PT2234631E

PT2234631E - Compostos e métodos para o tratamento de doença vascular

Info

Publication number: PT2234631E
Application number: PT08862538T
Authority: PT
Inventors: Johan Frostegard; Knut Pettersson
Original assignee: Athera Biotechnologies Ab
Priority date: 2007-12-18
Filing date: 2008-12-18
Publication date: 2012-11-20
Also published as: AU2008337284B2; HRP20120797T1; US20100291064A1; ES2393163T3; US9682122B2; JP2011506590A; MX2010006719A; EP2234631B1; SI2234631T1; WO2009077764A1; US20150010531A1; CA2708956C; DK2234631T3; CN102223892A; AU2008337284A1; BRPI0821272A2; US20160235811A1; EP2234631A1; CA2708956A1; PL2234631T3

Description

DESCRIÇÃO COMPOSTOS E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇA VASCULAR Campo da invenção A invenção refere-se à utilização no tratamento de disfunção vascular em pacientes, tais como os que sofrem estados a incluir angina de peito, cardiopatia isquémica, arteriopatia periférica, hipertensão sistólica, enxaqueca, diabetes tipo 2 e disfunção eréctil.

Antecedentes da invenção A indicação ou discussão de um documento aparentemente publicado previamente nesta memória descritiva não se deve considerar necessariamente como um reconhecimento de que o documento é parte do estado da técnica ou é conhecimento geral comum. A angina de peito ("opressão no peito") é uma dor de peito devido à falta de oxigénio no miocárdio. A falta de oxigénio deve-se normalmente a isquemia, uma redução do fornecimento de sangue (e, portanto, o fornecimento de oxigénio) ao miocárdio. Normalmente, esta isquemia está provocada por placas ateroscleróticas nos vasos coronários, mas também pode estar provocada por um espasmo local na vasculatura coronária. Outras causas pouco comuns podem ser valvulopatia, anemia grave, estenoses aórticas e taquiarritmias. A angina de peito divide-se em angina por esforço, angina desencadeada por exercício físico e/ou mental; angina por espasmo (angina de Prinzmetal ou variante), angina súbita sem correlação com uma situação específica; e síndrome X, normalmente uma angina relacionada com esforço, mas sem estenose manifestada na 1 angiografia. Um ataque de angina tem normalmente uma duração de 1 a 5 minutos. Se os ataques produzem-se em repouso, ou têm uma duração que supera aos 15 minutos, a doença denomina-se angina instável e está associada com risco iminente de acontecimento cardiovascular. 0 estado classifica-se também como angina instável quando pioram os sintomas da angina estável. A angina instável pertence à sindrome coronária aguda (SCA) e é um estado critico. Um infarto do miocárdio está provocado normalmente por uma ausência quase completa de fornecimento de sangue a uma parte do miocárdio, normalmente provocada pela ruptura de uma lesão aterosclerótica coronária com uma formação posterior de um trombo oclusivo. A doença arterial periférica (DAP) é um estado com semelhanças à angina de peito, mas está presente em artérias periféricas, normalmente as extremidades inferiores. A dor isquémica é comum nestes pacientes, e também está associada normalmente com a actividade física. A dor, ou sensação de câimbras, com frequência experimentada como resultado do exercício físico em pacientes com DAP denomina-se normalmente claudicação intermitente.

Endotélio em doença cardiovascular (CV). A disfunção vascular, num sentido geral, caracteriza à maioria dos estados de doença CV, e com frequência envolve função endotelial alterada. 0 endotélio é a capa de células mais interna em todos os vasos sanguíneos. É a maior glândula endócrina do organismo, e secreta vários factores importantes que controlam o sistema circulatório. Vários estudos recentes mostraram que a “disfunção endotelial" está relacionada com um aumento do risco de acontecimentos CV [1]. A "disfunção endotelial" mede-se normalmente como uma perda de dilatação mediada por endotélio, a capacidade que tem o endotélio para 2 dilatar vasos sanguíneos em resposta a determinados estímulos [2] . Há vários modos de medir a dilatação mediada por endotélio, o mais comum é a dilatação da artéria braquial durante a hiperemia, vasodilatação mediada por fluxo (VMF) [3] . A utilizar tais medições de dilatação mediada por endotélio, mostra-se que a função vascular se vê dificultada em indivíduos que sofrem doenças relacionadas com aterosclerose (hipertensão, hiperlipidemia, diabetes) [4, 5]. A libertação de óxido nítrico, NO, a partir do endotélio é um acontecimento chave na dilatação mediada por endotélio [6]. A enzima chave na geração de NO é a óxido nítrico sintase endotelial, eNOS. Estudou-se principalmente em conjunção directa com a regulação do sistema vascular (trombose/hemostasia, regulação do fluxo sanguíneo e crescimento de vasos sanguíneos), mas também está relacionada com o desenvolvimento de aterosclerose assim como resistência à insulina e/ou diabetes tipo 2 (T2DM). Por exemplo, ratos deficientes em eNOS são mais propensos a converter-se em ateroscleróticos que ratos com função eNOS normal e também são resistentes à insulina [7]. A normalização da (dis)função vascular num estado de doença arterial, medida como a restauração da dilatação mediada por endotélio normal, pode ser ou não o resultado de um aumento da libertação de NO a partir do endotélio. A disfunção vascular pode resultar, ou não, da redução da sensibilidade dos músculos lisos arteriais ao NO e/ou pode resultar, ou não, do aumento do metabolismo do NO que se gera. Outros mecanismos podem também alterar a função vascular em doença arterial; por exemplo, sabe-se bem que durante a inflamação vascular a formação de substâncias pró-inflamatórias e 3 vasoconstrictoras aumenta, e isto poderia desviar os efeitos vasodilatadores, tais como os provocados por NO.

Endotélio em angina de peito e doença arterial periférica. Quando se administra acetilcolina a artérias coronárias, desencadeia-se a libertação de NO a partir do endotélio coronário, o que por sua vez provoca a dilatação das artérias coronárias (dilatação mediada por endotélio). Quando se realizou este procedimento em pacientes com arteriopatia coronária, responderam com uma "vasoconstricção paradoxal" [8]. Desde então, mostrou-se que há uma perda inapropriada de dilatação mediada por endotélio em pacientes que sofrem qualquer forma de angina de peito [9, 10], e que esta função alterada é um factor contribuinte importante à isquemia miocárdica e, portanto, à dor anginosa nestes pacientes. A DAP (normalmente medida como a redução do índice tornozelo-braço (ITB) devido a lesões ateroscleróticas estenosantes) caracteriza-se também por uma redução da dilatação mediada por endotélio [11] . Em pacientes em que a doença é sintomática (claudicação intermitente), a redução da dilatação mediada por endotélio é maior que em pacientes não sintomáticos [12] . A hipertensão sistólica é uma importante doença em populações em envelhecimento, e está associada normalmente com um aumento da rigidez do compartimento arterial central [13]. Mostra-se também que o NO reduz a rigidez [14], e um agente que possa restaurar a dilatação mediada por endotélio reduzida até a normal num paciente com hipertensão sistólica pode ser, portanto, de valor terapêutico. 4

Outra observação interessante é que pacientes que sofrem enxaqueca também têm dilatação mediada por endotélio alterada, e isto sugeriu que as anomalias na vasomotricidade vascular podem ser um importante factor fisiopatológico na enxaqueca [15, 16]. Neste contexto é interessante que uma mutação no gene de eNOS que está associada com perda de função [17] e está associada com aumento do risco de acontecimentos de CV [18-20], também está associada com enxaqueca [21].

