CN108132213A - 精子活性氧类物质定量测定试剂盒及其用途和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种活性氧定量检测试剂盒，包括氯化硝基四氮唑蓝冻干粉、氯化硝基四氮唑蓝溶解液、显色剂A、显色剂B、标准品；所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉是浓度为0.1～1mmol/L的氯化硝基四氮唑蓝药液冷冻干燥后的粉末；所述氯化硝基四氮唑蓝溶解液是浓度为0.01～0.5mol/L、pH为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液；所述显色剂A是浓度为0.01～0.3mol/L的弱酸性缓冲液；所述显色剂B是0.01％～2％三乙醇胺溶液；所述标准品为含有已知浓度为0～36mmol/L的过氧化氢溶液。本发明具有方法学清洁环保、能实现手工操作和自动化批量检测、且操作简单、易于临床推广应用的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种活性氧类物质定量检测试剂盒及其用途，以及涉及利用这种试剂盒体外检测人体精子活性氧类物质浓度的方法。
背景技术
精液活性氧(reactive oxygen species,简称ROS)类物质主要由精子自身和精液中的白细胞产生，在生殖系统内，抗氧化酶系统和非酶性抗氧化物成分使ROS的产生和清除保持动态平衡。适量的活性氧在精子功能上扮演着多种角色，维持精子细胞的正常功能，是精子获能和顶体反应所必需的，但当ROS过量存在时，会导致细胞氧化应激反应，损伤机体的氧化防御系统，使精子运动功能改变、活力下降、死亡率升高，并影响精子的顶体反应及受精功能等。
现有技术中，在实验室对精子活性氧类物质(ROS)进行定量测量的方法有硫代巴比妥酸(TBA)法、鲁米诺化学发光法、辣根过氧化物酶法等。硫代巴比妥酸(TBA)法检测不够严谨，结果不精确，此法不便于评价活性氧的情况；鲁米诺化学发光法为世界卫生组织推荐的方法学，但操作过程中需使用到强酸性质的鲁米诺，对操作者、环境产生危害；辣根过氧化物酶法需使用到酸性腐蚀品三氯乙酸，也会对操作者、环境产生危害，且需要在0℃超声处理，临床使用不方便。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种方法学清洁环保、能实现手工操作和自动化批量检测、且操作简单、易于临床推广应用的活性氧(ROS)定量检测试剂盒，同时，本发明还提供其用途，以及一种利用该试剂盒检测人体精液标本中活性氧浓度的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种活性氧定量检测试剂盒，包括氯化硝基四氮唑蓝冻干粉、氯化硝基四氮唑蓝溶解液、显色剂A、显色剂B、标准品；
所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉是浓度为0.1～1mmol/L的氯化硝基四氮唑蓝药液冷冻干燥后的粉末；所述氯化硝基四氮唑蓝溶解液是浓度为0.01～0.5mol/L、pH为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液；所述显色剂A是浓度为0.01～0.3mol/L的弱酸性缓冲液；所述显色剂B是0.01％～2％三乙醇胺溶液；所述标准品为含有已知浓度为0～36mmol/L的过氧化氢溶液。
作为优选方式，还包括微孔板条；所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉为分装于密封容器的多瓶，所述显色剂A、显色剂B、标准品分别独立装于瓶中。
