CN108096312A - 接骨木中总单倍木脂素的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种接骨木中总单倍木脂素的提取方法，包括：提供接骨木茎枝，将接骨木茎枝干燥处理后切碎，得到接骨木茎枝碎料；将接骨木茎枝碎料进行煎煮处理，获得煎煮液；将煎煮液进行减压浓缩处理，得到第一浓缩液；在第一浓缩液中加入乙醇形成混合液，使得混合液中乙醇的百分体积含量为68‑72％，静置12‑16小时后离心处理，收集上清液；将上清液进行减压浓缩，得到第二浓缩液；将第二浓缩液进行大孔树脂梯度洗脱，其中，大孔树脂采用HP20大孔树脂，用量为第二浓缩液质量的10‑12倍，洗脱方法为：依次用水、30％乙醇‑水、50％乙醇‑水及95％乙醇‑水洗脱，收集50％乙醇‑水洗脱馏分，减压蒸馏得到总单倍木脂素。

Description

接骨木中总单倍木脂素的提取方法

技术领域

本发明属于活性化合物提取分离技术领域，尤其涉及一种接骨木中总单倍木脂素的提取方法。

背景技术

骨质疏松是导致骨折风险增加的骨病。在骨质疏松中，骨矿物质密度(BMD)降低，骨微结构被破坏，并且骨中的非胶原蛋白的量和多样性改变。世界卫生组织将(女性中的)骨质疏松定义为比骨量峰值(30岁健康女性的平均值)低2.5个标准差的骨矿物质密度。目前，市场上治疗骨质疏松的药物五花八门，而主导的抗骨质疏松药物仍然是化学合成药。但化学合成药由于副作用多、远期疗效不肯定、价格昂贵、耐受性差、且有些药物不适用于老年人等，长期应用仍有争议。

中药治疗骨折及骨相关疾病已有两千多年的历史，早在《内经》中就有“腰痛”、“骨伤”、“痹证”、“痿证”等的相关记载。《素问·萎论》明确提出“肾气热，则腰脊不能举，骨枯而髓减，发为骨痿”。结合临床应用及现代药理、药效、分子生物学等研究手段，很多补肾壮骨中药(如淫羊藿、骨碎补、续断、蛇床子、补骨脂、杜仲、山茱萸等)已被证明在整体动物或细胞水平上有治疗骨质疏松的活性。但是中药抗骨质疏松药物给药剂量大、生产成本高。目前为止，只有贵州同济堂研发的复方中药仙灵骨葆收载入了国家基础药物目录，每年的销售额达4亿元。因此，从中药中研发治疗骨质疏松的药物，即具有深厚的历史研究背景，也有广阔的市场应用前景

接骨木为忍冬科植物接骨木(Sambucus williamsii Hance)的茎枝，别名续骨木、接骨草等，分布于东北、华北等地区，根及根皮、叶、花均供药用。作为民间常用中药，接骨木药用历史悠久，具有接骨续筋，活血止痛，祛风利湿的作用，主要用于治疗骨折、跌打损伤、风湿性关节炎、痛风、大骨节病等。据《本草新编》记载：“接骨木，入骨节，专续筋接骨”，“尤以接骨为奇”，此外，《唐本草》、《千金翼方》、《采药书》、《百草镜》、《品汇精要》等本草对接骨木也有相应的记载。

接骨木化学成分复杂，包括单倍木脂素类、倍半木脂素类，环烯醚萜类、三萜类、黄酮类、酚酸类、脂质类等多种成分，研究表明接骨木具有抗骨质疏松、促进骨折愈合、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗衰老、增强记忆等活性，而发挥抗骨质疏松作用的主要活性成分为单倍木脂素类化合物。文献对接骨木的提取分离有不少报道，但现有提取工艺要么针对黄酮或青花素进行提取分离，要么就接骨木的整体活性成分进行提取，其重点并不在于单倍木脂素类成分的提取。因此，如何提供一种能够有效提取接骨木中单倍木脂素类化合物的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种接骨木中总单倍木脂素的提取方法，旨在解决现有技术没有提供一种针对接骨木中的总单倍木脂素整体成分进行提取分离的问题。

本发明是这样实现的，一种接骨木中总单倍木脂素的提取方法，包括以下步骤：

提供接骨木茎枝，将所述接骨木茎枝干燥处理后切碎，得到接骨木茎枝碎料；

将所述接骨木茎枝碎料进行煎煮处理，获得煎煮液；将所述煎煮液进行减压浓缩处理，得到第一浓缩液；

在所述第一浓缩液中加入乙醇形成混合液，使得所述混合液中乙醇的百分体积含量为68-72％，静置12-16小时后离心处理，收集上清液；将所述上清液进行减压浓缩，得到第二浓缩液；

