CN108135948B - 用于治疗和预防肠感染和炎症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，所述组合物包含至少一种乳杆菌属(Lactobacillus)菌株，其中所述乳杆菌属菌株选自由一种唾液乳杆菌(L.salivarius)菌株、三种植物乳杆菌(L.plantarum)菌株和一种短乳杆菌(L.brevis)菌株组成的组，其中所述唾液乳杆菌菌株是唾液乳杆菌CW30(LMG P‑28887)，其中所述植物乳杆菌菌株是植物乳杆菌Y1An734(LMG P‑28886)、植物乳杆菌SH1313(LMG P‑28884)、和植物乳杆菌KS11(LMG P‑28885)，并且其中所述短乳杆菌菌株是短乳杆菌SH111(LMG P‑28888)。本发明还涉及包含根据本发明的组合物的灌肠剂。本发明还涉及选自由唾液乳杆菌CW30(LMG P‑28887)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P‑28886)、植物乳杆菌SH1313(LMG P‑28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P‑28885)和短乳杆菌SH111(LMG P‑28888)组成的组的分离的菌株。本发明还涉及用于在治疗和/或预防被艰难梭菌(Clostridium difficile)NAP/027感染中使用的唾液乳杆菌CW30(LMG P‑28887)的分离的菌株。

Description

用于治疗和预防肠感染和炎症的组合物和方法
发明的技术领域
本发明涉及用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，所述组合物包含至少一种乳杆菌属(Lactobacillus)菌株。具体地，所述乳杆菌属菌株可以是唾液乳杆菌(L.salivarius)菌株、植物乳杆菌(L.plantarum)菌株和/或短乳杆菌(L.brevis)菌株且所述胃肠状况可以是被艰难梭菌(Clostridium difficile)、沙门氏菌属(Salmonella)或大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌感染。
背景
哺乳动物肠道被估计100万亿细菌寄居，这些细菌与宿主以共生关系共同演化。宿主中这种微生物群体的集合称为微生物群。微生物群可以有效地保护肠道免受外来病原体和潜在有害的固有微生物(病理生物(pathobionts))的定植。对正常肠道细菌的粘膜免疫应答对于宿主的发育和生理也是重要的。对微生物群的免疫耐受性的故障导致对肠道细菌群落的不适当的局部和全身免疫应答，这可导致多种疾病状态，诸如炎性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)。已经提示这些慢性状况的患病率增加受到包括细菌感染、抗生素暴露以及饮食因素、压力和卫生程度的因素影响。
肠道微生物群平衡的改变导致肠道内稳态被破坏，这增加病原体感染的风险和病理生物的过度生长，特别是在免疫受损的宿主中。病理生物通常是致结肠炎的(colitogenic)，因为它们可以引发肠道炎症。导致严重腹泻、发热和腹痛的假膜性结肠炎是由长期广谱抗生素治疗之后，一种革兰氏阳性厌氧菌艰难梭菌(CD)过度生长引起的。
长期住院、抗生素治疗、免疫缺陷、癌性疾病、化学疗法和类固醇治疗是通常由CD引起的医院内腹泻感染的主要原因，但也由其他肠道细菌病原体诸如沙门氏菌属、志贺氏菌属(Shigella)、弯曲菌属(Campylobacter)和耶尔森氏菌属(Yersinia)引起。
CD已成为抗生素相关腹泻最严重的原因之一。常规治疗包括万古霉素或甲硝唑治疗十天。然而，复发(发生在10％至25％的病例中)正在变得越来越常见，并且代表与CD感染(CDI)相关的最大挑战。
在加拿大和美国，已报道CDI的比率增加，严重病例和复发病例的比例比以前报道的更大。在美国，具有CDI列为任何诊断的出院率从2000年的3.82/1000次出院增加至2008年的8.75/1000次出院；增加在≥65岁的那些人群尤为突出。初步数据显示，在美国，具有CDI导致的小肠结肠炎的死亡证明数从1999年的793增加到2008年的7483。从1997年到2006年，儿科CDI相关住院率也从每千人住院0.724人增加至1.28人。据报道，1-4岁的儿童发病率最高。CDI的增加的发病率和毒力与被称为NAP1/027、也称为CD BI/NAP1/027(一种限制性内切酶分析组BI、脉冲场凝胶电泳型NAP1和聚合酶链式反应核糖型027)的超毒力CD的扩散一致。NAP1/027菌株产生二元毒素和比其他大多数医院爆发相关的菌株达16倍多的毒素。随后，CD NAP1/027引起的CDI流行已经在欧洲国家例如英国、荷兰、比利时、奥地利和瑞典的医院中被认识到。CDI近年来流行病学的重大变化，随着疾病的发病率和严重程度的增加，已使其成为全球性的公共健康挑战。
用于治疗CDI的仅有的产品是抗生素，诸如甲硝唑、万古霉素和最近批准的Dificid。尽管其临床治愈率高，15％-30％的患者仍然经历复发，每次复发增加进一步感染的风险。抗生素的适当使用和不适当使用二者也与对抗生素耐药性的增加、艰难梭菌耐万古霉素新生物型的出现以及慢性炎症状况的发病率增加有关。
CDI严重病例的比率在近年增加，且超毒力CD NAP1/027已经与全球近期的爆发有关。欧洲疾病预防控制中心(ECDC)(在2011年)发现，34个欧洲国家的CD NAP1/027患病率为5％。北美和欧洲也报告了严重的、常常致命的结肠炎的大爆发。作为没有其他有效治疗时的最后一种选择，这种感染可以通过移植健康个体的粪便来治疗。除了可能的心理不适之外，这种移植还可能造成从供体移植潜在有害微生物的风险。因此，尽管粪便微生物群移植已经显示出治疗CDI的一些有希望的结果，医生担心潜在的感染风险和长期的安全性。最近有关粪便移植后肥胖症发病的报道显示了风险和长期的安全性问题。另外，与该技术相关的繁琐程序限制了其日常使用。没有关于供者筛选/选择、粪便材料制备、卫生问题、受者准备和施用途径的标准方案和程序。
因此，对用于CDI的更有效的治疗性治疗选择以及预防性治疗存在需要。
改变的微生物群组成在不同的水平干扰正常的肠道功能。除了触发免疫系统和促炎性细胞因子之外，其还可以诱导微生物代谢物的释放，激活下丘脑-垂体肾上腺(HPA)轴，同时增加皮质醇，导致肠动力和感觉的改变，肠屏障的破坏和神经递质的生产受损，对压力事件的反应增加。这些并发症可导致IBS，其是一种胃肠系统慢性功能紊乱，并是疾病和工作场所缺勤的最常见原因。无法治愈，IBS患者不得不依靠治疗来缓解症状诸如疼痛、腹泻和便秘，并伴有副作用。IBS的病因尚不清楚，但越来越多的证据显示IBS患者的肠腔和粘膜微生物群组成与健康个体相比的变化。这些改变的实例是IBS患者中乳杆菌和双歧杆菌(bifidobacteria)的量减少，伴随着梭菌属(Clostridium)的量增加。诊断患有IBS的儿童肠道微生物群的调查也表明主要以梭菌属为主的生态失调。
因此，使用乳杆菌的治疗干预在IBS中是有吸引力的。许多研究已经得出结论：乳杆菌通常使IBS患者受益，但难以界定不同细菌菌株的相对益处。弱的作用和混合的结果主要是由于缺乏适当的细菌菌株选择和通常较差的研究质量。
发明概述
本发明的以上目标和其他目标完全或至少部分地由一种包含至少一种乳杆菌属菌株的组合物实现，所述乳杆菌属菌株选自由一种唾液乳杆菌菌株、三种植物乳杆菌菌株和一种短乳杆菌菌株组成的组，其中所述唾液乳杆菌菌株可以是唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)，所述植物乳杆菌菌株可以选自包括植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)的组，并且所述短乳杆菌菌株是短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。优选地，组合物包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMGP-28886)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)的全部。
本文件还涉及包含植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌SH1313(LMGP-28884)、和植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)的益生组合物。本文件还涉及包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)的组合物。组合物中的细菌可由唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)组合组成，但组合物还可包含另外的细菌菌株。
