一步提纯。
在利用阴离子交换精制步骤对由亲和色谱步骤产生的AnxA5产物间接地进行进一步提纯的情况下，通过将一个或多个调节添加剂添加到亲和色谱步骤的产物中，可将亲和色谱的步骤与阴离子交换精制步骤分离。
基于如下所述的本发明的第四方面，合适的添加剂可以包括例如：稀释剂(例如水)，用以进一步稀释亲和色谱的产物中的AnxA5蛋白；缓冲液(例如Tris，例如在35mM和pH8)；非离子洗涤剂(例如聚山梨醇酯，更优选地吐温80，如在约0.1％w/v的浓度下)；和/或一个或多个其他添加剂。
也就是说，本发明的第四方面是基于本发明申请人的意识：钙金属离子螯合剂(例如EDTA)会对阴离子交换步骤的效能产生负面影响。游离的EDTA(或其他螯合剂)可以直接地与阴离子交换官能团结合，并由此降低能力和由阴离子交换步骤实现的分离。这是在对肝素亲和色谱步骤的产物执行阴离子交换的情况下的一个具体问题，其中在钙离子的存在下使AnxA5蛋白与肝素结合，然后利用钙金属离子螯合剂(例如EDTA)洗脱结合的AnxA5蛋白。因此，肝素亲和色谱步骤的洗脱的AnxA5产物含有高水平的钙离子螯合剂。通常理想的是，能够利用另一个阴离子交换步骤将AnxA5产物进一步提纯，但在另一个阴离子交换步骤中钙离子螯合剂是个导致问题的成分。另一方面，在阴离子交换步骤之前试图去除钙金属离子螯合剂是耗时的，因此也增加成本。因此，现有技术方法包括：例如用于缓冲剂置换的透析步骤是缓慢且低效的，因此增加生产成本。此外，在阴离子交换步骤期间将钙金属离子螯合剂包含在AnxA5产物中可以是防止AnxA5蛋白与杂质(包括内毒素)的钙介导结合的一个重要因素。因此，导入阻止或减少钙离子螯合剂与阴离子交换树脂的结合的添加剂将会是方便的且有效的，更允许在没有不方便和与透析相关的成本的情况下执行阴离子交换步骤，并且不影响在阴离子交换步骤期间钙金属离子螯合剂的有利作用。
本发明申请人已意识到，这可以通过在阴离子交换之前将一个或多个类型的其他所选择金属离子包含在AnxA5蛋白产物中而实现，其中对其他所选择金属离子进行选择，使得钙金属离子螯合剂对所选择金属离子的结合亲和力大于其对阴离子交换树脂的结合亲和力但小于其对钙离子的结合亲和力。适当的其他金属离子的选择将取决于钙离子螯合剂的性质和阴离子交换树脂的性质。例如，在使用EDTA作为钙离子螯合剂的情况下，Mg2+离子通常适合于实现本发明的目的，并且可以在阴离子交换步骤之前加入到AnxA5蛋白产物。
因此，本发明的第四方面提供一种用于从包含AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂的组合物中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的蛋白质的方法，
其特征在于，所述方法包括使组合物经历阴离子交换树脂从而执行阴离子交换步骤，并由此从组合物中回收和/或提纯AnxA5蛋白；并且
其特征还在于，在其他所选择金属离子存在下，执行阴离子交换步骤；
其中对其他的所选择金属离子进行选择，使得钙金属离子螯合剂对所选择金属离子结合亲和力大于其对阴离子交换树脂的结合亲和力但小于其对钙离子的结合亲和力。
优选地，在使组合物经过阴离子交换树脂之前，将其他的所选择金属离子与包含AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂组合物加以混合。在随后的阴离子交换步骤中使用的溶液(例如清洗溶液和/或洗脱缓冲液)可以或者也可不包含其他的所选择金属离子。因此，在本发明的此方面的一个实施方式中，在其他所选择金属离子存在下执行阴离子交换步骤的步骤是指在使组合物经过阴离子交换树脂之前将其他的所选择金属离子添加到包含AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂的组合物中。
在本发明第四方面的一个实施方式中，钙金属离子螯合剂选自EDTA或其盐、EGTA或其盐，最优选EDTA。
钙金属离子螯合剂可以过量和/或在从约0.1mM至500mM，如从1mM至约100mM的范围内，更通常在从约2mM至约50mM的范围内，例如以约或者至少0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM或以上的浓度而存在于组合物中。在本上下文中，术语“约”可以包括规定值的±0.5mM、0.4mM、0.3mM、0.2mM或0.1mM的含义。在前述的上下文中，术语“过量”可以包括以下含义：提供充分量的钙金属离子螯合剂以便去除可能有助于在前述亲和色谱步骤中AnxA5蛋白与柱上的固定化肝素的结合的任何二价离子，由此允许AnxA5蛋白从柱中被释放到溶液中，然后直接地或间接地用于阴离子交换精制步骤。
在本发明第四方面的一个示例性实施方式中，所选择金属离子是二价阳离子，如Mg2+离子。
优选的是，在使组合物经历阴离子交换树脂的方法期间，在阴离子交换步骤期间所选择金属离子是以有效地降低(如达约50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或以上)或防止钙离子螯合剂与阴离子交换树脂之间相互作用的量而存在。例如，在将组合物加载到阴离子交换树脂上期间和/或在其中使AnxA5蛋白与阴离子交换树脂结合并通过清洗去除杂质的一个或多个清洗步骤期间，所选择金属离子在阴离子交换步骤期间能以可有效地减少或防止钙离子螯合剂与阴离子交换树脂之间的相互作用的量而存在。
优选的是，在阴离子交换步骤期间，所选择金属离子是在钙离子螯合剂存在下以有效地增加AnxA5蛋白与阴离子交换树脂结合的量而存在，并由此与在阴离子交换步骤期间不存在所选择金属离子时观测到的损失水平相比，在阴离子交换步骤的流动通过中减少了(如达约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或以上)AnxA5蛋白的损失。
优选的是，在阴离子交换步骤期间，所选择的金属离子是以约1至约100mM，如约2至约50mM、约5至约25mM、约10至约15mM或约12.5mM的浓度存在。
此外，优选的是钙金属离子螯合剂是EDTA并且所选择金属离子是Mg2+离子，并且更优选地Mg2+离子与EDTA的摩尔比在0.5∶1至2∶1的范围内，最优选地至少1∶1或>1∶1。
在本发明第四方面的上下文中，在另一个实施方式中，包含AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂并且经过阴离子交换树脂的组合物可以是前述方法的直接或间接产物，前述方法包括以下步骤：使AnxA5蛋白经历亲和色谱步骤并且用钙离子螯合剂洗脱AnxA5蛋白，由此产生包含AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂的组合物的亲和色谱产物。例如，前述亲和色谱步骤可包括使AnxA5蛋白与固定化肝素结合，任选地其中利用钙离子的存在促进结合，进而任选地其中利用含有钙离子螯合剂(如EDTA)的洗脱缓冲液将AnxA5蛋白从固定化肝素中洗脱出。
还优选的是，在前述亲和色谱步骤与阴离子交换步骤之间没有透析步骤和/或在使直接或间接产物经历阴离子交换步骤之前没有将钙离子螯合剂从前述亲和色谱步骤的产物中去除。
在本发明第四方面的上下文中，在另一个实施方式中，在阴离子交换步骤之前或期间将所选择金属离子加入到组合物中。
在一个优选的实施方式中，利用另一个阴离子交换步骤(如根据本发明第四方面的阴离子交换步骤)对根据本发明第一、第二或第三方面的任一方面的亲和色谱步骤的产物进行处理。
任选地，在(第二)精制阴离子交换步骤之前，对释放的AnxA5蛋白的环境的一个或多个参数进行调节，所述参数选自由以下组成的群组：AnxA5蛋白的浓度、pH值、电导率、钙离子螯合剂的水平和非离子洗涤剂的水平或所选择其他金属离子的水平(根据本发明的第四方面)。
通常，在精制步骤的(第二)阴离子交换树脂与AnxA5产物接触之前，使阴离子交换树脂平衡。可采用任何合适的平衡。例如，可用缓冲液(例如20mM Tris，pH 7.4)、非离子洗涤剂(例如0.1％聚山梨醇酯，优选地吐温80)以及盐(例如25mM NaCl)使阴离子交换树脂平衡。可采用任何的合适的平衡体积；没有限制，本发明申请人已发现，在示例性实施方式中3个柱体积(CV)是合适的体积。
优选地，就AnxA5蛋白而言，(第二)阴离子交换精制步骤是在正模式中执行，因此在阴离子交换步骤期间使AnxA5蛋白暂时地与阴离子交换器结合，通常使清洗溶液在柱上方通过以便从结合的AnxA5蛋白中去除杂质，然后通过将洗脱缓冲液加到阴离子交换树脂上以释放结合的AnxA5蛋白而产生包含释放的AnxA5蛋白的第二阴离子交换产物。
强阴离子交换树脂是优选的。强阴离子交换树脂在本技术领域是公知的，并且例子包括具有季铵官能团的树脂，如具有三烷基氯化铵或氢氧化铵的I型树脂，或具有二烷基2-羟乙基氯化铵或氢氧化铵的II型树脂。没有限制，用于第二精制步骤的合适的阴离子交换树脂的一个例子包括Source 15Q。Source15Q阴离子交换树脂可以被定义为高分子强阴离子交换器并且另外其特征是具有季铵配体，约15μM的累积体积分布(d50v)的中值粒径，聚苯乙烯/二乙烯苯基质和/或以床高10cm的FineLine100柱进行评估时的约400cm/h、1000kPa的压力/流量规格。
没有限制，用于第二精制步骤的合适阴离子交换树脂的其他例子包括Capto QImpRes.Capto Q ImpRes可以被定义为强阴离子交换器并且另外其特征是具有季胺配体、高流量琼脂糖基质、约36μM至44μM中值粒径(d50v)、约0.15mmol Cl-/ml至0.18mmol Cl-/毫升培养基的离子容量、>55mg BSA以及>48mgβ-乳球蛋白的结合能力/毫升色谱培养基和/或以床高20cm的1m直径柱进行评估时的约300kPat、220cm/h的压力/流量规格。
不受任何理论所束缚，本发明申请人已发现，当被提纯的AnxA5蛋白是来源于重组源(如大肠杆菌BL21(DE3)时，Capto Q ImpRes阴离子交换树脂用于(第二)阴离子交换精制步骤会是尤其有利的，所述重组源被进一步设计成过表达PGL，如在Aon等人《应用与环境微生物学(Appl.Env.Microbiol.)》，2008，74(4)：950-958中所描述；所述文献的内容通过引用并入本文)，这导致它不表达或表达低水平的AnxA5蛋白的葡糖基化。在本上下文中，“低”可以包括葡糖基化的水平小于在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达的AnxA5蛋白的葡糖基化水平(例如小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)(例如广泛地市售，并且如在Marder等人，2014，《BMC生物技术(BMCBiotechnology)》，14：33中所描述)的含义。例如，它可以是应用于(第二)阴离子交换精制步骤使用的Capto Q ImpRes阴离子交换树脂的产物中的葡萄糖酸化AnxA5蛋白的水平是在产物中的AnxA5蛋白总含量的0.5至30％或0.5至20％或0.5至15％或0.5至10％的范围内。Anx5的葡萄糖酸化变异体可以，例如使用适当的阴离子交换或反相柱通过超性能液相色谱(UPLC)或高效液相色谱(HPLC)色谱仪器而进行测量和定量。可以利用质谱法(MS)对不同的峰进行进一步的鉴定和表征。
本发明申请人已发现，当被提纯的AnxA5蛋白没有或具有低水平的葡糖基化时，Capto Q ImpRes阴离子交换树脂用于(第二)阴离子交换精制步骤，导致更高效的方法(与Source15Q阴离子交换树脂用于(第二)阴离子交换精制步骤相比)，因为Capto Q ImpRes阴离子交换树脂具有高结合能力，耐受高流率且没有背压，可以在较高的床高下堆积并且价格较低。无论使用Source15Q还是Capto Q ImpRes阴离子交换树脂，都保持最后产物的质量和纯度。然而，据估计，从Source 15Q阴离子交换树脂(具有15μM粒径)切换到Capto QImpRes阴离子交换树脂(具有40μM的粒径)可以通过减少操作全部方法所需的时间(特别是因为用于精制的第二阴离子交换步骤是最耗时的步骤)使生产率提高大于约五倍(5x)，并且能够降低总生产成本达大于约50％。避免使用具有非常小微珠粒径(<30μM)的树脂允许高流速并且允许以较高的树脂床高堆积色谱柱并且不导致不可接受的背压。这提高了生产率，因为在给定的足迹(柱直径)下可以将更多的树脂堆积在柱中，并因此结合更多的蛋白质结合，而此同时较高的流率允许更快的操作。
在正模式加载到用于精制的(第二)阴离子交换树脂上之后，AnxA5蛋白暂时地与树脂结合，并且可以被清洗以减少/去除杂质。可以采用任何合适的清洗条件。例如，清洗溶液可包含、基本上或由以下组成：缓冲剂水溶液(例如20mM Bis-Tris，pH7)和盐(例如25mMNaCl)以及任选地非离子缓冲液(例如聚山梨醇酯，优选地吐温80，如以约0.1w/v的水平)。可以采用任何合适的清洗体积；没有限制，本发明申请人已发现，在示例性实施方式中，3个柱体积(CV)是合适的体积。
然后利用洗脱缓冲液将结合的AnxA5蛋白从阴离子交换树脂中释放出。可使用任何合适的洗脱缓冲液。例如，洗脱缓冲液可包括、基本上由或由以下组成：缓冲剂的水溶液(例如20mM Bis-Tris，pH7)、高于清洗溶液浓度的盐(例如180mM NaCl，任选地±100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM或5mM)以及任选地非离子缓冲液(例如聚山梨醇酯，优选地吐温80，如以约0.1w/v的水平)。可采用任何合适的洗脱体积；没有限制，本发明申请人已发现，在示例性实施方式中，33个柱体积(CV)，以线性梯度将洗脱缓冲液的浓度从0增加到100％，适合于洗脱。
因此，使AnxA5蛋白释放进入洗脱缓冲液，并且这提供(第二)精制阴离子交换。如在实施例1中所描述，使用0.1％吐温80执行的方法提高中间步骤后的产物产率达大约30％。
然后可将(第二)阴离子交换树脂再生和清洗。用于再生和清洗的合适方法在本技术领域是已知的，并且在实施例中对一种这样合适的方案进行描述。
精制步骤主要是用于减少产物相关杂质，例如不同的膜联蛋白A5异形体的分离。另外，在用于残余的DNA方法中的精制步骤达到最高的消除因子，并且强烈地减少HCP。内毒素，在中间步骤之后已处在低水平，被进一步减少达约99％，(当与前面的细胞匀化、核酸酶处理、澄清处理、捕获阴离子交换、过滤(如无菌过滤步骤)和肝素亲和步骤的组合使用时)使内毒素水平在第一AX步骤之前达到澄清化产物水平的约0.0003％。
因此，在本发明第一、第二、第三和/或第四方面的另一个实施方式中，提供一种用于从具有细胞壁的宿主细胞或根据本发明第一方面的一种培养物中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达的细胞内蛋白质的方法，并且优选地其中所述方法包括从宿主细胞的培养物中回收和/或提纯重组表达的细胞内AnxA5蛋白，并且其中所述培养物具有至少约100L、约200L、约300L、约400L、约500L、约600L、约700L、约800L、约900L、约1,000L、约2,000L、约3,000L、约4,000L、约5,000L、约6,000L、约7,0000L、约8,0000L、约9,0000L、约100,000L、约200,000L、约300,000L、约400,000L、约500,000L、约600,000L、约70,0000L、约80,0000L、约90,0000L、约100,000L或更大的体积，其中：
