CN108094207B - 湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法，包括(1)采集湿地松的球果，分离出未成熟合子胚；(2)诱导产生胚性愈伤组织；(3)胚性愈伤组织的增殖；(4)熟化培养获得具有萌发潜力的子叶胚；(5)萌发培养获得萌发苗和(6)炼苗及移植的步骤，所述诱导培养基为高浓度硝态氮的培养基，硝酸根离子的总浓度为13.8‑14.6mM；所述诱导培养基中的激素组分包括：2.5‑3μM 6‑苄氨基嘌呤、10.5‑11μM萘乙酸、2.5‑3μM激动素、18.7‑19.2μM脱落酸和0.8‑1.2μM芸苔素内酯。该方法具有较高的胚性愈伤组织的诱导率、体胚成熟率以及萌发率，并且移殖后的植株成活率高。

Description

湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法。
背景技术
湿地松(Pinus elliottii Engelmann)为松科，松属树种。乔木，原产于美国东南部暖热潮湿的低海拔地区，在原产地高达30米，胸径90厘米。上世纪三十年代引进至我国来，表现出适应性强、抗旱耐瘠薄、造林成活率高、松脂产量高、质量好，具有较高的经济价值的优点，经由不断改良和推广种植，目前湿地松种植面积达到200万hm2，分布于北纬18°30'～35°50'之间，是我国南方主要的松脂原料栽培树种之一。
改良湿地松是指2002年经广东省林木审定委员会审定的林木良种，而传统种子繁殖或其他无性繁殖方法，难以解决湿地松育种周期长、杂合度高、种子萌发率不高等难题，致使选育出优良的家系和无性系不能规模化产业化生产，阻碍了该良种推广和应用。体细胞胚胎发生(体胚)是体细胞在人工控制无菌、光照等培养条件下分化产生体细胞胚胎，重演合子胚形态发生的过程，其与传统的种子繁殖和其他无性繁殖技术相比，具有①遗传增益大；②繁殖效率高；③同步化水平极高等优点。
湿地松体胚发生和植株再生已有相关报道，但前人研究的湿地松胚诱导率、存活率、体胚成熟率及萌发率普遍较低，这极大地阻碍了该技术的产业化应用。因此，有必要研发一种能提高胚诱导率、存活率、体胚成熟率及萌发率的湿地松体胚发生和植株再生的方法。
发明内容
基于此，本发明提供了一种湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法。
具体技术方案如下：
一种湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法，包括以下步骤：
(1)采集湿地松的球果，剥出种子，将种子消毒后分离出包含未成熟合子胚和胚乳的外植体；
(2)诱导：将所述外植体转移到装有诱导培养基的培养器皿中进行诱导培养，获得胚性愈伤组织；
(3)增殖：将步骤(2)所获得的胚性愈伤组织转移到装有增殖培养基的培养器皿中进行增殖培养，获得增殖胚；
(4)熟化：将步骤(3)所获得的增殖胚转移到装有熟化培养基的培养器皿中进行熟化培养，获得具有萌发潜力的子叶胚；
(5)萌发：将步骤(4)所获得的具有萌发潜力的子叶胚接种到装有萌发培养基的培养器皿中进行萌发培养，获得萌发苗；
(6)炼苗：将步骤(5)获得的萌发苗进行炼苗，移植后即得再生植株；
所述诱导培养基为高浓度硝态氮的培养基，硝酸根离子的总浓度为13.8-14.6mM；所述诱导培养基中的激素组分包括：2.5-3μM的6-苄氨基嘌呤、10.5-11μM的萘乙酸、2.5-3μM的激动素、18.7-19.2μM的脱落酸和0.8-1.2μM的芸苔素内酯。
在其中一些实施例中，所述诱导培养基中的硝态氮组分包括：1-1.4mM的硝酸铵、8.8-9.2mM的硝酸钾、0.9-1.1mM的四水硝酸钙和0.9-1.1mM的六水合硝酸镁。
在其中一些实施例中，所述诱导培养基包括以下组分：1-1.4mM的硝酸铵、8.8-9.2mM的硝酸钾、0.9-1.1mM的四水硝酸钙、0.9-1.1mM的六水合硝酸镁、0.9-1.1mM的磷酸二氢钾、0.9-1.1mM的七水合硫酸镁、0.4-0.6mM的六水合氯化镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、2.6-3mM的肌醇、24.8-25.2μM的碘化钾、250.4-251.2μM的硼酸、61.8-62.3μM的一水合硫酸锰、50.8-51.3μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.6-0.8μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、50.5-51.5μM的七水合硫酸亚铁、49.8-50.3μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、2.5-3μM的6-苄氨基嘌呤、10.5-11μM的萘乙酸、2.5-3μM的激动素、18.7-19.2μM的脱落酸和0.8-1.2μM的芸苔素内酯、0.48-0.52g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶。