Ainda em outro aspecto do papel do endotélio e o NO na doença, a disfunção eréctil também está associada com dilatação mediada por endotélio alterada [22], e a restauração da dilatação mediada por endotélio normal também pode melhorar a disfunção eréctil. A partir do resumo anterior, resulta evidente que a restauração do controle endotelial normal do tónus vascular mediante a normalização do metabolismo do NO endotelial é uma oportunidade terapêutica em estados patológicos em que se reduz a dilatação mediada por endotélio.

Tal como se descreveu anteriormente, a dilatação mediada por endotélio é um importante factor no desenvolvimento de doença arterial. Também se sabe bem que estas doenças também estão vinculadas a alterações no sistema hemostático, e que a inflamação vascular está associada com um estado em que há um aumento do risco de formação de trombos arteriais. A anexina A5 é uma proteína endógena que se une a fosfolipídeos carregados tais como fosfatidilserina (PS) [23]. A anexina A5 é um potente agente antitrombótico [24], e propõe-se que a anexina A5, a unir-se a PS exposta, pode 5 formar um “escudo protector" que pode inibir os efeitos de PS sobre a formação de trombose [25] . Neste contexto é interessante que em pacientes com transtornos autoimunitários tais como APS e/ou SLE, há anticorpos no plasma que podem reduzir a união de anexina A5 a PS sobre, por exemplo, superfícies de células endoteliais, a aumentar desse modo a exposição a PS. Este achado pode explicar por que estes pacientes têm um risco superior de acontecimentos trombóticos que a população geral [23]. De maneira muito interessante, teve uma redução significativa na capacidade de união de anexina A5 a células endoteliais de soro de controlos para pacientes com SLE que não haviam sofrido acontecimentos trombóticos em relação com pacientes com SLE que haviam padecido tais acontecimentos [26].

Mostrou-se que além dos efeitos antiplaquetários e anticoagulantes da anexina A5, esta proteína e um análogo da mesma, o dímero de anexina A5 dianexina, é eficaz na prevenção frente à lesão por reperfusão no fígado [27], e melhorava o desenlace de transplantes de fígado em ratas [28]. De maneira interessante, em ambos destes estudos os tratamentos estavam associados com uma actividade inflamatória reduzida no endotélio hepático, medida como expressão reduzida de moléculas de adesão. Sugeriu-se que a dianexina melhorava a sobrevivência dos transplantes de fígado mediante um efeito antitrombótico que conduzia a um fornecimento de sangue mantido ao fígado [28].

Sugeriu-se anteriormente que se pode utilizar anexina A5 para estabilizar lesões ateroscleróticas em artérias coronárias em pacientes, o que deve reduzir o risco de infarto do miocárdio nestes pacientes ([26]; documento WO 2005/099744). 6

Breve descrição dos desenhos

Figura 1. A anexina A5 restaura a vasodilatação mediada por endotélio

Registos representativos da pressão arterial num rato apoE(_/_> controlo (perfil superior) e um rato tratado com anexina A5 (perfil inferior). Injectou-se metacolina tal como se indica mediante a linha descontinua. Painéis à direita com administração prévia do inibidor de eNOS, L-NAME .

Figura 2. Resumo dos efeitos de anexina A5 sobre a vasodilatação mediada por endotélio medida como pressão arterial.

As barras mostram a pressão arterial média antes (basal) e 3 minutos após a administração de metacolina em ratos não tratados e tratados com anexina 5, respectivamente.

Figura 3. Resumo dos efeitos de anexina A5 sobre alterações induzidas por metacolina na pressão arterial sistólica e diastólica.

Injectou-se metacolina no instante 0 em ratos ateroscleróticos ou controlo (-♦-) ou tratados com anexina A5 (······)· Mostra-se o efeito sobre a pressão arterial sistólica (A) e diastólica (B).

Descrição da invenção

No presente documento mostra-se que a anexina A5 pode restaurar a vasodilatação mediada por endotélio normal em ratos ateroscleróticos, mediante um mecanismo dependente de NO. Portanto, a anexina A5 ou análogos da mesma proporcionam uma nova modalidade de tratamento com efeitos anti-isquémicos 7 que pode normalizar as anomalias da vasomotricidade em doenças em que esta anomalia se deve a uma biodisponibilidade de NO ou função de eNOS dificultada. Não há nenhum informe prévio que mostre que a anexina A5 tenha propriedades anti-isquémicas. Tais doenças incluem, mas não se limitam a, angina de peito, cardiopatia isquémica, arteriopatia periférica, hipertensão sistólica, enxaqueca, diabetes tipo 2 e disfunção eréctil. 0 primeiro aspecto da presente invenção proporciona anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma para a sua utilização no tratamento de disfunção vascular e/ou para restaurar a função vascular, em que a disfunção vascular está associada com vasodilatação mediada por endotélio alterada, uma actividade óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) reduzida e/ou biodisponibilidade de óxido nítrico reduzida, a compreender o análogo ou variante funcional de anexina A5 uma proteína que é idêntica em mais de 90% a anexina A5 humana, SEQ ID NO: 1.

Numa forma de realização, pode dizer-se que um paciente sofre disfunção vascular se o paciente apresenta uma capacidade reduzida para responder a um estímulo vasodilatador (opcionalmente, quando a resposta mediana média do paciente avalia-se em múltiplas repetições, tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, da prova) em comparação com a capacidade mediana média de um grupo controlo (10 indivíduos saudáveis de idade e sexo coincidentes, opcionalmente em que cada membro do grupo controlo avalia-se em múltiplas repetições, tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, da prova) para responder à mesma dosagem do estímulo vasodilatador. Os estímulos vasodilatadores adequados que se podem utilizar nesta avaliação incluem estímulos seleccionados do grupo que 8 consiste em metacolina, acetilcolina, aumento da velocidade de fluxo sanguíneo, um composto que gera NO tal como nitroglicerina, ou uma prova funcional tal como uma prova de exercício frequentemente usada em pacientes com angina. A capacidade de um indivíduo para responder a um estímulo vasodilatador pode avaliar-se a medir a alteração na vasodilatação provocada pela administração do estímulo vasodilatador mediante administração intravenosa, intra-arterial, sublingual, oral ou subcutânea (quando o estímulo vasodilatador é um agente que vai administrar-se ao sujeito de prova) ou a medir a resposta a uma prova funcional, tal como uma prova de exercício.