将所述第二浓缩液进行大孔树脂梯度洗脱，其中，大孔树脂采用HP20大孔树脂，用量为所述第二浓缩液质量的10-12倍，洗脱方法为：依次用水、30％乙醇-水、50％乙醇-水及95％乙醇-水洗脱，收集50％乙醇-水洗脱馏分，减压蒸馏得到总单倍木脂素。

本发明提供的接骨木中总单倍木脂素的提取方法，采用水提醇沉及大孔树脂梯度洗脱的方法来提取接骨木中的单倍木脂素，可以高效的摈除接骨木活性部位中无活性或活性较低的倍半木脂素、二倍木脂素、三萜类等成分，高效提取接骨木中的总单倍木脂素；且本发明提供的方法不需要使用精细的大型制备仪器，不仅可以减少原料的损耗，而且适合于工业大生产，降低了乙醇的使用量，有利于成本的控制。通过本发明方法提取得到的单倍木脂素提取物，所含成分种类单一，单倍木脂素含量高达62％，符合中药五类申报标准。此外，该部位干燥后为松散的颗粒状粉末，物理状态较好，易于制备药剂。

附图说明

图1是本发明实施例与对比例的馏分进行HPLC检测时，UV280nm下的对比图；

图2是本发明实施例与对比例的馏分进行HPLC检测时，ELSD对比图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种接骨木中总单倍木脂素的提取方法，包括以下步骤：

S01.提供接骨木茎枝，将所述接骨木茎枝干燥处理后切碎，得到接骨木茎枝碎料；

S02.将所述接骨木茎枝碎料进行煎煮处理，获得煎煮液；将所述煎煮液进行减压浓缩处理，得到第一浓缩液；

S03.在所述第一浓缩液中加入乙醇形成混合液，使得所述混合液中乙醇的百分体积含量为68-72％，静置12-16小时后离心处理，收集上清液；将所述上清液进行减压浓缩，得到第二浓缩液；

S04.将所述第二浓缩液进行大孔树脂梯度洗脱，其中，大孔树脂采用HP20大孔树脂，用量为所述第二浓缩液质量的10-12倍，洗脱方法为：依次用水、30％乙醇-水、50％乙醇-水及95％乙醇-水洗脱，收集50％乙醇-水洗脱馏分，减压蒸馏得到总单倍木脂素。

具体的，上述步骤S01中，所述接骨木茎枝，可以通过购买得到接骨木后，自行获取茎枝部分。不同产地的接骨木样品存在成分差异，本发明实施例优选采用东北地区产的接骨木作为原料，其单倍木脂素含量相对较高，当然，不限于此。

将所述接骨木茎枝进行干燥处理，所述干燥处理的方式没有明确的限制，可以自然晾干，也可以采用其他常规的温和干燥处理方法，如烘房中干燥。干燥完后将所述接骨木茎枝进行切碎处理，以利用后续水提过程中活性物质的充分高效浸出。

上述步骤S02中，有别于通常对接骨木进行的乙醇热回流提取，本发明实施例将所述接骨木茎枝碎料进行煎煮处理，充分提取出其单倍木脂素成分，当然，应当理解，不可避免地会将木脂素中的其他成分提取出来。所述煎煮处理，不仅可以避免乙醇热回流提供的高成本和易爆炸的安全隐患，还可以避免提取出接骨木中极性相对较小的三萜苷元类、多倍木脂素等成分，从而降低后续提取的难度，提高得到的总单倍木脂素的纯度。优选的，所述煎煮处理的方法为：将所述接骨木茎枝碎料浸于8-10倍体积的水中，90-100℃煎煮2-3小时，煎煮两次，合并煎煮液。该优选的煎煮处理，可以在将所述接骨木茎枝碎料中的单倍木脂素充分提取的前提下，减少其他难分离成分的浸出，降低后续提取的难度，更好地提高得到的总单倍木脂素的纯度。具体优选的，为了节约时间和溶剂，将所述接骨木茎枝碎料浸于8倍体积的水中，90-100℃煎煮2小时，煎煮两次，合并煎煮液。

将所述煎煮液进行减压浓缩处理得到第一浓缩液，优选的，所述第一浓缩液的相对密度为1.15-1.25。优选的相对密度的所述第一浓缩液，既能有效保证提取液不粘壁，避免造成浪费，又能保证适于后续醇提的含水量，以利于提高后续醇提效率。

上述步骤S03中，在所述第一浓缩液中加入乙醇形成混合液，进一步的，对混合液依次进行静置、离心处理，除去部分不溶于醇的杂质，提高提取液的纯度。其中，所述混合液中乙醇的百分体积含量为68-72％，在此条件下静置12-16小时，使得不溶于醇的物质(如淀粉、蛋白质、粘液质等)充分沉降，然后离心处理获得上清液。优选的，在所述第一浓缩液中加入乙醇形成混合液，使得所述混合液中乙醇的百分体积含量为70％。所述离心处理的方法为3800-4200rpm/min，离心30-35分钟，具体优选为所述离心处理的方法为4000rpm/min，离心30分钟。将上述得到的上清液进行减压浓缩，得到第二浓缩液。