在其中一些实施例中，所述增殖培养基包括以下组分：3.4-3.8mM的硝酸铵、8.8-9.2mM的硝酸钾、0.9-1.1mM的四水硝酸钙、0.9-1.1mM的六水合硝酸镁、0.9-1.1mM的磷酸二氢钾、0.9-1.1mM的七水合硫酸镁、0.1-0.3mM的六水合氯化镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、2.6-3mM的肌醇、24.8-25.2μM的碘化钾、250.4-251.2μM的硼酸、61.8-62.3μM的一水合硫酸锰、49.8-50.3μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.4-0.58μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、50.5-51.5μM的七水合硫酸亚铁、49.8-50.3μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、4.2-4.6μM的6-苄氨基嘌呤、18.7-19.2μM的脱落酸、1.8-2.2g/L的水解酪蛋白。
在其中一些实施例中，所述熟化培养基包括以下组分：1-1.4mM的硝酸铵、4.3-4.7mM的硝酸钾、0.2-0.4mM的四水硝酸钙、0.9-1.1mM的六水合硝酸镁、0.9-1.1mM的磷酸二氢钾、0.9-1.1mM的七水合硫酸镁、0.4-0.6mM的六水合氯化镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、55-56mM的D-(+)-一水合麦芽糖、0.5-0.7mM的肌醇、24.8-25.2μM的碘化钾、125-125.8μM的硼酸、61.8-62.3μM的一水合硫酸锰、50.8-51.3μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.4-0.58μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、149-151μM的七水合硫酸亚铁、150-150.6μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、5.8-6.2μM的脱落酸、1.8-2.2g/L的水解酪蛋白、2.8-3.2g/L的植物凝胶。
在其中一些实施例中，所述萌发培养基包括以下组分：1-1.4mM的硝酸铵、11.4-11.8mM的硝酸钾、0.6-0.8mM的六水合硝酸镁、0.5-0.7mM的磷酸二氢钾、0.8-0.88mM的七水合硫酸镁、58-59mM的蔗糖、0.5-0.7mM的肌醇、207.8-208.6mM的活性炭、2.4-2.6μM的碘化钾、50-50.4μM的硼酸、49.8-50.2μM的一水合硫酸锰、14.8-15.2μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.8-1.2μM的五水硫酸酮、0.08-0.12μM的六水合氯化钴、50.5-51.5μM的七水合硫酸亚铁、49.8-50.3μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、1.8-2.2g/L的水解酪蛋白、2.8-3.2g/L的植物凝胶。
在其中一些实施例中，所述采集湿地松的球果的时间为6月25日-7月1日。
在其中一些实施例中，所述诱导培养的条件包括：培养温度为24±1℃、暗条件下诱导培养20～48天。
在其中一些实施例中，所述增殖的步骤包括：
a、在培养器皿中第一次加入所述增殖培养基，再接种步骤(2)获得接种胚性愈伤组织，以110-130rpm的转速震荡所述培养器皿6-8天，再以280-320的转速震荡所述培养器皿使所述胚性愈伤组织分散；所述第一次加入的所述增殖培养基与接种的胚性愈伤组织的配比为8-10mL:1g；
b、再在所述培养器皿中第二次加入所述增殖培养基，再以110-130rpm的转速震荡6-8天；所述第二次加入的所述增殖培养基与接种的胚性愈伤组织的配比为9-11mL:1g；
c、将所述培养器皿中的所有物料均转入离心管中，静置，移除培养基，记录剩下的胚性愈伤组织的细胞体积，按所述胚性愈伤组织的细胞体积的8-10倍再次加入所述增殖培养基，以90-100rpm转速震荡所述离心管6-8天，静置，再次移除培养基；
d、重复所述步骤c，即获得大量增殖胚。
在其中一些实施例中，所述熟化的步骤包括：
