CN108084089B - 一种防治白色念珠菌的2-烷基胺喹啉类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种防治白色念珠菌的2‑烷基胺喹啉类化合物及其制备方法与应用，由化合物A（1,2,3,4‑Tetrahydroquinolines）和化合物B(O–benzoyl hydroxylamines)为原料合成而来，本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：本申请发明人之前的研究已经鉴定出可扩散的信号因子（DSF）群体感应信号及其衍生物可以较强的干扰白色念珠菌酵母态‑菌丝态的转变，本次研究也成功合成并筛选出具有抑制白色念珠菌粘附性、菌丝形态转换和致病性的化合物。同时，这些化合物本身毒性较小，不影响白色念珠菌及人类细胞的生长，这些特点有望促进新型抗真菌药物治疗的发展。

Description

一种防治白色念珠菌的2-烷基胺喹啉类化合物及其制备方法 与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种防治白色念珠菌的2-烷基胺喹啉类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

白色念珠菌(Candida albicans)，也称为白色念球菌、白假丝酵母菌，是一种条件致病菌，广泛存在于大自然以及人体的口腔、呼吸道、消化道、阴道粘膜中。在正常的情况下，白色念珠菌一般不会引起病害，然而在宿主免疫力低下时，可引起体表甚至内部组织器官的深度感染，通常难以治愈。资料显示，在免疫缺陷病人中，白色念珠菌感染致死率达40％-70％。

已有的研究表明，白色念珠菌的致病与它的酵母‐菌丝二相转变有关。首先，游离的酵母态粘附在宿主细胞上，此时白色念珠菌不显示毒性；随后，附着的酵母态逐渐形成菌丝，促进对宿主组织的侵染，进而产生生物膜。而生物膜是白色念珠菌致病的重要原因。因此，白色念珠菌形态的转变是致病的关键一步。

基于此，从白色念珠菌特有的酵母‐菌丝二相性入手，研发出一种具有针对性的、高效、低毒、不易产生耐药性的新型化合物，具有重要的科学意义和应用前景。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明提供了一种防治白色念珠菌的2- 烷基胺喹啉类化合物。

为达到上述目的，本发明方法采取的反应机理为：

一种防治白色念珠菌的2-烷基胺喹啉类化合物，由1,2,3,4-四氢喹啉和O-苯甲酰基羟胺反应生成，该化合物的化学结构式为：

其中，R为H或CH₃。

本发明的另一目的在于提供上述防治白色念珠菌的2-烷基胺喹啉类化合物的制备方法，具体步骤如下：

S1、在25mL的反应管中分别加入0.1mmol 1,2,3,4-四氢喹啉 (1,2,3,4-Tetrahydroquinolines，以下称为化合物A)、0.3mmol O-苯甲酰基羟胺 (O–benzoylhydroxylamines，以下称为化合物B)、0.04mmol CuI、0.15mmol KOH、 1.5mmol K₂CO₃、0.02mmol BHT和1mL干燥的四氢呋喃(THF)，与80℃下反应18h；

S2、反应结束后冷却至室温，用乙酸乙酯萃取反应液，收集有机相，用无水硫酸钠干燥30min，过滤，浓缩溶剂，柱层析分离得到纯品。

本发明的第三个目的在于提供所述2-烷基胺喹啉类化合物在制备抗白色念珠菌感染药物中的应用。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：本申请发明人之前的研究已经鉴定出可扩散的信号因子(DSF)群体感应信号及其衍生物可以较强的干扰白色念珠菌酵母态-菌丝态的转变。本次研究也成功合成并筛选出具有抑制白色念珠菌粘附性、菌丝形态转换和致病性的化合物。同时，这些化合物本身毒性较小，不影响白色念珠菌及人类细胞的生长，这些特点有望促进新型抗真菌药物治疗的发展。