上述步骤得到的上清液中，虽然淀粉、蛋白质、粘液质、无机盐等已经以沉淀的形式去除，但鞣质、色素、树脂等杂质仍然存在，此外，还含有大量的其他活性成分，如倍半木脂素、多倍木脂素、三萜类等。为了进一步富集单倍木脂素成分，本发明实施例采用大孔树脂进行梯度洗脱处理。

具体的，上述步骤S04中，选用HP20大孔树脂进行梯度洗脱。所述HP20大孔树脂适用于将所述第二浓缩液中的倍半木脂素、多倍木脂素、三萜类等杂质与单倍木脂素分离，降低单倍木脂素馏分中的其他成分含量，提高馏分纯度。此外，所述HP20大孔树脂吸附量高、颗粒均匀、机械强度好、不易破碎、残留物少、预处理方便、价格相对较低。进一步的，本发明实施例所述HP20大孔树脂用量为所述第二浓缩液质量的10-12倍。更进一步的，洗脱方法为：依次用水、30％乙醇-水、50％乙醇-水及95％乙醇-水洗脱，收集50％乙醇-水洗脱馏分，减压蒸馏得到总单倍木脂素。通过该洗脱方法，可以充分去除鞣质、色素、树脂，并去除大部分的倍半木脂素、多倍木脂素、三萜类，由此得到的50％乙醇-水洗脱馏分中，所含成分种类单一，单倍木脂素含量超过62％。

进一步的，可通过TLC和分析型HPLC结合，检测50％乙醇-水洗脱馏分中单倍木脂素的薄层和液相特征。

更进一步的，可对得到的总单倍木脂素进行干燥处理，干燥方式优选冷冻干燥，由此得到松散的颗粒状粉末。其具有较好的物理状态，易于制备药剂。

本发明实施例提供的接骨木中总单倍木脂素的提取方法，采用水提醇沉及大孔树脂梯度洗脱的方法来提取接骨木中的单倍木脂素，可以高效的摈除接骨木活性部位中无活性或活性较低的倍半木脂素、二倍木脂素、三萜类等成分，高效提取接骨木中的总单倍木脂素；且本发明实施例提供的方法不需要使用精细的大型制备仪器，不仅可以减少原料的损耗，而且适合于工业大生产，降低了乙醇的使用量，有利于成本的控制。通过本发明方法提取得到的单倍木脂素提取物，所含成分种类单一，单倍木脂素含量高达62％，符合中药五类申报标准。此外，该部位干燥后为松散的颗粒状粉末，物理状态较好，易于制备药剂。

下面结合一个具体优选实施例进行说明。

实施例1

一种接骨木中总单倍木脂素的提取方法，包括以下步骤：

S11.提供接骨木茎枝，将所述接骨木茎枝干燥处理后切碎，得到接骨木茎枝碎料；

S12.将所述接骨木茎枝碎料进行煎煮处理，获得煎煮液，其中，所述煎煮处理的方法为：将所述接骨木茎枝碎料浸于8倍体积的水中，90-100℃煎煮2小时，煎煮两次，合并煎煮液；将所述煎煮液进行减压浓缩处理，得到第一浓缩液，第一浓缩液的相对密度为1.15-1.25；

S13.在所述第一浓缩液中加入乙醇形成混合液，使得所述混合液中乙醇的百分体积含量为70％，静置12小时后4000rpm/min离心30分钟，收集上清液(SWH)；将所述上清液进行减压浓缩，得到第二浓缩液；

S14.将所述第二浓缩液进行大孔树脂梯度洗脱，其中，大孔树脂采用HP20大孔树脂，用量为所述第二浓缩液质量的10-12倍，洗脱方法为：依次用水、30％乙醇-水、50％乙醇-水及95％乙醇-水洗脱，收集50％乙醇-水洗脱馏分，减压蒸馏得到总单倍木脂素。

对比例

一种接骨木中总单倍木脂素的提取方法，包括以下步骤：

D11.提供接骨木茎枝，将所述接骨木茎枝干燥处理后切碎，得到接骨木茎枝碎料；

D12.将所述接骨木茎枝碎料采用60％乙醇水提取，减压浓缩提取液；

D13.将所述提取液进行大孔树脂梯度洗脱，其中，大孔树脂采用HP20大孔树脂，洗脱方法为：依次用50％甲醇-水、75％甲醇-水及甲醇洗脱，收集50％乙醇-水洗脱馏分(SWCA)，减压蒸馏。