Conhecem-se na técnica métodos para medir alterações na vasodilatação, e o método mais apropriado será eleito dependendo da natureza da disfunção vascular e/ou o tipo de estímulo vasodilatador utilizado.

Uma forma comum para medir a vasodilatação num sujeito de prova, para os fins de avaliar a disfunção vascular, é medir a dilatação mediada por fluxo da artéria braquial após a isquemia induzida por um manguito na extremidade superior [3]. Informes prévios de utilização desta técnica mostraram que, normalmente, a hiperemia pós-isquêmica provoca um aumento no diâmetro da artéria braquial de aproximadamente 10% no indivíduo jovem e saudável, enquanto que num paciente com CVD ou um paciente com diabetes tipo 2, esta resposta pode ser, por exemplo, de 2-4% ou inclusive estar completamente ausente. A resposta pode inibir-se quase completamente mediante a administração de um inibidor da enzima geradora de NO, tal como L-NAME. 9

Alternativamente, a vasodilatação nas artérias de resistência de um sujeito de prova (por exemplo, artérias no antebraço e/ou a mão) pode medir-se como alterações no fluxo sanguíneo a utilizar a técnica conhecida na técnica de pletismografia. Neste entorno experimental, o estimulo vasodilatador poderia ser opcionalmente uma administração local (tal como, intra-arterial) de uma substância vasodilatadora, tal como acetilcolina. A função vascular coronária pode avaliar-se mediante uma prova de exercício tal como uma prova de exercício em bicicleta ou uma prova de esforço em tapete rolante. Nesta situação, a isquemia cardiaca mede-se mediante as alterações no electrocardiograma cardíaco (ECG), e/ou como a quantidade de trabalho físico que pode realizar um sujeito antes que se produza dor isquémica (angina).

Alternativamente, pode avaliar-se a função de artérias coronárias grandes mediante a injecção local de um composto vasodilatador durante a cateterização cardíaca, e a resposta avalia-se mediante angiografia coronária.

Portanto, um paciente que sofre disfunção vascular pode apresentar uma capacidade para responder a um estímulo vasodilatador que é, como máximo, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou menos que a capacidade mediana média do grupo controlo para responder à mesma dosagem do estímulo vasodilatador.

Pacientes que sofrem doenças tais como angina de peito, cardiopatia isquémica, arteriopatia periférica, hipertensão sistólica, enxaqueca, diabetes tipo 2 e disfunção eréctil apresentam comummente disfunção vascular. 10

Portanto, a disfunção vascular pode tratar-se e/ou a função vascular restaurar-se mediante a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de anexina A5, ou um análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID NO:l, a um paciente que o necessita. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de anexina A5, ou um análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID NO:l, quando se utiliza para tratar a disfunção vascular e/ou restaurar a função vascular, pode avaliar-se (i) a monitorizar a resposta a um estímulo vasodilatador de um paciente que sofre disfunção vascular, e a comparar a resposta observada antes, e logo depois, do tratamento com anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma; e/ou (ii) a monitorizar a resposta a um estímulo vasodilatador de um paciente que sofre disfunção vascular que foi tratado com anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma, e a comparar a resposta observada com a capacidade mediana média do grupo controlo de indivíduos saudáveis (tal como se definiu anteriormente, em que os membros do grupo controlo não foram tratados com anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma) para responder à mesma dosagem do estímulo vasodilatador; e/ou (iii) a monitorizar a resposta a um estímulo vasodilatador de um paciente que sofre disfunção vascular que foi tratado com anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma, e a comparar a resposta 11 observada com a capacidade mediana média de um grupo controlo de indivíduos com estado coincidente (10 indivíduos de estado, idade e sexo coincidentes, opcionalmente em que cada membro do grupo controlo avalia-se em múltiplas repetições, tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, da prova), em que os membros do grupo controlo não foram tratados com anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma, para responder à mesma dosagem do estímulo vasodilatador. A capacidade de um indivíduo para responder a um estímulo vasodilatador pode avaliar-se a medir a alteração na vasodilatação provocada pela administração do estímulo vasodilatador tal como se expôs anteriormente.

Quando o efeito terapêutico da anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma se determina como em (i) anteriormente, então o nível de vasodilatação induzida pelo estímulo vasodilatador conseguido no paciente antes do tratamento com anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma pode melhorar-se em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou pelo menos 100% ou inclusive valores superiores, tais como pelo menos 150%, 200%, 250%, 300% ou mais, mediante tratamento com uma quantidade terapeuticamente eficaz de anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma de acordo com a presente invenção, em comparação com o nível antes do tratamento da vasodilatação induzida pelo estímulo vasodilatador conseguida no paciente.

Quando o efeito terapêutico da anexina A5, ou um análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID NO:l, se determina como em 12 (ii) anteriormente, então o nível de vasodilatação induzida pelo estímulo vasodilatador conseguido no paciente após o tratamento com anexina A5, ou um análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID NO:l, pode melhorar-se até um nível que é pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 90%, 95%, 98%, 99%, substancialmente de aproximadamente 100% ou mais em comparação com o nível mediano médio de vasodilatação induzida pelo estímulo vasodilatador observado no grupo controlo.

Quando o efeito terapêutico da anexina A5, ou um análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID NO:l, se determina como em (iii) anteriormente, então o nível de vasodilatação induzida pelo estímulo vasodilatador conseguido no paciente após o tratamento com anexina A5, ou um análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID N0:1, pode melhorar-se até um nível que é maior de 100%, tal como pelo menos 150%, 200%, 250%, 300% ou mais, em comparação com o nível mediano médio de vasodilatação induzida pelo estímulo vasodilatador observado no grupo controlo. A disfunção vascular pode estar associada com vasodilatação mediada por endotélio alterada e/ou pode estar associada com uma actividade eNOS reduzida e/ou uma biodisponibilidade de NO reduzida. O segundo aspecto da presente invenção proporciona anexina A5, ou um análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID NO:l, para a sua utilização na redução da dor isquémica, 13 tal como angina de peito ou dor associada com doença arterial periférica (DAP), em que uma quantidade terapeuticamente eficaz de anexina A5, ou um análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID NO: 1, administra-se a um paciente que necessita tal tratamento. O paciente tratado com o primeiro ou segundo aspecto da invenção pode ser ou não um sujeito que sofre uma doença seleccionada de angina de peito, cardiopatia isquémica, arteriopatia periférica, hipertensão sistólica, enxaqueca, diabetes tipo 2 e disfunção eréctil, e portanto a disfunção vascular e/ou a dor isquémica pode estar associada com qualquer uma ou mais destas doenças.