作为优选方式，所述显色剂A为碳酸氢钠溶液或醋酸钠或磷酸二氢钾或柠檬酸缓冲液。
作为优选方式，所述氯化硝基四氮唑蓝药液的浓度为0.212mmol/L；所述氯化硝基四氮唑蓝溶解液是浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液；所述显色剂A是浓度为0.25mol/L的碳酸氢钠溶液；所述显色剂B的浓度是1.62％的三乙醇胺溶液；所述标准品是浓度为36mmol/L的过氧化氢溶液。
本发明提供一种活性氧定量检测试剂盒的用途，用于检测成年男性精子活性氧类物质的含量。
本发明提供一种使用活性氧定量检测试剂盒检测精子活性氧的方法，包括如下步骤：
步骤一，将所取新鲜精液标本进行前处理，精子浓度记为M×106/mL；
步骤二，将氯化硝基四氮唑蓝溶液分为两大组，第一组加入精液浓度为M的洗涤精液标本，第二组分别依次加入多个已知过氧化氢浓度C标准的标准品，混匀；其中，氯化硝基四氮唑蓝溶液与洗涤精液标本的体积比为1～10。
步骤三，将所述步骤一中所得第一组和第二组反应液在10～40℃温度下反应1min，分别读取第一组和第二组的反应液在630nm波长下的第一次吸光度；然后，反应液在10～40℃温度下继续反应10～120min；
步骤四，在所述步骤二中所得第一组和第二组反应液内分别加入显色剂A，混匀；其中，显色剂A与洗涤精液标本的体积比为0.2～3。
步骤五，在所述步骤三中所得第一组和第二组反应液内加入显色剂B，混匀；其中，显色剂B与去洗涤精液标本的体积比为0.2～3。
步骤六，将所述步骤四中所得第一组和第二组反应液在10～40℃温度下反应1min，分别读取第一组和第二组的反应液在630nm波长下的第二次吸光度；然后，反应液在10～40℃温度下继续反应10～120min；
步骤七，分别以第一组和第二组的第二次吸光度减去各自的第一次吸光度，分别记为精液标本中参与反应的活性氧吸光度△A标本和标准品中参与反应的活性氧吸光度△A标准；
步骤八，计算得出精子活性氧的水平C标本。
作为优选方式，所述步骤二中，所述标准品是使用浓度为36mmol/L的过氧化氢溶液和纯水配制成浓度为0、2.25mmol/L、4.5mmol/L、9mmol/L、18mmol/L、36mmol/L的六个标准品。
作为优选方式，所述步骤三或步骤六中，反应液的反应温度是37℃；读取吸光度数值后，反应液在37℃温度下继续反应45min。
作为优选方式，所述氯化硝基四氮唑蓝溶液与洗涤精液标本的体积比为2；所述氯化硝基四氮唑蓝溶液与标准品的体积比为10；所述显色剂A与洗涤精液标本的体积比为0.6；显色剂B与去洗涤精液标本的体积比为0.6。
作为优选方式，所述步骤八中，分别得到六个标准品相应的△A标准拟合成校准曲线，读取△A标本的值在校准曲线上对应的浓度值并除以标本的稀释倍数，即为精子活性氧的水平C标本；精子ROS量＝精子ROS浓度÷精子浓度。
本发明涉及一种活性氧类物质定量检测试剂盒及其用途，以及涉及利用这种试剂盒体外检测人体精子活性氧类物质浓度的方法。本发明氯化硝基四氮唑蓝法的检验原理是人精液中的超氧阴离子自由基(O2- ●)具有高的反应活性，可将氯化硝基四氮唑蓝(下文简称NBT)还原为蓝色的甲臜(formazan)，反应液颜色深浅与O2- ●含量正相关，通过酶标比色仪检测630nm波长处甲臜的吸光度值，可检测出标本中的活性氧的浓度。本发明NBT法试剂配方环保、操作简单、灵敏度高、特异性强，适合临床使用，突出的有益效果在于：
(1)本试剂盒采用NBT法，具有高反应活性超氧阴离子自由基，可将硝基四氮唑蓝还原为蓝色的甲臜产物，甲臜可通过分析仪直接检测，此方法检测准确，清洁环保；既克服硫代巴比妥酸法检测不严谨的缺陷，又克服了鲁米诺化学发光法和辣根过氧化物酶法等检测活性氧方法中需要直接使用强酸的弱点。