本文件还涉及包含菌株植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)的等量细菌的混合物的益生组合物。应理解的是，在本文件的上下文中关于细菌的量的术语“相等”等等意味着，不同细菌菌株的细菌细胞的数目以相对于彼此的一定量存在，使得没有细菌菌株以其他菌株的多于10倍，且优选地其他菌株的小于9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍的量存在。优选地，当细菌以相等的量存在时，每种细菌菌株以一种量存在，使得相对于每一种其他细菌菌株的比率是约1:1。
本文件还涉及一种用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，其中所述组合物包含至少一种乳杆菌属菌株，其中所述乳杆菌属菌株选自由一种唾液乳杆菌菌株、三种植物乳杆菌菌株和一种短乳杆菌菌株组成的组，其中所述唾液乳杆菌菌株是唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)，其中所述植物乳杆菌菌株是植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、和植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)，并且其中所述短乳杆菌菌株是短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
治疗可以是治愈性治疗，即，恢复受试者的健康的治疗。在治愈性治疗期间，组合物可作为灌肠剂施用。当作为灌肠剂施用时，组合物可施用有限的次数，通常在一次和五次之间，持续短的时间段，例如持续一天至五周的时间段。当口服施用时，组合物可每天施用，持续例如1至6周。
对于某些状况或在某些患者中，治疗可具有更支持性的特征，其中所述组合物经更长、有时终生的时间段施用数次。组合物可以一天至两周的间隔施用。
组合物还可用作预防性(prophylactic)(预防(preventive))治疗，例如在摄入抗生素的更长时间段期间，以支持和/或保持和/或恢复胃肠道的健康细菌菌群。
组合物可包含至少一种唾液乳杆菌菌株,其中所述唾液乳杆菌菌株可以是唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)。其一个益处是，唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)具有潜在的抗微生物作用。因此，本文件还涉及一种组合物，其中所述组合物的细菌部分包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)或由唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)组成。
此外，组合物可包含至少唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)，和菌株植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)中的至少一种。因此，本文件还涉及一种组合物，其中所述组合物的细菌部分包含以下或由以下组成：唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)，和菌株植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)中的至少一种。植物乳杆菌菌株植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)的益处是，这些菌株具备抗炎性特征。此外，这些菌株可预防和/或治疗肠道炎症和改进肠道屏障功能。此外，在针对与胃肠并发症相关的更宽范围的病原性细菌的抑制活性方面，这些植物乳杆菌菌株可与唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)协同作用。这导致肠道微生物群生态失调的治疗性矫正，促进恢复免疫系统的内稳态。短乳杆菌SH111(LMG P-28888)的益处是，其具有协同的抗细菌潜力。这种菌株已经被证明具有针对不同的革兰氏阳性病原细菌诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和革兰氏阴性病原细菌诸如大肠杆菌的宽的抗微生物活性。
可选地，组合物可包含至少植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、和植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)。因此，本文件还涉及一种组合物，其中所述组合物的细菌部分包含以下或由以下组成：植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、和植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)。这种组合物还可包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
胃肠状况可以是腹泻、抗生素相关的腹泻(AAD)、胃肠炎、急性胃肠炎和/或感染性腹泻(infectious diarrhoea)。
此外，胃肠状况可以是被艰难梭菌、沙门氏菌属和/或大肠杆菌的细菌感染。胃肠状况还可以是由腹泻疾病引起，所述腹泻疾病是由于诸如以下的细菌：空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠道出血性大肠杆菌(EHEC)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。胃肠状况还可以是由于病毒感染，诸如轮状病毒相关的腹泻。胃肠状况还可以是感染后腹泻。
尤其是，胃肠状况可以是被艰难梭菌NAP1/027感染。本发明的一个益处是，其通过靶向病原细菌快速地解决(resolve)疾病，并重新建立免疫耐受性和肠道内稳态。第二益处是，使用具有充分定义的有益健康作用的纯化的乳杆菌属菌株避免了使用粪便或涉及关键的安全性和健康问题的其他组合物。
胃肠状况可以是肠易激综合征(IBS)或炎性肠病(IBD)。术语炎性肠病(IBD)包括，除了其他状况以外，克罗恩病和溃疡性结肠炎。
胃肠状况还可以是结肠袋炎或感染后结肠炎。
组合物可以口服施用，诸如以饮料或食物产品。组合物可以作为饮料施用，在这种情况中乳杆菌属菌株被悬浮于液体中。液体可以是例如水、牛奶、盐-糖溶液或粥(gruel)。可选地，组合物可作为稀饭(porridge)或布丁施用。组合物可被包括在药丸中，药丸可被患者吞咽。这些施用途径的益处是，它们不要求任何高级的医学设备。将组合物作为饮料、稀饭、布丁或药丸施用的另一益处是，患者可控制何时吞咽饮料、稀饭、布丁或药丸。
组合物可作为灌肠剂使用。这一施用途径的益处是，其可使用医院常用的设备进行。这一施用途径的益处是，组合物可在其最有效的胃肠道中的位置处施用。另一益处是，其由健康护理专业人士进行；患者可以数次治疗达到满意，并将由护理提供者规律地评估。
组合物可作为向上胃肠道的灌注剂(infusion)施用。组合物可通过医学装置诸如鼻十二指肠管施用。这一施用途径的益处是，其可使用医院常用的设备进行。这一施用途径的另一益处是，组合物可在其最有效的胃肠道中的位置处施用。另一益处是，细菌组合物绕过胃及其酸性环境并被直接灌注到肠道。
组合物可通过医学装置诸如鼻胃管施用。组合物可经由结肠镜检查施用。
乳杆菌属的总量可以是109至1013CFU/治疗，例如109、1010、1011、1012或1013CFU/治疗。在鼻十二指肠管灌注的情形中，治疗可在一天、数天或一周后重复至少两次。
组合物可以是冷冻干燥的。这样的益处是，细菌可被保持用于长期储存，且不需要高级储存设施来操作细菌。
冷冻干燥的组合物可被包含在袋、罐、胶囊或任何其他种类的容器诸如药丸中。冷冻干燥的组合物可以是混合物中的数种组分之一。此外，冷冻干燥的组合物也可以是药丸的数种组分之一。其他常规添加剂可被自然地加入到冷冻干燥的组合物或加入到如本文公开的其他提及的组合物的任一种，以提供具有合适的货架期的稳定组合物。技术人员将知晓此类常规添加剂和将在组合物中使用的量。