Quando o paciente sofre angina de peito, pode estar provocada ou não por qualquer uma das placas ateroscleróticas nos vasos coronários, espasmo local na vasculatura coronária, valvulopatia, anemia grave, estenoses aórticas e/ou taquiarritmias. O paciente pode sofrer ou não angina por esforço, angina por espasmo (angina de Prinzmetal ou variante), angina súbita ou síndrome X. O paciente pode sofrer ou não angina estável ou instável. O tratamento da disfunção vascular e/ou a restauração da função vascular em pacientes com estados tais como angina de peito de acordo com a presente invenção também pode reduzir o risco de aparição de infarto agudo de miocárdio (IAM) e as suas complicações posteriores tais como as indicadas pela classificação internacional de doenças (CID) em http://www.who.int/classifications/apps/icd/icdlOOnline/, na categoria 1.23 que inclui hemopericardio após IAM (123.0), comunicação interauricular após IAM (123.1), defeito do septo 14 ventricular após IAM (123.2), ruptura da parede cardíaca sem hemopericardio após IAM (123.3), ruptura da corda tendínea após IAM (123.4), ruptura do músculo papilar após IAM (123.5), trombose de átrio, apêndice auricular e ventrículo após IAM (123.6) e outras complicações actuais após IAM (123.8).

Quando o paciente sofre cardiopatia isquémica, o paciente pode sofrer ou não aterosclerose, ou angina sem aterosclerose manifestada. 0 paciente pode ser ou não um ser humano. 0 paciente pode ser ou não um animal não humano, tal como um animal doméstico (por exemplo, gato, cão, coelho, vaca, ovelha, porco, rato ou outro roedor). 0 terceiro aspecto da presente invenção proporciona anexina A5, ou um análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID NO: 1, para a sua utilização no tratamento, a prevenção ou a redução do risco de aparição de uma doença vascular que está associada com vasodilatação mediada por endotélio alterada, actividade eNOS reduzida e/ou biodisponibilidade de NO reduzida. A doença vascular tratada com o terceiro aspecto da invenção pode ser ou não uma doença seleccionada de angina de peito, cardiopatia isquémica, arteriopatia periférica, hipertensão sistólica, enxaqueca, diabetes tipo 2 e disfunção eréctil, tal como os estados mencionados anteriormente em mais detalhe em relação com os aspectos primeiro e segundo da invenção. O tratamento de estados tais como angina de peito de acordo com a presente invenção também pode reduzir o risco de 15 e as suas aparição de infarto agudo de miocárdio (IAM) complicações posteriores tais como as indicadas pela classificação internacional de doença (CID) em http://www.who.int/classifications/apps/icd/icdlOonline/, na categoria 1.23 que inclui hemopericardio após IAM (123.0), comunicação interauricular após IAM (123.1), defeito do septo ventricular após IAM (123.2), ruptura da parede cardíaca sem hemopericardio após IAM (123.3), ruptura da corda tendínea após IAM (123.4) r ruptura do músculo papilar após IAM (123.5), trombose do átrio, apêndice auricular e ventrículo após IAM (123.6) e outras complicações actuais após IAM (123.8) . Portanto, o terceiro aspecto da presente invenção inclui a redução do risco de aparição de IAM ou as suas complicações posteriores mediante o tratamento de uma doença vascular em que uma quantidade terapeuticamente eficaz de anexina A5, ou um análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID NO: 1, administra-se a um paciente. A anexina A5, ou o análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID NO: 1, pode administrar-se conjuntamente com (isto é, de maneira separada, simultânea ou sequencial com) um ou mais agentes activos adicionais, tais como • um produto terapêutico trombolítico, tal como activador de plasminogênio tissular, uroquinase ou uma enzima bacteriana, • um agente antiplaquetário, tal como aspirina ou clopidogrel (Plavix), e/ou 16 • nitroglicerina e/ou morfina.

Revela-se também no presente documento uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma para o tratamento de uma doença vascular seleccionada de angina de peito, cardiopatia isquémica, arteriopatia periférica, hipertensão sistólica, enxaqueca e disfunção eréctil, tal como se comentou anteriormente em relação com os aspectos primeiro e segundo da invenção. A doença vascular pode estar associada com (em outras palavras, um paciente com a doença vascular pode apresentar) vasodilatação mediada por endotélio alterada, uma actividade eNOS reduzida e/ou uma biodisponibilidade de NO reduzida.

Revela-se também no presente documento uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma para o tratamento de uma disfunção vascular e/ou a restauração da função vascular. A disfunção vascular pode estar associada com (em outras palavras, um paciente com a disfunção vascular pode apresentar) vasodilatação mediada por endotélio alterada, uma actividade eNOS reduzida e/ou uma biodisponibilidade de NO reduzida. A disfunção vascular pode estar associada com uma doença seleccionada de angina de peito, cardiopatia isquémica, arteriopatia periférica, hipertensão sistólica, enxaqueca, diabetes tipo 2 e disfunção eréctil, tal como se comentou anteriormente em relação com os aspectos primeiro e segundo da invenção.

Uma composição farmacêutica pode compreender, portanto, anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma em mistura com um adjuvante, diluente ou portador farmacêutica 17 ou veterinariamente aceitável, que se seleccionará normalmente em relação com a via de administração prevista e a prática farmacêutica convencional. A composição pode estar na forma de aplicações de libertação imediata, retardada ou controlada. Preferivelmente, a formulação é uma dosagem unitária que contém uma unidade ou dose diária, subdose diária ou uma fracção apropriada da mesma, do principio activo. A composição farmacêutica pode estar destinada ou não para, e portanto, formulada de uma maneira adequada para, administração parenteral, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea, ou pode administrar-se mediante técnicas de infusão. Pode utilizar-se da melhor maneira na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, suficientes sais ou glucose para fazer com que a solução seja isotónica com o sangue. As soluções aquosas podem tamponar-se de maneira adequada (preferivelmente a um pH de desde 3 até 9), se é necessário. A preparação de formulações farmacêuticas adequadas em condições estéreis consegue-se facilmente mediante técnicas farmacêuticas convencionais bem conhecidas pelos especialistas.