(a)根据本发明的第一方面，所述方法包括在包含非离子洗涤剂的匀化缓冲液存在下从宿主细胞中释放细胞内蛋白质；
(b)任选地其中释放步骤是根据本发明第一方面的一个或多个实施方式中的任一实施方式，如上面在C部分中所描述；
(c)进而任选地，其中根据一个或多个实施方式中的任一实施方式，所述方法包括使生物质匀化产物澄清的步骤，如上面在段D部分中所描述；
(d)其中如在上面的E部分中所描述，根据一个或多个实施方式中的任一实施方式，所述方法还包括以下步骤：使释放的AnxA5蛋白直接地或间接地经历阴离子交换树脂从而执行第一阴离子交换产物步骤，并由此产生包含释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物；
(e)其中，根据本发明第一、第二和/或第三方面任一方面，如上面在F部分中所描述，所述方法还包括以下步骤：使释放的AnxA5蛋白直接地或间接地经历亲和色谱步骤，
(f)其中亲和色谱步骤的产物是包含AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂的组合物；以及
(g)其中根据本章节以上描述的任一实施方式，(即，G部分)中所描述，使包含AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂的亲和色谱步骤的直接或间接产物经历阴离子交换步骤。
H.产品制剂
本发明第一、第二、第三或第四方面的任一方面的方法还可包括，优选地在所述方法结束后，一个或多个其他步骤，所述步骤选自由以下组成的群组：浓度、缓冲液改变、调节和过滤(如无菌过滤步骤)以及任选地将含有AnxA5蛋白的产物储存于无菌容器的最终步骤。
例如，用于产品配制的其他步骤中的一个步骤可以是超滤/渗滤(UF/DF)，任选地其中UF/DF步骤的产物以至少约1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、125mg/mL或更大的浓度而含有AnxA5蛋白。
在另一个例子中，用于产品配制的其他步骤中的一个步骤可以是添加非离子表面活性剂，优选地聚山梨醇酯，更优选地吐温80。非离子表面活性剂可以最后产物所期望的量而加入，如达到约0.05％(w/w)(例如，±0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％w/v)的最终浓度。
在另一个实施例中，用于产品配制的其他步骤中的一个步骤可以是过滤步骤(例如无菌过滤步骤)，例如使用0.45μM至0.2μM过滤器或0.22μM过滤器。
如上所述，本发明第一、第二、第三或第四方面的方法可终止于无菌过滤的步骤，并且将无菌过滤的含有AnxA5蛋白的产物置于无菌容器中。
可根据需要，对填充容器中的AnxA5蛋白的最终浓度进行调节。没有限制，本发明申请人已例示了10mg/mL的最终浓度。合适的浓度可以是例如1mg/mL至125mg/mL、2mg/mL至100mg/mL、5mg/mL至50mg/mL、7mg/mL至30mg/mL或约10mg/mL至20mg/mL。
任选地，本发明的方法可在pH约7.4(例如±0.5、0.4、0.3、0.2、或0.1pH单位)，且包含约150mM NaCl(例如±50、40、30、20或10mM)、约1mM CaCl2(例如±500μM、400μM、300μM、200μM、100μM或50μM)、约0.05％(w/w)(例如，±0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％w/v)聚山梨醇酯(如吐温80)或其他非离子洗涤剂的非磷酸盐缓冲液(如Bis-Tris或Tris缓冲液)中提供最终无菌AnxA5蛋白产物。约7.4的pH值是用于配制使用于人的(特别是用于静脉给药)的典型的目标pH，因为它匹配人血液中的pH值并且提供具有良好稳定性的稳定AnxA5蛋白。低于pH7，并且尤其低至大约pH 6，AnxA5蛋白失去可溶性并且会开始沉淀。
NaCl可以用于在储存期间将AnxA5产物维持在单体形式。因此，本发明的方法可提供一种最终无菌AnxA5蛋白产物，其中所存在的NaCl浓度将AnxA5蛋白主要地维持(亦即，大于约50％，如60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或大致100％)单体的形式。单体水平百分率可以利用在本技术领域公知的技术，例如凝胶渗透色谱(GPC)而容易地确定。
在一个实施方式中，本发明的方法提供一种最终无菌的治疗上可接受的AnxA5蛋白产物，其中总产率大于每升宿主细胞培养物1g AnxA5蛋白，更优选地至少约1.5g/L，甚至更优选地在约2g/L至约4g/L的范围内。在本上下文中，术语“约”可包括指规定值的±0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L或0.1g/L。
在另一个实施方式中，本发明的方法提供一种最终无菌的治疗上可接受的AnxA5蛋白产物，其中AnxA5蛋白的总收率为存在于宿主细胞培养物中的AnxA5蛋白的至少约24重量％(例如±10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％)或以上。这可以例如通过测量在初始匀化产物(可以通过对匀化产物的等分样品进行离心并测试上清液中AnxA5的水平而捕获和测量)和最终提纯产物中的可溶性AnxA5蛋白而确定。
此外，在所述方法的任意点(如果有关联，在填充无菌容器之前)并且通常在最终提纯步骤之后，如上所述，可对AnxA5蛋白进行化学改性。例如，可将AnxA5蛋白PEG化。PEG化的膜联蛋白A5公开于WO 02/067857中。PEG化是本领域技术人员公知的方法，其中对多肽或拟肽化合物(用于本发明的目的，AnxA5蛋白)进行修饰使得一个或多个聚乙二醇(PEG)分子利用共价键连接到一个或多个氨基酸或其衍生物的侧链。它是最重要的分子变构化学(MASC)技术之一。可采用其他MASC技术；这种技术可改善分子的药代动力学特征，例如延长其体内半衰期。ApEG-蛋白质缀合物是通过首先激活PEG基团以便它将与本发明的蛋白质或拟肽化合物发生反应或者与之偶联而形成。PEG基团在分子量和构像中有很大的变化，且早期基团(单官能化PEG；mPEG)是线性的具有12kDa或以下的分子量，而后期的基团具有增加的分子量。PEG2，PEG技术中的一个最近创新，包括将30kDa(或以下)的mPEG偶联到赖氨酸氨基酸(尽管可以使PEG化延续到将PEG加到其他氨基酸)，所述氨基酸进一步反应而形成行为类似于分子量更大的线性mPEG的成支化结构(Kozlowski等人，2001)。可以利用共价键将PEG分子连接到多肽的方法进一步描述于Roberts等人(2002)的《先进药物输送评论(AdvDrug Deliv Rev)》，54，459-476；Bhadra等人(2002)《药物学(Pharmazie)》57，5-29；Kozlowski等人(2001)《控制释放杂志(J Control Release)》72，217-224；以及Veronese(2001)《生物材料(Biomaterials)》22，405-417并且它们的内容通过引用并入本文。PEG化的优点包括降低的肾清除率，这对于一些产物而言，导致在给药后的更持久的吸收以及受限制的分布，从而有可能形成更恒定且持久的血浆浓度以及因此临床有效性的提高(Harris等人(2001)《临床药代动力学(Clin Pharmacokinet)》40，539-551)。其他的优势可以包括降低的治疗化合物的免疫原性(Reddy(2001)《药物治疗学年鉴(AnnPharmacother)》34，915-923)以及较低毒性(Kozlowski等人(2001)，《生物制药(BioDrugs)》15，419–429)。在AnxA5蛋白被化学改性的情况下，它可以是适合于执行一个或多个其他的提纯步骤，例如减少或去除未反应的成分，并且/或者选择同质的化学改性AnxA5蛋白群，用以包含于最后产物中。用于从反应方法中对化学改性蛋白质进行提纯的合适技术对于本领域技术人员而言是已知的。
最后产物可或可以随后进行配制而形成药物或兽医学组合物。
最后产物可以单位剂型提供。例如，单位剂型可含有约1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg的AnxA5蛋白(其中术语“约”是指±0.5mg、0.4mg、0.3mg、0.2mg或0.1mg)或以上，例如在0.1mg至1000mg或1mg至100mg的范围内。
药物或兽医学组合物可将AnxA5蛋白包含于具有药学上或兽医学可接受的佐剂、稀释剂或载体(这些通常将根据预定的给药途径和标准药学实践进行选择)的混合物中。所述组合物可采用立即释放、延迟释放或控制释放应用的形式。优选地，该剂型是单位剂型，含有活性成分的每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当的部分。
短语“药学上或兽医学上可接受的”包括对视情况向动物或人施用时不产生不良反应、过敏反应或其他不良反应的组合物的引用。根据本公开，这种药物或兽医学组合物的制备对于本领域技术人员而言是已知的，如《雷明登氏药学全书(Remington'sPharmaceutical Sciences)》，第18版，麦克印刷公司(Mack Printing Company)，1990所例示，所述文献的内容通过引用并入本文。此外，就动物或人给药而言，应当理解的是制剂应当满足FDA生物标准办公室办公室要求的无菌性、致热原性、一般安全性以及纯度标准。
本文中所使用的“药学上或兽医学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣材料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐类、防腐剂、药物、药物稳定剂、赋形剂、崩解剂等材料及其组合，如本领域普通技术人员已知的。除非任何常规载体与活性成分不配伍，否则可想到其在治疗或药物组合物中的使用。
根据本发明的药物或兽医学组合物可以或者可以不旨在用于并因此以适合于肠胃外、静脉、动脉内、腹腔内、肌肉内、眼内、颅内、脑内、骨内、脑室内、鞘内或皮下给药的方式而配制，并从药物洗脱支架中给药，或用于通过融合技术给药，或用于局部给药(如采用适合于经皮给药的剂型，例如霜剂或软膏剂、吸入剂、滴眼剂、滴耳液、或者通过身体中的粘膜)。无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物包含入具有上面所列举的各种其他成分的适当溶剂中，根据需要接着进行灭菌而制备。所述药物组合物可最佳地采用可含有其他物质(例如充分的盐或葡萄糖以使该溶液与血液等渗)的灭菌水溶液的形式而使用。必要时，可将所述水溶液适当地缓冲(优选地3至9的pH值)。在无菌条件下对合适药物制剂的制备，可利用本领域技术人员公知的标准制药技术容易地完成。
可替代地，可将根据本发明的药物或兽医学组合物可以配制成粉末形式，例如无菌粉末，其可以是冻干粉。
基于日剂量水平，用于向患者(例如人患者)给药的AnxA5蛋白的治疗有效量可以是每成人0.01mg至1000mg的AnxA5蛋白(例如，每kg患者体重约0.001mg至20mg，例如0.01mg/kg至10mg/kg，例如大于0.1mg/kg并且高达或小于20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg或2mg/kg，如约1mg/kg)，以单剂量或分剂量而给药。
任何情况下医生将确定将最适合于任何单独患者的实际剂量，并且实际剂量将随着特定患者的年龄、体重和应答而变化。以上的剂量是平均情况的例示。当然，可以存在其中需要较高或较低剂量范围的个体情况，并且这种情况是在本发明的范围内。
就兽医学应用而言，本发明化合物是根据兽医学惯例采用适当地可接受的剂型而给药，并且兽医将确定最适用于具体动物的给药方案和给药路径。
I.产品特征
本发明的方法提供一种如上面所定义的AnxA5产物。因此，通过要求保护的方法生产的产品也是本发明的另一个，即第五方面。
在另一个实施方式中，本发明任何方面的方法可提供一种包含AnxA5蛋白的产品，所述蛋白的纯度适合人使用的可注射药物。本文中所描述的方法通常将方法相关杂质达去除到远低于可接受水平，如宿主细胞蛋白低于每mg AnxA5蛋白20ng、DNA低于每mg AnxA5蛋白10pg以及内毒素低于每mg AnxA5蛋白1EU。
在另一个实施方式中，本发明各方面的方法可提供一种包含非AnxA5蛋白，特别是宿主细胞蛋白(除重组表达的AnxA5蛋白外)的产品，所述蛋白的水平为小于每mg AnxA5蛋白100ng、90ng、80ng、70ng、60ng、50ng、40ng、30ng、20ng、10ng、5ng或以下。FDA和EMA预计宿主细胞蛋白小于100ng/mg，并且本发明申请人已证明小于20ng/mg的宿主细胞蛋白。宿主细胞蛋白含量可以例如利用ELISA三明治技术或者其他EMA和FDA接受方法通过使用抗宿主细胞蛋白抗体进行测量。
在另一个实施方式中，本发明各方面的方法可提供一种包括小于每mg AnxA5蛋白100EU、90EU、80EU、70EU、60EU、50EU、45EU、40EU、35EU、30EU、25EU、20EU、15EU并且优选地小于10EU、5EU或1EU的内毒素含量的产品，并且/或者优选地，其中所述方法提供一种单位剂型的产品，并且所述产品每单位剂量含有小于100EU、90EU、80EU、70EU、60EU、50EU、45EU、40EU、35EU、30EU、25EU、20EU、15EU，并且优选地小于10EU、5EU或1EU每单位剂量。FDA和EMA预计内毒素小于100EU/剂量(最大允许值为350EU/剂量)；所述预计的量在10mg剂量下转换成小于10EU/mg。在这些参数中，单位剂型可含有约1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg的AnxA5蛋白或以上(例如，在0.1mg至1000mg或1至100mg的范围内)。内毒素可以例如利用基于LAL的技术或者其他EMA和FDA接受的方法进行测量。
在另一个实施方式中，本发明各方面的方法可提供一种包含小于每mg AnxA5蛋白1,000pg，优选地小于每mg AnxA5蛋白500pg、小于每mg AnxA5蛋白400pg、小于每mg AnxA5蛋白300pg、小于每mg AnxA5蛋白200pg、小于每mg AnxA5蛋白100pg、小于每mg AnxA5蛋白50pg、小于每mg AnxA5蛋白40pg、小于每mg AnxA5蛋白30pg、小于每mg AnxA5蛋白20pg、小于每mg AnxA5蛋白15pg、小于每mg AnxA5蛋白10pg、小于每mg AnxA5蛋白9pg、小于每mgAnxA5蛋白8pg、小于每mg AnxA5蛋白7pg、小于每mg AnxA5蛋白6pg、小于每mg AnxA5蛋白5pg，如约每mg AnxA5蛋白4pg的核酸(例如DNA)水平，如宿主细胞核酸(例如DNA)水平的产品。DNA可以例如利用定量聚合酶链反应(qPCR)技术或者其他EMA和FDA接受的方法进行测量。
在一个特别优选的实施方式中，本发明的任何方面的方法可提供一种具有选自下列的任何一个或多个特征的产品：
-AnxA5蛋白的浓度通常为大约8g/L至12g/L；
-宿主细胞蛋白水平在或低于100ng/mg，更优选地20ng/mg(如利用ELISA所测量)；
-宿主细胞DNA水平在或低于100pg/mg，更优选地10pg/mg；
