CN108130331A - 大丽轮枝菌糖基磷脂酰肌醇基因VdGAP亚细胞定位载体的构建和应用 - Google Patents

大丽轮枝菌糖基磷脂酰肌醇基因VdGAP亚细胞定位载体的构建和应用 Download PDF

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张昕
林玲
邓晟
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi

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Abstract

本发明涉及植物病理学领域，根据前期从大丽轮枝菌V08DF1菌株中克隆的VdGAP基因的全长序列，将其克隆到1300‑ble‑GFP载体，构建了针对该基因的绿色荧光标记重组载体，利用农杆菌介导的转化方法，获得了该基因的绿色荧光标记突变体。通过对的绿色荧光标记突变体表型观察和分析，发现VdGAP基因表达的蛋白在孢子时期定位在细胞核，在菌丝和微菌核时期定位在细胞质。本发明在前面工作基础上，利用GFP标记该基因，对明确微菌核形成和发育的机制以及深入研究该病害流行规律和制定防治措施具有重要意义。

Description

大丽轮枝菌糖基磷脂酰肌醇基因VdGAP亚细胞定位载体的构 建和应用
技术领域
本发明涉及大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)糖基磷脂酰肌醇基因VdGAP的亚细胞定位，属于植物病理学研究领域。
背景技术
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是引起植物黄萎病的重要土传病原真菌，寄主广泛，可危害多种重要的经济作物和园艺作物。传统的防治技术，如轮作、抗性品种选育、化学药剂等对黄萎病的防治有一定的效果，但是由于大丽轮枝菌具有丰富的遗传多样性，致病力易发生分化，且主要以抗逆性强的微菌核结构在土壤中存活，因而在世界范围内黄萎病的危害依然严重。
黄萎病是系统性侵染的单循环病害，微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要休眠结构，能够在无寄主植物的土壤中长期存活达14年之久，成为植物黄萎病重要的初侵染来源，在病害循环中起重要作用，其形成的数量及存活情况直接影响着黄萎病的发生危害程度。对于大丽轮枝菌微菌核的研究过去集中于微菌核的形态、大小、分布，微菌核的分离培养技术以及影响微菌核存活的土壤环境因素等。对于其发育的过程在形态学层次也已清晰，最初阶段是由单根或数根菌丝膨大，并产生大量的隔膜，隔膜的细胞继续增大，成为球状并产生侧芽，最终在细胞壁内和细胞间沉积黑色素颗粒，黑色素对于形成完整的休眠结构是必须的。但对于微菌核形成和发育的分子机制并不明确。本实验室前期通过对大丽轮枝菌糖基磷脂酰肌醇基因VdGAP敲除与回补，证明该基因参与大丽轮枝菌黑色素的形成。本发明在前面工作基础上，利用GFP标记该基因，对明确微菌核形成和发育的机制以及深入研究该病害流行规律和制定防治措施具有重要意义。
根据膜蛋白分离的难易程度及与其脂分子的结合方式，膜蛋白可分为三种基本类型：外在膜蛋白(extrinsic membrane protein)或称外周膜蛋白(peripheral membraneprotein)、内在膜蛋白(intrinsic membrane protein)或称整合膜蛋白(integralmembrane protein)和脂锚定膜蛋白(lipid anchored protein)。脂锚定膜蛋白是通过与之共价相连的脂分子(脂肪酸或糖脂)插入膜的脂双分子中，而锚定在细胞质膜上，其水溶性的蛋白质部分位于脂双层外。脂锚定膜蛋白可以分为三种类型：(1)脂肪酸结合到膜蛋白N端的甘氨酸残基上，如与肿瘤发生相关的酪氨酸蛋白激酶的突变体v-Src；(2)由15或20个碳链长的烃链结合到膜蛋白C端的半胱氨酸残基上，有时还有另一条烃链或脂肪酸链结合到近C端的其他半胱氨酸残基上；(3)通过糖脂锚定在细胞质膜上，如磷脂酶C和大分子的蛋白聚糖，在不同细胞中，这类糖脂的结构有很大的不同，但都还有磷脂酰肌醇(PI)基团，因此称为磷脂酰肌醇糖脂(glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚定方式，简称GPI锚定方式。同磷脂分子类似，同磷脂酰肌醇结合的2个脂肪酸链插入脂膜中。肌醇同时与长度不等的寡糖链相结合，最后寡糖末端的磷酸己醇胺与蛋白质共价相连，从而有效地将蛋白质结合到质膜上，GPI脂锚定膜蛋白均分布在质膜外侧。糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白在原生动物到脊椎动物中都广泛存在，在不同物种和进化中高度保守，在物种体内可作为酶、细胞表面抗原、信号受体蛋白、细胞粘合和迁移分子，并且在多种生理活动，例如发育、免疫、神经形成中发挥重要作用。糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白有一个特征，转酰胺基酶将预成型的糖基磷脂酰肌醇锚整体连接到内质网新生蛋白的C末端。有趣的是，糖基磷脂酰肌醇部分已被证明在蛋白的亚细胞和膜划分中发挥重要作用，进而影响它们的转运和特殊功能。糖基磷脂酰肌醇蛋白几乎特异性定位在细胞表面，在脂质双分子层的外叶，因此脂类和蛋白代谢通路可能影响它们的胞内运输。
发明内容
根据前期从大丽轮枝菌V08DF1菌株中克隆的VdGAP基因的全长序列，将其克隆到1300-ble-GFP载体，构建了针对该基因的绿色荧光标记重组载体，利用农杆菌介导的转化方法，获得了该基因的绿色荧光标记突变体。通过对的绿色荧光标记突变体表型观察和分析，发现VdGAP基因表达的蛋白在孢子时期定位在细胞核，在菌丝和微菌核时期定位在细胞质。
相关技术路线如下：