Tais formulações podem incluir soluções de injecção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que fazem com que a formulação seja isotónica com o sangue do receptor previsto; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes de espessamento. As formulações podem apresentar-se em envasamentos de dose unitária ou de múltiplas doses, por exemplo, frascos e ampolas seladas, e podem armazenar-se num estado secado por 18 congelamento (liofilizado) que só requer a adição do portador líquido estéril, por exemplo, água para injecções, imediatamente antes da sua utilização. Podem preparar-se soluções e suspensões de injecção extemporâneas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis da classe anteriormente descrita.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma para a sua administração a um paciente, tal como um paciente humano, a basear-se num nível de dosagem diário, pode ser de desde 0,01 até 1000 mg de anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma por adulto (por exemplo, desde aproximadamente 0,001 até 20 mg por kg do peso corporal do paciente, tal como de 0,01 a 10 mg/kg, por exemplo mais de 0,1 mg/kg e menos de 20, 10, 5, 4, 3 ou 2 mg/kg, tal como aproximadamente 1 mg/kg), administrada em doses individuais ou divididas. 0 médico, em qualquer caso, determinará a dosagem real que será a mais adequada para qualquer paciente individual e variará com a idade, o peso e a resposta do paciente particular. As dosagens anteriores são a modo de exemplo do caso mediano. Claro que, pode ter casos individuais em que se necessitem intervalos de dosagem superiores ou inferiores e tais estão dentro do alcance desta invenção.

Para utilização veterinária, administra-se um composto da invenção como uma formulação adequadamente aceitável de acordo com a prática veterinária normal e o cirurgião veterinário determinará o regime de dosagem e a via de administração que serão os mais apropriados para um animal particular. 19

Em um quarto, quinto e sexto aspecto, a invenção proporciona a utilização de anexina A5, ou um análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID NO:l, na preparação de uma especialidade farmacêutica para o tratamento, a prevenção ou a redução do risco de aparição de um estado definido anteriormente no contexto de qualquer um dos aspectos primeiro, segundo ou terceiro da presente invenção, respectivamente. A anexina A5, ou o análogo ou variante funcional da mesma que compreende uma proteína que é idêntica em mais de 90% a SEQ ID NO:l, de acordo com a invenção pode ser anexina A5 humana (SEQ ID NO:l), uma variante alélica ou genética da mesma, um ortólogo de mamífero da mesma ou uma variante alélica ou genética do mesmo. Preferivelmente, o análogo ou variante funcional de anexina A5 de acordo com a invenção é idêntico em mais de 95% ou 99% a anexina A5 humana, SEQ ID NO: 1. A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos determina-se tal como segue. Em primeiro lugar, compara-se uma sequência de aminoácidos, por exemplo, com SEQ ID NO:l a utilizar o programa BLAST 2 Sequences (B12seq) da versão independente de BLASTZ que contém a versão de BLASTN 2.0.14 e a versão de BLASTP 2.0.14. Esta versão independente de BLASTZ pode obter-se do sitio web do Centro Nacional de Informação Biotecnológica do governo dos Estados Unidos em ncbi.nlm.nih.gov. Podem encontrar-se instruções que explicam como utilizar o programa B12seq no arquivo leia-me adjunto a BLASTZ. B12seq realiza uma comparação entre duas sequências de aminoácidos a utilizar o algoritmo BLASTP. Para comparar duas sequências de aminoácidos, as opções de B12seq fixam-se tal como segue: -i fixa-se a um arquivo que contém a primeira 20 sequência de aminoácidos que vai comparar-se (por exemplo, C:\seql.txt); -j fixa-se a um arquivo que contém a segunda sequência de aminoácidos que vai comparar-se (por exemplo, C:\seq2.txt); -p fixa-se a blastp; -o fixa-se a qualquer nome de arquivo desejado (por exemplo, C:\output.txt); e todas as outras opções deixam-se nos seus parâmetros por padrão. Por exemplo, pode utilizar-se o seguinte comando para gerar um arquivo de saída que contém uma comparação entre duas sequências de aminoácidos: C:\B12seq -i c:\seql.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Se as duas sequências comparadas compartem homologia, então o arquivo de saída designado apresentará as regiões de homologia como sequências alinhadas. Se as duas sequências comparadas não compartem homologia, então o arquivo de saída designado não apresentará sequências alinhadas. Uma vez alinhadas, determina-se o número de coincidências a contar o número de posições em que está presente um resíduo de aminoácido ou nucleotídeo idêntico em ambas as sequências. A percentagem de identidade determina-se a dividir o número de coincidências entre o comprimento da sequência exposta numa sequência identificada seguido pela multiplicação do valor resultante por 100. Por exemplo, se se compara uma sequência com a sequência exposta em SEQ ID NO: 1 (o comprimento da sequência exposta em SEQ ID NO:l é de 320) e o número de coincidências é de 288, então a sequência tem uma percentagem de identidade de 90 (isto é, 288 -e 320 * 100 = 90) com a sequência exposta em SEQ ID NO: 1.

Portanto, um análogo ou variante funcional de anexina A5 pode ser uma proteína em que em uma ou mais posições tem tido inserções, deleções ou substituições de aminoácidos, ou conservativas ou não conservativas, sempre que tais 21 alterações dêem como resultado uma proteína cujas propriedades básicas para funcionar de uma maneira equivalente a anexina A5 não tenham alterado significativamente. "Significativamente" neste contexto significa que um especialista diria que as propriedades da variante podem ser ainda diferentes, mas seriam óbvias em relação com as da proteína original.

Por "substituições conservativas" quer dizer-se combinações tais como Gly, Ala; Vai, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gin; Ser, Thr; Lys, Arg; e Phe, Tyr.

Tais variantes podem preparar-se a utilizar os métodos de modificação de proteínas por engenharia genética e mutagênese dirigida ao sitio que se conhecem bem na técnica. 0 análogo ou variante funcional de anexina A5 de acordo com a invenção pode ser ou não um dímero de anexina A5 ou um análogo ou variante funcional do mesmo, ou pode ser ou não uma anexina A5 PEGuilada ou um análogo ou variante funcional da mesma. Revelam-se dianexina A5 e anexina A5 PEGuilada no documento WO 02/067857. A PEGuilação é um método bem conhecido para os especialistas em que um polipeptídeo ou composto peptidomimético (para os fins da presente invenção, anexina A5 ou o análogo ou variante funcional) se modifica de maneira que uma ou mais moléculas de polietilenoglicol (PEG) se unem covalentemente à cadeia lateral de um ou mais aminoácidos ou derivados dos mesmos. É uma das técnicas de química estrutural de alteração de moléculas (MASC) mais importantes. Podem utilizar-se outras técnicas de MASC; tais técnicas podem melhorar as propriedades farmacodinâmicas da molécula, por exemplo, a 22 estender a sua semivida in vivo. Forma-se um conjugado de PEG-proteína a activar em primeiro lugar o resto de PEG de modo que reagirá com, e acoplar-se-á a, a proteína ou o composto peptidomimético da invenção. Os restos de PEG variam consideravelmente em quanto a conformação e peso molecular, sendo os restos precoces (PCG monofuncionais; mPEG) lineares com pesos moleculares de 12 kDa ou menos, e sendo os restos posteriores de pesos moleculares aumentados. PEG2, uma recente inovação na tecnologia de PEG, implica o acoplamento de um mPEG de 30 kDa (ou menos) a um aminoácido lisina (embora a PEGuilação pode estender-se à adição de PEG a outros aminoácidos) que se reage adicionalmente para formar uma estrutura ramificada que se comporta como um mPEG linear de peso molecular muito maior (Kozlowski et al., (2001), Biodrugs 15, 419 - 429). Descrevem-se adicionalmente métodos que podem utilizar-se para unir covalentemente as moléculas de PEG a polipeptídeos em Roberts et al., (2002) Adv Drug Deliv Rev, 54, 459 - 476, Bhadra et al., (2002) Pharmazie 57, 5 - 29, Kozlowski et al., (2001) J Control Release 72, 217 -224, e Veronese (2001) Biomaterials 22, 405 -417 e referências mencionadas nos mesmos.