-内毒素在或低于35EU/mg，更优选地1EU/mg；
->95％的纯度，如利用尺寸排阻色谱而测定；
-<1cfu/mL的初始污染菌(如利用欧洲药典2.6.12而测定)；
-无可见颗粒的澄清、无色外观；以及
-其中利用蛋白质印迹法检测的主带与膜联蛋白A5参考相对应。
在另一个特别优选的实施方式中，产品中的AnxA5蛋白可具有低水平的葡糖基化。在本上下文中，“低”可以包括葡糖基化的水平小于在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中所表达的AnxA5蛋白的葡糖基化的水平(如小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、0％，10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)的含义(例如，如广泛地购得，并且如在Marder等人，2014，《BMC生物技术(BMC Biotechnology)》，14：33中所描述)。例如，可能产品中葡萄糖酸化AnxA5蛋白的水平在产品中AnxA5蛋白的总含量的0.5％至30％或0.5％至20％或0.5％至15％或0.5％至10％的范围内。换句话说，产品中的葡萄糖酸化AnxA5蛋白的水平低于40％，如低于30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％，并且优选地大致为0％。可以例如利用UPLC或HPLC色谱仪器通过使用适当的阴离子交换器反相柱对Anx5的葡萄糖酸化变异体进行测量和定量。
因此，本发明的第五方面提供一种包含AnxA5蛋白的组合物，其中所述组合物是根据本发明第一、第二、第三或第四方面中任一方面的方法的直接或间接产物(或者可直接地或间接地获得)。任选地，所述组合物是药学上可接受的和/或兽医学上可接受的组合物。
J.医学和兽医学应用
本发明的第六方面还提供本发明第五方面的组合物在医学中的应用。换句话说，本发明的第六方面提供一种包括将治疗有效量的本发明第五方面的组合物向需要的人或动物进行施用的方法。
在本发明第六方面的某些实施方式中，本发明第五方面的组合物可以用于：
(a)用于预防或降低血栓症(如动脉粥样硬化性血栓形成)和/或斑块破裂的风险，或者用于向属于风险组的患者给药，包括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)患者和/或具有或已具有(或者有风险)可以导致抗磷脂相关抗体水平提高的上呼吸道或其他感染(包括肺炎球菌感染)的患者，或者治疗(主动地或预防地)或降低血栓栓塞、出血性或脉管炎脑卒中、心肌梗死、心绞痛或间歇性跛行、不稳定型心绞痛、其他形式的严重心绞痛或短暂性脑缺血发作(TIA)的风险，例如在WO 2005/099744中进一步描述(该专利的内容通过引用并入本文)；
(b)用于治疗、预防或降低血管功能障碍、心绞痛、缺血性心脏病、外周动脉疾病、收缩期高血压、偏头痛、2型糖尿病以及勃起功能障碍的风险，减轻缺血性疼痛和/或治疗血管疾病破裂，例如在WO 2009/077764中所描述(该专利的内容通过引用并入本文)；
(c)用于预防或治疗再狭窄(尤其是新生内膜形成或增厚)或脉管炎症，例如在WO2009/103977中所描述(该专利的内容通过引用并入本文)；
(d)用于抑制氧化心磷脂(oxCL)的活性并且用于治疗、预防和/或降低患上心血管疾病、自身免疫性疾病或炎症疾病的风险，例如在WO 2010/069605中所描述(该专利的内容通过引用并入本文)，包括但不限于下列疾病：哺乳动物中的心血管疾病(CVD)、2型糖尿病、阿尔茨海默病、一般痴呆症、风湿性疾病、动脉粥样硬化、高血压、急性和/或慢性炎症状态、心肌梗死、急性冠脉综合征、脑卒中、短暂性脑缺血发作(TIA)、跛行、心绞痛、1型糖尿病、类风湿关节炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、赖特综合征、系统性红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合征、红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、哮病、脑炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、关节炎(包括骨关节炎)、特发性炎性肌病(IIM)、皮肌炎(DM)、多发性肌炎(PM)、包涵体肌炎、过敏性疾病和/或骨关节炎；以及
(e)用于预防和/或减轻在手术干预后的围手术期或手术后并发症，例如在血管手术(特别是外周血管手术)后的并发症，例如在WO 2012/136819中所描述(该专利的内容通过引用并入本文)。
在本发明第六方面的另一个实施方式中，本发明第五方面的组合物可以用于治疗、预防或降低血液系统疾病(包括但不限于镰状细胞贫血症)的风险的预防或治疗方法。
在本发明第六方面的另一个实施方式中，本发明第五方面的组合物可用于治疗、预防或降低急性和慢性脉管炎症、原发性或继发性脉管炎(包括但不限于脉管炎具有自身免疫成分)和/或药物诱导的脉管炎的风险的预防或治疗方法。因此，本发明还提供一种治疗、预防或降低血管炎，包括白塞病、皮肤脉管炎、嗜酸细胞性肉芽肿性多血管炎(EGPA)、巨细胞动脉炎、肉芽肿性多血管炎(GPA)、免疫球蛋白A相关脉管炎(IgAV)、显微镜下多脉管炎(MPA)、结节性多动脉炎(PAN)、风湿性多肌痛以及大动脉炎的风险的预防或治疗方法。风湿性多肌痛可能是特别感兴趣的。
在本发明第六方面的另一个实施方式中，本发明第五方面的组合物可用于治疗、预防或降低视网膜静脉阻塞的风险的预防或治疗方法。
在发明第六方面的另一个实施方式中，本发明第五方面的组合物可用于预防或治疗方法，所述方法用于：
(i)预防或降低病毒感染的传播速度；(ii)预防或防护病毒感染；或者(iii)治疗受试者中的病毒感染，其中病毒感染由病毒所引起
(a)能够导致出血热(VHF)的病毒，和
(b)呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合而介导细胞感染和/或内化的病毒。
因此，在另一个实施方式中，本发明提供本发明第五方面的组合物在防止受试者中的病毒感染的传播或降低病毒感染的传播速度的预防或治疗方法中的应用，其中病毒感染是由能够导致出血热的病毒(VHF)所引起。
也就是说，本发明提供一种防止受试者中的病毒感染的传播或降低病毒感染的传播速度的预防或治疗方法，其中病毒感染是由能够导致出血热的病毒(VHF)所引起，所述方法包括将治疗有效量的本发明第五方面的组合物向该受试者进行给药。
换句话说，此实施方式提供本发明第五方面的组合物在生产通过防止受试者中的病毒感染的传播或降低病毒感染的传播速度而进行预防或治疗的药物中的应用，其中病毒感染是由能够导致出血热的病毒(VHF)所引起。
在另一个实施方式中，本发明提供本发明第五方面的组合物在防止受试者中的病毒感染的传播或降低病毒感染的传播速度的预防或治疗方法中的应用，其中病毒感染是由呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合而介导细胞感染和/或内化的病毒所引起。
也就是说，本发明提供一种防止受试者中的病毒感染的传播或降低病毒感染的传播速度的预防或治疗方法，其中病毒感染是由呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合而介导细胞感染和/或内化的病毒所引起，所述方法包括将治疗有效量的本发明第五方面的组合物向受试者进行给药。
换句话说，此实施方式提供本发明第五方面的组合物在生产通过防止受试者中的病毒感染的传播或降低病毒感染的传播速度而进行预防或治疗的药物中的应用，其中病毒感染是由呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合而介导细胞感染和/或内化的病毒所引起。
在另一个实施方式中，本发明提供本发明第五方面的组合物在防止或防护受试者中的病毒感染的预防或治疗方法中的应用，其中病毒感染是由能够导致出血热的病毒(VHF)所引起。
也就是说，本发明提供一种防止或防护受试者中的病毒感染的预防或治疗方法，其中病毒感染是由能够导致出血热的病毒(VHF)所引起，所述方法包括将治疗有效量的本发明第五方面的组合物向该受试者进行给药。
换句话说，此实施方式提供本发明第五方面的组合物在生产通过防止受试者中的病毒感染的传播或降低病毒感染的传播速度而进行预防或治疗的药物中的应用，其中病毒感染是由能够导致出血热的病毒(VHF)引起。
在另一个实施方式中，本发明提供本发明第五方面的组合物在防止或防护受试者中的病毒感染的预防或治疗方法中的应用，其中病毒感染是由呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合而介导细胞感染和/或内化的病毒所引起。
也就是说，本发明提供一种防止或防护受试者中的病毒感染的预防或治疗方法，其中病毒感染是由呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合而介导细胞感染和/或内化的病毒所引起，所述方法包括将治疗有效量的本发明第五方面的组合物向受试者进行给药。
换句话说，此实施方式提供本发明第五方面的组合物在生产通过防止受试者中的病毒感染的传播或降低病毒感染的传播速度而进行预防或治疗的药物中的应用，其中病毒感染是由呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合而介导细胞感染和/或内化的病毒所引起。
在另一个实施方式中，本发明提供本发明第五方面的组合物在治疗受试者中的病毒感染的预防或治疗方法中的应用，其中病毒感染是由能够导致出血热的病毒(VHF)所引起。
也就是说，本发明提供一种治疗受试者中的病毒感染的预防或治疗方法，其中病毒感染是由能够导致出血热的病毒(VHF)所引起，所述方法包括将治疗有效量的本发明第五方面的组合物向受试者进行给药。
换句话说，此实施方式提供本发明第五方面的组合物在生产通过防止受试者中的病毒感染的传播或降低病毒感染的传播速度而进行预防或治疗的药物中的应用，其中病毒感染是由能够导致出血热的病毒(VHF)所引起。
在另一个实施方式中，本发明提供本发明第五方面的组合物在治疗受试者中的病毒感染的预防或治疗方法中的应用，其中病毒感染是由呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合而介导细胞感染和/或内化的病毒所引起。
也就是说，本发明提供一种治疗受试者中的病毒感染的预防或治疗方法，其中病毒感染是由呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合而介导细胞感染和/或内化的病毒引起，所述方法包括将治疗有效量的本发明第五方面的组合物向受试者进行给药。
换句话说，此实施方式提供本发明第五方面的组合物在生产通过防止受试者中的病毒感染的传播或降低病毒感染的传播速度而进行预防或治疗的药物中的应用，其中病毒感染是由呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合介导细胞感染和/或内化的病毒所引起。
根据本发明的另一个实施方式，提供本发明第五方面的组合物在治疗感染或怀疑感染了能够导致出血热的病原体(如能够导致出血热的病毒(VHF)或者能够导致出血热的细菌(BHF))的受试者的方法。
换句话说，此实施方式提供一种用于治疗感染或怀疑感染了能够导致出血热的病原体(如能够导致出血热(VHF)的病毒或者能够导致出血热(BHF)的细菌)的受试者的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明第五方面的组合物向受试者进行给药。
换句话说，此实施方式提供本发明第五方面的组合物在生产用于治疗感染或怀疑感染了能够导致出血热的病原体(如能够导致出血热的病毒(VHF)或者能够导致出血热(BHF)的细菌)的受试者的药物中的应用。
根据本发明的另一个实施方式，提供本发明第五方面的组合物在治疗与感染或怀疑感染了能够导致出血热的病原体(如能够导致出血热的病毒(VHF)或者能够导致出血热的细菌(BHF))的另一位受试者接触的受试者的方法中的应用。
换句话说，此实施方式提供一种用于治疗与感染或怀疑感染了能够导致出血热的病原体(如能够导致出血热的病毒(VHF)或者能够导致出血热的细菌(BHF))的另一位受试者接触的受试者的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明第五方面的组合物向受试者给药。
换句话说，此实施方式提供本发明第五方面的组合物在生产用于治疗与感染或怀疑感染了能够导致出血热病的病原体(如能够导致出血热(VHF)的病毒或者能够导致出血热(BHF)的细菌)的另一位受试者接触的受试者的药物中的应用。
根据本发明的另一个实施方式，提供本发明第五方面的组合物在治疗与感染或怀疑感染了能够导致出血热的病原体(如能够导致出血热的病毒(VHF)或者能够导致出血热(BHF)的细菌)的另一位受试者中存在的或者尤其产生的生物材料接触的受试者的方法中的应用。
换句话说，此实施方式提供一种用于治疗与感染或怀疑感染了能够导致出血热的病原体(如能够导致出血热的病毒(VHF)或者能够导致出血热的细菌(BHF))的另一位受试者中存在的或者由其产生的生物材料接触的受试者的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明第五方面的组合物向该受试者进行给药。
换句话说，此实施方式提供本发明的第五方面组合物在生产用于治疗与感染或怀疑感染了能够导致出血热的病原体(如能够导致出血热(VHF)的病毒或者能够导致出血热(BHF)的细菌)的另一位受试者中存在的或者由其产生的生物材料接触的受试者的药物中的应用。
根据本发明的这些前述实施方式，能够导致出血热的病原体可以是VHF。
病毒性出血热(VHFs)可由至少五个不同科的RNA病毒所引起的动物和人疾病的不同组：沙粒病毒科(Arenaviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)以及弹状病毒科(Rhabdoviridae)。所有类型的VHF的特征可以是发热和出血性疾病并且在许多情况下都可以发展到高热、休克以及死亡。
怀疑感染了能够导致出血热的病原体(如能够导致出血热的病毒(VHF)或者能够导致出血热的细菌(BHF))的受试者可以是具有与疾病接触历史的受试者(例如由于他们卫生工作者的职业或由于家庭成员的感染)和/或可以是在确诊之前显示被感染的一个或多个体征或症状的受试者。
VHF的体征和症状典型地包括发热和对出血的敏感性增加(出血素质)。VHF的表现也常常包括：面部和胸部发红、红色或紫色小点(瘀点)、弗兰克出血、由水肿引起的肿块、低血压以及休克。乏力、肌肉疼痛(肌痛)、头痛、呕吐以及腹泻频繁地发生。症状的严重程度随着病毒的类型而变化，并且“VHF综合征”(毛细血管渗漏、出血素质、和导致休克的循环衰竭)出现在患有丝状病毒属出血热(例如，埃博拉和马尔堡)、CCHF以及南美出血热的大部分患者中，而在小部分的登革、RVF以及拉沙热的患者中出现。
根据本发明的第六方面，VHF可以是埃博拉，并且受试者可显示埃博拉的一个或多个症状，例如选自初期临床症状的症状，如出汗过多或大汗、发热的发作、肌痛、一般性乏力和/或发冷；和/或流感样症状，任选地伴发胃肠道症状；斑丘疹、瘀点、结膜出血、鼻出血、黑便、呕血、休克和/或脑病；白细胞减少症(例如，与淋巴样细胞凋亡增加相关的)、血小板减少、转氨酶水平升高、凝血酶和/或部分凝血活酶时间、在血液中可检出纤维蛋白裂解产物和/或弥散性血管内凝血(DIC)。