(2)本发明使用标准曲线法，使待测精液样品与标准品同步反应，避免因实验条件波动导致检测错误，增强的检测的准确性。
(3)检测吸光度时，采用两步法得到ΔA，第一次反应可除去精液标本内其它能导致非特异性吸光度变化的影响因素，使检测更加特异、精准。
(4)由于采用了优化检测方案，减少了操作步骤和操作时间，大大提高了检测效率。
(5)由于采用了优化检测方案，减化了试剂结构，较大程度地降低了检测成本。
(6)由于操作简单、采用即用型试剂且性能稳定、无需特殊检测仪器，便于临床常规应用与推广。
附图说明
图1为实施例标准曲线图。
具体实施方式
本发明所用的仪器、设备和材料：
1.适用仪器：酶标比色仪
2.操作过程中用到的其它设备：
(1)酶标比色仪
(2)振荡器
(3)精子计数装置
(4)低速离心机
3.其它需要的材料
(1)精液采样装备
(2)1μL-10μL数字可调移液枪和一次性吸头
(3)5μ-50μL数字可调移液枪和一次性吸头
(4)100μL-1000μL数字可调移液枪和一次性吸头
(5)5mL玻璃试管
(6)一次性塑料吸管
(7)96孔微孔板架
(8)一次性使用手套
下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1
一、制备本实施例1的精子活性氧类物质定量检测试剂盒，如下。
配制NBT冻干粉(0.212mmol/L)：准确称量NBT干粉1.2134g，用纯化水补至1000mL，分装1mL/瓶，冻干，使用时加入7mLNBT溶解液复溶，即NBT的浓度为0.212mmol/L。
配制NBT溶解液(浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液)：称取磷酸二氢钾2.5857g，十二水磷酸氢二钠29.0093g，加入适量纯化水搅拌溶解后，纯化水定容至1000mL，调整磷酸盐pH至7.2～7.6。
配制显色剂A(0.25mol/L碳酸氢钠)：称取碳酸氢钠21.0025g，加入容量瓶中纯化水补至1000mL。
配制显色剂B(1.62％三乙醇胺)：取三乙醇胺16.2mL，向容量瓶中加纯化水至1000mL。
配制标准品(0～36mmol/L)：使用纯水和质量浓度为3％的过氧化氢配置成浓度为36mmol/L的过氧化氢溶液。
二、使用本实施例1的活性氧定量检测试剂盒检测精子活性氧的方法，步骤如下：
1、受试者禁欲2-7天后，通过手淫法或用特制的精液采集套留取全部精液标本。将此新鲜的精液标本置37℃或室温30-60min，待其完全液后进行检测。若精液液化迟缓或黏度增高，可在标本中添加液化剂以降低黏度。
2、检测前精液标本处理
(1)在5mL的小玻璃试管中加入液化完全的新鲜精液标本1-2mL，加入生理盐水3-4mL，以巴氏管轻轻吹打混匀。
(2)1500g离心5min；去除上层液体，保留底部精子沉淀。
(3)加入5mL生理盐水使(2)中所得精子重新悬浮，以巴氏管轻轻吹打混匀。
(4)1500g离心5min；去除上层液体，保留底部精子沉淀。
(5)加入1.5mL生理盐水使(4)中所得精子重新悬浮，以巴氏管轻轻吹打混匀。
(6)准确计数精液标本中精子的浓度，记为M×106/mL。
3、试剂准备
将NBT冻干粉、NBT溶解液、显色剂A、显色剂B、标准品等试剂置于室温平衡。
使用纯水和浓度为36mmol/L的过氧化氢溶液标准品，配制成梯度浓度为0mmol/L、2.25mmol/L、4.5mmol/L、9mmol/L、18mmol/L、36mmol/L的六个标准样。
取1支NBT冻干粉，加入7mL NBT溶解液充分溶解。4℃避光保存可用1周，-20℃保存至少可用1年(勿反复冻融)。溶解后的底物液为淡黄色，若颜色变为深黄色，则表明该试剂已失效。
4、检测
参照上表所示，在微孔板条的微孔内完成检测，检测步骤为：
