CN115583915A - 一种喹啉查尔酮衍生物、合成方法及其应用 - Google Patents

一种喹啉查尔酮衍生物、合成方法及其应用 Download PDF

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CN115583915A CN202211227485.9A CN202211227485A CN115583915A CN 115583915 A CN115583915 A CN 115583915A CN 202211227485 A CN202211227485 A CN 202211227485A CN 115583915 A CN115583915 A CN 115583915A
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孙爱梅
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Abstract

本发明公开了一种喹啉查尔酮衍生物、合成方法及其应用。该方法路线短、收率高。本发明提供的喹啉查尔酮衍生物与氟康唑联合产生协同抗耐药白念珠菌作用，有望进一步解决深部真菌感染的耐药性问题。

Description

一种喹啉查尔酮衍生物、合成方法及其应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种喹啉查尔酮衍生物、合成方法及其应用。
背景技术
近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤药物、免疫缺陷疾病的发生、移植手术的普及，深部真菌感染（invasive fungal infections，IFIs）的发生率逐年增加，严重威胁人类健康与生命，每年超过150万人死于IFIs。其中，白念珠菌（Candida albicans）是造成IFIs的主要致病菌。白念珠菌是一种存在于人体粘膜的共生菌，通常对健康无害。当人体免疫力下降时，白念珠菌能够引起浅表感染，甚至是IFIs，是最常见的院内感染真菌，已成为全球第４大致病菌。
以氟康唑为代表的唑类药物抗真菌抑制作用强、毒性低，广泛用于临床。然而，唑类药物只是抑菌剂而无直接杀伤作用，为存活下来的菌株产生耐药性提供了有力的条件，在长期的治疗过程中，反复给药会加重真菌氟康唑耐药性的产生。面对耐药菌株的大量出现，现阶段抗真菌药物治疗真菌感染性疾病陷入瓶颈。
本发明提供的喹啉查尔酮衍生物对于抗耐药白念珠菌具有很好的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供喹啉查尔酮衍生物、合成方法及其应用。
结构式如下：
Figure 609947DEST_PATH_IMAGE001
，其中R=H,
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合成路线如下：
Figure 708167DEST_PATH_IMAGE021
。
具体步骤为：
（1）化合物1的制备：称取2-氯喹啉-3-甲醛（3.84 g，20 mmol）和碳酸钾（5.52g，40 mmol）于100 mL圆底烧瓶中，加入50 mL干燥后的乙腈溶解；然后加入N-甲基哌嗪（4.0g，40 mmol），并加热回流反应过夜；薄层层析色谱检测原料消失后，冷却至室温，并倒入200mL冷水中；以120 mL二氯甲烷分三次萃取，二氯甲烷层经无水硫酸钠干燥后过滤；真空浓缩，残余物为化合物1；
（2）化合物2的制备：依次称取2.762g 4-氟苯乙酮（20 mmol）和3.438g无水哌嗪（40 mmol）于100 mL圆底烧瓶中，加入60 mL经过氢氧化钾干燥后的N,N-二甲基甲酰胺，最后加入5.522g碳酸钾（40 mmol），并置于油浴上115℃反应一天；反应结束后，将混合物倒入200 mL冰水中搅拌，析出淡黄色固体；固体抽滤后用水洗涤（50 mL×3），真空干燥，得到浅色固体化合物2；
（3）关键中间体PK-1的合成：称取2.55g制备的化合物1（10mmol）和2.04g化合物2（10 mmol）在100 mL圆底烧瓶中，加入40 mL无水甲醇溶解；然后在冰水浴冷却下分批加入4g氢氧化钠；待固体完全溶解后，移除冰水浴，在室温下继续反应24小时；薄层层析检测反应原料基本上消失后，倒入200 mL冷水中，以二氯甲烷萃取（30 mL×3）；有机相合并后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液真空浓缩；残余物进行柱层析分离（以甲醇/二氯甲烷=3:97为洗脱剂），得到黄褐色固体关键中间体PK-1；
（4）衍生物PK-2~PK20的制备：称取88 mg关键中间体PK-1（0.2 mmol）于10 mL干燥圆底烧瓶中，再按顺序依次加入69 mg 碳酸钾（0.6 mmol）和5 mL干燥二氯甲烷溶解；最后滴加0.3 mmol酰氯、酸酐、磺酰氯或卤代烃，室温下反应5-12h；薄层层析色谱检测反应结束后，加5 mL水搅拌30min；二氯甲烷层直接以甲醇/二氯甲烷=2:98为洗脱剂进行层析，分离得到如权利要求1所述的喹啉查尔酮衍生物。