确定诊断通常是在具有先进的生物防护能力的实验室中进行。实验室研究发现在各病毒之间有略微变化，但一般来说存在总白细胞计数(尤其是淋巴细胞)的增加、血小板计数的减小、血液血清肝酶的升高以及血液凝固能力的下降，如凝血酶原(PT)和活化部分凝血活酶时间(PTT)的增加。血细胞比容可能增加。血清尿素和肌酸可能升高，但这依赖于患者的水合状态。出血时间往往会延长。
例如，作为BSL-4药剂，使用合适的实验室设备在埃博拉病毒感染的急性期期间确认病毒血症的临床实验室诊断是有可能的。可以利用的测定基于疾病的阶段。
在急性疾病期间，测定包括(a)使用Vero或Vero E6细胞系的病毒隔离；(b)适当的假阴性和假阳性对照下的RT-PCR和实时定量PCR测定；(c)抗原捕获ELISA；以及(d)IgMELISA。
在疾病过程的后期，可利用的测试包括(a)使用可靠病毒抗原的IgM和IgG ELISA，并且在死亡的情况下，可以将尸检组织用于(a)利用免疫染色技术的抗原检测；(b)埃博拉抗原的免疫组织化学辅助检测(Zaki等人，《国际传染病杂志(J Infect Dis)》，1999；179(增刊1)：S36e47。该文献的内容通过引用并入本文)；以及(c)用于病毒RNA的检测的原位杂交技术。
这些技术的各项技术的细节已被概述于Saijo等人，《临床及疫苗免疫学(ClinVaccine Immunol)》2006；13：444e51，该文献的内容通过引用并入本文。
CDC已将基于ELISA的测定标准化，以便用于埃博拉病毒特异性抗体的检测的。所述测定具有高敏感性并且已被证明能够检测在10年前接触埃博拉的人血清中的抗体。也已开发出基于细胞的血小板测定和终点滴定测定(TCID50)，用以检测并定量线状病毒，用于临床前研究(Shurtleff等人，《病毒(Viruses)》2012；4：3511e30；Smither等人，《病毒学方法杂志(J Virol Methods)》2013；193：565e71，该文献的内容通过引用并入本文)。
例如，VHF可以是选自纤丝病毒科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科、黄病毒科或弹状病毒科的一科中的病毒。
沙粒病毒科包括导致拉沙热、卢约病毒、阿根廷、玻利维亚、巴西和委内瑞拉出血热的病毒。
布尼亚病毒科包括导致具有肾综合征(HFRS)的出血热的汉坦病毒属、来自内罗病毒属的克里米亚-刚果出血热(CCHF)病毒、加里萨病毒和来自正本雅病毒属的伊莱沙病毒以及来自白蛉热病毒属的里夫特裂谷热(RVF)病毒的成员。
纤丝病毒科包括埃博拉病毒和马尔堡病毒。
黄病毒科包括登革、黄热病以及导致VHF的蜱传脑炎组中的两种病毒：鄂木斯克出血热病毒和科萨努尔森林病病毒。
导致刚果民主共和国的下刚果省地区的出血热中的2个致死例和2个非致死例的弹状病毒的一个成员的隔离也已被报道。非致死例发生在与其他两个的治疗有关的卫生工作者中，这表明了人与人传播的可能性。
因此，例如在特别感兴趣的一个实施方式中，本发明可应用于纤丝病毒科，例如埃博拉病毒和马尔堡病毒。在特别感兴趣的另一个实施方式中，本发明可应用于黄病毒科中的病毒，如登革病毒。
因此，本发明提供本发明第五方面的组合物在如上所述的预防或治疗方法中的应用，所述方法用于(i)防止埃博拉感染的传播或降低埃博拉感染的传播速度；(ii)防止或防护埃博拉感染；或者(iii)治疗埃博拉感染，其中受试者感染或怀疑感染了埃博拉病毒，或者曾经或预期会与另一位受试者接触，所述另一位受试者感染或怀疑感染了埃博拉病毒，或者曾经或预期会与再一位感染或怀疑感染了埃博拉病毒的受试者中存在的或由其产生的生物材料接触。
因此，本发明提供本发明第五方面的组合物在如上所述的预防或治疗方法中的应用，所述方法用于(i)防止马尔堡感染的传播或降低马尔堡感染的传播速度；(ii)防止或防护马尔堡感染；或者(iii)治疗马尔堡感染，其中受试者感染或怀疑感染了马尔堡病毒，或者曾经或预期会与另一位受试者接触，所述另一位受试者感染或怀疑感染了马尔堡病毒，或者曾经或预期会与再一位感染或怀疑感染了马尔堡病毒的受试者中存在的或由其产生的生物材料接触。
因此，本发明提供本发明第五方面的组合物在如上所述的预防或治疗方法中的应用，所述方法用于(i)防止登革热病毒感染的传播或降低登革热病毒感染的传播速度；(ii)防止或防护登革热病毒感染；或者(iii)治疗登革热病毒感染，其中受试者感染或怀疑感染了登革热病毒，或者曾经或预期会与另一位受试者接触，所述另一位受试者感染或怀疑感染了登革热病毒，或者曾经或预期会与再一位感染或怀疑感染了登革热病毒的受试者中存在的或由其产生的生物材料接触。
本发明还提供本发明第五方面的组合物在如上所述方法中的应用，所述方法用于治疗被VHF或BHF感染的受试者、延迟感染的发作和/或延缓感染的进展。
本发明还提供本发明第五方面的组合物在如上所述方法中的应用，所述方法用于预防、减轻由BHF或VHF引起的对受试者的免疫和/或血管系统的直接和/或间接细菌或病毒损伤、延迟其发作或延缓其进展。
例如，本发明可用于预防、减轻对受试者的免疫系统的的直接和/或间接细菌或病毒损伤、延迟其发作或延缓其进展，例如在埃博拉感染的背景中。例如，细菌或病毒损伤可以是选自对固有免疫应答的损伤、对获得性体液应答的损伤、对树突状细胞的损伤、对炎性因子(如干扰素生产(包括IL1生产))的产生的调节的损伤、对巨噬细胞的损伤和/或对单核细胞的损伤。
本发明可用于预防、减轻受试者的血液渗漏(出血)、低血压、血压降低、休克或死亡、延迟其发作或延迟期进展。
本发明可用于预防、减轻对受试者的血管内皮的病毒诱导的氧化氮损伤、延迟其发作或延缓其进展。
本发明提供本发明第五方面的组合物在方法中的应用，所述方法用于防止、减轻感染或怀疑感染了能够导致出血热的病原体(例如VHF或BHF)的受试者的损伤、激活、死亡和/或对受试者血管内皮或血管内皮的内皮细胞的完整性的破坏、延迟其发作或延缓其进展。血管内皮或其内皮细胞的完整性可例如利用细胞或血管上皮渗漏的程度和/或通过对一个或多个出血事件、或受试者的水肿和/或脱水的形成的检测而确定。
本发明提供本发明第五方面的组合物在方法中的应用，所述方法用于防止、减轻曾经或预期会与感染或怀疑感染了能够导致出血热的病原体(例如VHF或BHF)的另一位受试者接触的受试者的损伤、激活、死亡和/或对受试者血管内皮或血管内皮的内皮细胞的完整性的破坏、延迟其发作或延缓其进展。
本发明提供本发明第五方面的组合物在方法中的用于，所述方法用于防止、减轻曾经或预期会与感染或怀疑感染了能够导致出血热的病原体(例如VHF或BHF)的另一位受试者中存在的或由其产生的生物材料接触的受试者的损伤、激活、死亡和/或对受试者血管内皮或血管内皮的内皮细胞的完整性的破坏、延迟其发作或延缓其进展。
本发明的另一个实施方式提供如上所述通过参考本发明的各种实施方式的本发明第五方面的组合物在预防或治疗方法中的应用，其中病毒感染是由呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合而介导细胞感染和/或内化的的病毒所引起。可替代地，病毒感染可由具有被膜联蛋白A5结合的一个或多个其他类型的磷脂和/或被膜联蛋白A5结合的其它基团的病毒所引起。
呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合而介导细胞感染和/或内化的病毒可以具体地包括包含在它们的包膜中特别是在外层中的磷脂酰丝氨酸(PS)的包膜病毒。通过病毒存在的PS可以利用本技术领域已知的方法确定，例如利用ELISA研究来测量膜联蛋白A5与病毒的结合。合适的方法可以例如包括对与抗HA抗血清结合的血凝素(HA)标记的签膜联蛋白A5的ELISA测量，例如在Moller-tank等人，2013，《病毒学杂志(J.Virol.)》，87(15)，8327-8341中所描述(该文献的内容通过引用并入本文)。
本发明特别感兴趣的一组病毒包括通过与磷脂酰丝氨酸介导的病毒进入增强受体(PVEER)结合而介导细胞感染和/或内化的那些病毒。PVEER描述于Moller Tank等人，2013，《病毒学杂志(J.Virol.)》，87(15)，8327-8341中，其一个例子是T细胞免疫球蛋白和黏液素1(TIM-1)受体。其他例子可包括TIM-4、Gas6或蛋白质S/Axl、Mer和Tyro3以及MFG-E8/整合素αvβ3或αvβ5。
埃博拉是呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS与TIM-1结合而介导细胞感染和/或内化的特别感兴趣的一种病毒的一个例子。Moller Tank等人，2013，《病毒学杂志(J.Virol.)》，87(15)，8327-8341。
本发明认识到膜联蛋白A5和本发明第五方面的组合物，可用于通过PVEER(如TIM-1)抑制或阻碍病毒(如埃博拉病毒)的PS介导的细胞感染和/或内化，并由此可以预防或治疗方法，所述方法用于：(i)预防病毒感染的传播或降低病毒感染的传播速度；(ii)防止或防护病毒感染；或(iii)治疗受试者的病毒感染，其中病毒感染是由呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS结合介导细胞感染和/或内化的病毒所引起。
呈递磷脂酰丝氨酸(PS)的病毒可以是例如选自由以下组成的群组：纤丝病毒科(如埃博拉和马尔堡)中的病毒；黄病毒科；甲型肝炎；α病毒；杆状病毒；和沙粒病毒。这些病毒可在或仅在人之间有传染性。这些病毒可在或仅在非人动物中有传染性，如选自由狗、猫、牛、绵羊、猪、山羊、啮齿动物、骆驼、驯化动物以及野生动物所组成的群组的任何一种或多种动物。
PVEER(如TIM-1)可以参与将病毒内化成各种细胞类型。在一个实施方式中，根据本发明用于防护和/或治疗的特别感兴趣的细胞类型可包括选自由上皮细胞(包括血管上皮细胞)、肥大细胞、B细胞以及T细胞(如CD4+细胞或CD8+细胞，特别是激活的CD4+细胞)所组成的群组的一个或多个细胞类型。
TIM-1(也被称为HAVCR1和KIM-1)已被鉴定为人哮病的易感性基因(Mclntire等人，2003，《自然(Nature)》425：576)。一个发表的用于人TIM-1蛋白的氨基酸序列如下所示：
MHPQVVILSLILHLADSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWRGSCSLFTCQNGIVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPPKVTTTPIVTTVPTVTTVRTSTTVPTTTTVPMTTVPTTTVPTTMSIPTTTTVLTTMTVSTTTSVPTTTSIPTTTSVPVTTTVSTFVPPMPLPRQNHEPVATSPSSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSSPLYSYTTDGNDTVTESSDGLWNNQTQLFLEHSLLTANTTKGIYAGVCISVLVLLALLGVIIAKKYFFKKEVQQLSVSFSSLQIKALQNAVEKEVQAEDNIYIENSLYATD(SEQ ID NO：2)。
TIM-1是具有包含IgV结构域、富黏液素结构域的胞外域和包含N-连接糖基化位点的短膜近端柄的I型膜蛋白质(Ichimura等人，1998，《生物化学杂志(J.Biol.Chem)》273(7)：4135-42)。TIM-1IgV结构域具有二硫化物依赖性构象，其中CC'环被折叠到GFCβ链上，从而形成由CC'和FG环所构成的独特裂缝(Santiago等人，2007，《免疫学(Immiunity)》26(3)：299-310)。由CC'和FG环所构成的裂缝是用于磷脂酰丝氨酸的结合部位(Kobayashi等人，2007，《免疫学(Immiunity)》27(6)：927-40)。被引导到TIM-1IgV结构域的CC'/FG裂缝的抗体抑制TIM-1与磷脂酰丝氨酸和树突状细胞的结合并且在过敏性哮病的人源化小鼠模型中显示出体内治疗活性(Sonar等人，2010，《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》120：2767-81)。
本发明的另一个实施方式是基于本发明第五方面的组合物在防止、抑制TIM-1的IgV结构域和其他PVEER与呈递给它的PS结合或降低其结合能力中的应用。根据本发明的此实施方式，本发明第五方面的组合物中的AnxA5蛋白优选地也具有与PS结合的能力，并且能够与PVEER竞争以与PS结合。
因此，在另一个实施方式中，本发明第五方面的组合物可用于抑制磷脂酰丝氨酸与TIM-1(或其他PVEER)结合的方法。
例如，这可以预防地或治疗地用于抑制、减轻或预防细胞被呈递磷脂酰丝氨酸(PS)并通过PS而介导细胞感染和/或内化的病毒所感染的情况。
可替代地，这可预防地或治疗地用于解决涉及PS与TIM-1(或其他PVEER)的结合的其他医学状况。下面对TIM-1相关疾病进行描述。
因此，在另一个实施方式中，本发明提供一种抑制或减少TIM-1或其他PVEER与磷脂酰丝氨酸的结合的方法，所述方法包括将表达TIM-1或其他PVEER的第一细胞接触与一定量的本发明第五方面的组合物接触，所述组合物有效地抑制或减少第一细胞与在其细胞表面上含有磷脂酰丝氨酸的第二细胞或者与在其表面上呈递磷脂酰丝氨酸(PS)的病毒的结合。所述方法可以是体内或体外方法。在体内方法的情况下，其可治疗或预防涉及PS与TIM-1或其他PVEER的结合的病况。
换句话说，本发明的此实施方式还提供本发明第五方面的组合物在预防或治疗方法中的应用，所述方法用于抑制或减少有需要的患者中TIM-1或其他PVEER与磷脂酰丝氨酸的结合。
在另一个实施方式中，本发明提供一种抑制或减少PS与树突状细胞上的TIM-1或其他PVEER的结合的方法，所述方法包括使表达TIM-1或其他PVEER的树突状细胞与一定量的本发明第五方面的组合物接触，所述组合物有效地抑制或减少PS与树突状细胞的结合。所述方法可以是体内或体外方法。在体内方法的情况下，其可治疗或预防涉及PS与树突状细胞上的TIM-1或其他PVEER的结合的病况。
换句话说，本发明的此实施方式还提供本发明第五方面的组合物在预防或治疗方法中的应用，所述方法用于抑制或减少有需要的患者中PS与树突状细胞上的TIM-1或其他PVEER的结合。
还公开了一种治疗或预防炎症或自身免疫疾病的方法，所述方法包括将包含治疗有效量的本发明第五方面的组合物的药物组合物施用于患有炎症或自身免疫疾病的哺乳动物。
换句话说，本发明的此实施方式还提供本发明第五方面的组合物在用于预防、治疗或减轻炎性或自身免疫疾病的预防或治疗方法中的应用。
还公开了一种治疗或预防哮病的方法，所述方法包括将包含本发明第五方面的组合物的药物组合物施用于患有哮病的哺乳动物。
换句话说，本发明的此实施方式还提供本发明第五方面的组合物在用于预防、治疗或减轻哮病的预防或治疗方法中的应用。
还公开了一种治疗或预防特应性疾病的方法，所述方法包括将包含治疗有效量的本发明第五方面的组合物的药物组合物施用于患有特应性疾病的哺乳动物。特应性疾病可以是例如特应性皮炎、接触性皮炎、荨麻疹、过敏性鼻炎、血管性水肿、乳胶过敏反应或过敏性肺病(例如，哮病、过敏性支气管肺曲霉菌或超敏感性肺炎)。
换句话说，本发明的此实施方式还提供本发明第五方面的组合物在用于预防治疗或减轻特应性疾病的预防或治疗方法中的应用。