(1)分别取洗涤精子标本50μL和6种不同校准浓度的标准样各10μL，分别加入NBT溶液100μL，混匀；分为两大组，记为第一组和第二组；
(2)将上述(1)所得第一组和第二组反应液在37℃反应1min后，用酶标比色仪在630nm波长下读取并记录各自的第一次吸光度A11、A21；
(3)将上述(2)所得第一组和第二组反应液在37℃准确反应45min；
(4)向上述(3)所得第一组和第二组反应液内分别加入显色剂A 30μL，混匀；
(5)向上述(4)所得第一组和第二组反应液内分别加入显色剂B 30μL，混匀；
(6)将上述(5)所得第一组和第二组反应液在37℃反应1min后，用酶标比色仪在630nm波长下读取并记录各自的第一次吸光度A12、A22。
5、比色与计算
(1)计算得到精液标本和每个浓度标准品中活性氧类物质参与反应的吸光度△A标本＝A12-A11、△A标准＝A22-A21；其中，6个标准样的浓度及吸光度数据见表1。
(2)将表1中数据拟合成校准曲线(按现有技术常规方法)，X轴为6个标准品对应的吸光度△A标准，Y轴为标准品中6个已知过氧化氢浓度中活性氧浓度数值，如图1，得出标准曲线y＝5.58x2-3.083x+1.412；R2＝0.992。将精液标本的△A标本数值代入标准曲线，得到校准曲线上对应的浓度值，即为精液标本中活性氧类物质的浓度C标本，C标本＝标本在校准曲线上对应的浓度值÷标本稀释系数5。
(3)按以下公式计算精子ROS的水平：
精子ROS量(pmol/106精子)＝1000×精子ROS浓度C标本(mmol/L)÷精子浓度M。
实施例2
一、制备本实施例2的精子活性氧类物质定量检测试剂盒，如下。
配制冻干粉(0.1mmol/L NBT)：准确称量NBT干粉0.2862g，用纯化水补至500mL，分装1mL/瓶，冻干，使用时加入7mLNBT溶解液复溶，即NBT的浓度为0.1mmol/L。
配制NBT溶解液(浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液)：称取磷酸二氢钾0.25857g，十二水磷酸氢二钠2.90093g，加入适量纯化水搅拌溶解后，纯化水定容至1000mL，使用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调整pH至7.2～7.6。
配制显色剂A(0.01mol/L碳酸氢钠)：称取碳酸氢钠0.8401g，加入容量瓶中纯化水补至1000mL。
配制显色剂B(0.01％三乙醇胺)：取三乙醇胺0.1mL，向容量瓶中加纯化水至1000mL。
配制标准品(0～36mmol/L)：使用纯水和质量浓度为3％的过氧化氢配置成浓度为36mmol/L的过氧化氢溶液。
二、使用本实施例2的活性氧定量检测试剂盒检测精子活性氧的方法，步骤如下：
1、受试者禁欲2-7天后，通过手淫法或用特制的精液采集套留取全部精液标本。将此新鲜的精液标本置37℃或室温30-60min，待其完全液后进行检测。若精液液化迟缓或黏度增高，可在标本中添加液化剂以降低黏度。
2、检测前精液标本处理
(1)在5mL的小玻璃试管中加入液化完全的新鲜精液标本1-2mL，加入生理盐水3-4mL，以巴氏管轻轻吹打混匀。
(2)1500g离心5min；去除上层液体，保留底部精子沉淀。
(3)加入5mL生理盐水使(2)中所得精子重新悬浮，以巴氏管轻轻吹打混匀。
(4)1500g离心5min；去除上层液体，保留底部精子沉淀。
(5)加入1.5mL生理盐水使(4)中所得精子重新悬浮，以巴氏管轻轻吹打混匀。
(6)准确计数精液标本中精子的浓度，记为M×106/mL。
3、试剂准备
将NBT冻干粉、NBT溶解液、显色剂A、显色剂B、标准品等试剂置于室温平衡。