将实施例1上清液(SWH)、水洗脱馏分(SWH-1)、30％乙醇-水洗脱馏分(SWH-2)、50％乙醇-水洗脱馏分(SWH-3)及95％乙醇-水洗脱馏分(SWH-4)、对比例50％甲醇-水洗脱馏分(SWCA)进行HPLC液相分析，分析条件如下：

(1)仪器：岛津LC-20；

(2)色谱柱：Cosmosil-5C18-MS-II(4.60×250mm，5μm)；

(3)检测波长：UV280nm；

(4)流速：0.8ml/min；

(5)洗脱流动相：B(乙腈，滴加体积百分含量为0.4％的醋酸)-A(水，滴加体积百分含量为0.4％的醋酸)；

(6)洗脱条件为：0min 15％B；20min 20％B；40min 26％B；60min 30％B；62min100％B)。

HPLC液相分析对比图如图1、2所示，其中，图1为UV280nm下的紫外吸收图；图2为ELSD图。由图可见，上清液(SWH)中的单倍木脂素成分富集在50％乙醇-水洗脱馏分(SWH-3)中，而本发明实施例50％乙醇-水洗脱馏分(SWH-3)中15-25min内色谱峰的数量和吸收强度明显高于对比例50％甲醇-水洗脱馏分(SWCA)，可见，本发明实施例方法对接骨木中总单倍木脂素的富集效果明显。

检测分析SWH-3和SWCA中的单倍木脂素的含量，结果显示，本发明实施例1接骨木中总单倍木脂素的提取方法得到的50％乙醇-水洗脱馏分(SWH-3)中，总单倍木脂素的含量为62.99％；而对比例1接骨木中总单倍木脂素的提取方法得到的50％甲醇-水洗脱馏分(SWCA)中，总单倍木脂素的含量低于50％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种接骨木中总单倍木脂素的提取方法，包括以下步骤：

提供接骨木茎枝，将所述接骨木茎枝干燥处理后切碎，得到接骨木茎枝碎料；

将所述接骨木茎枝碎料进行煎煮处理，获得煎煮液；将所述煎煮液进行减压浓缩处理，得到第一浓缩液；

在所述第一浓缩液中加入乙醇形成混合液，使得所述混合液中乙醇的百分体积含量为68-72％，静置12-16小时后离心处理，收集上清液；将所述上清液进行减压浓缩，得到第二浓缩液；

将所述第二浓缩液进行大孔树脂梯度洗脱，其中，大孔树脂采用HP20大孔树脂，用量为所述第二浓缩液质量的10-12倍，洗脱方法为：依次用水、30％乙醇-水、50％乙醇-水及95％乙醇-水洗脱，收集50％乙醇-水洗脱馏分，减压蒸馏得到总单倍木脂素。

2.如权利要求1所述的接骨木中总单倍木脂素的提取方法，其特征在于，所述煎煮处理的方法为：将所述接骨木茎枝碎料浸于8-10倍体积的水中，90-100℃煎煮2-3小时，煎煮两次，合并煎煮液。

3.如权利要求1所述的接骨木中总单倍木脂素的提取方法，其特征在于，所述第一浓缩液的相对密度为1.15-1.25。

4.如权利要求1所述的接骨木中总单倍木脂素的提取方法，其特征在于，在所述第一浓缩液中加入乙醇形成混合液，使得所述混合液中乙醇的百分体积含量为70％。

5.如权利要求1所述的接骨木中总单倍木脂素的提取方法，其特征在于，所述离心处理的方法为3800-4200rpm/min，离心30-35分钟。

6.如权利要求1所述的接骨木中总单倍木脂素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供接骨木茎枝，将所述接骨木茎枝干燥处理后切碎，得到接骨木茎枝碎料；

将所述接骨木茎枝碎料进行煎煮处理，获得煎煮液，其中，所述煎煮处理的方法为：将所述接骨木茎枝碎料浸于8倍体积的水中，90-100℃煎煮2小时，煎煮两次，合并煎煮液；

将所述煎煮液进行减压浓缩处理，得到第一浓缩液，第一浓缩液的相对密度为1.15-1.25；

在所述第一浓缩液中加入乙醇形成混合液，使得所述混合液中乙醇的百分体积含量为70％，静置12小时后4000rpm/min离心30分钟，收集上清液；

将所述上清液进行减压浓缩，得到第二浓缩液；

将所述第二浓缩液进行大孔树脂梯度洗脱，其中，大孔树脂采用HP20大孔树脂，用量为所述第二浓缩液质量的10-12倍，洗脱方法为：依次用水、30％乙醇-水、50％乙醇-水及95％乙醇-水洗脱，收集50％乙醇-水洗脱馏分，减压蒸馏得到总单倍木脂素。