如本文中所描述，本发明第五方面的组合物可用于治疗或防止多种TIM-1相关疾病和其他PVEER相关疾病(包括免疫系统障碍，如炎性和自身免疫疾病)。
术语“治疗”包括以下含义：以有效改善病况、症状或与疾病相关的参数，或者有效防止疾病发展或恶化(包括由所述疾病所引起的二次损伤)的量、方式和/或模式施用本文中所描述的物质或组合物，以达到统计学显著的程度或对于本领域技术人员而言可检测的程度。
可以将本发明第五方面的组合物以提供总体疗效的量和时间施用于有患这些疾病的风险、诊断有这些疾病或患有这些疾病的的受试者。本发明第五方面的组合物可以单独地(单药治疗)或者在混合物中或者以间隔的、同时的或序贯给药的方式联合其他药剂(联合治疗)而施用。在联合治疗的情况下，给药的量和时间可以是提供例如累加或协同治疗作用的量和时间。此外，本发明第五方面的组合物(有或没有第二药剂)的给药可以被用作首要治疗(例如第一线治疗)或者作为次要治疗，例如用于对先前施用的治疗具有不充分应答的受试者(即，除使用AnxA5蛋白的治疗外)。
可利用本文中所描述的本发明第五方面的组合物进行治疗的疾病或病况包括例如缺血性再灌注损伤(例如，器官缺血性再灌注损伤，如肝或肾缺血再灌注损伤)、过敏反应、哮病、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病、移植排斥、胰腺炎以及迟发型超敏反应(DTH)。
可利用本文中所描述本发明第五方面的组合物治疗的其他的疾病或病况包括例如自身免疫疾病。
系统性红斑狼疮(SLE；狼疮)是TH-2介导的自身免疫疾病，其特征是针对细胞内抗原(如双链DNA、单链DNA以及组蛋白)的高水平的自身抗体。
适于利用本文中所描述的本发明第五方面的组合物进行治疗的其他器官特异性或全身性自身免疫病的例子包括：重症肌无力、自身免疫溶血性贫血、查加斯病、弥漫性毒性甲状腺肿、特发性血小板减少紫瘢(ITP)、韦格纳肉芽肿病、结节性多动脉炎和快速发展的新月形肾小球肾炎。参见，例如Benjamini等人，1996，《免疫学：短期课程(Immunology，AShort Course)》，第三版(Wiley-Liss，纽约)。另外，类风湿关节炎(RA)适合利用如本文中所描述的膜联蛋白A5进行治疗。
可利用本文中所描述的本发明第五方面的组合物进行治疗的其他TIM-1相关疾病或病况包括例如移植物抗宿主病(GVHD)。GVHD是可以利用本文中所描述的膜联蛋白A5进行治疗的T细胞介导病况的典型。当供体T细胞将宿主抗原确认为外来物时引发了GVHD。GVHD，常常是人类患者中骨髓移植(BMT)的致死结果，可以是急性或慢性粘膜皮肤念珠菌病。急性和慢性形式的GVHD分别例示了抗原特异性Th1和Th2应答的形成。急性GVHD在BMT后的前两个月内发生，并且特征是对皮肤、肠、肝以及其他器官的供体细胞毒T细胞介导损伤。慢性粘膜皮肤念珠菌病GVHD在其后出现(在BMT后的100天内)并且其特征是免疫球蛋白(Ig)，包括自身抗体和由Ig沉积所引起的对肤、肾以及其他器官的损伤的超高产生。几乎90％的急性GVHD患者继续发展到慢性GVHD。慢性GVHD似乎是Th2T细胞介导1疾病(De Wit等人，1993，《(免疫学杂志J.Immunol.)》150：361-366)。急性GVHD是Th1介导的疾病(Krenger等人，1996，《研究方向：免疫学(Immunol.Res.)》15：50-73；Williamson等人，1996，《免疫学杂志(J.Immunol.)》157：689-699)。T细胞细胞毒性是急性GVHD的特征。供体抗宿主细胞毒性的后果可以以各种方式看出。第一，宿主淋巴细胞被快速地摧毁，使得患有急性GVHD的小鼠被极度地免疫抑制。第二，供体淋巴细胞在宿主脾中移植并膨大，并且它们的细胞毒活性可以直接通过利用表达可以被供体细胞确认(为外来物)的宿主抗原的细胞系的优势进行体外测量。第三，疾病变得致命，因为其他的组织和细胞群体被摧毁。
可利用本文中所描述的本发明第五方面的组合物进行治疗的其他TIM-1相关疾病或病况包括例如特应性疾病。特应性疾病的特征是免疫系统细胞(包括激活的T细胞和APC)对是Th2应答的特征的细胞因子、趋化因子以及其他分子(如IL-4、IL-5以及IL-13细胞因子等)的表达。因此，这种特应性疾病将适于利用本文中所描述的本发明第五方面的组合物进行治疗。特应性疾病包括气道超敏和窘迫综合征、特应性皮炎、接触性皮炎、荨麻疹、过敏性鼻炎、血管性水肿、乳胶过敏反应以及过敏性肺病(例如，哮病、过敏性支气管肺曲霉菌病以及超敏性肺炎)。
可利用本文中所描述的本发明第五方面的组合物进行治疗的其他TIM-1相关疾病或病况包括例如许多免疫或炎症性病症。免疫或炎症性病症包括但不限于：过敏性鼻炎、自身免疫溶血性贫血；黑棘皮病；阿狄森氏病；斑秃；普秃；淀粉样变性；过敏性紫瘢；类过敏性反应；再生障碍性贫血；强直性脊柱炎；颅动脉炎；动脉炎巨细胞；高安氏动脉炎；颞动脉炎；共济失调-毛细血管扩张；自身免疫性卵巢炎；自身免疫性睾丸炎；自身免疫性多内分泌失调；白塞病；贝格尔病；血栓闭塞性脉管炎；支气管炎；大疱性天疱疮；慢性粘膜皮肤念珠菌病；卡普兰综合征；心肌梗死后综合征；心包切开术后综合征；心炎；口炎性腹泻；查加斯病；Chediak-Higashi综合征；变应性肉芽肿性血管炎；科干综合征；冷凝集素病；肢端硬皮(CREST)综合征；克罗恩病；冷球蛋白血症；隐源性纤维性肺泡炎；疱疹样皮炎；皮肌炎；糖尿病；戴-布二氏综合征；迪格奥尔格综合征；圆盘状红斑狼疮；嗜酸性筋膜炎；巩膜外层炎；持久性隆起性红斑；边缘性红斑；多形性红斑；结节性红斑；家族性地中海热；费尔蒂综合征；肺间质纤维化；过敏性肾小球肾炎；自身免疫肾小球肾炎；链球菌感染后肾小球肾炎；移植后肾小球肾炎；膜性实心球病；肺出血肾炎综合征；免疫介导粒细胞减少症；环状肉芽肿；过敏性肉芽肿病；肉芽肿性肌炎；毒性弥漫性甲状腺肿；桥本氏甲状腺炎；新生儿的溶血疾病；特发性血色沉着病；过敏性紫瘢；慢性活动性和慢性进行性肝炎；组织细胞增生症X；嗜酸粒细胞增多综合征；特发性血小板减少性紫瘢；乔布综合征；幼年型皮肌炎；幼年型类风湿关节炎(青少年慢性粘膜皮肤念珠菌病关节炎)；川崎病；角膜炎；干燥性角结膜炎；兰-格-巴-斯四氏综合征；瘤型麻风；吕佛琉综合征；狼疮；赖氏综合征；莱姆病；淋巴瘤样肉芽肿病；全身性肥大细胞增多症；混合性结缔组织病；多发性单神经炎；穆-韦二氏综合征；黏膜皮肤淋巴结综合征；黏膜皮肤淋巴结综合征；多中心网状组织细胞增多症；多发性硬化；重症肌无力；蕈样肉芽肿；全身性坏死性脉管炎；肾病综合征；重叠综合征；脂膜炎；阵发性冷性血红蛋白尿症；阵发性睡眠性血红蛋白尿症；类天疱疮；天疱疮；红斑型天疱疮；落叶型天疱疮；寻常型天疱疮；鸽饲养者肺；结节性多动脉炎；风湿性多肌痛；多发性肌炎；特发性多神经炎；葡萄牙家族性多发性神经病；先兆子痫/子痫惊厥；原发性胆汁性肝硬化；进行性系统性硬化症(硬皮病)；银屑病；银屑病关节炎；肺泡蛋白沉着症；肺间质纤维化、雷诺氏现象/综合征；慢性纤维性甲状腺炎；赖特综合征、复发性多软骨炎；风湿热；类风湿关节炎；结节病；巩膜炎；硬化性胆管炎；血清病；塞扎里综合征；干燥综合征；史蒂芬斯-强森综合征；斯蒂尔病；亚急性硬化性全脑炎；交感性眼炎；系统性红斑狼疮；移植排斥；溃疡性结肠炎；未分化结缔组织病；慢性荨麻疹；寒冷性荨麻疹；葡萄膜炎；白癜风；韦伯-克里斯钦病；韦格纳肉芽肿病或威斯科特-奥尔德里奇二氏综合征。
现在将参考一个或多个非限制性实施例对本发明进行描述。
实施例
以下的实施例被包括用以揭示本发明的具体实施方式。本领域技术人员应当理解的是，在接下来的各实施例中所公开的技术代表了本发明的实施中起很好作用的由本发明人发现的技术，并因此可以被认为构成其实施的优选方式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解的是，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以在所公开的具体实施方式中作出许多变更并且仍然获得同样的或类似的结果。
比较实施例1
Marder等人，2014，《BMC生物技术(BMC Biotechnology)》，14：33的方法报告了对1L培养物的处理，并且是由二次30分钟时间段的38,900g离心所组成，在第一离心步骤中使与细胞碎片结合的膜联蛋白A5沉淀，在第二离心步骤中使细胞碎片沉淀同时将膜联蛋白A5保持在溶液中。
提供以下的分析用以计算将Marder等人的方法从1L扩大到1000L的工业相关培养体积的影响。
基于选择目前可获得的具有最佳转子的最佳离心机，他们以6×250ml＝1.5升并且可以实现30,200g至38,400g。例子是用于Thermo ScientificTM SorvallTM LYNX超速离心机的高价的碳纤维轻质转子(Fiberlite F14-6x250y，固定角度转子)或JLA-16.250转子，固定角度，铝制，生物安全盖，6×250mL，38,400×g，用于Beckmancoulters AvantiJXN-26。利用这种高端的先进离心机来加载离心物，开始并加速到所需要的转速，在最大G力下用时30分钟，然后允许仔细地破裂至静止状态从而不干扰团块，然后用约45分钟清空转子。
亦即，目前可获得的最佳离心机允许每45分钟1.5升的处理。
Marder等人报告了(在标题为“提纯”的节中)，在超声处理和离心之前，使3g湿重量的细胞悬浮于30mL的缓冲液中。因此，在离心期间，由Marder等人所采用的湿细胞重量(WCW)浓度为(30ml缓冲液缓冲液中加入3克)＝9.1％WCW。
Marder等人(在第二页的标题为“生物反应器培养”下)也报告了生物质浓度为27.48g(DCW)L-1(SD＝1.96)的均值。因此，在Marder的发酵罐中干细胞重量(DCW)浓度为27.48gr/L＝2.748％。已知1克DCW＝约4克湿细胞重量(WCW)。因此，在细胞浓度发酵罐中存在2.748×4＝11.0％的WCW浓度。如果将这扩大到高达1000L培养体积，并且保守假设从1000L中采集期间细胞损失为5％，那么利用Marder的方法得出的1000L贮罐中的WCW将会＝1000×11％×0.95＝104.5kg WCW。
Marder的离心方法在离心步骤期间采用9.1％的WCW浓度。因此，来自1000L培养物的104.5kg WCW将会需要被稀释到9.1％WCW浓度，这需要1148L的离心总体积。
大胆假设生物生产设备具有两个高端先进的离心机，以便一台离心机可以用于使带细胞碎片的膜联蛋白形成团块(第一离心)，而另一台离心机可在膜联蛋白在溶液中并且然后使细胞碎片形成团块时并行进行第二离心：
将1148L溶液离心的总时间为(其中离心机每45分钟可以处理1.5升＝1148/1.5＝766次离心每45分钟)分别＝34,4700分钟＝574.5小时。
假设生物生产设备每天运行12小时，然后利用Marder等人的方法对来自1000L贮罐的WCW进行处理将将用时48天，或者仅离心(假设每周5个工作日)就用时10周。
合计，将需要大约另外的两周时间用于发酵、下游处理和其他操作。假设生物生产设备完全地被一个方法所占有，并且因此同时在相同的设备中不可以进行其他生产，这提供生产车间12周的时间以制备并处理来自1000L培养物的细胞。这是基于可获得两个离心机的大胆假设。如果仅使用一个离心机，那么一个1000L批次的生产时间将会是22周。
相反，如下所述，本发明的方法可以仅在两周内处理1000L培养物，即速度大约快6倍(并且还提供与Marder等人方法的产物相比质量高得多的产物，且具有高得多的产率)。
生产成本与与生产时间成正比，因为生产车间将被占用并且同时在相同的车间内不可以进行其他生产。
经计算，在本发明的方法中膜联蛋白A5的产率比由Marder等人的方法所生产的每个批次高2至3倍。这使得Marder方法中每克膜联蛋白A5蛋白的生产成本高出(6×2-3＝)12至18倍。
此外，来自Marder方法的蛋白质的纯度将会不适合于人类使用。尽管有细致的离心，但仅使用一个阴离子交换色谱步骤，这远达不到有关方法中相关杂质(特别是内毒素)和产物相关变异体的足够纯度的要求。Marder未提供关于内毒素水平或其他杂质的任何数据，进一步表明不适用于药学应用。
另外，Marder方法的非常缓慢的离心操作要求膜联蛋白A5蛋白长时间处在不稳定环境中。这有可能导致产品降解或产品改性，并且是长生产运行时间的另一个缺点，同时对产品质量有负面影响。
实施例1
缩略语：
Figure GDA0001623996400000561
Figure GDA0001623996400000572
导言：
含有320个氨基酸的重组36kDa蛋白质膜联蛋白A5在大肠杆菌BL21/pHIP.ANXA5的细胞质中表达。重组膜联蛋白A5主要是以其可溶性形式而产生。使用携带用于膜联蛋白A5的编码序列的热诱导表达质粒pHIP。选择性的标志是卡那霉素抗性基因。各个克隆的MCB已被建立并且被广泛地表征。
所述生产方法是从实验室规模(相当于3L发酵体积)扩大到大规模(相当于100L发酵体积)。
开发的方法包括从粗溶解产物进行高效阴离子交换捕获，接着是在钙存在下对固定化肝素进行的亲和步骤。此中间亲和步骤对于膜联蛋白A5是非常特异性的。作为最终精制步骤，采用高分离度阴离子交换色谱。所述精制步骤允许产物相关杂质的分离。配制通过使用10kDa NMWCO组件的超滤渗滤执行。
本实施例描述并评价了生产方法中的计划修改/变更，确定了操作参数和必需措施以确保成功的转移，并且定义了验收标准以便确定其成功。成功的转移由下游方法的执行而证明，所述方法实施对实验室规模程序的修改，从而形成具有相当的产率和质量的DS。
总体项目目标是开发用于膜联蛋白A5的cGMP生产的方法。
程序–方法比较和评价
在本节中，对使用的方法参数、原材料、消耗品、缓冲液以及设备进行了评价。
图2示出了用于膜联蛋白A5的生产的完整方法的示意性概略图。
表1对3L和100L方法所使用的原材料进行了比较和评价。
表1：对3L和100L方法所使用原材料的比较
Figure GDA0001623996400000571
Figure GDA0001623996400000581
表2对3L和100L方法所使用的消耗品进行了比较和评价。消耗品(取样装置和管件)应当对DSP方法的产品质量和产率没有影响。所有使用材料符合要求的规格。
表2：消耗品列表
Figure GDA0001623996400000582
一般说明：
●所有使用的消耗品是一次性的或产品专用材料。
●在整个方法中用于储存缓冲液并且用作中间产物容器的袋子来自赛多利斯公司，具有PE/EVOH层(CX5-14膜)。袋子在例如无菌性、低内毒素以及可滤去物和可提取物方面得到制造商的确证。
●所有其他使用的消耗品包括产物接触的材料，如管件、连接件、采样系统或样品容器适合用于所述方法各步骤。这通常包括USP级VI认证、无菌性和/或低内毒素，如果适用。除预先组装到袋子的C-Flex管件外，在整个DSP中使用铂处理硅胶管。所有使用的消耗品不含动物源性成分或者可提供TSE证书。
表3对用于膜联蛋白A5的生产的3L和100L方法所使用的设备进行了比较。
表3：所使用设备的列表
Figure GDA0001623996400000591
培养基、缓冲液以及溶液如表4中所示。缓冲液的规格仅针对电导率进行调整，并且基于测试缓冲制剂。缓冲液在所述方法前制备，根据它们的规格进行了测试，微孔过滤(0.2μm过滤器)并储存(保存时间≤3个月，在室温下)。在使用的时间点，执行缓冲液的采样(作为参考；分析：内毒素、初始污染菌)。
表4：培养基和溶液列表
Figure GDA0001623996400000592
Figure GDA0001623996400000601