将所述熟化培养基，倒入培养器皿中，在所述熟化培养基中央放置灭菌过的滤纸；按照所述熟化培养基的配方，减去其中的植物凝胶和脱落酸，配制悬浮液中间液；将步骤(3)所获得的胚按1g：98-102mL的比例悬浮于所述悬浮液中间液中，震荡得熟化悬浮液，取所述熟化悬浮液在所述滤纸上铺开，进行熟化培养，即可获得具有萌发潜力的子叶胚；所述熟化培养的条件包括暗培养2.5-4个月，每4周转移一次。
在其中一些实施例中，所述萌发培养的条件包括：先暗培养6-8天，再进行光培养15-17小时，光培养的光强为6-8μmolphotons/m2/s。
在其中一些实施例中，所述炼苗的步骤包括：将步骤(5)获得的萌发苗转移到植物培养箱中炼苗55-65天，再将生长稳定后的苗木转移至轻基质中进行炼苗，再进行移植；
所述植物培养箱中炼苗的条件包括：温度为23-27℃，湿度为75-85％，每天光照时间为15-17小时，光强为38-42μmolphotons/m2/s；
所述轻基质为质量比为2.5-3.5:1的泥炭和珍珠岩的混合物；所述在轻基质中进行炼苗的条件包括：温度为23-27℃，湿度为75-85％，每天光照时间为15-17小时，光强为38-42μmolphotons/m2/s，炼苗时间为6-8天。
本发明还提供了用于湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的培养基。
具体技术方案如下：
用于湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的培养基，所述培养基包括诱导培养基，所述诱导培养基包括以下组分：1-1.4mM的硝酸铵、8.8-9.2mM的硝酸钾、0.9-1.1mM的四水硝酸钙、0.9-1.1mM的六水合硝酸镁、0.9-1.1mM的磷酸二氢钾、0.9-1.1mM的七水合硫酸镁、0.4-0.6mM的六水合氯化镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、2.6-3mM的肌醇、24.8-25.2μM的碘化钾、250.4-251.2μM的硼酸、61.8-62.3μM的一水合硫酸锰、50.8-51.3μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.6-0.8μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、50.5-51.5μM的七水合硫酸亚铁、49.8-50.3μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、2.5-3μM的6-苄氨基嘌呤、10.5-11μM的萘乙酸、2.5-3μM的激动素、18.7-19.2μM的脱落酸和0.8-1.2μM的芸苔素内酯、0.48-0.52g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶；及/或，
所述培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基包括以下组分：3.4-3.8mM的硝酸铵、8.8-9.2mM的硝酸钾、0.9-1.1mM的四水硝酸钙、0.9-1.1mM的六水合硝酸镁、0.9-1.1mM的磷酸二氢钾、0.9-1.1mM的七水合硫酸镁、0.1-0.3mM的六水合氯化镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、2.6-3mM的肌醇、24.8-25.2μM的碘化钾、250.4-251.2μM的硼酸、61.8-62.3μM的一水合硫酸锰、49.8-50.3μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.4-0.58μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、50.5-51.5μM的七水合硫酸亚铁、49.8-50.3μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、4.2-4.6μM的6-苄氨基嘌呤、18.7-19.2μM的脱落酸、1.8-2.2g/L的水解酪蛋白；及/或，
所述培养基包括熟化培养基，所述熟化培养基包括以下组分：1-1.4mM的硝酸铵、4.3-4.7mM的硝酸钾、0.2-0.4mM的四水硝酸钙、0.9-1.1mM的六水合硝酸镁、0.9-1.1mM的磷酸二氢钾、0.9-1.1mM的七水合硫酸镁、0.4-0.6mM的六水合氯化镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、55-56mM的D-(+)-一水合麦芽糖、0.5-0.7mM的肌醇、24.8-25.2μM的碘化钾、125-125.8μM的硼酸、61.8-62.3μM的一水合硫酸锰、50.8-51.3μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.4-0.58μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、149-151μM的七水合硫酸亚铁、150-150.6μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、5.8-6.2μM的脱落酸、1.8-2.2g/L的水解酪蛋白、2.8-3.2g/L的植物凝胶；及/或，