As vantagens da PEGuilação para o polipeptídeo ou composto peptidomimético da invenção incluem depuração renal reduzida que, para alguns produtos, resulta numa adsorção mais sustentada após a administração assim como distribuição restringida, a conduzir possivelmente a concentrações plasmáticas mais constantes e sustentadas e, portanto, a um aumento da eficácia clínica (Harris et al., (2001) Clin Pharmacokinet 40, 539 - 551). As vantagens adicionais podem incluir imunogenicidade reduzida do composto terapêutico (Reddy, (2001) Ann Pharmacother 34, 915 - 923), e toxicidade inferior (Kozlowski et al., (2001), Biodrugs 15, 419-429). 23 0 análogo ou variante funcional de anexina A5 de acordo com a invenção pode ser uma proteína de fusão que compreende a sequência de anexina A5 ou uma variante da mesma. Portanto, por exemplo, a anexina A5 ou uma variante da mesma pode fusionar-se com uma ou mais sequências polipeptídicas de par de fusão para estender a semivida da molécula dentro do sistema circulatório de um paciente e/ou adicionar funcionalidade adicional à molécula.

Por um análogo ou variante “funcional" de anexina A5 quer dizer-se uma proteína que pode unir-se a fosfatidilserina numa membrana biológica, preferivelmente a um nível que é pelo menos de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou aproximadamente 100% do apresentado por anexina A5 humana (SEQ ID NO:l) nas mesmas condições. Conhece-se na técnica um método adequado para medir a união de anexina A5 a fosfatidilserina numa membrana biológica [29].

Um análogo ou variante "funcional" de anexina A5 também pode ter, adicional ou alternativamente, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou aproximadamente 100% da actividade terapêutica de anexina A5 humana (SEQ ID NO:l) quando utiliza-se à mesma dosagem (isto é, equivalente molar), para o tratamento de disfunção vascular, para restaurar a função vascular, para reduzir a dor isquémica e/ou para o tratamento de uma doença vascular de acordo com qualquer dos aspectos da invenção.

Neste contexto, a actividade terapêutica de um análogo ou variante "funcional" de anexina A5 pode determinar-se, em comparação com a de anexina A5 humana (SEQ ID N0:1), a comparar a capacidade de uma quantidade equivalente molar do análogo ou variante funcional e de anexina A5 humana para 24 vascular tal como tratar a disfunção vascular tal como se descreveu anteriormente, e/ou para restaurar a capacidade de ratos apoE(_/_) mantidos com uma dieta de alto teor em lipídeos e colesterol durante 4 meses para apresentar dilatação mediada por endotélio em resposta à administração intraperitoneal de 3 μg/kg de peso corporal (10 μΐ/g) de metacolina (Sigma), quando se administra aos ratos, mediante injecção intraperitoneal, uma quantidade equivalente molar ou de anexina A5 ou do análogo ou variante em questão uma vez ao dia pela manhã durante 3 dias consecutivos, sendo a injecção final aproximadamente 2-3 horas antes da administração de metacolina, e em que o grau de dilatação mediada por endotélio nos sujeitos de prova mede-se a avaliar a pressão arterial mediante cateterização da artéria carótida esquerda, tal como a utilizar a metodologia exposta no seguinte exemplo. "Doença vascular associada com uma actividade eNOS reduzida ou uma biodisponibilidade de NO reduzida" tal como se utiliza no presente documento refere-se a uma doença vascular que está provocada por, provoca ou conduz a, tem uma causa comum com, ou coexiste com, uma actividade eNOS reduzida ou uma biodisponibilidade de NO reduzida. "Disfunção vascular associada com uma doença" tal como se usa no presente documento refere-se a uma disfunção vascular, tal como uma perda de vasodilatação mediada por endotélio, que está provocada por, provoca ou conduz a, tem uma causa comum com, ou coexiste com, a doença em questão. Anteriormente proporcionaram-se exemplos de tais doenças.

Exemplo. 25

Ratos que se fazem deficientes em apolipoproteína E mediante direccionamiento génico (ratos apoE(_/_)) são hiperlipidémicos e desenvolvem aterosclerose. Este processo acelera-se a alimentar aos ratos com uma dieta denominada Western, por exemplo, Harlan Teklad TD.88137. Esta é uma dieta purificada com 21% de gordura láctea anidra (manteiga) , 34% de sacarose e um total de 0,2% de colesterol que, em comparação com dietas de rato normais, contém lipídeos extra e algo de colesterol. Administrou-se uma dieta deste tipo a ratos apoE(“ /_) macho durante pelo menos 4 meses, após o qual avaliaram-se os efeitos de anexina A5 sobre a dilatação mediada por endotélio. Deste modo, os ratos desenvolverão doença vascular que inclui uma alteração da dilatação mediada por endotélio que é típica para pacientes com, por exemplo, angina de peito, hipertensão, diabetes e hiperlipidemia.

Avaliação da dilatação mediada por endotélio em ratos anestesiados. 4,5% (Isoba®vet, então manteve-se fosse necessário

Induziu-se anestesia mediante isoflurano a Schering-Plough Animal Health, Dinamarca) e a fornecer isoflurano de acordo com o que (normalmente a 1,5-2%).

Para as medições da pressão arterial, realizou-se uma cateterização (Samba Sensor preclin 420 LP, Vástra Frõlunda, Suécia) da artéria carótida esquerda. Depois disso, moveu-se o cateter suavemente ao interior do arco aórtico. Conectou-se o sensor Samba a uma unidade Samba 3200, desde a que se transferiram os dados a, e armazenaram-se em, o software Powerlab (AD Instrument, versão 5) a 2 kHz.