组合物还可包含纤维组分。
纤维组分可选自由以下组成的组：燕麦纤维、小麦纤维、黑麦纤维、奇亚(chia)纤维、玉米纤维(corn fiber)、大麦纤维、马铃薯纤维、水果纤维(fruit fiber)、蔬菜纤维(vegetable fiber)、谷类纤维(cereal fiber)和来自藻类的纤维。
合适的纤维的其他实例包括不同种类的可溶和不可溶纤维。例如，可使用来源于种子(例如亚麻子和车前子)或来源于坚果(诸如核桃、椰子、扁桃(almond))的纤维。可使用膳食纤维诸如菊粉。其他常规添加剂可被加入到包含纤维的组合物。
细菌可被悬浮在粥、流食(pap)、稀饭或布丁中。
粥可以是燕麦粥。可使用的粥包括小麦粥、大麦粥、黑麦粥或玉米(corn)或玉蜀黍(maize)粥。
在施用根据本发明的组合物之前，可将新鲜或冷冻干燥的细菌组合物悬浮在合适的液体中。液体可以是药学上可接受的液体组分或任何类型的合适的介质，例如以上描述的介质之一。优选地，使用蒸馏水或缓冲水性介质，其包含药学上可接受的盐和缓冲剂。合适的盐溶液为PBS(磷酸盐缓冲盐水)、GBSS(Gey's平衡盐溶液)、EBSS(Earle's平衡盐溶液)、HBSS(Hank's平衡盐溶液)和SBF(合成/模拟体液)。取决于应用，液体组分还可具有更疏水的性质。
在口服施用的情形中，不同的调味剂可被加入以使得包含组合物的混合物味道更愉快。
组合物在合适的介质中再活化后在室温持续24h或在4℃多达一周可以是随时可用的。然而，应注意，时间段和温度可根据尤其是使用的介质变化。
组合物还可包含一种或更多种治疗剂，诸如针对细菌引起的感染和/或炎性状况的剂。
组合物可包含以上提及的五种菌株或甚至更多，只要存在以上提及的细菌菌株中的至少一种。
如以上描述的组合物可被包含在灌肠剂中。这样的灌肠剂的益处是，施用途径可使用医院常用的设备进行。这一施用途径的另一益处是，组合物可在其最有效的胃肠道中的位置处，即结肠中，施用。
施用组合物的体积将取决于接受灌肠剂的个体的年龄和尺寸变化。然而一般方针将是：幼儿：250ml或更少，学龄儿童：200-500ml，成人：200-1,000ml。
组合物可以是药物制剂。
本文件还提供选自由以下组成的组的分离的菌株：唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和短乳杆菌(LMG P-28888)。细菌菌株是生物上纯的。
本文件还提供唾液乳杆菌的分离的菌株，用于在治疗和/或预防被艰难梭菌NAP/027感染中使用，其中所述菌株是唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)。
本文件还涉及用于治疗和/或预防胃肠状况的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用药学上有效量的以下的步骤：包含选自由唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和短乳杆菌(LMG P-28888)组成的组的一种或更多种细菌菌株的组合物、包含这些细菌的一种或更多种的灌肠剂、或选自由唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和短乳杆菌(LMG P-28888)组成的组的一种或更多种分离的细菌菌株。所述胃肠状况是如本文别处公开的胃肠状况。
本文件还涉及包含选自由唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和短乳杆菌(LMG P-28888)组成的组的一种或更多种细菌菌株的组合物、包含这些细菌的一种或更多种的灌肠剂、或选自由唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和短乳杆菌(LMG P-28888)组成的组的一种或更多种分离的细菌菌株，用于制备用于治疗和/或预防胃肠状况的药物的用途。所述胃肠状况是如本文别处公开的胃肠状况。
本发明的其他目标、特征和益处将从以下详细公开内容、从所附的权利要求、以及从附图呈现。应注意，本发明涉及特征的所有可能组合。
通常，权利要求中使用的所有术语将根据它们在技术领域中的普通含义来解释，除非本文另有明确定义。除非另有明确声明，否则所有对“一(a)/一(an)/该(the)[元件、设备、部件、装置、步骤等等]”的引用都被开放地解释为指所述元件、设备、部件、装置、步骤等等的至少一个实例。除非明确陈述，否则本文公开的任何方法的步骤不必以所公开的确切顺序进行。
如本文使用的，术语“包括”和该术语的变化形式不意图排除其他添加剂、组分、整数或步骤。
菌株的定义
所有菌株于2015年5月19日保藏在BCCM/LMG(比利时微生物协调保藏中心/微生物实验室(Laboratorium voor Microbiologie),根特大学(Universiteit Gent)(UGent))，根特，比利时。保藏者是隆德大学(Lund University)，代表人为Shahram Aghaibeik-Lavasani,生物系(Department of Biology),
Figure BDA0001581302070000102
35,C栋(Building C),223 62隆德,瑞典。
保藏号如下。
Figure BDA0001581302070000101
Figure BDA0001581302070000111
菌株是生物上纯的。
菌株和术语的定义
CFU＝菌落形成单位
表格和附图的描述
图1显示乳杆菌与来自鼠肠道淋巴组织的新分离的免疫细胞共孵育后，CD4+Foxp3+T细胞的百分比。将1×106个免疫细胞与单种乳杆菌属(Lactobacillus sp.)或两种或数种的组合一起孵育。*代表p-值≤0.05，**代表p-值≤0.01且***代表p-值≤0.001，与对照相比。
图2显示乳杆菌与如以上描述的来自鼠肠道淋巴组织的免疫细胞共孵育后，CD4+Foxp3+T细胞的百分比。将1×106个免疫细胞与包括五种乳杆菌菌株LMG P-28884–P28888和从不同的市售可得食物产品分离的四种乳杆菌菌株(类干酪乳杆菌(L.paracasei)CNCM I-1518、植物乳杆菌DSM9843、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)DSM 13241和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)ATCC 53103)的单种乳杆菌属物种一起孵育。*代表p-值≤0.05，**代表p-值≤0.01且***代表p-值≤0.001，与植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)相比。
图3表1显示不同乳杆菌物种针对包括超毒力NAP1/027菌株的艰难梭菌的拮抗活性；-指示无抑制，+指示抑制、或乳杆菌划线周围无生长。
图4表2显示交叉划线方法以研究五种不同乳杆菌属菌株的物种间抑制。对于每一组，在表格上部的菌株是(首先划线的)测试者菌株；-指示无抑制，+指示抑制、或在乳杆菌属划线集中处的区域中无生长。
图5表3显示乳杆菌属菌株的抗生素敏感性测试。
图6显示乳杆菌菌株粘附于人类上皮结肠直肠细胞的能力。包括五种乳杆菌菌株LMG P-28884–P28888和从不同的市售可得食物产品分离的四种乳杆菌菌株(类干酪乳杆菌CNCM I-1518、植物乳杆菌DSM 9843、嗜酸乳杆菌DSM 13241和鼠李糖乳杆菌ATCC 53103)的乳杆菌属物种用于比较。将每种菌株的等量的细胞(5×108)与完全分化的Caco-2细胞单层独立地孵育(在37℃1h)。洗涤细胞并用吉姆萨染液染色。计数随机选择的显微镜视野中的粘附细菌并取平均值。*代表p-值≤0.05，**代表p-值≤0.01且***代表p-值≤0.001，与植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)相比。
图7表4显示五种不同乳杆菌属菌株的组合针对沙门氏菌属和大肠杆菌的菌株的拮抗活性；+++指示良好抑制(抑制区域>5-10mm)。++++指示强的抑制(抑制区域>10mm)。
图8唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)的保藏接收和存活证明。
图9短乳杆菌SH111(LMG P-28888)的保藏接收和存活证明。
图10植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)的保藏接收和存活证明。
图11植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)的保藏接收和存活证明。