开发了可扩展分批式发酵方法并且在生产单位扩大。下游提纯方法包括三个色谱步骤。核酸酶后处理：将经过滤和稀释的加料流加到AX色谱(Q琼脂糖凝胶XL，通用电气医疗集团)上，作为第一捕获步骤。通过稀释对洗脱液进行调节，从而能够借助于亲和色谱(肝素HyperD M，颇尔)实现中间提纯。将AF池稀释并经历最终AX色谱步骤(Source15Q，通用电气医疗集团)。最后，利用UF/DF执行浓度和缓冲液改变。
以相当于3L发酵体积的DSP实施了成功的小批试生产，以证明用于所有方法步骤的充分方法性能。
目标范围是由小规模方法所确定，并且用于对扩大的结果进行评价。
方法的比较
在下面的章节中，基于以相当于3L发酵体积的方法规模的小批试生产，对试验室规模下游方法(DSP)进行详细描述。通常，除了加载到第一捕获物外，色谱步骤是以带AektaExplorer系统的实验室规模而执行。在大规模中，所有色谱步骤利用生物方法系统执行。用于DSP的扩大因子为33(从3LUSP至100LUSP)。
1.1.1生物质的重悬、核酸酶处理以及细胞破碎
在发酵后，通过离心收集生物质并在-20℃下储存。下游处理开始于生物质的解冻和重悬于匀化缓冲液1中。在匀化之前，将预先在匀化缓冲液中稀释(3.300U/LUSP或1.850U/L重悬生物质)的全能核酸酶加入到重悬细胞中。将重悬比率设定为1g生物质/10mL。在三次循环中于600巴下执行匀化，以达到高度的均一性，从而有利用于接下来的捕获步骤。在匀化中无需主动冷却，因为需要高达40℃的高温以允许利用核酸酶对核酸进行最佳消化。在小规模中，获得在36℃至40℃范围内的温度。
下面示出了生物质的重悬、全能核酸酶处理以及细胞破碎的方法流程图：
Figure GDA0001623996400000611
1.1.2澄清处理、调节以及捕获色谱
在匀化后，通过使用利用Cuno60SP(0.6μm至0.2μm深度过滤器的过滤，使溶解产物澄清化。执行此步骤以额外减少核酸的含量并获得颗粒减少溶液，所述溶液可以用于捕获色谱。根据制造商的指导，用水将深度过滤器预先清洗。
过滤后，用1％吐温80将溶解产物稀释2倍。加入EDTA直到最终浓度为2mM。
该调节池利用蠕动泵脱机使用，以用于AX捕获色谱。以200cm/h的线性泵速度，用两个柱体积(CV)(20mM Tris pH 7.4、0.1％吐温80、25mM NaCl)使AX捕获柱平衡。
加载后，用5CV的平衡缓冲液对柱进行脱机清洗，随后转移到色谱系统以进行另外5CV的清洗。利用较高盐浓度(20mM Tris pH 7.4；0.1％吐温80；300mM NaCl)使用分步洗脱执行膜联蛋白A5洗脱达9CV。在下降峰中升高UV280nm信号0.1吸收单位(AU)至0.2AU定义分级。对整个洗脱峰进行进一步处理。
实施两步CIP程序从而使柱再生并清洗(步骤1：2M NaCl，用于3CV 100cm/h；上向流/步骤2：1M NaOH，3CV；保温培养用>15h，40cm/h上向流)。最后，将柱保存于20mM的NaOH。
图3提供了AX捕获色谱的方法流程图。
通常，捕获步骤可以被认为是调节步骤，用以提高中间步骤的性能。其将产物浓缩并且显著地改变加载的基质。此外，观察到内毒素的强减少(达约97％)以及DNA和HCP的中等减少。
1.1.3中间亲和色谱
在中间色谱之前，将所获得的AX洗脱池(250mL/LUSP)进行过滤(Sartopore2 0.45μm至0.2μm)。
随后对经过滤的AX池进行8倍稀释(稀释缓冲液：20mM Tris pH 7.4；0.1％吐温80；2mM CaCl2)。用钙进行的稀释允许膜联蛋白A5与固定化肝素色谱结合。与离子相互作用相比，此相互作用是缓慢的。接触时间是关键的，因此以≤100cm/h执行色谱。
执行两个清洗步骤。利用不含钙的缓冲液(20mM TrispH 7.4；0.1％吐温80)，对于15CV(20mM Tris pH 7.4；0.1％吐温80；2mM CaCl2)执行清洗步骤1，接着对于2CV执行第二清洗步骤。
利用使用含有螯合钙离子的EDTA的缓冲液(20mM TrispH 7.4；0.1％吐温80；10mMEDTA；25mM NaCl)的阶梯洗脱执行洗脱。所述螯合反应特定地洗脱在钙存在下仅可以与肝素结合的膜联蛋白A5。为了实现浓缩的洗脱，在洗脱中将流率减小到≤60cm/h。完整的洗脱峰可以从0.05AU处的UV信号上升开始到代表约7CV的下降峰的0.05AU处采集。洗脱曲线显示单个尖锐峰。
实施两步骤CIP程序从而使柱再生并清洗柱(步骤1：2M NaCl用于3CV 100cm/h；上向流/步骤2：0.1M NaOH，3CV；保温培养达>15h，40cm/h上向流)。最后，将柱保存于25％EtOH中的1M NaCl。
图1示出了用于中间亲和色谱的方法流程图。
中间步骤是该方法方案中最有效的提纯步骤。膜联蛋白A5与钙离子结合。在此钙结合的状态中，产物可以与肝素形成高度特异性的结合。仅能够与钙复合的正确折叠的膜联蛋白A5形式可以与肝素结合。由此，色谱步骤可以在正确折叠产物与错误折叠产物之间的进行辨别。另外，中间步骤达到高消除因子，因为利用钙与EDTA的螯合反应而将高度特异性的相互作用与特异性洗脱组合。因此，观测到内毒素的强减少(进一步减少约99％)和HCP的强减少，以及DNA含量的中等减小。
第一AX捕获步骤(约97％)和中间亲和色谱步骤(约99％)的联合减少内毒素的效果提供膜联蛋白A5产物，其中内毒素水平被减少到第一AX步骤之前澄清化产物中水平的约0.03％。
1.1.4精制-AX色谱
在精制色谱之前，对所获得的AF洗脱池(300mL/LUSP)进行2倍稀释(35mM TrispH8；0.1％吐温80；12.5mM MgCl2)并且过滤(Sartopore2 0.45μm至0.2μm)。所述稀释降低AX加载的电导率但也使游离EDTA分子与Mg离子复合。或者，使游离EDTA与柱结合，由此主要地降低能力但也降低此步骤中的分离。
精制树脂是具有15μm的平均树脂直径的Source15Q。所述树脂是具有高背压缺点的高分离度精制树脂。因此，以100cm/h执行色谱。加载量应当<16g/L树脂从而实现适当的分离度。
加载后，利用用于3CV的缓冲液A(20mM Bis-TrispH7；25mM NaCl)执行清洗。在33CV中，利用线性梯度执行洗脱达到100％B(20mM Bis-Tris pH7；180mM NaCl)。该色谱步骤主要设计用于去除产物相关杂质。不同形式的膜联蛋白A5从40％至100％B中洗脱出，开始是主峰，接下来是第二降低峰和若干较小的峰。
采集从0.05AU开始到在代表大约7CV的峰1与峰2之间的谷的第一主峰。
实施两步骤CIP程序从而使柱再生并清洗柱(步骤1：2M NaCl，用于3CV100cm/h；上向流/步骤2：1M NaOH，3CV；保温培养达>15h，40cm/h上向流)。最后，将柱保存于25mM NaCl。
在小规模实验中所获得的最近结果表明吐温80具有积极作用的。用0.1％吐温80执行的方法提高中间后产品产率大约30％。在精制步骤中的加载量限于16g/L树脂以确保适当的分离度。产率的提高对扩大的情况也具有影响。利用两个循环计划精制步骤中计算的柱尺寸。如果对来自100LUSP规模的总量进行处理，产率的提高使4至5次循环的情况成为必需。
图2示出了用于AX精制色谱步骤的方法流程图。
精制步骤主要被执行用于减少产物相关杂质，例如不同膜联蛋白A5异形体的分离。另外，在用于残余的DNA的方法中精制步骤达到最高消除因子并且强烈地减少HCP。在中间步骤之后已处在低水平内毒素被进一步减少达约99％，这使内毒素水平达到第一AX步骤之前澄清化产物中水平的约0.0003％。
1.1.5膜联蛋白A5的超滤/渗滤和配制
将AX池直接地转移到UF/DF以提高产物浓度并执行缓冲液变化。在缓冲液改变之后，加入吐温80直到0.05％的最终浓度并对药物进行无菌过滤。
在第一方法步骤中，对AX池进行6至8倍浓缩。在此之后，在不含有吐温(20mM Bis-Tris，150mM NaCl，1mM CaCl2pH7或pH 7.4)的配制缓冲液中，用8至10渗滤体积执行缓冲液变化。在缓冲液变化后，执行第二次浓缩以实现12g/L的最终浓度。这允许添加第一次清洗的组件的加入和添加吐温80直到0.05％的最终浓度，从而达到10g/L的无菌过滤后的最终浓度。用0.9巴至1.1巴的低TMP执行UF/DF步骤以使覆盖层形成最小化。
图3示出了用于膜联蛋白A5的超滤/渗滤和配制的方法流程图。
2.目标值和验收标准
以下的目标值和验收标准被是定义以便与小规模运行DSP相比较对方法性能和扩大进行评价。基于批试生产的IPC/整体(Bulk)分析来定义目标值。关键方法参数的特征是详细说明关键方法步骤并提高方法性能的可靠性。
2.1主要方法参数
表5示出了主要方法参数。在方法执行期间目标范围的达到指示方法成功放大。
表5：方法步骤的方法参数和各自的目标值
Figure GDA0001623996400000641
Figure GDA0001623996400000651
2.2关键方法参数
在捕获色谱之前悬浮液的高度的均一性是重要的。三次匀化循环的采用适合于实现此目的。此外，在匀化中的温度升高适合于获得37℃范围内的溶解产物的温度。这对于对过滤步骤和捕获性能有直接影响的全能核酸酶的活性是重要的。
来自精制步骤的池化也是重要的，因为此步骤是用于产物相关杂质的分离。就TMP而言，在中等条件下执行UF/DF步骤，以使覆盖层的形成最小化。
表6：重要的方法参数
Figure GDA0001623996400000652
2.3方法中控制
表7示出了方法中控制。在方法性能期间实现的目标范围显示了成功的方法扩大。基于对以前小规模生产的观察而设定目标范围，所述观察仅通过实施的改变进行。
Figure GDA0001623996400000653
Figure GDA0001623996400000661
Figure GDA0001623996400000671
Figure GDA0001623996400000681
Figure GDA0001623996400000691
Figure GDA0001623996400000701
3结论
如果需要，前述的生产方法非常适用于大规模生产，并且在扩大规模到且超过10,000L规模时无瓶颈。
以下的小批试生产采用在GMP试验装置中的扩大的200L，所述方法提供具有每mgAnxA5蛋白1.8pg宿主细胞DNA；每mg AnxA5蛋白16.6ng宿主细胞蛋白质；以及每mg AnxA5蛋白0.1EU的产物。
在整个生产方法中，当不暂时地与色谱树脂结合时，膜联蛋白A5蛋白以其活性形式保持在溶液中。
当应用于1,000L培养物时，总方法时间将为在生产车间中发酵、收集、细胞破碎和色谱之前的处理需要的一周，和下游处理需要的连续的一周。在GMP车间中的整个方法将为2周。这独立于规模并且非常适合于工业标准并且将会适合任何的CMO或药物厂商。
如上所述，相比较而言，Marder等人的方法将会用时大约12周以对1,000L培养物进行处理。
此外，本发明的方法中每批次的产率比Marder等人的批次高2至3倍。这使得Marder方法每克膜联蛋白A5药物的生产成本高出(6-8x2-3＝)12至24倍。
此外，除了提供一种与Marder等人的方法相比更快且具有更高产率的提纯方法外，本发明的方法还提供纯度较高的产物。如在上面的比较实施例1中所述，由Marder方法得到的蛋白质浓度将会不适合于人类使用。虽然有细致的离心，但仅将一个阴离子交换色谱步骤用于Marder方法，这远达不到有关方法中相关杂质(特别是内毒素)和产物相关变异体的足够纯度的要求。Marder未提供关于内毒素水平或其他杂质的任何数据，从而进一步表明不适合于药学应用。
相反，本申请的方法提供高纯度的膜联蛋白A5蛋白产物，具有如下所列出的特性：
-浓度通常为大约8g/L至12g/L；
-宿主细胞蛋白水平在或低于100ng/mg，更通常地低于20ng/mg(如利用ELISA所测定)；
-宿主细胞DNA水平在或低于100pg/mg，更通常地低于10pg/mg；
-内毒素水平在或低于35EU/mg，更通常地低于1EU/mg；
->95％的纯度，如利用尺寸排阻色谱所测定；
-<1cfu/mL的初始污染菌(如通过欧药典洲2.6.12所测定)；
-无可见颗粒的澄清、无色外观；以及
-其中通过蛋白质印迹法分析所检测的主带检测与膜联蛋白A5参考相对应。
利用用于第二精制步骤的Capto Q ImpRes代替Source15Q来重复所述方法。这提供更高效的方法，因为Capto Q ImpRes阴离子交换树脂具有高结合能力，耐受高流率且具有低背压，可以以较高的床高进行堆叠并且价格较低。保持最后产物的质量和纯度。
与Source15Q相比，Capto Q ImpRes树脂具有：
●用克/升树脂表示，大于双倍的容量；
●在相同的背压下，耐受大于2×的更高流率；
●可以以较高的床高进行堆叠，通常高出约35％至60％，这为任何给定的柱足迹提供更高的容量用；以及
●成本小于每升树脂购买价格的一半。
实施例2
本实施例说明了对阴离子交换(AX)捕获与采用肝素色谱的亲和捕获的比较。
在捕获洗脱物的膜联蛋白A5步骤产率和纯度方面，将AX捕获与肝素亲和捕获色谱进行了比较。在优化条件下批次实验中，对这两种方法进行了比较。
测试参数：
AX色谱：
批次模式500μl树脂(75％浆体)
缓冲液AX A：20mM磷酸钠pH 7.5mM EDTA、250mM NaCl
缓冲液AX B：20mM磷酸钠pH 6.5、5mM EDTA
AX色谱：加载：10mL过滤前溶解产物
CIP：1M NaOH
肝素亲和色谱：
批次模式500μl树脂(75％浆体)
加载：10mL预先过滤的溶解产物；+10mM CaCl2
缓冲液AF A：50mM Tris pH 7.4、5mM CaCl2
缓冲液AF B：50mM Tris pH 7.4、40mM EGTA、50mM NaCl
CIP：3M NaCl
表7：AX与肝素亲和色谱捕获的比较
Figure GDA0001623996400000711
Figure GDA0001623996400000721
这些结果表明在亲和色谱前执行AX捕获不会显著地提高纯度，但对肝素步骤产率具有显著影响。此外，如果被用作中间步骤，高成本的亲和树脂可能具有延长的使用寿命。产率具有大的重要性。
AX的捕获可能被分类为调节步骤，这允许肝素色谱有效使用高度特异性亲和步骤。
实施例3
利用类似于实施例1的方法获得部分提纯的膜联蛋白A5产物，直到第一阴离子交换产物色谱捕获步骤。
简单地说，使表达膜联蛋白A5的重组大肠杆菌重悬于含有3200U全能核酸酶的匀化缓冲液(50mM Tris、1mM MgCl、1％吐温20，pH 7.5)中，并且利用600巴压力的三次循环进行匀化。测量匀化后温度为36℃。执行使用Cuno60SP 0.6μm至0.2μm的澄清化骤，在1％吐温20中将澄清化溶液进行1：2稀释，并且添加EDTA。在用于捕获的调节后，溶液具有6.9的pH和2.7mS/cm的电导率。使用Q琼脂糖凝胶XL(GE)执行阴离子交换，用缓冲液A(20mM Tris，25mMNaCl、0.1％吐温20，pH 7.4)进行清洗，然后用缓冲液B(20mM Tris，300mM NaCl、0.1％吐温20，pH 7.4)进行洗脱。然后，用0.2μM过滤器对所形成的产物进行无菌过滤。
利用肝素亲和色谱和不同的测试条件，对所形成的无菌过滤的阴离子交换产物进行提纯。
所采用的肝素亲和色谱条件如下：
Figure GDA0001623996400000722