所述培养基包括萌发培养基，所述萌发培养基包括以下组分：1-1.4mM的硝酸铵、11.4-11.8mM的硝酸钾、0.6-0.8mM的六水合硝酸镁、0.5-0.7mM的磷酸二氢钾、0.8-0.88mM的七水合硫酸镁、58-59mM的蔗糖、0.5-0.7mM的肌醇、207.8-208.6mM的活性炭、2.4-2.6μM的碘化钾、50-50.4μM的硼酸、49.8-50.2μM的一水合硫酸锰、14.8-15.2μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.8-1.2μM的五水硫酸酮、0.08-0.12μM的六水合氯化钴、50.5-51.5μM的七水合硫酸亚铁、49.8-50.3μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、1.8-2.2g/L的水解酪蛋白、2.8-3.2g/L的植物凝胶。
本发明的湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法具有以下优点和有益效果：
现有的松柏类植物体细胞胚诱导的基本培养基的一个共性是，其大量元素中的NO3 -以及NH4 +的总量较低，并且本领域普遍认为只有明显降低NO3 —及NH4 +的含量时，才能促进体细胞胚的发育和诱导产生分化芽。而本发明的发明人经过大量创造性实验，意外的发现提高诱导培养基中硝态氮的浓度并且配合特定种类和用量的激素有利于湿地松的体细胞胚胎发生，能够明显提高胚性愈伤组织的诱导率，进而有利于后续步骤中胚性愈伤组织的增殖与熟化等。从而使本发明的湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法具有较高的胚性愈伤组织的诱导率、体胚成熟率以及萌发率，并且移殖后的植株成活率高。
本发明的发明人还发现前人研究湿地松体胚发生的方法时，所用到的增殖培养基多为原诱导培养基，不考虑胚性愈伤组织在增殖阶段所需大量元素、微量元素及生长调节剂的特异性，这样会使愈伤组织的胚性能力受到影响，不利于愈伤组织的增殖、熟化及萌发。本发明的发明人进一步针对增殖、熟化及萌发步骤中愈伤组织增殖生长的特性以及对营养素的特异性需要，对增殖、熟化及萌发培养基都进行了进一步的优化，同时优化了各步骤的具体操作和条件，进一步提高了体胚成熟率、萌发率以入移殖后的植株成活率。
附图说明
图1为湿地松自由授粉家系球果种子的胚成熟情况；图中标记：1为未成熟合子胚前期，不适宜于接种诱导；2、3、4为较为理想的未成熟合子胚；5为合子胚近成熟期；6、7为成熟的合子胚。
图2为湿地松未成熟体细胞接种及胚性愈伤组织的产生；图中标记：8为包含未成熟合子胚及胚乳的外植体接种于培养基；9为诱导成功的外植体。
图3为湿地松的胚性及非胚性愈伤组织；图中标记：10为胚性愈伤组织；11为非胚性愈伤组织；12为EMS结构；13为非EMS结构。
图4为湿地松的体胚熟化过程图；图中标记：14为体胚熟化的起始阶段；15为体胚熟化阶段的生长；16、17为熟化产生子叶张开的胚。
图5为湿地松体胚的萌发植株的产生及炼苗过程；图中标记：18为体胚萌发苗在培养基上大量产生；19为萌发苗的炼苗；20为萌发苗转移至轻基质炼苗生长。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：湿地松球果种子的胚成熟情况观察
以广东省台山市红岭种子园生长良好，健康，无虫害的6棵改良湿地松为取材资源，其中3棵EE1，3棵EE2，分别于2016年6月16日，6月23日，26日，30日及7月7日，采集球果，每次每棵树采集3～9个球果，将当天采集的球果在冰盒中低温保存带回实验室，之后放在4℃的冰箱里冷藏，用于胚成熟度观测，步骤如下：
(1)剥球果，分离出包含合子胚及胚乳的外植体：将采集的球果对半切开后，逆种鳞拨开，把种子挑出来，剥离除去外种皮，得到所述外植体。
(2)将步骤(1)中得到的外植体移至显微镜下，剥离胚乳，在20×倍数下观察胚的形态，如图1所示，1为未成熟胚前期，不适宜于接种诱导；2、3、4为较为理想的未成熟合子胚；5为合子胚近成熟；6、7为成熟的合子胚。
观测结果显示不同家系的湿地松胚成熟情况有所差异，如表1，EE1，EE2的球果最佳采集时间分别为：6月30日，6月26日。
表1不同家系的湿地松胚成熟情况