附图说明

图1是2-烷基胺喹啉类化合物的反应机理图。

图2A、图2B和图2C是2-烷基胺喹啉类对白色念珠菌菌丝形成的影响结果图；

其中，图2A是终浓度为100μM的28个化合物对白色念珠菌菌丝形成的抑制率的测定结果图；

图2B是1、15号化合物在25μM到100μM的不同浓度下的抑制效果图；

图2C是DMSO、BDSF、1、15号化合物在终浓度为100μM时对菌丝抑制的显微镜观察图片图。

图3是两种2-烷基胺喹啉类化合物对白色念珠菌生长速率的影响结果图。

图4A、图4B和图4C是两种2‐烷基胺喹啉类化合物对白色念珠菌在A549细胞的致病性方面的影响；

其中，图4A为终浓度为100μM的28个2-烷基胺喹啉类化合物对A549细胞的细胞毒性；

图4B终浓度为100μM的28个化合物对白色念珠菌SC5314细胞毒性的影响；

图4C为1、15号化合物在6.25μM到100μM的不同浓度下对白色念珠菌细胞毒性的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，也不得作为对本发明保护范围的限定。除非特定说明，以下试剂均为市售。

实施例1 2-烷基胺喹啉类化合物的制备方法

如图1所示，为2-烷基胺喹啉类化合物的合成反应机理图，制备的具体步骤为：在25mL的反应管中分别加入0.1mmol化合物A、0.3mmol化合物B、0.04 mmol CuI、0.15mmolKOH、1.5mmol K₂CO₃、0.02mmol BHT和1mL干燥的 THF，与80℃下反应18h。反应结束后冷却至室温，用乙酸乙酯萃取反应液，收集有机相，用无水硫酸钠干燥30min，过滤，浓缩溶剂，柱层析分离得到纯品。

以下为获得的28种化合物：

实施例2效果检测试验

(一)试验方法：

(1)白色念珠菌菌株的活化：将白色念珠菌标准菌株SC5314于LB培养基活化(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L)，置于30℃培养箱培养过夜。

(2)2-烷基胺喹啉类化合物对白色念珠菌菌株SC5314菌丝的影响：

挑取LB固体平板上的SC5314菌株，接种于GMM培养液(6.7g/L YNB+0.2％葡萄糖)中，30℃，200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD₆₀₀，用GMM将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.1。取500μL菌液于1.5mL EP管中，分别加入终浓度为100μM化合物，同时设置DMSO、BDSF(B.cenocepaciadiffusible signal factor，对SC5314 菌丝形成有很好的抑制作用)分别为对照。震荡混匀，置于37℃水浴锅中孵育，6 h后，离心5000rpm，10min，弃上清，加入40μL GMM培养液重悬菌体，于Leica DMi8显微镜下观察菌丝的形成，取不同视野拍摄照片。

(3)2-烷基胺喹啉类化合物对白色念珠菌菌株SC5314生长影响测定：

挑取菌株SC5314单菌落接种于GMM培养液，30℃，200rpm振荡培养过夜，测定菌液OD₆₀₀，用GMM将菌液稀释至OD₆₀₀＝0.5。取1mL菌液于1.5ml EP 管中，依次加入终浓度为100μM的化合物，震荡混匀，各取300μL加入100孔板中，每个处理设置4个重复，同时设置只加DMSO或氟康唑(FLC)处理。置于生长曲线测定仪中，30℃，200rpm，每2h测定一次OD₆₀₀值，2d后观察实验结果，GraphPad Prism 6处理数据。

(4)化合物对白色念珠菌菌株SC5314细胞毒力的影响：

(a)A549细胞的复苏及培养：将冻融的A549细胞转移至含10％FBS的 DMEM培养基(Gioco公司)中，37℃，5％CO₂条件下过夜培养。

(b)A549细胞准备：A549细胞在含10％胎牛血清的高糖培养基DMEM中，以1.5×10⁴个/孔的细胞浓度于96孔板中培养过夜。待细胞布满96孔板底部80％的时候，弃去培养液，用1×PBS清洗细胞3次。

(c)白色念珠菌准备：挑取新鲜SC5314接种于GMM培养液中，于30℃， 200rpm条件下振荡培养过夜；用含1％FBS的DMEM细胞维持液调节至 OD₆₀₀＝1.0，再用DMEM(1％FBS)稀释10倍(≈10⁸CFU/mL)待用。