使用Sartopore 2 0.45μm至0.2μm，执行捕获洗脱池的无菌过滤。用来自肝素色谱中的缓冲液A(1050mL)将该池稀释8倍。所形成的池具有7.4的pH值和6.8mS的电导率。以60cm/h的减小的流率执行洗脱。
以如下方式执行测试1和2，以确定吐温80对用于清洗的缓冲液A和用于洗脱的缓冲液B的影响：
测试1：
缓冲液A：20mM Tris、25mM NaCl、2mM CaCl2、0.1％吐温20，pH 7.4
缓冲液B：20mM Tris、10mM EDTA、25mM NaCl、0.1％吐温20，pH 7.4
测试2：
缓冲液A：20mM Tris、25mM NaCl、2mM CaCl2、0.1％吐温20、0.1％吐温80pH7.4
缓冲液B：20mM Tris、10mM EDTA、100mM NaCl、0.1％吐温20、0.1％吐温80pH7.4
将测试1的结果示于图7A，将测试2的结果示于图7B。
结果表明吐温80的添加将洗脱转变为单个峰，与在标准条件下(测试1)的单独洗脱相反。吐温80似乎使膜联蛋白A5变稳定。对洗脱行为变化的一个可能的解释是防止在柱上的理论上的沉淀。对于吐温80在肝素亲和色谱步骤中的使用，可以描述两个主要积极作用：
-降低压力：柱上的压力(在加载中从0.5增加到2巴至3巴)明显地被降低到0.5巴。这对于大规模而言是特别有利。在延长的保温培养后所看见的少量沉淀可能是压力增加的原因。
-防止沉淀：在洗脱中看见第二积极作用。在洗脱的分离中高度浓缩的主峰部分具有产生沉淀的倾向。在各部分的池化后，未观察到更多的沉淀，假设此作用与主峰中的非常高浓度的膜联蛋白A5有关：此外，沉淀似乎是不可逆的。通过提高洗脱中的盐浓度，可以防止主峰中的沉淀。与此相反，吐温80的添加也防止在主峰的各部分中沉淀物的形成。
基于这些结果，似乎有利的是另外地将吐温80加入所有中间色谱缓冲液中，因为它对膜联蛋白A5具有稳定化作用。
实施例4
利用类似于实施例1的方法获得部分提纯的膜联蛋白A5产物，直到第一阴离子交换产物色谱捕获步骤。
然后，将1.25mL阴离子交换步骤的产物与8.75mL不同形式的测试稀释缓冲液加以混合。然后，将混合物在环境温度下进行保温培养，并且在30分钟、18小时以及4天后进行目视评价。
将结果示于下表中：
Figure GDA0001623996400000741
这些结果显示了添加吐温80(即，聚山梨醇酯80)在避免样品中的产物沉淀方面的益处。这对于在应用于色谱柱(例如亲和色谱柱)之前调节AnxA5产物以当柱工作时减少沉淀并防止背压的增加的情况是重要的。
Figure IDA0001597981460000011
Figure IDA0001597981460000021
Figure IDA0001597981460000031

Claims (104)

1.一种从具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达细胞内蛋白质的方法，其中所述方法包括
(I)从所述宿主细胞中释放所述细胞内蛋白质，
其特征在于，释放所述细胞内AnxA5蛋白的步骤在包含非离子洗涤剂的匀化缓冲液的存在下执行；
(II)使所述释放的AnxA5蛋白经过阴离子交换树脂以便执行第一阴离子交换步骤，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物；和
(III)使所述释放的AnxA5蛋白经历亲和色谱步骤，由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法不包括从所述宿主细胞中释放所述AnxA5蛋白之后回收和/或提纯所述AnxA5蛋白的任何离心步骤，并且/或者其中所述AnxA5蛋白除暂时地与任何色谱树脂结合外，在整个方法中保留在溶液中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子洗涤剂是聚山梨醇酯。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述聚山梨醇酯选自吐温20和吐温80。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述聚山梨醇酯是吐温80。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中释放所述细胞内AnxA5蛋白的步骤在匀化缓冲液的存在下执行，所述匀化缓冲液包含有效地减少或防止膜联蛋白A5与内毒素之间结合的量的非离子洗涤剂。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中释放所述细胞内AnxA5蛋白的步骤在匀化缓冲液的存在下执行，所述匀化缓冲液包含0.01至10％(w/w)非离子洗涤剂，如0.02至5％(w/w)、0.05至2％(w/w)或约1％(w/w)非离子洗涤剂。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的从具有细胞壁的宿主细胞中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达细胞内蛋白质的方法，其中所述方法包括从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白，
其中在从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白时或者在从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白之后，但在任何进一步的色谱提纯进行之前，所述匀化缓冲液中的游离钙离子浓度低于10mM，并且/或者
其中所述匀化缓冲液包含钙金属离子螯合剂，或者在释放所述细胞内AnxA5蛋白之后被改性而包含钙金属离子螯合剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白时或者在从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白之后，但在任何进一步的色谱提纯进行之前，所述匀化缓冲液中的游离钙离子浓度低于5mM、1mM，或500μM，或者基本上为零。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂选自EDTA或其盐和EGTA或其盐。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂是EDTA。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述游离钙离子的水平和/或钙金属离子螯合剂的量有效地降低或防止膜联蛋白A5与所述宿主细胞的细胞壁成分之间的结合。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述匀化缓冲液在释放所述AnxA5蛋白之前或之后包含或者被调节而包含选自0.01至500mM，0.05至100mM、0.5至20mM、1至15mM、2至10mM或约4mM的浓度的钙金属离子螯合剂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂是EDTA。
15.根据权利要求8所述的方法，其中根据权利要求3到7中任一项所述的方法，所述匀化缓冲液包含非离子洗涤剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂是EDTA。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述非离子洗涤剂是吐温80。
18.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述方法包含从所述宿主细胞的培养物中回收和/或提纯重组表达的细胞内AnxA5蛋白，并且其中所述培养物具有至少100L、500L、1,000L、5,000L或10,000L的体积。
19.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其包括按每mL匀化缓冲液约10g生物质的浓度将来自所述宿主细胞培养物的生物质混合于所述匀化缓冲液中的步骤。
20.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在所述匀化缓冲液中从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白的步骤包括对所述宿主细胞进行溶解、破裂、匀化、超声处理或压力处理，使得所述宿主细胞的细胞壁和细胞膜屏障破裂，并由此释放出细胞内AnxA5蛋白，并且任选地，其中此步骤不包括渗透压冲击和/或冻结-解冻步骤的采用。
21.根据权利要求20所述的方法，其中从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白的所述步骤包括高压匀化。
22.根据权利要求21所述的方法，其中从所述宿主细胞中释放所述细胞内AnxA5蛋白的所述步骤包括(i)在约400巴和约2,500巴之间的一个或多个循环的高压匀化，(ii)约600巴的三次匀化循环或(iii)约800巴的两次匀化循环。
23.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中释放所述细胞内AnxA5蛋白的所述步骤形成包含所述释放的AnxA5蛋白的生物质匀浆。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述生物质匀浆还包含选自由以下组成的群组的杂质中的一种或多种：宿主细胞蛋白、宿主细胞壁成分、宿主细胞膜、宿主细胞核酸以及内毒素。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物质匀浆还包含选自由以下组成的群组的杂质中的全部：宿主细胞蛋白、宿主细胞壁成分、宿主细胞膜、宿主细胞核酸以及内毒素。
26.根据权利要求23所述的方法，其还包括以下步骤：澄清所述生物质匀浆，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的澄清化产物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中澄清所述生物质匀浆的步骤包括利用核酸酶，如核酸酶A对所述匀浆进行处理。
28.根据权利要求27所述的方法，其中：(i)核酸酶A来自来自粘质沙雷菌(Serratiamarescens)，或(ii)核酸酶A来自来自粘质沙雷菌(Serratia marescens)并且在释放所述细胞内AnxA5蛋白之前将所述核酸酶包含在所述匀化缓冲液中。
29.根据权利要求26所述的方法，其中澄清所述生物质匀浆的步骤包括使包含所述释放的AnxA5蛋白的所述生物质匀浆通过过滤器的步骤，并且其中所述过滤器流出物是包含所述释放的AnxA5蛋白的所述澄清化产物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述过滤器是纤维素或聚丙烯过滤器。
31.根据权利要求29所述的方法，其中澄清所述生物质匀浆的步骤包括在权利要求25到27任一项的核酸酶处理之后，使包含所述释放的AnxA5蛋白的所述生物质匀浆通过过滤器的步骤，并且其中所述过滤器流出物是包含所述释放的AnxA5蛋白的所述澄清化产物。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述纤维素或聚丙烯过滤器是深度过滤器，和/或其中所述过滤器具有小于4μm的截止值。
33.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中使根据权利要求29到32任一项所述的方法所产生的包含所述释放的AnxA5蛋白的所述澄清化产物经历所述第一阴离子交换步骤，由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中在所述第一阴离子交换步骤之前，对所述释放的AnxA5蛋白的环境的一个或多个参数进行调节，所述参数选自由以下组成的群组：pH、电导率、钙离子螯合剂的水平以及非离子洗涤剂的水平。
35.根据权利要求33所述的方法，其中在约6.9的pH值、约2.8mS/cm的电导率、约1mM的钙离子螯合剂浓度下，对经历所述阴离子交换步骤的所述释放的AnxA5蛋白进行配制，并且利用非离子洗涤剂稀释，例如以获得0.01至1％(w/v)的最终非离子洗涤剂浓度。
36.根据权利要求35所述的方法，其中在约6.9的pH值、约2.8mS/cm的电导率、约1mM的钙离子螯合剂浓度下，对经历所述阴离子交换步骤的所述释放的AnxA5蛋白进行配制，并且利用非离子洗涤剂稀释，以获得约0.1％(w/v)的最终非离子洗涤剂浓度。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述nxA5蛋白在所述阴离子交换步骤期间结合，并且为了释放所述结合的AnxA5蛋白，将清洗溶液和/或洗脱缓冲液施加到所述阴离子交换树脂中，产生了包含所述释放的AnxA5蛋白的所述第一阴离子交换产物，任选地，其中所述洗脱缓冲液包含NaCl，例如约300mM的NaCl。
38.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中使根据权利要求33至37中任一项所述的方法所产生的所述第一阴离子交换产物中的AnxA5蛋白经历所述亲和色谱步骤。
39.根据权利要求38所述的方法，其包括以下步骤，其中：
(a)利用根据权利要求26到32中任一项所述的方法澄清根据权利要求23或24的包含所述释放的AnxA5蛋白的生物质匀浆，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的澄清化产物，以及
(b)根据权利要求33至37中的任一项，使所述澄清化产物中的所述AnxA5蛋白经过阴离子交换树脂，以便执行第一阴离子交换步骤，并由此产生包含所述AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物，以及
(c)其中根据权利要求38，使所述第一阴离子交换产物中的所述AnxA5蛋白经历亲和色谱步骤。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述亲和色谱步骤包括使所述AnxA5蛋白与固定化肝素结合，并且任选地，其中利用钙离子的存在促进所述结合。
41.根据权利要求40所述的方法，其中利用含有钙离子螯合剂，如EDTA的洗脱缓冲液将所述AnxA5蛋白从所述固定化肝素中洗脱出。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述第一亲和色谱产物包含所述释放的AnxA5蛋白和钙离子螯合剂，如EDTA或EGTA，其任选地在0.1至500mM的范围内。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第一亲和色谱产物包含所述释放的AnxA5蛋白和钙离子螯合剂，如约10mM的EDTA或EGTA。
44.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中
所述方法包括使包含AnxA5蛋白和钙离子螯合剂的组合物经历阴离子交换树脂，以便执行阴离子交换步骤，并由此从所述组合物中回收和/或提纯所述AnxA5蛋白；并且
其中所述阴离子交换步骤是在另外选择的金属离子存在下执行，和