Figure BDA0001525974710000081
备注：表中“┅”表示EE1家系，“━”表示EE2家系。
实施例2：湿地松的未成熟合子胚的体胚发生和植株再生
本实施例中所用培养基的配方如表2所示，其中配方1为诱导培养基，配方2为增殖培养基，配方3为熟化培养基，配方4为萌发培养基。
表2各培养基配方组分
Figure BDA0001525974710000082
Figure BDA0001525974710000091
注：表中“—”表示未添加该组分，按上述表2中的配方组分添加完后，配方1中还加入水解酪蛋白(Casein Hydrolysate)0.5g/L，植物凝胶(Phytagel)2g/L；配方2,3,4各加入CaseinHydrolysate 2g/L；,配方3，4加入Phytagel 3g/L；用1M的HCl或NaOH调整培养基的pH值到5.70-5.80之间。
(1)球果采集
根据实施例1确定的球果的最佳采集时间，大量采集球果。
(2)剥球果及种子消毒
剥球果：按照实施例1中剥球果的方法，把剥出来的种子转移至灭菌过的空瓶内。
种子消毒：将无菌水，大烧杯，75wt％的乙醇水溶液，0.1wt％的氯化汞水溶液，纱布(无菌，在瓶子里)拿进超净工作台，所有物品拿进工作台前都需喷酒精消毒。以下任何操作任何物品都不能彼此接触：首先，往所述装有球果种子的瓶中倒入75wt％的乙醇水溶液，约半瓶左右，摇晃45秒，用纱布过滤，纱布不与烧杯接触；过滤后得到的种子再用无菌水洗5遍，每遍2分钟，并不停摇晃；再倒入0.1wt％的氯化汞水溶液，摇晃15～20分钟；再用无菌水洗5遍，每遍2分钟，并不停摇晃。
(3)剥种皮及诱导接种
将步骤(2)得到的消毒后的种子每次取10粒到灭菌的碟子上，剥离外种皮后，得到类似米粒状的外植体(有些是半透明的，有些是乳白色的)，及时转移到装有诱导培养基(配方如1中的配方1所示)的诱导培养皿内进行诱导培养。贴标签，记录家系号，球果采摘时间，诱导时间，控制诱导培养的温度为24±1℃、暗条件下进行诱导培养，诱导培养28天后开始生成愈伤组织，继续培养14天获得大量愈伤组织，如图2。
(4)愈伤组织的鉴别
对步骤(3)中得到的愈伤组织进行胚性与非胚性鉴别，如图3中的10、11所示；胚性愈伤组织在显微镜下能观测到愈伤组织内有排列紧密的细胞团和长条形细胞组成的胚性胚柄团(ESM)结构，如图3中的12所示，非胚性愈伤组织则无EMS结构，如图3中的13所示。胚性愈伤组织能不断增殖，具有胚胎发生潜力，是研究建立体细胞胚胎发生体系的关键；非胚性愈伤组织也能不断增殖，但无胚胎发生潜力。本实例中，步骤(3)诱导产生愈伤组织的比例为71.4％(计算方法：产生愈伤组织的外植体数量/接种外植体总数量)，通过鉴别，其中胚性愈伤组织的占比为31.4％(计算方法：具有ESM结构的胚性愈伤组织的外植体数量/产生愈伤组织的外植体数量)，步骤(3)的诱导率为22.4％(计算方法：产生胚性愈伤组织的外植体数量/接种外植体总数量)。
(5)愈伤组织的增殖培养
配置液体增殖培养基(按照表1中的配方2)，加入所述液体增殖培养基9mL于250mL锥形瓶中，所述锥形瓶用铝箔纸包裹，将在步骤(3)中生成的胚性愈伤组织，取1g转移到所述锥形瓶内，以120rpm的转速轻柔震荡所述锥形瓶7天，所述轻柔震荡完成后，以300rpm的转速剧烈震荡锥形瓶，使胚性愈伤组织分散，再加入10ml增殖液体培养基，再以120rpm的转速轻柔震荡7天。将所述锥形瓶内所有细胞组织及培养基转入50mL离心管中，静置20min；移除掉培养基，记录剩下的胚性愈伤组织的细胞体积；按每1mL所述剩下的胚性愈伤组织的细胞体积加9mL增殖液体培养基，以95rpm的转速轻柔震荡，静置20min，再次移除培养基；再按上述条件重复上述“加入增殖液体培养基，轻柔震荡，静置，再次移除培养基”的步骤，胚性愈伤组织的细胞体积每次会增加2-6倍，从而收获大量增殖胚。
(6)熟化
配制固体熟化培养基(按表1中的配方3)，每个培养皿倒20mL固体熟化培养基(10cm直径，1.5cm高培养皿)，在所述固体熟化培养基中央放置灭菌过的滤纸；配制液体的悬浮液中间液(按表1中的配方3，不加植物凝胶与ABA)；取步骤(5)液体增殖得到的增殖胚1g悬浮于所述液体的悬浮液中间液100mL中，剧烈震荡以形成良好的悬浮体系，为熟化悬浮液，取1mL所述熟化悬浮液，于所述固体熟化培养基中央的滤纸上铺开(如图4中的14所示)进行暗培养，温度为24±1℃；继代时，滤纸与组织一起转移到新的固体熟化培养基中央的滤纸上(如图4中的15所示)，每4周转移一次，暗培养3个月，可得到具有萌发潜力的子叶胚(如图4中的16，17所示)。继续培养3个月，可产生76.5个子叶胚/g增殖胚。
(7)萌发