使用纯水和浓度为36mmol/L的过氧化氢溶液标准品，配制成梯度浓度为0mmol/L、2.25mmol/L、4.5mmol/L、9mmol/L、18mmol/L、36mmol/L的六个标准样。
取1支NBT冻干粉，加入7mL NBT溶解液充分溶解。4℃避光保存可用1周，-20℃保存至少可用1年(勿反复冻融)。溶解后的底物液为淡黄色，若颜色变为深黄色，则表明该试剂已失效。
4、检测
参照上表所示，在微孔板条的微孔内完成检测，检测步骤为：
(1)分别取洗涤精子标本50μL和6种不同校准浓度的标准样各10μL，分别加入NBT溶液50μL，混匀；分为两大组，记为第一组和第二组；
(2)将上述(1)所得第一组和第二组反应液在37℃反应1min后，用酶标比色仪在630nm波长下读取并记录各自的第一次吸光度A11、A21；
(3)将上述(2)所得第一组和第二组反应液在37℃准确反应120min；
(4)向上述(3)所得第一组和第二组反应液内分别加入显色剂A 150μL，混匀；
(5)向上述(4)所得第一组和第二组反应液内分别加入显色剂B 150μL，混匀；
(6)将上述(5)所得第一组和第二组反应液在37℃反应1min后，用酶标比色仪在630nm波长下读取并记录各自的第一次吸光度A12、A22。
5、比色与计算
(1)计算得到精液标本和每个浓度标准品中活性氧类物质参与反应的吸光度△A标本＝A12-A11、△A标准＝A22-A21；其中，6个标准样的浓度及吸光度数据见表1。
(2)将表1中数据拟合成校准曲线(按现有技术常规方法)，X轴为6个标准品对应的吸光度△A标准，Y轴为标准品中6个已知过氧化氢浓度中活性氧浓度数值，如图1，得出标准曲线y＝5.58x2-3.083x+1.412；R2＝0.992。将精液标本的△A标本数值代入标准曲线，得到校准曲线上对应的浓度值，即为精液标本中活性氧类物质的浓度C标本，C标本＝标本在校准曲线上对应的浓度值÷标本稀释系数5。
(3)按以下公式计算精子ROS的水平：
精子ROS量(pmol/106精子)＝1000×精子ROS浓度C标本(mmol/L)÷精子浓度M。
实施例3
一、制备本实施例3的精子活性氧类物质定量检测试剂盒，如下。
配制NBT冻干粉(1mmol/L)：准确称量NBT干粉5.7236g，用纯化水补至1000mL，分装1mL/瓶，冻干，使用时加入7mLNBT溶解液复溶(，即NBT的浓度为1mmol/L。
配制NBT溶解液(浓度为0.5mol/L的磷酸盐缓冲液)：称取磷酸二氢钾12.9285g，十二水磷酸氢二钠145.0465g，加入适量纯化水搅拌溶解后，纯化水定容至1000mL，使用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调整pH至7.2～7.6。
配制显色剂A(0.3mol/L碳酸氢钠)：称取碳酸氢钠12.6046g，加入容量瓶中纯化水补至500mL。
配制显色剂B(2％三乙醇胺)：取三乙醇胺10mL，向容量瓶中加纯化水至500mL。
配制标准品(0～36mmol/L)：使用纯水和质量浓度为3％的过氧化氢配置成浓度为36mmol/L的过氧化氢溶液。
二、使用本实施例3的活性氧定量检测试剂盒检测精子活性氧的方法，步骤如下：
1、受试者禁欲2-7天后，通过手淫法或用特制的精液采集套留取全部精液标本。将此新鲜的精液标本置37℃或室温30-60min，待其完全液后进行检测。若精液液化迟缓或黏度增高，可在标本中添加液化剂以降低黏度。
2、检测前精液标本处理
(1)在5mL的小玻璃试管中加入液化完全的新鲜精液标本1-2mL，加入生理盐水3-4mL，以巴氏管轻轻吹打混匀。
(2)1500g离心5min；去除上层液体，保留底部精子沉淀。
(3)加入5mL生理盐水使(2)中所得精子重新悬浮，以巴氏管轻轻吹打混匀。
(4)1500g离心5min；去除上层液体，保留底部精子沉淀。