图12植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)的保藏接收和存活证明。
图13唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)分别的碳水化合物谱系分析。评分是关于颜色强度。阳性测试通过由于酸的厌氧产生，从紫色向黄色的颜色变化(1-3)指示(-＝无变化)。
发明详述
在本上下文和发明中，适用以下定义：术语“肠道感染和炎症”意图指胃肠炎，一种由病毒、细菌或寄生虫感染导致的胃肠道的炎症增加。其还可指其他胃肠状况，例如肠易激综合征(IBS)、炎性肠病(IBD)、结肠袋炎或感染后结肠炎。术语抗生素相关的腹泻(AAD)意图指正在摄取或最近摄取抗生素的人体中发展的腹泻。AAD的最严重的原因之一是被艰难梭菌(CD)细菌感染，艰难梭菌是一种革兰氏阳性厌氧细菌。此外，医院内腹泻感染主要由CD引起，但也由其他肠道细菌病原体诸如沙门氏菌属、志贺氏菌属、弯曲菌属和耶尔森氏菌属引起。
本发明提供一种共生组合物，所述组合物包含有效量的选自包含以下或由以下组成的组的乳杆菌属细菌：唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)的一种或更多种。细菌菌株选自从不同植物来源分离的新型乳酸细菌菌株。将来自不同植物性植物(vegtable plant)的原始和发酵后的样品铺板于Rogosa琼脂上并在35-42℃在厌氧条件中孵育24-72h。随机选择单克隆。检查具有革兰氏阳性棒状形状的所有克隆的益生特性诸如对酸性pH(pH≤3)和胆盐的耐受性。分离的细菌通过碳水化合物发酵谱系(参见图13中的表5)和16S rRNA测序来鉴定。进一步筛选乳酸细菌菌株粘附于肠道和抑制胃肠病原体的生长、而非彼此的生长的能力。通常，当组合物包含这些细菌菌株的多于一种时，不同细菌菌株的细菌细胞的数目是大约相等的(即，大约相同数目的细菌细胞，例如，如通过测量CFU的数目或通过细菌数目的显微镜计算确定的)。包含这些细菌菌株的一种或更多种的组合物可被表示为益生组合物。
本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含至少一种根据本发明的菌株，即选自由以下组成的组的至少一种菌株：唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、短乳杆菌SH111(LMGP-28888)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)。本发明还涉及包含所述细菌菌株的一种或更多种的培养物、组合物或产物，用于在预防和/或治疗胃肠状况，诸如CD导致的状况中使用。
在本研究中，多于18种不同的和新型乳杆菌菌株被筛选并关于针对21种病原性CD菌株的抗微生物活性被表征。有趣地，发现这些特性是菌株特异性的并且不是对一个属的所有菌株普遍的。包含来自唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)菌株的所有的细菌的本发明的治疗组合物已经显示抑制所有CD菌株的生长而非彼此的生长的能力。其证明本发明组合物的菌株之间表现的协同性。
如在本文件中提供的实验数据证明的，植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)和唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)具有比植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)更高的定植能力(如通过结合Caco-2细胞证明的)，而后者仍然显示良好的定植能力。另一方面，植物乳杆菌SH1313、KS11和Y1An734被证明具有最高的抗炎性作用(如通过诱导Treg的潜力测量的)。如此，包含植物乳杆菌SH1313、KS11和Y1An734的组合物可以在治疗和/或预防慢性炎性紊乱中是特别有用的，所述慢性炎性紊乱诸如但不限于，IBD，其包括，除了其他状况以外，克罗恩病和溃疡性结肠炎、结肠袋炎或感染后结肠炎。在分离的五种乳杆菌菌株中，短乳杆菌SH111(LMG P-28888)和唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)显示最强的抗微生物作用。如此，包含短乳杆菌SH111(LMG P-28888)和唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)的组合物可以在治疗和/或预防微生物胃肠感染中是特别有用的，所述微生物胃肠感染诸如由艰难梭菌、沙门氏菌属、大肠杆菌、弯曲菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、李斯特菌属(Listeria)、弧菌属(Vibrio)、和/或蜡状芽孢杆菌引起的感染。胃肠感染可以是由于病毒感染，诸如轮状病毒。
由于所选的乳杆菌菌株对CD的病原性菌株和/或其他肠道病原体的抑制特性和对抗生素相关的腹泻(AAD)患者的治疗作用，本发明涉及共生乳杆菌属组合用于制备用于预防、治疗胃肠状况或改善胃肠状况的症状的药物组合物的医学用途，所述胃肠状况选自但不限于，AAD、胃肠炎、急性胃肠炎、或感染性腹泻。胃肠状况可以是由以下，但不限于以下导致的细菌感染：艰难梭菌、沙门氏菌属、大肠杆菌、弯曲菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、葡萄球菌属、李斯特菌属、弧菌属、或蜡状芽孢杆菌。胃肠状况可以是由于病毒感染，诸如轮状病毒相关的腹泻、或感染后腹泻。
本文件的组合物还可有效地用于治疗由沙门氏菌属或大肠杆菌导致的胃肠炎。沙门氏菌属(Salmonella spp.)在全世界引起最常见形式的食物中毒之一。实验清楚地证明，本发明的共生组合物强烈地抑制沙门氏菌属的病原性菌株(肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))和大肠杆菌的生长。
本发明还涉及针对CD感染的预防性(预防)使用。CD感染的患者通常用抗生素诸如甲硝唑和万古霉素治疗。本发明的组合物还已被实验测试并揭示无针对甲硝唑和万古霉素的敏感性，显示其用作预防性(预防)治疗的潜力，例如在摄入抗生素的更长时间段期间以支持和/或保持和/或恢复胃肠道的健康细菌菌群。其还可用于抑制复发，复发是常见的并代表CD感染相关的最大挑战。
本发明还涉及治疗由称为NAP1/027的超毒力CD引起的感染。CD感染的发病率和毒力升高已经与CD NAP1/027的传播一致。新型乳杆菌的筛选揭示，仅数种乳杆菌属菌株具有抑制2种不同的超毒力CD NAP1/027菌株生长的潜力。这些治疗菌株被包括在本发明展示的共生组合物中。
本文件还涉及本发明中陈述的共生组合物用于预防性或治疗性治疗慢性炎性紊乱的用途，所述慢性炎性紊乱诸如但不限于，IBD，其包括，除了其他状况以外，克罗恩病和溃疡性结肠炎、结肠袋炎或感染后结肠炎。细菌病原体与肠道上皮细胞的相互作用起始了炎性过程的级联，这有助于胃肠状况。改变的肠道微生物群和炎症破坏肠道屏障功能，允许病原体进一步繁殖和在肠道定植。Foxp3+调节性T细胞(Treg)在维持肠道中的免疫耐受、阻遏有害的炎性响应中是重要的。基于我们的经验，已经进一步筛选了乳杆菌组合触发Treg的潜力。与测试的其他组合相比，本发明的治疗组合物显示触发这些抗炎性细胞的最大潜力。其再次指示本发明组合物的菌株之间展示的协同性。
本文件还涉及本发明中陈述的共生组合物用于预防性或治疗性治疗腹部不适或疼痛相关的肠道状况的用途，所述腹部不适或疼痛相关的肠道状况诸如但不限于，肠易激综合征(IBS)。已经提示肠道微生物群的作用和压力的影响对于发展IBS是重要的。本发明中呈现的治疗组合物已经显示用于治疗IBS的较大成功。
组合物可口服施用。本发明组合物的菌株全部由于其在胃中的低pH和小肠中的高胆酸含量存活的独特和极佳能力、和粘附于结肠粘膜并临时定植于大肠的能力而选择。组合物可以作为饮料施用，在这种情况中细菌菌株被悬浮于液体中。液体可以是水、牛奶、盐-糖溶液或粥(gruel)。可选地，组合物可作为稀饭(porridge)或布丁施用。组合物可被包括在药丸中，药丸可被患者吞咽。
组合物可作为灌肠剂使用。这一施用途径的益处是，组合物可在其最有效的胃肠道中的位置处施用。通过灌肠剂施用的粪便微生物群移植物已经用于治疗患者。尽管使用灌肠剂被认为安全的并且该技术显示用于治疗CD感染的一些有希望的结果，但医师担心潜在的感染风险和长期的安全性，由于该疗法的内容物是来自志愿捐赠者的粪便细菌。然而，本发明中呈现的治疗组合物由从深入研究选择的、已经对患者测试、具有大的成功的乳杆菌属菌株组成。方法的另一益处是，其由健康护理专业人士进行；患者可以数次治疗达到满意，并将由护理提供者规律地评估。