配置萌发培养基(按表1中的配方4)，例入萌发培养皿中，将在步骤(6)熟化培养3个月后形态正常的具有萌发潜力的子叶胚(如图4中的17所示)接种至萌发培养皿中，每个萌发培养皿水平放置10个胚，暗培养7天，再转移到光照下(7μmolphotons/m2/s(518LUX)光强)培养16h。胚的根与地上部均出现时，即为萌发，获得萌发苗(如图5中的18所示)，在本实施例的实验条件下，具有萌发潜力的子叶胚均能萌发，萌发率100％。
(8)炼苗及移植
再将所述萌发苗转移至植物培养箱炼苗(如图5中的19所示)，条件为：25℃，湿度为80％，40μmolphotons/m2/s，16h光周期。萌发苗在植物培养箱中炼苗2个月，生长稳定后，转移至轻基质继续炼苗7天(如图5中的20所示)，所述轻基质为泥炭：珍珠岩(质量比3:1)的混合物，用KMnO4消毒，条件为：25℃，湿度为80％，40μmolphotons/m2/s，每天16h光周期。7天后将湿度降至自然环境湿度，再转移至黄心土盆栽即可得到再生植株。两周后，统计再生植株的存活率，为66.7％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集湿地松的球果，剥出种子，将种子消毒后分离出包含未成熟合子胚和胚乳的外植体；
(2)诱导：将所述外植体转移到装有诱导培养基的培养器皿中进行诱导培养，获得胚性愈伤组织；
(3)增殖：将步骤(2)所获得的胚性愈伤组织转移到装有增殖培养基的培养器皿中进行增殖培养，获得增殖胚；
(4)熟化：将步骤(3)所获得的增殖胚转移到装有熟化培养基的培养器皿中进行熟化培养，获得具有萌发潜力的子叶胚；
(5)萌发：将步骤(4)所获得的具有萌发潜力的子叶胚接种到装有萌发培养基的培养器皿中进行萌发培养，获得萌发苗；
(6)炼苗：将步骤(5)获得的萌发苗进行炼苗，移植后即得再生植株；
所述诱导培养基为高浓度硝态氮的培养基，硝酸根离子的总浓度为13.8-14.6mM；所述诱导培养基包括以下组分：1-1.4mM的硝酸铵、8.8-9.2mM的硝酸钾、0.9-1.1mM的四水硝酸钙、0.9-1.1mM的六水合硝酸镁、0.9-1.1mM的磷酸二氢钾、0.9-1.1mM的七水合硫酸镁、0.4-0.6mM的六水合氯化镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、2.6-3mM的肌醇、24.8-25.2μM的碘化钾、250.4-251.2μM的硼酸、61.8-62.3μM的一水合硫酸锰、50.8-51.3μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.6-0.8μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、50.5-51.5μM的七水合硫酸亚铁、49.8-50.3μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、2.5-3μM的6-苄氨基嘌呤、10.5-11μM的萘乙酸、2.5-3μM的激动素、18.7-19.2μM的脱落酸和0.8-1.2μM的芸苔素内酯、0.48-0.52g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶；
所述增殖培养基包括以下组分：3.4-3.8mM的硝酸铵、8.8-9.2mM的硝酸钾、0.9-1.1mM的四水硝酸钙、0.9-1.1mM的六水合硝酸镁、0.9-1.1mM的磷酸二氢钾、0.9-1.1mM的七水合硫酸镁、0.1-0.3mM的六水合氯化镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、2.6-3mM的肌醇、24.8-25.2μM的碘化钾、250.4-251.2μM的硼酸、61.8-62.3μM的一水合硫酸锰、49.8-50.3μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.4-0.58μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、50.5-51.5μM的七水合硫酸亚铁、49.8-50.3μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、4.2-4.6μM的6-苄氨基嘌呤、18.7-19.2μM的脱落酸、1.8-2.2g/L的水解酪蛋白；