1.前期已通过RACE获得VdGAP的ORF，参照Vazyme的ClonExpress定向克隆说明书，设计核酸引物(包含启动子区和ORF区，但不包含终止密码子)，采用高保真PCR体系扩增VdGAP，同时Hind III单酶切1300-Ble-GFP载体(本实验室设计改造)质粒，琼脂糖凝胶电泳分别回收扩增片段和酶切片段。
2.采用Vazyme的ClonExpress定向克隆方法将VdGAP扩增回收片段和1300-Ble-GFP载体线性化回收片段连接，转化至DH5α，再转化至AGL-1，获得1300-Ble-VdGAP-GFP重组载体。
3.将1300-Ble-VdGAP-GFP重组载体利用农杆菌转化的方法导入到大丽轮枝菌V08DF1和ΔVdGAP敲除突变体中，获得VdGAP-GFP重组突变体。
4.在激光共聚焦显微镜下观察VdGAP亚细胞定位。
附图说明
图1.VdGAP片段高保真PCR扩增胶回收电泳图(包含启动子不包含终止子)，V08df1的gDNA为模板，Marker：全式金2000plus；
图2.Hind III单酶切1300-Ble-GFP载体胶回收电泳图，Marker：全式金15000bp
图3.VdGAP-GFP重组突变体PCR验证电泳图，泳道1-8：VdGAP-GFP重组突变体1-8，泳道9：空白对照，Marker：全式金2000plus；
图4.VdGAP-GFP重组突变体不同生长形态激光共聚焦图
具体实施方式
1. 1300-Ble-VdGAP-GFP载体的构建，并将构建好的载体用化学转化法导入农杆菌AGL-1菌株中，获得VdGAP融合GFP的AGL-1农杆菌，具体流程描述如下：
利用前期已通过RACE获得VdGAP的ORF，参照Vazyme的ClonExpress定向克隆说明书，设计设计核酸引物(包含启动子区和ORF区，但不包含终止密码子)，上游引物为acgacggccagtgccaagcttGATTCATCCTCCGGCACTTG，下游引物为gacctgcaggcatgcaagcttCGCCAGGAGGAAGGCGCC，小写字母为1300-Ble-GFP载体配对序列。利用它们对大丽轮枝菌V08DF1的基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，得到VdGAP基因从启动子到终止子(不包含终止子)的序列，全长2234bp，然后将目的条带进行纯化。将纯化好的核酸片段，利用ClonExpressTM II重组反应体系(购于Vazyme生物技术公司)将该片段连接至用HindIII线性化的1300-Ble-GFP载体(经本实验室改造)上，获得VdGAP-GFP重组质粒。将该质粒转化大肠杆菌，经核酸测序正确后，采用热激法将敲除质粒导入农杆菌AGL-1中，由此即得到携带有VdGAP-GFP的AGL-1农杆菌菌株。
2.VdGAP-GFP重组突变体的获得
利用上一步骤中获得的VdGAP-GFP的AGL-1农杆菌菌株分别对野生型V08DF1菌株和ΔVdGAP敲除突变体进行转化，具体的转化步骤如下：大丽轮枝菌转接至液体PDA中，28℃，150rpm培养3天；含有T-DNA双元载体的农杆菌AGL-1挑取单克隆接至液体MM培养基当中(现配现用，1升超纯水中溶解：2.05g K2HPO4，1.45g KH2PO4，0.15g NaCl，0.5g MgSO4·7H2O，0.1g CaCl2·6H2O，0.0025g FeSO4·7H2O，0.5g(NH4)2SO4和2.0g glucose)，28℃，150rpm培养2天。之后将农杆菌用IM培养基(在90ml MM培养基中加入0.5ml甘油和0.7808gMES，pH值调至5.3-5.5，并用MM定容至100ml)稀释到OD600＝0.15，预培养6小时，然后与等体积的、浓度为1.0×105孢子/ml的大丽轮枝菌孢子液混合。将混合物取适量涂布于灭菌的、置于CM固体培养基(与IM培养基相似，但葡萄糖浓度为IM培养基的一半，另外还包含200μM乙酰丁香酮)上的硝酸纤维素膜(0.45μm孔径)上，于28℃共培养48小时。之后，硝酸纤维素膜被转移至PDA固体培养基上【200μM cefotaxime和25μg/ml Bleomycin】。相同条件培养5-7天后，可见小的转化子菌落，用接种针分别挑取其孢子进行培养，经过单孢分离后以终浓度25％甘油，-70℃保存。获得的每个转化子提取基因组DNA，设计引物PCR检测，上游引物设计在VdGAP内，序列为：5′GTCGACATCACCTTTGCC3′，下游引物设计在sGFP内，序列为：5′TTCTCGTTGGGGTCTTTG3′，经检测，转化子1、2、3、4、6、8为转化成功的VdGAP-GFP重组突变体(图3)。
3.VdGAP-GFP重组突变体的激光共聚焦观察
PDA培养VdGAP-GFP重组突变体，挑取孢子、菌丝、微菌核等不同生长时期，在激光共聚焦显微镜下观察VdGAP的亚细胞定位(图4)，发现VdGAP在孢子时期定位在细胞核中，在菌丝中定位在细胞质中，在微菌核形成初期也定位在细胞质中。

Claims (2)

1.大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的产微菌核相关基因VdGAP从启动子到终止密码子(不包含终止密码子)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求2所述的基因核苷酸序列构建VdGAP-GFP重组载体。
1)利用引物将权利要求1的2234bp的核苷酸序列扩增纯化，并连接至线性化的1300-ble-GFP载体上，获得VdGAP-GFP重组质粒。
2)经测序验证正确后，将该质粒导入农杆菌AGL-1中。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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