组合物可作为向上胃肠道的灌注剂施用。组合物可通过医学装置诸如鼻十二指肠管施用。这一施用途径的益处是，组合物可在胃肠状况中在其最有效的胃肠道中的位置处施用。
细菌组合可与药学上可接受的液体组分一起施用，但也作为粉末。优选地，使用蒸馏水或缓冲水性介质，其包含药学上可接受的盐和缓冲剂。细菌菌株可如此存在，使得每次治疗施用至少109至1013CFU的总浓度的细菌。如果将施用多于一种细菌菌株，通常施用相同量的所有不同菌株。
组合物还可包含纤维组分。膳食纤维的健康益处已经长期被认识到。还已知其中一些选择性地刺激结肠中一种或有限数目的共生细菌的生长和/或活性，从而改进宿主健康。
可需要一种或更多种药学上可接受的液体组分。这类组分是本领域技术人员所熟知的。
组合物还可包含纤维组分。纤维组分可选自由以下组成的组，但不限于其：燕麦纤维、小麦纤维、黑麦纤维、奇亚(chia)纤维、玉米纤维、大麦纤维、马铃薯纤维、水果纤维、蔬菜纤维、谷类纤维和来自藻类的纤维。细菌组合还可被悬浮在粥、流食(pap)、稀饭或布丁中。
为了制备根据本文件的组合物，将被包括在组合物中的细菌菌株可单独生长或以一种或更多种菌株的组合生长。如果单独生长且预期将施用多于一种细菌菌株，通常混合不同的细菌菌株以使所得的组合物包含相同量(等量)的细菌(CFU)。本文公开的乳杆菌菌株可在通常用于生长乳杆菌的任何培养基中生长，所述培养基诸如Man–Rogosa–Sharpe(MRS)肉汤/琼脂和Rogosa琼脂。细菌通常在约25至42℃、诸如30至37℃、特别是约37℃的温度生长。细菌可在伴随摇动或不伴随摇动的液体培养基中或在固体培养基上生长。通常，细菌生长持续24-72小时的时间段。生长的时间将是如本领域技术人员已知的，取决于不同因素，诸如温度、接种细菌的量、培养基的营养含量等等。通常，生长细菌至静止期。在将细菌施用于需要其的受试者之前，通常从其用过的生长培养基分离细菌，例如通过离心或过滤细菌培养物。细菌可在例如缓冲液或盐溶液，诸如在PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液或0.9％NaCl中洗涤一次或更多次。然后在使用前，将细菌重悬于将用于施用的介质中。还可将细菌冷冻干燥以延长其储存能力。冷冻干燥的细菌可以其干燥状态施用，或其可在施用之前溶解在液体或含液体的介质中。在合适的介质中在室温持续24h或在4℃多达一周再活化冷冻干燥的细菌是可能的。然而，应注意，用于此类再活化的时间段和温度可根据尤其是使用的介质变化。直接使用细菌培养物而不从其使用的生长培养基分离细菌也是可能的。将细菌从其使用的生长培养基分离并且代替细菌本身施用其使用的生长培养基也是可能的。
本发明现在将在以下部分中更详细地描述。然而，实施例仅是说明性的并且不意图限制本发明的范围。
实验
乳杆菌与艰难梭菌之间的相互作用的评估：为了评估乳杆菌与艰难梭菌之间的体外相互作用，确定了18种乳杆菌属菌株针对包括两种超毒力CD NAP1/027(还称为CD BI/NAP1/027或CD NAP1/027)菌株的21种病原性艰难梭菌的拮抗活性。CD菌株属于不同的基因型，此前从瑞典，主要在
Figure BDA0001581302070000171
的
Figure BDA0001581302070000172
University Hospital的住院患者的粪便分离，其中包括抗生素相关的腹泻的随机病例。乳杆菌的拮抗活性作为对艰难梭菌生长的抑制在琼脂平板上检测。结果总结在表1中。乳杆菌属菌株在Man–Rogosa–Sharpe(MRS)肉汤中在37℃中培养48h。将艰难梭菌菌株在脑心浸液(BHI)肉汤中在37℃在厌氧环境中培养24h。将所有细菌培养物在4℃离心并将团块悬浮于0.9％NaCl溶液中以制备浓度等于在McFarland浊度标的0.5。接种100μl艰难梭菌悬液并涂布在Wilkins–Chalgren血琼脂平板上。将10μl的每种乳杆菌属悬液以不同的线划线(约2cm)。将板在厌氧环境中在37℃孵育48h，并研究乳杆菌属生长对艰难梭菌划线的抑制区域。
结果清楚地证明，植物乳杆菌菌株SH1313(LMG P-28884)、KS11(LMG P-28885)和Y1An734(LMG P-28886)、以及唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)抑制测试的艰难梭菌菌株的若干种的生长。特别是，这五种菌株的混合物抑制所有测试的艰难梭菌菌株的生长。此外，唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)和短乳杆菌SH111(LMGP-28888)以及植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)抑制CD NAP1/027菌株的生长。特别是，这五种菌株的混合物抑制测试的两种CD NAP1/027菌株的生长。值得注意地，乳杆菌的其他测试的菌株不在相同程度抑制艰难梭菌的生长。
乳杆菌与免疫细胞的相互作用：已经显示，艰难梭菌与肠道上皮细胞的直接相互作用起始炎性过程的级联，这促进肠道疾病诸如腹泻和假膜性结肠炎。改变的肠道微生物群组成和炎症破坏肠道屏障功能，允许艰难梭菌进一步繁殖和在肠道定植。表达Foxp3+的CD4+T细胞(调节性T细胞；Treg)在维持肠道中的免疫耐受，阻遏有害的炎性响应中是重要的。基于此前的经验，我们已经从小鼠分离了肠道淋巴组织(派伊尔结和肠系膜淋巴结)。在体外将其汇集并提供免疫细胞的单细胞悬液。然后将细胞与单独或组合在一起的五种不同乳杆菌一起孵育：植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)。将共1x106个免疫细胞/孔接种于96孔板中(在RPMI 1640细胞培养基中)。将1x107CFU/ml(100μl)的细菌(悬浮于RPMI 1640)加入到细胞并孵育共培养物20h(37℃、潮湿环境、5％CO2)。第二天，洗涤细胞并使用流式细胞术分析Treg的普遍性。检测表达受体CD4、转录因子(叉头盒P3；Foxp3)和细胞内细胞因子IL-10的Treg。细菌以单种形式使用或以两种、三种、四种或五种菌株的组合使用。组合包含等量的每种菌株(在实验的当天加入)，都达到1x107CFU/ml的终浓度。对照样品包含仅细胞培养基。结果示于图1中。数据代表以百分比的CD4+Foxp3+T细胞的频率。
从结果清楚地可见的是，只有植物乳杆菌的选择的单菌株(SH1313、KS11或Y1An734)具有在来自新分离的肠道淋巴组织的细胞中诱导抗炎性谱和活化Treg的潜力。唾液乳杆菌CW30、短乳杆菌SH111仅与植物乳杆菌的仔细选择的菌株组合可触发Treg。结果还证明，植物乳杆菌SH1313、植物乳杆菌KS11、植物乳杆菌Y1An734、唾液乳杆菌CW30和短乳杆菌SH111协同作用以活化和增加Treg。最显著和突出的抗炎性作用通过使用所有五种菌株的组合实现。
使用相同的测定，我们进一步比较了不同乳杆菌诱导Treg的潜力。我们使用了植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和从不同市售可得的食物产品分离的四种乳杆菌菌株：类干酪乳杆菌CNCM I-1518(Actimel)、植物乳杆菌DSM 9843(ProViva)、嗜酸乳杆菌DSM 13241(Arla A-fil)和鼠李糖乳杆菌ATCC 53103(Valio yoghurt)。在37℃将1x107CFU/ml(100μl)的每种菌株与免疫细胞共培养20h。结果显示在图2中。数据代表以百分比的CD4+Foxp3+T细胞的频率。
结果揭示，植物乳杆菌(SH1313、KS11和Y1An734)具有比包括类干酪乳杆菌CNCMI-1518、植物乳杆菌DSM 9843、嗜酸乳杆菌DSM 13241和鼠李糖乳杆菌ATCC 53103的其他菌株显著更强的诱导Treg的潜力，即这些植物乳杆菌菌株(植物乳杆菌(SH1313、KS11和Y1An734))具有突出的抗炎性作用。
统计评价全部使用StatView进行且使用非参数Mann-Whitney检验评价数据。
五种不同乳杆菌属菌株的物种间抑制：存在增加的证据，显示乳杆菌属物种的某些混合物具有比其组分菌株更有益的作用。已经表明，体内的各种协同或加和作用被可能的组分菌株相互抑制影响。我们研究了五种不同乳杆菌：植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)是否可在体外抑制彼此的生长。交叉划线测定用于这一目的。将每种菌株使用1ml环在MRS琼脂上划线(3个平行线)。在线干燥后，将其他菌株垂直于这些菌株划线，对每种菌株组合产生3个可能的抑制区域。如果测试者菌株妨碍了第二次划线的菌株的生长，其意味着抑制。结果在表2中示出。