所述熟化培养基包括以下组分：1-1.4mM的硝酸铵、4.3-4.7mM的硝酸钾、0.2-0.4mM的四水硝酸钙、0.9-1.1mM的六水合硝酸镁、0.9-1.1mM的磷酸二氢钾、0.9-1.1mM的七水合硫酸镁、0.4-0.6mM的六水合氯化镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、55-56mM的D-(+)-一水合麦芽糖、0.5-0.7mM的肌醇、24.8-25.2μM的碘化钾、125-125.8μM的硼酸、61.8-62.3μM的一水合硫酸锰、50.8-51.3μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.4-0.58μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、149-151μM的七水合硫酸亚铁、150-150.6μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、5.8-6.2μM脱落酸、1.8-2.2g/L的水解酪蛋白、2.8-3.2g/L的植物凝胶；
所述萌发培养基包括以下组分：1-1.4mM的硝酸铵、11.4-11.8mM的硝酸钾、0.6-0.8mM的六水合硝酸镁、0.5-0.7mM的磷酸二氢钾、0.8-0.88mM的七水合硫酸镁、58-59mM的蔗糖、0.5-0.7mM的肌醇、207.8-208.6mM的活性炭、2.4-2.6μM的碘化钾、50-50.4μM的硼酸、49.8-50.2μM的一水合硫酸锰、14.8-15.2μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.8-1.2μM的五水硫酸酮、0.08-0.12μM的六水合氯化钴、50.5-51.5μM的七水合硫酸亚铁、
49.8-50.3μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、1.8-2.2g/L的水解酪蛋白、2.8-3.2g/L的植物凝胶。
2.根据权利要求1所述的湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于，所述采集湿地松的球果的时间为6月25日-7月1日。
3.根据权利要求1所述的湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于，所述诱导培养的条件包括：培养温度为24±1℃、暗条件下诱导培养20～48天。
4.根据权利要求1所述的湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于，所述增殖的步骤包括：
a、在培养器皿中第一次加入所述增殖培养基，再接种步骤(2)获得的胚性愈伤组织，以110-130rpm的转速震荡所述培养器皿6-8天，再以280-320rpm的转速震荡所述培养器皿使所述胚性愈伤组织分散；所述第一次加入的所述增殖培养基与接种的胚性愈伤组织的配比为8-10mL:1g；
b、再在所述培养器皿中第二次加入所述增殖培养基，再以110-130rpm的转速震荡6-8天；所述第二次加入的所述增殖培养基与接种的胚性愈伤组织的配比为9-11mL:1g；
c、将所述培养器皿中的所有物料均转入离心管中，静置，移除培养基，记录剩下的胚性愈伤组织的细胞体积，按所述胚性愈伤组织的细胞体积的8-10倍再次加入所述增殖培养基，以90-100rpm转速震荡所述离心管6-8天，静置，再次移除培养基；
d、重复所述步骤c，即获得大量增殖胚。
5.根据权利要求1所述的湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于，所述熟化的步骤包括：
将所述熟化培养基，倒入培养器皿中，在所述熟化培养基中央放置灭菌过的滤纸；按照所述熟化培养基的配方，减去其中的植物凝胶和脱落酸，配制悬浮液中间液；将步骤(3)所获得的胚按1g：98-102mL的比例悬浮于所述悬浮液中间液中，震荡得熟化悬浮液，取所述熟化悬浮液在所述滤纸上铺开，进行熟化培养，即可获得具有萌发潜力的子叶胚；所述熟化培养的条件包括暗培养2.5-4个月，每4周转移一次。
6.根据权利要求1所述的湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于，所述萌发培养的条件包括：先暗培养6-8天，再进行光培养15-17小时，光培养的光强为6-8μmolphotons/m2/s。
7.根据权利要求1所述的湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于，所述炼苗的步骤包括：将步骤(5)获得的萌发苗转移到植物培养箱中炼苗55-65天，再将生长稳定后的苗木转移至轻基质中进行炼苗，再进行移植；
所述植物培养箱中炼苗的条件包括：温度为23-27℃，湿度为75-85％，每天光照时间为15-17小时，光强为38-42μmol photons/m2/s；
所述轻基质为质量比为2.5-3.5:1的泥炭和珍珠岩的混合物；所述在轻基质中进行炼苗的条件包括：温度为23-27℃，湿度为75-85％，每天光照时间为15-17小时，光强为38-42μmol photons/m2/s，炼苗时间为6-8天。