(5)加入1.5mL生理盐水使(4)中所得精子重新悬浮，以巴氏管轻轻吹打混匀。
(6)准确计数精液标本中精子的浓度，记为M×106/mL。
3、试剂准备
将NBT冻干粉、NBT溶解液、显色剂A、显色剂B、标准品等试剂置于室温平衡。
使用纯水和浓度为36mmol/L的过氧化氢溶液标准品，配制成梯度浓度为0mmol/L、2.25mmol/L、4.5mmol/L、9mmol/L、18mmol/L、36mmol/L的六个标准样。
取1支NBT冻干粉，加入7mL NBT溶解液充分溶解。4℃避光保存可用1周，-20℃保存至少可用1年(勿反复冻融)。溶解后的底物液为淡黄色，若颜色变为深黄色，则表明该试剂已失效。
4、检测
参照上表所示，在微孔板条的微孔内完成检测，检测步骤为：
(1)分别取洗涤精子标本50μL和6种不同校准浓度的标准样各10μL，分别加入NBT溶液300μL，混匀；分为两大组，记为第一组和第二组；
(2)将上述(1)所得第一组和第二组反应液在37℃反应1min后，用酶标比色仪在630nm波长下读取并记录各自的第一次吸光度A11、A21；
(3)将上述(2)所得第一组和第二组反应液在37℃准确反应10min；
(4)向上述(3)所得第一组和第二组反应液内分别加入显色剂A 10μL，混匀；
(5)向上述(4)所得第一组和第二组反应液内分别加入显色剂B 10μL，混匀；
(6)将上述(5)所得第一组和第二组反应液在37℃反应1min后，用酶标比色仪在630nm波长下读取并记录各自的第一次吸光度A12、A22。
5、比色与计算
(1)计算得到精液标本和每个浓度标准品中活性氧类物质参与反应的吸光度△A标本＝A12-A11、△A标准＝A22-A21；其中，6个标准样的浓度及吸光度数据见表1。
(2)将表1中数据拟合成校准曲线(按现有技术常规方法)，X轴为6个标准品对应的吸光度△A标准，Y轴为标准品中6个已知过氧化氢浓度中活性氧浓度数值，如图1，得出标准曲线y＝5.58x2-3.083x+1.412；R2＝0.992。将精液标本的△A标本数值代入标准曲线，得到校准曲线上对应的浓度值，即为精液标本中活性氧类物质的浓度C标本，C标本＝标本在校准曲线上对应的浓度值÷标本稀释系数5。
(3)按以下公式计算精子ROS的水平：
精子ROS量(pmol/106精子)＝1000×精子ROS浓度C标本(mmol/L)÷精子浓度M。
表1标准品浓度与吸光度△A数据
| 序号 | 标准品吸光度△A | 过氧化氢浓度(mmol/L) |
| 1 | 0.3185 | 0 |
| 2 | 0.641 | 2.25 |
| 3 | 0.93 | 4.5 |
| 4 | 1.449 | 9 |
| 5 | 2.115 | 18 |
| 6 | 2.7505 | 36 |
Claims (10)
1.一种活性氧定量检测试剂盒，其特征在于，包括氯化硝基四氮唑蓝冻干粉、氯化硝基四氮唑蓝溶解液、显色剂A、显色剂B、标准品；
所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉是浓度为0.1～1mmol/L的氯化硝基四氮唑蓝药液冷冻干燥后的粉末；所述氯化硝基四氮唑蓝溶解液是浓度为0.01～0.5mol/L、pH为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液；所述显色剂A是浓度为0.01～0.3mol/L的弱酸性缓冲液；所述显色剂B是0.01％～2％三乙醇胺溶液；所述标准品为含有已知浓度为0～36mmol/L的过氧化氢溶液。
2.根据权利要求1所述的一种活性氧定量检测试剂盒，其特征在于，还包括微孔板条；所述氯化硝基四氮唑蓝冻干粉为分装于密封容器的多瓶，所述显色剂A、显色剂B、标准品分别独立装于瓶中。