结果清楚地揭示，唾液乳杆菌CW30和短乳杆菌SH111具有抑制其他选择的细菌菌株生长的极小能力，且植物乳杆菌SH1313、植物乳杆菌KS11、植物乳杆菌Y1An734不具有抑制其他选择的细菌菌株生长的能力。尽管提出的多菌株乳杆菌制品(由唾液乳杆菌CW30、和短乳杆菌SH111、植物乳杆菌SH1313、植物乳杆菌KS11和植物乳杆菌Y1An734组成)可维持抑制一系列病原性艰难梭菌的事实，组分菌株之间不存在影响细菌混合物的治疗功效的抑制。
乳杆菌属菌株的抗生素敏感性：乳杆菌的抗生素敏感性已经显示是物种和菌株依赖性的。因此，使用盘扩散测试检查五种不同乳杆菌的抗生素敏感性：植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)。用来自乳杆菌属菌株的新制备的培养物的细菌接种Rogosa琼脂平板。对红霉素(15μg盘)、万古霉素(30μg盘)和甲硝唑(5μg盘)进行盘扩散测试。结果在表3中示出。"S”代表敏感和"R”代表耐受。
抗生素谱系分析数据揭示，唾液乳杆菌CW30、和短乳杆菌SH111、植物乳杆菌SH1313、植物乳杆菌KS11、和植物乳杆菌Y1An734全部对红霉素敏感，红霉素是称为大环抗生素的一类药物，且所述菌株无一对万古霉素或甲硝唑敏感。
乳杆菌菌株向人类肠细胞样Caco-2细胞的粘附：乳杆菌菌株向肠道粘膜的粘附是其在肠道中定植的适当特性之一，在那里它们与其他细菌竞争。人类肠道细胞系Caco-2(来自结肠腺癌)是充分表征的细胞模型，其发展成熟肠细胞的特征，当完全分化时具有功能性的刷-边缘微绒毛。Caco-2细胞系已经被广泛用于研究细菌粘附和侵入。
在本研究中，比较了各种乳杆菌属菌株向Caco-2细胞的粘附。将Caco-2细胞在100-mm塑料培养皿中生长。将细胞以大约5×105接种在35-mm皿中并在汇合后两周(完全分化的细胞)使用。将细菌细胞(5×108)加入到洗涤的细胞单层并在37℃孵育1h。我们使用了植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、短乳杆菌SH111(LMGP-28888)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和从不同市售可得的食物产品分离的四种乳杆菌菌株：类干酪乳杆菌CNCM I-1518、植物乳杆菌DSM9843、嗜酸乳杆菌DSM 13241和鼠李糖乳杆菌ATCC 53103。
然后用PBS洗涤所有单层3次以释放未结合的细菌并用姬姆萨染色溶液染色。然后洗涤皿，干燥1h并在油浸下显微镜检查(放大率×100)。计数20个随机选择的显微镜视野中的乳杆菌菌株并取平均值。
如图6所示的，不同乳杆菌菌株向Caco-2细胞的粘附存在显著的变化，指示粘附特性不是乳杆菌的普遍特征。植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)、和唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)显示向Caco-2细胞粘附的最强效力。尽管植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和类干酪乳杆菌CNCM I-1518的粘附特性略微弱，它们向Caco-2细胞的粘附仍然表现为比植物乳杆菌DSM 9843、嗜酸乳杆菌DSM 13241、和鼠李糖乳杆菌ATCC 53103的粘附特性更突出。
乳杆菌属菌株的组合针对沙门氏菌属的菌株和大肠杆菌的拮抗活性：我们进一步评价了五种不同乳杆菌：植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)的组合抑制肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的体外生长的能力。将乳杆菌属菌株在Man–Rogosa–Sharpe(MRS)肉汤中在37℃培养48h。将沙门氏菌属和大肠杆菌菌株在脑心浸液(BHI)肉汤中在37℃培养24h。将所有细菌培养物在4℃离心并将团块悬浮于0.9％NaCl溶液中以制备浓度等于在McFarland浊度标的0.5。接种100μl沙门氏菌属或大肠杆菌菌株的细胞悬液并涂布在Wilkins–Chalgren血琼脂平板上。制备包含等量的五种乳杆菌属菌株的每一种(在实验的当天加入)的混合物，达到1x107CFU/ml的终浓度。将10μl的乳杆菌属悬液以不同的线划线(约2cm)。将板在37℃(与5％CO2)孵育48小时。然后测量生长抑制区域。
如表4中所示的，结果清楚地证明，唾液乳杆菌CW30、和短乳杆菌SH111、植物乳杆菌SH1313、植物乳杆菌KS11、和植物乳杆菌Y1An734的组合能够强烈地抑制肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的生长。数据进一步证明乳杆菌混合物针对胃肠病原细菌的抗微生物潜力。
临床病例
本发明通过以下临床试验的实例证明，其在Department of InfectiousDiseases,
Figure BDA0001581302070000221
University Hospital in
Figure BDA0001581302070000222
Sweden,(在2013-2014期间)进行。涉及的实例、材料和程序将以如本文所列的本发明的范围和主旨宽泛地理解。
病例1：艰难梭菌感染是住院患者中抗生素疗法经常相关的并发症。具有正在进行的肛门癌和造口手术(stoma surgery)的70岁女性患者由于伤口问题，接受若干疗程的抗生素。她在一年内显示复发艰难梭菌结肠炎，并在六周内用甲硝唑和万古霉素以递减策略治疗数次。她又一次发展了复发艰难梭菌感染(CDI)。
方法：提供了五种乳杆菌的组合：植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)(等量的每种菌株)。将1×1012CFU与无菌富含纤维的粥组合。然后将组合物混合到灌肠剂溶液中，并通过直肠管进行结肠灌注。治疗重复五次，间隔3-5天。
结果：患者在3个月后临床和细菌学上治愈，在最后一次治疗后多达一年没有显示复发的迹象。
病例2：一名75岁男性患者，患有多种疾病。他一年前在使用含有称为盐酸克林霉素的抗生素的曲张链菌素(Dalacin)长期治疗后显示复发性艰难梭菌结肠炎。他接受了两个疗程的甲硝唑，然后是10天万古霉素治疗。在递减策略的六周之后，他显示复发的CDI。他接受含来自健康供体的粪便的由医院的临床调查人员准备的粪便微生物群移植。抗生素治疗新疗程后，他又一次发展了复发性CDI。
方法：如上所述提供五种乳杆菌的组合物，并灌注灌肠剂溶液。治疗重复三次，间隔7天。
结果：患者在几天后临床治愈，在最后一次治疗后多达一年没有显示复发的迹象。
病例3:一名55岁女性患者在长期抗生素治疗后显示复发性艰难梭菌结肠炎。她接受了两个疗程的甲硝唑，然后是10天万古霉素治疗。在递减策略的六周之后，她显示复发的CDI。
方法：如上所述提供五种乳杆菌的组合物，并灌注灌肠剂溶液。治疗重复三次，间隔7天。
结果：患者在几天后临床治愈，在最后一次治疗后多达一年没有显示复发的迹象。
病例4:一名20岁的年轻人在早期胃肠炎后发展肠易激综合征(IBS)。他两次接受含来自健康供体的粪便的粪便微生物群移植(由医院的临床调查人员准备)，他的状况没有改善的迹象。
方法：如上所述提供五种乳杆菌的组合物，并灌注灌肠剂溶液。治疗重复三次，间隔7天。
结果：患者显示IBS症状的显著改善。他在最后一次治疗后多达一年没有出现任何临床恶化的迹象。
来自临床研究的结果证明，由植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)组成的细菌组合物，用于治疗罹患严重胃肠状况的患者是有效和相对安全的。
具体实施方案
1.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)。
2.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)和植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)。