8.用于湿地松体细胞胚胎发生和植株再生的培养基，其特征在于，所述培养基包括诱导培养基，所述诱导培养基包括以下组分：1-1.4mM的硝酸铵、8.8-9.2mM的硝酸钾、0.9-1.1mM的四水硝酸钙、0.9-1.1mM的六水合硝酸镁、0.9-1.1mM的磷酸二氢钾、0.9-1.1mM的七水合硫酸镁、0.4-0.6mM的六水合氯化镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、2.6-3mM的肌醇、24.8-25.2μM的碘化钾、250.4-251.2μM的硼酸、61.8-62.3μM的一水合硫酸锰、50.8-51.3μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.6-0.8μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、50.5-51.5μM的七水合硫酸亚铁、49.8-50.3μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、2.5-3μM的6-苄氨基嘌呤、10.5-11μM的萘乙酸、2.5-3μM的激动素、18.7-19.2μM的脱落酸和0.8-1.2μM的芸苔素内酯、0.48-0.52g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶；
所述培养基包括增殖培养基，所述增殖培养基包括以下组分：3.4-3.8mM的硝酸铵、8.8-9.2mM的硝酸钾、0.9-1.1mM的四水硝酸钙、0.9-1.1mM的六水合硝酸镁、0.9-1.1mM的磷酸二氢钾、0.9-1.1mM的七水合硫酸镁、0.1-0.3mM的六水合氯化镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、2.6-3mM的肌醇、24.8-25.2μM的碘化钾、250.4-251.2μM的硼酸、61.8-62.3μM的一水合硫酸锰、49.8-50.3μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.4-0.58μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、50.5-51.5μM的七水合硫酸亚铁、49.8-50.3μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、4.2-4.6μM的6-苄氨基嘌呤、18.7-19.2μM的脱落酸、1.8-2.2g/L的水解酪蛋白；
所述培养基包括熟化培养基，所述熟化培养基包括以下组分：1-1.4mM的硝酸铵、4.3-4.7mM的硝酸钾、0.2-0.4mM的四水硝酸钙、0.9-1.1mM的六水合硝酸镁、0.9-1.1mM的磷酸二氢钾、0.9-1.1mM的七水合硫酸镁、0.4-0.6mM的六水合氯化镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、55-56mM的D-(+)-一水合麦芽糖、0.5-0.7mM的肌醇、24.8-25.2μM的碘化钾、125-125.8μM的硼酸、61.8-62.3μM的一水合硫酸锰、50.8-51.3μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.4-0.58μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、149-151μM的七水合硫酸亚铁、150-150.6μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、5.8-6.2μM的脱落酸、1.8-2.2g/L的水解酪蛋白、2.8-3.2g/L的植物凝胶；
所述培养基包括萌发培养基，所述萌发培养基包括以下组分：1-1.4mM的硝酸铵、11.4-11.8mM的硝酸钾、0.6-0.8mM的六水合硝酸镁、0.5-0.7mM的磷酸二氢钾、0.8-0.88mM的七水合硫酸镁、58-59mM的蔗糖、0.5-0.7mM的肌醇、207.8-208.6mM的活性炭、2.4-2.6μM的碘化钾、50-50.4μM的硼酸、49.8-50.2μM的一水合硫酸锰、14.8-15.2μM的七水合硫酸锌、0.4-0.6μM的二水合钼酸钠、0.8-1.2μM的五水硫酸酮、0.08-0.12μM的六水合氯化钴、50.5-51.5μM的七水合硫酸亚铁、49.8-50.3μM的EDTA-二钠、3-3.6μM的盐酸硫胺素、2.2-2.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、26.4-27μM的甘氨酸、1.8-2.2g/L的水解酪蛋白、2.8-3.2g/L的植物凝胶。
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