3.根据权利要求1或2所述的一种活性氧定量检测试剂盒，其特征在于，所述显色剂A为碳酸氢钠溶液或醋酸钠或磷酸二氢钾或柠檬酸缓冲液。
4.根据权利要求3所述的一种活性氧定量检测试剂盒，其特征在于，所述氯化硝基四氮唑蓝药液的浓度为0.212mmol/L；所述氯化硝基四氮唑蓝溶解液是浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液；所述显色剂A是浓度为0.25mol/L的碳酸氢钠溶液；所述显色剂B的浓度是1.62％的三乙醇胺溶液；所述标准品是浓度为36mmol/L的过氧化氢溶液。
5.一种活性氧定量检测试剂盒的用途，其特征在于，用于检测成年男性精子活性氧类物质的含量。
6.一种使用权利要求1所述活性氧定量检测试剂盒检测精子活性氧的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，将所取新鲜精液标本进行前处理，精子浓度记为M×106/mL；
步骤二，将氯化硝基四氮唑蓝溶液分为两大组，第一组加入精液浓度为M的洗涤精液标本，第二组分别依次加入多个已知过氧化氢浓度C标准的标准品，混匀；其中，氯化硝基四氮唑蓝溶液与洗涤精液标本的体积比为1～10。
步骤三，将所述步骤一中所得第一组和第二组反应液在10～40℃温度下反应1min，分别读取第一组和第二组的反应液在630nm波长下的第一次吸光度；然后，反应液在10～40℃温度下继续反应10～120min；
步骤四，在所述步骤二中所得第一组和第二组反应液内分别加入显色剂A，混匀；其中，显色剂A与洗涤精液标本的体积比为0.2～3。
步骤五，在所述步骤三中所得第一组和第二组反应液内加入显色剂B，混匀；其中，显色剂B与去洗涤精液标本的体积比为0.2～3。
步骤六，将所述步骤四中所得第一组和第二组反应液在10～40℃温度下反应1min，分别读取第一组和第二组的反应液在630nm波长下的第二次吸光度；然后，反应液在10～40℃温度下继续反应10～120min；
步骤七，分别以第一组和第二组的第二次吸光度减去各自的第一次吸光度，分别记为精液标本中参与反应的活性氧吸光度△A标本和标准品中参与反应的活性氧吸光度△A标准；
步骤八，计算得出精子活性氧的水平C标本。
7.根据权利要求6所述一种检测精子活性氧的方法，其特征在于，所述步骤二中，所述标准品是使用浓度为36mmol/L的过氧化氢溶液和纯水配制成浓度为0、2.25mmol/L、4.5mmol/L、9mmol/L、18mmol/L、36mmol/L的六个标准品。
8.根据权利要求6所述一种检测精子活性氧的方法，其特征在于，所述步骤三或步骤六中，反应液的反应温度是37℃；读取吸光度数值后，反应液在37℃温度下继续反应45min。
9.根据权利要求6所述一种检测精子活性氧的方法，其特征在于，所述氯化硝基四氮唑蓝溶液与洗涤精液标本的体积比为2；所述氯化硝基四氮唑蓝溶液与标准品的体积比为10；所述显色剂A与洗涤精液标本的体积比为0.6；显色剂B与去洗涤精液标本的体积比为0.6。
10.根据权利要求6所述一种检测精子活性氧的方法，其特征在于，所述步骤八中，分别得到六个标准品相应的△A标准拟合成校准曲线，读取△A标本的值在校准曲线上对应的浓度值并除以标本的稀释倍数，即为精子活性氧的水平C标本；精子ROS量＝精子ROS浓度÷精子浓度。
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| CN110967230B (zh) * | 2019-11-22 | 2022-05-31 | 珠海高瑞特医疗科技有限公司 | 一种精子活性氧含量的测定方法及试剂盒 |
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