Então deixou-se que os ratos se estabilizassem durante aproximadamente 15 minutos. Então induziu-se dilatação 26 mediada por endotélio mediante a administração intraperitoneal (i.p.) de 3 μρ/kg de peso corporal (10 μΐ/g) de metacolina (Sigma), e mediu-se a pressão arterial durante 5 minutos. Quando estimula-se de maneira sistémica a dilatação mediada por endotélio, reduz-se a resistência vascular periférica total, e a vasodilatação pode medir-se como uma redução da pressão arterial. A metacolina provoca uma estimulação transitória do endotélio arterial para liberar NO, o que por sua vez provocará vasodilatação mediada por endotélio num rato saudável, normal. Depois de desaparecer o efeito da metacolina e estabelecer-se de novo a tensão inicial, administrou-se uma dose i.p. de 50 mg/kg de peso corporal de L-NAME (éster metilico de NG-nitro-L- arginina) (Sigma) . Este é um inibidor da enzima eNOS, que converte arginina em NO (e citrulina), e portanto, é responsável pela dilatação mediada por endotélio. Então realizou-se um seguimento da pressão arterial até que se alcançou um novo patamar (12-15 minutos), após o qual se administrou de novo metacolina 3 μρ/kg e mediu-se a pressão arterial durante 5 minutos.

Resultados.

Os ratos normais responderão às injecções de metacolina mediante uma redução da pressão arterial tanto sistólica como diastólica. Após 4 meses com a dieta Western, realizou-se um estudo piloto de alguns ratos apoE(_/_) para verificar que estava ausente a resposta normal a uma injecção de metacolina. Quando tinha sido estabelecido isto, os ratos receberam 1 mg de anexina A5 humana recombinante (Bender

Medsystems, Viena, Áustria)/kg de peso corporal ou o seu veiculo (solução salina) pela manhã durante 3 dias mediante injecção intraperitoneal. No 3o dia, e aproximadamente 2-3 27 horas após a injecção final de anexina A5/veículo, investigou-se a dilatação mediada por endotélio tal como se descreveu anteriormente. A figura 1 é um exemplo de uma experiência típica: A figura 1 mostra registos representativos da pressão arterial num rato apoE(_/_> controlo (perfil superior) e um rato tratado com anexina A5 (perfil inferior). Injectou-se metacolina tal como se indica mediante a linha descontínua. 0 rato tratado com anexina A5 respondeu com uma profunda vasodilatação, uma marcada melhora em comparação com o rato controlo, que apenas respondeu em absoluto (painéis esquerdos). 0 painel à direita mostra que esta resposta se inibiu mediante a administração prévia do inibidor de eNOS, L-NAME, o que verifica que o efeito de anexina A5 sobre a dilatação mediada por endotélio estava mediado por NO. A redução da pressão arterial sistólica foi maior que a redução da pressão arterial diastólica. A figura 2 resume os efeitos da anexina A5 sobre a dilatação mediada por endotélio neste modelo de angina de peito e mostra que nos ratos apoE( 1 ’ não tratados a injecção de metacolina não reduziu a pressão arterial média. Em troca, os ratos apoE( / 1 tratados com anexina A5 responderam à metacolina com uma redução significativa da pressão arterial. Posto que este efeito se bloqueava por L-NAME, concluiu-se que o efeito estava mediado por eNOS/óxido nítrico. A figura 3 mostra que o tratamento com anexina A5 durante 3 dias melhorou significativamente a redução mediada por endotélio das tensões arteriais tanto sistólica (A) como diastólica (B). 28 0 tratamento com anexina A5 restaurou não somente a função das artérias de resistência tal como se indica mediante a redução da pressão arterial diastólica, senão que como o efeito sobre a pressão arterial sistólica foi maior que os efeitos sobre a pressão arterial diastólica, o tratamento farmacológico também aumentou a elasticidade das artérias centrais.

Este estudo mostra pela primeira vez que a anexina A5 pode restaurar a função normal do endotélio num modelo de rato de arteriopatia/angina de peito. 0 efeito estava mediado pela restauração do metabolismo do NO no endotélio. Este achado mostra o potencial da anexina A5 para exercer efeitos anti-isquémicos. 0 tratamento mais comum da angina de peito é restaurar o fluxo sanguíneo ao tecido miocárdico isquémico mediante a administração de NO exógeno, normalmente na forma de nitratos orgânicos tais como nitroglicerina. Posto que a utilização repetida de nitratos orgânicos exógenos está associada com o desenvolvimento de tolerância aos nitratos, este tratamento limita-se normalmente a situações isquémicas agudas. No presente documento mostrou-se o potencial da anexina A5 como tratamento anti-isquémico alternativo em doenças vasculares em que o metabolismo de NO normal está dificultado.

Sumário. As anomalias da vasomotricidade arterial devido à dilatação mediada por endotélio alterada são comuns na maioria dos pacientes com doença vascular isquémica. Num modelo de tal doença, encontrou-se se surpreendentemente que a anexina A5 restaurava a função mediada por endotélio alterada através de um mecanismo dependente de NO. 29

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Hingorani, A.D., et ai., A common variant of the endothelial nitric oxide synthase (Glu298—>Asp) is a major risk factor for coronary artery disease in the UK. Circulation, 1999. 100(14): p. 1515-20. 19. Lembo, G., et ai., A common variant of endothelial nitric oxide synthase (Glu298Asp) is an independent risk factor for carotid atherosclerosis. Stroke, 2001. 32(3): p. 735-40. 20. Rose, K.M., et al., Migraine and other headaches: associations with Rose angina and coronary heart disease. Neurology, 2004. 63(12): p. 2233-9. 21. Borroni, B., et al., Endothelial nitric oxide synthase (Glu298Asp) polymorphism is an independent risk factor for migraine with aura. Headache, 2006. 46(10): p. 1575-9. 22. Giugliano, F., et al., Erectile dysfunction associates with endothelial dysfunction and raised proinflammatory cytokine leveis in obese men. J Endocrinol Invest, 2004. 27(7): p. 665-9. 23. Cederholm, A. e J. 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LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Athera Biotechnologies AB <110> Knut Pettersson 33 <110> Johan Frostegârd <110> Andrew Wright <120> Compostos e métodos para o tratamento de doença vascular

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Met Ala Gin Vai Léu Arg Gly Thr 1 s val Thr Asp Phe Pro Gly Phe Asp 10 15 6iu Arg Ala Asp Ala Gin Thr Leu 20

Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu Gly 25 30

Thr Asp Glu Glu Ser He Léu Thr 35 40

Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn Ala 45

Gin Arg Gin Glu lia Ser Ala Ala 50 55

Phe Lya Thr Leu Phe Gly Arg Asp Ê0

Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu 65 70

Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys Leu 75 80

Xle Vai Ala. Leu Met Lys Pro Ser 85

Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu 90 95 35

Lys tíis Ais Léu Lys Gly Ala Gly 100 Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu 115 120 Τγ.ιτ Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser 130 135 Thr Ser Gly Tyr Tyr Gin Arg Met 145 150 Arg Asp Pre Asp Ala Gly Ile Asp 165 Gin Ala Leu Phe Glft Ala Gly Glu 180 Lys Phe Ilô Thr Ile Phe Gly Thr 195 200 Vai Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile 210 215 Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly As» 225 230

Thr Asn Gíu Lys Vai Leu Thr Glu 105 110

Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gin Vai 125

Leu Glu Asp Asp Vai Vai Gly Asp 140

Leu Vai Vai Leu Leu Gin Ala &sn 155 160 61 tt Ma Gin Vai Glu Gin Asp Ala 170 175

Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu 185 190

Arg Ser Vai Ser His Leu Arg Lys 205 ser Gly Phe Gin 11« Glu Glu Thr 220

Leu Glu Gin Leu Leu Leu Ala Vai 235 240

Vai Lys Set 11« Arg Ser lie Pró 245

Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu Tyr 250 255

Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr 260

Asp Asp His Thr Leu lie Arg Vai 265 270

Met Vai Ser Arg Ser Glu He Asp 275 280

Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu Phe 285

Arg Lys Asrs Phe Ala Tht Ser Leu 290 295

Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp Thr 300

Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu 305 3iq

Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp Asp 315 320 36 07-11-2012 37

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma para a sua utilização no tratamento de disfunção vascular associada com vasodilatação mediada por endotélio alterada, uma actividade óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) reduzida e/ou uma biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) reduzida, caracterizada por o análogo ou variante funcional de anexina A5 compreender uma proteína que é idêntica em mais de 90% a anexina A5 humana, SEQ ID NO: 1.
2. Utilização de anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma na preparação de um medicamento para a sua utilização no tratamento de disfunção vascular associada com vasodilatação mediada por endotélio alterada, uma actividade óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) reduzida e/ou uma biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) reduzida, caracterizada por o análogo ou variante funcional de anexina A5 compreender uma proteína que é idêntica em mais de 90% a anexina A5 humana, SEQ ID NO: 1.
3. Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma para a sua utilização na redução da dor isquémica, caracterizada por o análogo ou variante funcional de anexina A5 compreender uma proteína que é idêntica em mais de 90% a anexina A5 humana, SEQ ID NO: 1.
4. Utilização de anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma na preparação de um medicamento para a sua utilização na redução da dor isquémica, caracterizada por o análogo ou variante funcional de anexina A5 compreender uma proteína que é idêntica em mais de 90% a anexina A5 humana, SEQ ID NO:1 1
5. Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma caracterizada por ser para a sua utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 3, ou utilização de acordo com as reivindicações 2 ou 4, para a sua utilização na redução do risco de apariçao de infarto agudo de miocárdio (IAM).
6. Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma para a sua utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1, 3 ou 5, ou utilização de acordo com as reivindicações 2, 4 ou 5, caracterizada por o paciente tratado sofrer uma doença seleccionada de angina de peito, cardiopatia isquémica, arteriopatia periférica, hipertensão sistólica, enxaqueca, diabetes tipo 2 e disfunção eréctil.
7. Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma para a sua utilização no tratamento, a prevenção ou a redução do risco de aparição de uma doença vascular que está associada com vasodilatação mediada por endotélio alterada, uma actividade eNOS reduzida e/ou uma biodisponibilidade de NO reduzida, caracterizada por o análogo ou variante funcional de anexina A5 compreender uma proteína que é idêntica em mais de 90% a anexina A5 humana, SEQ ID NO: 1.
8. Utilização de anexina A5 ou um análogo ou variante funcional da mesma na preparação de um medicamento para a sua utilização no tratamento, a prevenção ou a redução do risco de aparição de uma doença vascular que está associada com vasodilatação mediada por endotélio alterada, uma actividade eNOS reduzida e/ou uma biodisponibilidade de NO reduzida, caracterizada por o análogo ou variante funcional de anexina A5 compreender uma proteína que é idêntica em mais de 90% a anexina A5 humana, SEQ ID NO: 1 2
9. Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma, de acordo com a reivindicação 7, ou utilização de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por o tratamento reduzir o risco de aparição de infarto agudo de miocárdio (IAM).
10. Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma para a sua utilização de acordo com as reivindicações 7 ou 9, ou utilização de acordo com as reivindicações 8 ou 9, caracterizada por a doença vascular seleccionar-se de angina de peito, cardiopatia isquémica, arteriopatia periférica, hipertensão sistólica, enxaqueca, diabetes tipo 2 e disfunção eréctil.
11. Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma para a sua utilização de acordo com qualquer das reivindicações 7, 9 ou 10, ou utilização de acordo com qualquer das reivindicações 8 a 10, caracterizada por a anexina A5 ou o análogo ou variante funcional da mesma ter que administrar-se conjuntamente com um produto terapêutico trombolitico tal como activador de plasminogênio tissular, uroquinase ou uma enzima bacteriana.
12. Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma para a sua utilização de acordo com qualquer das reivindicações 7 ou 9 a 11, ou utilização de qualquer das reivindicações 8 a 11, caracterizada por a anexina A5 ou o análogo ou variante funcional da mesma ter que administrar-se conjuntamente com um agente antiplaquetário tal como clopidogrel ou aspirina.
13. Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma para a sua utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1, 3, 5 a 7, ou 9 a 12, ou utilização de 3 qualquer das reivindicações 2, 4 a 6 ou 8 a 12, caracterizada por a anexina A5 ou o análogo ou variante funcional da mesma seleccionar-se de: a) anexina A5 humana (SEQ ID NO: 1), b) um ortólogo de mamífero de anexina A5 humana, c) uma variante alélica ou genética de a) ou b), d) um análogo funcional de anexina A5 que é uma proteína que é idêntica em mais de 95% a anexina A5 humana, SEQ ID NO:1, e) um dímero de, ou proteína de fusão que compreende, qualquer de a), b), c) ou d) , e f) uma variante peguilada de qualquer de a), b) , c), d) ou e) .
14. Anexina A5 ou análogo ou variante funcional da mesma para a sua utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 5 a 7, ou 9 a 13, ou utilização de qualquer das reivindicações 2, 4 a 6 ou 8 a 13, caracterizada por ter que administrar-se por via parenteral, por via intravenosa, por via intra-arterial, por via intraperitoneal, por via intramuscular ou por via subcutânea. 07-11-2012 4