(d)细胞毒力测定：通过检测LDH的释放量来检测细胞的毒性，将终浓度为100μM化合物加入含菌的细胞维持液中，取100μL加入准备好的A549细胞中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱内培养8h，每个样品4个重复，同时设置只加DMSO、BDSF作为对照，同时测定化合物对细胞本身的毒力作用，即将终浓度为100μM化合物加入不含菌的细胞维持液中，同上处理。参照Promega公司 CytoTox

NonRadioactive Cytotoxicity Assay操作方法测定细胞LDH活性，随后用GraphPad Prism 6处理数据。

在检测白色念珠菌的细胞毒性时，申请人将加入了阳性与阴性对照组的 LDH释放量作为100％，并由此来规范其他加入2-烷基胺喹啉类化合物组的LDH 释放比例。

(二)实验结果

(1)A549细胞化合物能抑制白色念球菌SC5314的菌丝形成

以DMSO和BDSF处理过的菌丝形成率为对照，化合物的终浓度为100μM，化合物对白色念球菌SC5314的菌丝形成是否有影响。如附图2A所示，1号和 15号化合物对白色念球菌有较强的菌丝抑制作用，菌丝形成率皆低于20％。另外，附图2B显示的是这2个化合物在倒置显微镜下观察到的结果。

同时，我们检测了这2个化合物在25μM到100μM浓度梯度下白色念球菌 SC5314的菌丝形成情况，如附图2C所示。从结果来看，2个化合物的菌丝抑制效果良好，结果呈现出浓度依赖的特性；并且这两种化合物在浓度只有25μM的情况下，菌丝形成率也低于40％。

(2)A549细胞化合物对白色念球菌SC5314的生长有影响

以DMSO和氟康唑(FLC)为对照，化合物的终浓度为100μM，化合物对白色念球菌SC5314的生长是否有影响。结果如附图3所示，2种化合物对白色念球菌SC5314的生长均有抑制作用。

(3)化合物可以抑制白色念珠菌菌株SC5314对细胞的毒力作用

以DMSO和BDSF为对照，化合物的终浓度为100μM，申请人测试了在没有白色念球菌SC5314的情况下，化合物本身对细胞的毒力作用，如附图4A所示，化合物对细胞毒力作用较小。

同时，申请人还测试了化合物是否能减弱白色念珠菌SC5314对细胞的毒力作用，结果如附图4B所示，化合物1、15号对细胞有较强的保护作用，均可以使白色念珠菌的毒力降低在15％以下。另外，两种化合物在不同浓度梯度下，对白色念珠菌的侵染有一定的抑制作用，尤其是15号，在12.5μM时仍可以使白色念珠菌的毒力降低在30％以下。结果如附图4C所示。

总的来说，申请人合成了一系列2-烷基胺喹啉类化合物，并筛选了它们对抗真菌病原体的能力。其中，一些化合物显示出了很强的抑制白色念珠菌细胞菌丝形成和致病性的特性，而且它们对白色念珠菌细胞本身的生长没有太大的影响，以及对人体细胞没有毒性。因此，这些化合物中的有些化合物可能被开发为新型抗白色念珠菌感染的药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种防治白色念珠菌的2-烷基胺喹啉类化合物的制备方法，所述2-烷基胺喹啉类化合物由1,2,3,4-四氢喹啉和O-苯甲酰基羟胺反应生成，化学结构式如下：

，R为H或者甲基基团；

其特征在于，包括以下步骤：

S1、在25mL的反应管中分别加入0.1mmol1,2,3,4-四氢喹啉、0.3mmolO-苯甲酰基羟胺、0.04mmolCuI、0.15mmolKOH、1.5mmol碳酸钾、0.02mmolBHT和1mL干燥的四氢呋喃，于80℃下反应18h；

S2、反应结束后冷却至室温，用乙酸乙酯萃取反应液，收集有机相，用无水硫酸钠干燥30min，过滤，浓缩溶剂，柱层析分离得到纯品。

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