3.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)和植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)。
4.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)和植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)。
5.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
6.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和植物乳杆菌SH313(LMG-28884)。
7.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和植物乳杆菌KS11(LMG P-28885。
8.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
9.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)和植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)。
10.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMGP-28887)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
11.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMGP-28887)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
12.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMGP-28887)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885),短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
13.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMGP-28887)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)和植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)。
14.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMGP-28887)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
15.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMGP-28887)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
16.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMGP-28887)、植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
17.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)。
18.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)。
19.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)和植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)。
20.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含唾液乳杆菌CW30(LMGP-28887)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
21.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、和植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)。
22.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
23.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)、短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
24.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)、植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
25.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌SH1313(LMGP-28884)。
26.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌SH1313(LMGP-28884)和植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)。
27.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌SH1313(LMGP-28884)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
28.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌SH1313(LMGP-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
29.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌KS11(LMGP-28885)。
30.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含植物乳杆菌KS11(LMGP-28885)和短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
31.用于在治疗和/或预防胃肠状况中使用的组合物，包含短乳杆菌SH111(LMG P-28888)。
32.根据前述实施方案中任一项所述的用于使用的组合物，其中所述胃肠状况是腹泻、抗生素相关的腹泻(AAD)、胃肠炎、急性胃肠炎和感染性腹泻。
33.根据前述实施方案中任一项所述的用于使用的组合物，其中所述胃肠状况是被艰难梭菌、沙门氏菌属或大肠杆菌细菌感染。
34.根据前述实施方案中任一项所述的用于使用的组合物，其中所述胃肠状况是被艰难梭菌NAP1/027感染。
35.根据实施方案1至32中任一项所述的用于使用的组合物，其中所述胃肠状况是肠易激综合征(IBS)或炎性肠病(IBD)。
36.根据前述实施方案中任一项所述的用于使用的组合物，其中所述组合物口服施用。
37.根据前述实施方案中任一项所述的用于使用的组合物，其中所述组合物作为灌肠剂施用。
38.根据前述实施方案中任一项所述的用于使用的组合物，其中所述组合物作为向上胃肠道的灌注剂施用。
39.根据前述实施方案中任一项所述的用于使用的组合物，其中乳杆菌属的总量是每次治疗109至1013CFU/治疗且所述治疗每周重复一次，持续至少两次。
40.根据前述实施方案中任一项所述的用于使用的组合物，其中所述组合物是冷冻干燥的。
41.根据实施方案40所述的用于使用的组合物，其中所述组合物还包含纤维组分。
42.根据实施方案41所述的用于使用的组合物，其中所述纤维组分选自由以下组成的组：燕麦纤维、小麦纤维、黑麦纤维、奇亚(chia)纤维、玉米纤维、大麦纤维、马铃薯纤维、水果纤维、蔬菜纤维、谷类纤维和来自藻类的纤维。
43.根据实施方案40至42的任一项所述的用于使用的组合物，其中所述细菌被悬浮在粥、流食(pap)、稀饭或布丁中。
44.根据实施方案43所述的用于使用的组合物，其中所述粥是燕麦粥。
45.一种灌肠剂，包含根据前述实施方案中任一项所述的组合物。