其中对所述另外选择的金属离子进行选择，以使得所述钙金属离子螯合剂对所述所选择金属离子的结合亲和力大于其对所述阴离子交换树脂的结合亲和力，但小于其对钙离子的结合亲和力。
45.根据权利要求44所述的方法，
其中所述AnxA5蛋白在整个所述方法中，包括任何之前的或之后的步骤，除暂时地与任何色谱树脂结合外，均保留在溶液中。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂选自EDTA或其盐、EGTA或其盐。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂是EDTA。
48.根据权利要求44所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂过量存在于所述组合物中，且/或以约或至少0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM或更大的浓度存在于所述组合物中。
49.根据权利要求44所述的方法，其中所述所选择金属离子是二价阳离子，例如Mg2+离子。
50.根据权利要求44所述的方法，其中在所述阴离子交换步骤期间，所述所选择金属离子的存在量在所述组合物经历所述阴离子交换树脂的过程期间有效地减少或防止所述钙离子螯合剂与所述阴离子交换树脂之间的相互作用。
51.根据权利要求44所述的方法，其中在所述阴离子交换步骤期间，在所述钙离子螯合剂存在下，所述所选择金属离子的存在量有效地增加所述AnxA5蛋白与所述阴离子交换树脂的结合，并相较于在所述阴离子交换步骤期间当没有所选择金属离子存在时所观测的损失水平，由此减少AnxA5蛋白在流经所述阴离子交换步骤时的损失。
52.根据权利要求44所述的方法，其中所述所选择金属离子在所述阴离子交换步骤期间存在的浓度是约1至约100mM，如约2至约50mM、约5至约25mM、约10至约15mM或约12.5mM。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述选择金属离子被添加到包含所述AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂的组合物中，随后使所述组合物经历所述阴离子交换树脂。
54.根据权利要求44所述的方法，其中所述钙金属离子螯合剂是EDTA并且所选择金属离子是Mg2+离子。
55.根据权利要求54所述的方法，其中Mg2+离子与EDTA的摩尔比是在0.5:1至2:1的范围内。
56.根据权利要求54所述的方法，其中Mg2+离子与EDTA的摩尔比是至少1:1或更大。
57.根据权利要求44所述的方法，其中
包含所述AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂并经历所述阴离子交换树脂的所述组合物是前一程序的直接或间接产物，所述前一程序包括以下步骤：使所述AnxA5蛋白经历亲和色谱步骤并且用钙离子螯合剂对所述AnxA5蛋白进行洗脱，由此产生亲和色谱产物，所述亲和色谱产物是包含所述AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂的组合物。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述前一亲和色谱步骤包括使所述AnxA5蛋白与固定化肝素结合，并且任选地，其中利用钙离子的存在促进所述结合。
59.根据权利要求58所述的方法，其中利用含有钙离子螯合剂，如EDTA或EGTA的洗脱缓冲液将所述AnxA5蛋白从所述固定化肝素中洗脱出。
60.根据权利要求57所述的方法，其中在所述前一亲和色谱步骤与所述阴离子交换步骤之间不存在透析步骤，并且/或者在所述直接或间接产物施加于所述阴离子交换步骤之前，不将钙离子螯合剂从前一亲和色谱步骤的产物中去除。
61.根据权利要求44所述的方法，其中在所述阴离子交换步骤之前或期间，将所述所选择金属离子加入到所述组合物中。
62.一种用于从具有细胞壁的内毒素产生宿主细胞或由权利要求18所定义的其培养物中回收和/或提纯包含膜联蛋白A5(AnxA5)序列的重组表达细胞内蛋白质的方法，其中：
(a)所述方法包括根据权利要求1(I)至7中的任一项在包含非离子洗涤剂的匀化缓冲液存在下，从所述内毒素产生宿主细胞中释放所述细胞内蛋白质；
(b)任选地，其中所述释放步骤是根据权利要求中19至24中的任一项进行；
(c)另外任选地，其中所述方法包括根据权利要求26至32中的任一项澄清所述生物质匀浆的步骤；
(d)其中所述方法还包括根据权利要求1(II)和33至37中任一项的以下步骤：任选地在钙离子螯合剂的存在下，使所述释放的AnxA5蛋白直接地或间接地经历阴离子交换树脂，以便执行第一阴离子交换步骤，并由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一阴离子交换产物；
(e)其中所述方法还包括以下步骤：使所述释放的AnxA5蛋白直接地或间接地经历亲和色谱步骤，由此产生包含所述释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物，以及
(f)其中所述第一亲和色谱产物是包含所述AnxA5蛋白和钙金属离子螯合剂的组合物；以及
(g)其中使所述亲和色谱步骤的包含所述AnxA5蛋白和所述钙金属离子螯合剂的所述直接或间接产物根据权利要求44至61中的任一项经历阴离子交换步骤。
63.根据权利要求62所述的方法，其中步骤(a)至(g)均不包括或均不在其间插入选自离心和/或透析的一个或多个步骤。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述AnxA5蛋白除了暂时地与阴离子交换和亲和色谱固相结合外，在整个所述方法中均保持可溶。
65.根据权利要求62至64中任一项所述的方法，其中步骤(e)的亲和色谱步骤包括将AnxA5蛋白与固定化的肝素结合，并且其中通过钙离子的存在来促进结合。
66.根据权利要求65所述的方法，其中使用含有钙离子螯合剂例如EDTA的洗脱缓冲液从固定化的肝素中洗脱出所述AnxA5蛋白。
67.根据权利要求62至64中任一项所述的方法，其中步骤(e)的亲和色谱步骤包括
在Tween80存在下，使所述包含AnxA5蛋白和一种或多种杂质的溶液经历肝素亲和色谱步骤，从而产生包含释放的AnxA5蛋白的第一亲和色谱产物。
68.根据权利要求67所述的方法，其中步骤(e)的亲和色谱步骤包括在0.1％Tween80存在下使包含所述AnxA5蛋白和一种或多种杂质的溶液经历肝素亲和色谱步骤。
69.根据权利要求67所述的方法，其中除了与任何色谱树脂暂时结合时，所述AnxA5蛋白在整个过程中都保留在溶液中，所述整个过程包括任何先前或随后的步骤。
70.根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述方法包括一个或多个选自由以下组成的群组的其他步骤：浓缩、缓冲液更换、调节和过滤，以及任选地将所述含有AnxA5蛋白的产物储存于无菌容器中的最后步骤。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述过滤是无菌过滤。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述一个或多个其他步骤在如任何前述权利要求所限定的所述方法结束时。
73.根据权利要求70所述的方法，其中所述其他步骤中的一个是渗滤，任选地，其中所述渗滤步骤的产物含有浓度为至少约1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、50mg/mL、100mg/mL或更高的所述AnxA5蛋白。
74.根据权利要求70所述的方法，其中所述过滤使用0.45-0.2μm过滤器或0.22μm过滤器。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述过滤是无菌过滤步骤。
76.根据权利要求70所述的方法，其中无菌过滤是在将所述含AnxA5蛋白的产物储存于无菌容器中之前的最终提纯步骤。
77.根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述方法包括在约pH 7.4的非磷酸盐缓冲液中提供最终无菌AnxA5蛋白产物所要求的步骤，所述非磷酸盐缓冲液包含约150mMNaCl、约1mM CaCl2、约0.05％(w/w)聚山梨醇酯或其他非离子洗涤剂，并且任选地，其中所述最终无菌AnxA5蛋白产物中所述AnxA5蛋白的浓度为约10mg/mL。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述非磷酸盐缓冲液是Bis-Tris或Tris缓冲液，和/或所述聚山梨醇酯是吐温80。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述方法提供最终无菌AnxA5蛋白产物，其中所存在的所述NaCl浓度将AnxA5蛋白维持在主要是单体的形式。
80.根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述方法提供的总产率为每升宿主细胞培养物大于1g的AnxA5蛋白。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述方法提供至少约1.5g/L的总产率。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述方法提供在约2g/L至约4g/L的范围内的总产率。
83.根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述方法提供的总回收率为存在于所述宿主细胞培养物中的所述AnxA5蛋白的约24重量％的AnxA5蛋白。
84.根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述方法提供的产物除了所述重组表达的AnxA5蛋白外包含含量小于每mg AnxA5蛋白100ng、90ng、80ng、70ng、60ng、50ng、40ng、30ng、20ng或更小的宿主细胞蛋白。
85.根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述方法提供的产物包括每mgAnxA5蛋白小于100EU、90EU、80EU、70EU、60EU、50EU、45EU、40EU、35EU、30EU、25EU、20EU、15EU的内毒素含量。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述方法提供的产物包括每mg AnxA5蛋白小于10EU、5EU或1EU的内毒素含量。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述方法提供呈单位剂型的产物，并且所述产物含有每单位剂量小于100EU、90EU、80EU、70EU、60EU、50EU、45EU、40EU、35EU、30EU、25EU、20EU、15EU。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述产物含有每单位剂量小于10EU、5EU或1EU。
89.根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述方法提供的产物包含每mgAnxA5蛋白小于1,000pg的宿主细胞核酸含量。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述方法提供的产物包含每mg AnxA5蛋白小于100pg白，或每mg AnxA5蛋白小于10pg的宿主细胞核酸含量。
91.一种包含AnxA5蛋白的组合物，其中所述组合物是根据权利要求65-69或其任何从属权利要求中任一项所述的方法的直接或间接产物或者可通过所述方法直接地或间接地获得，并且其中：
(a)该组合物已经历无菌过滤步骤，并且是无菌组合物；
(b)将组合物储存在无菌容器中；
(c)所述组合物包含每mg AnxA5蛋白小于100、50、20、10、5或1EU的内毒素含量；
(d)所述组合物包含每mg AnxA5蛋白小于1,000pg，100pg或10pg的核酸水平，例如宿主细胞核酸水平；和
(e)所述AnxA5蛋白不含His标签。
92.根据权利要求91所述的组合物，其含有浓度为至少约1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、50mg/mL、100mg/mL或更大的所述AnxA5蛋白。
93.根据权利要求91或92所述的组合物，其中所述组合物包含存在于约pH 7.4的非磷酸盐缓冲液中的无菌AnxA5蛋白产物，所述非磷酸盐缓冲液包含约150mM NaCl、约1mMCaCl2、约0.05％(w/w)聚山梨醇酯或其他非离子洗涤剂，并且任选地，其中所述无菌AnxA5蛋白产物中的所述AnxA5蛋白的浓度为约10mg/mL。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述非磷酸盐缓冲液是Bis-Tris或Tris缓冲液，和/或所述聚山梨醇酯是吐温80。
95.根据权利要求91或92所述的组合物，其中所述组合物包含NaCl，所述NaCl浓度将AnxA5蛋白维持在主要是单体的形式。
96.根据权利要求91或92所述的组合物，所述组合物包含含量为每mg AnxA5蛋白小于100,90,80,70,60,50,40,30,20,10,或5ng的非AnxA5蛋白，如宿主细胞蛋白，并且任选地，其中虽然每mg AnxA5蛋白小于100,90,80,70,60,50,40,30,20,10,或5ng，所述宿主细胞蛋白以可检测含量,存在于所述组合物中。
97.根据权利要求91或92所述的组合物，其中虽然每AnxA5蛋白小于100EU、50EU、20EU、10EU、5EU或1EU，内毒素以可检测含量存在于所述组合物中。
98.根据权利要求91或92所述的组合物，所述组合物是呈单位剂型的产品，并且含有每单位剂量小于100EU、50EU、20EU、10EU、5EU或1EU，并且任选地，其中虽然每单位剂量小于100EU、50EU、20EU、10EU、5EU或1EU，内毒素以可检测含量存在于所述组合物中。
99.根据权利要求91或92所述的组合物，虽然每mg AnxA5蛋白小于1,000pg、100pg或10pg，所述组合物包括所述组合物中可检测含量的核酸含量。
100.根据权利要求91或92所述的组合物，其中所述组合物中的葡糖酰化AnxA5蛋白含量是在所述产物中的AnxA5蛋白总含量的0.5％至30％或0.5％至20％或0.5％至15％或0.5％至10％的范围内。
101.根据权利要求91或92所述的组合物，其中所述组合物中的葡糖酰化AnxA5蛋白含量低于40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。
102.根据权利要求101所述的组合物，其中所述组合物中的葡糖酰化AnxA5蛋白基本为0％。
103.根据权利要求91或92所述的组合物，其中所述AnxA5蛋白不含有一个或多个RGD基序。
104.根据权利要求91或92所述的组合物，其中所述组合物是药学上可接受和/或兽医学上可接受的组合物。
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