46.唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)的分离的菌株。
47.植物乳杆菌Y1An734(LMG P-28886)的分离的菌株。
48.植物乳杆菌SH1313(LMG P-28884)的分离的菌株。
49.植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)的分离的菌株。
50.短乳杆菌SH111(LMG P-28888)的分离的菌株。
51.唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)的分离的菌株，用于在治疗和/或预防被艰难梭菌NAP1/027感染中使用。
52.根据实施方案47至50中任一项所述的分离的菌株，用于在治疗和/或预防被艰难梭菌NAP1/027感染中使用。
53.治疗和/或预防胃肠状况的方法，通过施用根据实施方案1至44中任一项所述的组合物或根据实施方案45所述的灌肠剂或根据实施方案46至50中任一项所述的分离的菌株。
54.根据实施方案53所述的治疗和/或预防方法，其中所述胃肠状况是腹泻、抗生素相关的腹泻(AAD)、胃肠炎、急性胃肠炎和感染性腹泻。
55.根据实施方案53或54所述的治疗和/或预防方法，其中所述胃肠状况是被艰难梭菌、沙门氏菌属或大肠杆菌的细菌感染。
56.根据实施方案53至57中任一项所述的治疗和/或预防方法，其中所述胃肠状况是被艰难梭菌NAP1/027感染。
57.根据实施方案53至56中任一项所述的治疗和/或预防方法，其中所述胃肠状况是肠易激综合征(IBS)或炎性肠病(IBD)。
58.根据实施方案53至57中任一项所述的治疗和/或预防方法，其中所述组合物口服施用。
59.根据实施方案53至58中任一项所述的治疗和/或预防方法，其中所述组合物作为灌肠剂施用。
60.根据实施方案53至59中任一项所述的治疗和/或预防方法，其中所述组合物作为向上胃肠道的灌注剂施用。
61.根据实施方案53至60中任一项所述的治疗和/或预防方法，其中乳杆菌属的总量是每次治疗109至1013CFU/治疗且所述治疗每周重复一次，持续至少两次。
62.根据实施方案1至44中任一项所述的组合物或根据实施方案45所述的灌肠剂或根据实施方案46至50中任一项所述的分离的菌株在治疗和/或预防胃肠状况中的用途。
63.根据实施方案62所述的用途，其中所述胃肠状况是腹泻、抗生素相关的腹泻(AAD)、胃肠炎、急性胃肠炎和感染性腹泻。
64.根据实施方案62或63所述的用途，其中所述胃肠状况是被艰难梭菌、沙门氏菌属或大肠杆菌的细菌感染。
65.根据实施方案62至64中任一项所述的用途，其中所述胃肠状况是被艰难梭菌NAP1/027感染。
66.根据实施方案62至64中任一项所述的用途，其中所述胃肠状况是肠易激综合征(IBS)或炎性肠病(IBD)。
67.根据实施方案62至66中任一项所述的用途，其中所述组合物是口服施用的。
68.根据实施方案62至66中任一项所述的用途，其中所述组合物作为灌肠剂施用。
69.根据实施方案62至68中任一项所述的用途，其中所述组合物作为向上胃肠道的灌注剂施用。
70.根据实施方案62至69中任一项所述的用途，其中乳杆菌属的总量是每次治疗109至1013CFU/治疗且所述治疗每周重复一次，持续至少两次。
71.唾液乳杆菌CW30(LMG P-28887)的分离的菌株在治疗和/或预防被艰难梭菌NAP1/027感染中的用途。
72.根据实施方案47至50中任一项所述的分离的菌株用于治疗和/或预防被艰难梭菌NAP1/027感染的用途。

Claims (33)

1.用于在治疗胃肠状况中使用的组合物，所述组合物包含以下的乳杆菌属(Lactobacillus)菌株：唾液乳杆菌(L. salivarius)CW30 (LMG P-28887)、植物乳杆菌(L. plantarum)Y1An734 (LMG P-28886)、植物乳杆菌SH1313 (LMG P-28884)、植物乳杆菌KS11(LMG P-28885)和短乳杆菌(L. brevis)SH111 (LMG P-28888)，其中所述胃肠状况是被艰难梭菌(Clostridium difficile)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌感染，或者所述胃肠状况是肠易激综合征(IBS)或复发艰难梭菌感染(CDI)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述胃肠状况是被艰难梭菌NAP1/027感染。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物口服施用。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物作为灌肠剂施用。
5.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物作为向上胃肠道的灌注剂施用。
6.根据权利要求1或2所述的组合物，其中乳杆菌属的总量是109至1013 CFU/治疗且所述治疗每周重复一次，持续至少两次。
7.根据权利要求3所述的组合物，其中乳杆菌属的总量是109至1013 CFU/治疗且所述治疗每周重复一次，持续至少两次。
8.根据权利要求4所述的组合物，其中乳杆菌属的总量是109至1013 CFU/治疗且所述治疗每周重复一次，持续至少两次。
9.根据权利要求5所述的组合物，其中乳杆菌属的总量是109至1013 CFU/治疗且所述治疗每周重复一次，持续至少两次。
10.根据权利要求1、2、7-9中任一项所述的组合物，其中所述组合物是冷冻干燥的。
11.根据权利要求3所述的组合物，其中所述组合物是冷冻干燥的。
12.根据权利要求4所述的组合物，其中所述组合物是冷冻干燥的。
13.根据权利要求5所述的组合物，其中所述组合物是冷冻干燥的。
14.根据权利要求6所述的组合物，其中所述组合物是冷冻干燥的。
15.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物还包含纤维组分。
16.根据权利要求11-14中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含纤维组分。
17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述纤维组分选自由以下组成的组：燕麦纤维、小麦纤维、黑麦纤维、奇亚纤维、玉米纤维、大麦纤维、马铃薯纤维、水果纤维、和来自藻类的纤维。
18.根据权利要求16所述的组合物，其中所述纤维组分选自由以下组成的组：燕麦纤维、小麦纤维、黑麦纤维、奇亚纤维、玉米纤维、大麦纤维、马铃薯纤维、水果纤维、和来自藻类的纤维。
19.根据权利要求15所述的组合物，其中所述纤维组分选自由蔬菜纤维和谷类纤维组成的组。
20.根据权利要求16所述的组合物，其中所述纤维组分选自由蔬菜纤维和谷类纤维组成的组。
21.根据权利要求11-15、17-20中任一项所述的组合物，其中所述细菌被悬浮在流食或布丁中。
22.根据权利要求10所述的组合物，其中所述细菌被悬浮在流食或布丁中。
23.根据权利要求16所述的组合物，其中所述细菌被悬浮在流食或布丁中。
24.根据权利要求11-15、17-20中任一项所述的组合物，其中所述细菌被悬浮在粥中。
25.根据权利要求10所述的组合物，其中所述细菌被悬浮在粥中。
26.根据权利要求16所述的组合物，其中所述细菌被悬浮在粥中。
27.根据权利要求11-15、17-20中任一项所述的组合物，其中所述细菌被悬浮在稀饭中。
28.根据权利要求10所述的组合物，其中所述细菌被悬浮在稀饭中。
29.根据权利要求16所述的组合物，其中所述细菌被悬浮在稀饭中。
30.根据权利要求24所述的组合物，其中所述粥是燕麦粥。
31.根据权利要求25或26所述的组合物，其中所述粥是燕麦粥。
32.一种灌肠剂，包含根据前述权利要求中任一项所定义的组合物。
33.根据权利要求1至31中任一项所定义的组合物、根据权利要求32所定义的灌肠剂用于制备用于治疗胃肠状况的药物的用途, 其中所述胃肠状况是被艰难梭菌(Clostridium difficile)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或大肠杆菌(Escherichia coli)的细菌感染，或者所述胃肠状况是肠易激综合征(IBS)或复发艰难梭菌感染(CDI)。
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