步骤（4）所述的酰氯、酸酐、磺酰氯或卤代烃分别为：乙酸酐,
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。
喹啉查尔酮衍生物在与抗真菌药物联合使用抗耐药真菌的应用。
耐药真菌为耐药白念珠菌。
耐药真菌为耐药白念珠菌(CA23)。
抗真菌药物为氟康唑。
本发明优点：
本发明公开了一种新的喹啉查尔酮衍生物。
本发明还公开了该衍生物的合成方法，路线短、收率高。
本发明提供的喹啉查尔酮衍生物与氟康唑联合产生协同抗耐药白念珠菌作用，有望进一步解决深部真菌感染的耐药性问题。
附图说明
图1为本发明所述的喹啉查尔酮衍生物PK-1~PK-8的结构式；
图2为本发明所述的喹啉查尔酮衍生物PK-9~PK-16的结构式；
图3为本发明所述的喹啉查尔酮衍生物PK-17~PK-20的结构式；
图4为喹啉查尔酮衍生物PK-1~PK-20的合成路线；
图5为本发明所述的喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对白念珠菌的时间杀菌曲线图；
图6为喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用在SD+10%FBS培养基中对白念珠菌菌丝的生长情况(×20)；
图7为喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用在Spider培养基中对白念珠菌菌丝的生长情况(×20)；
图8为喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对白念珠菌外排泵的影响；
图9为喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对白念珠菌细胞内线粒体膜电位；
图10为喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对白念珠菌细胞内活性氧的影响；
图11为喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对白念珠菌细胞内ATP的影响；
图12为喹啉查尔酮衍生物PK-10与FLC单独或联合使用对RAS1-cAMP-EFG1信号通路相关基因的表达；
图13为外源性cAMP对SD+10%FBS培养基中白念珠菌菌丝形成的影响；
图14为外源性cAMP对Spider培养基中白念珠菌菌丝形成的影响；
图15为喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对系统性白念珠菌感染小鼠生存率的影响；
图16为喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对系统性白念珠菌感染小鼠实验期间小鼠给药前后体重变化的影响；
图17为喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对系统性白念珠菌感染小鼠肾、肺、肝落数的影响；
图18为喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对系统性白念珠菌感染小鼠脾脏，胸腺系数的影响。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换，均属于本发明的保护范围。
本发明所涉及的喹啉查尔酮的结构式如图1、图2和图3所示。
本发明所涉及的喹啉查尔酮的合成路线如图4所示。
本发明所涉及的喹啉查尔酮的制备步骤为：
（1）化合物1的制备：称取2-氯喹啉-3-甲醛（3.84 g，20 mmol）和碳酸钾（5.52g，40 mmol）于100 mL圆底烧瓶中，加入50 mL干燥后的乙腈溶解；然后加入N-甲基哌嗪（4.0g，40 mmol），并加热回流反应过夜；薄层层析色谱检测原料消失后，冷却至室温，并倒入200mL冷水中；以120 mL二氯甲烷分三次萃取，二氯甲烷层经无水硫酸钠干燥后过滤；真空浓缩，残余物为化合物1；
（2）化合物2的制备：依次称取2.762g 4-氟苯乙酮（20 mmol）和3.438g无水哌嗪（40 mmol）于100 mL圆底烧瓶中，加入60 mL经过氢氧化钾干燥后的N,N-二甲基甲酰胺，最后加入5.522g碳酸钾（40 mmol），并置于油浴上115℃反应一天；反应结束后，将混合物倒入200 mL冰水中搅拌，析出淡黄色固体；固体抽滤后用水洗涤（50 mL×3），真空干燥，得到浅色固体化合物2；
（3）关键中间体PK-1的合成：称取2.55g制备的化合物1（10mmol）和2.04g化合物2（10 mmol）在100 mL圆底烧瓶中，加入40 mL无水甲醇溶解；然后在冰水浴冷却下分批加入4g氢氧化钠；待固体完全溶解后，移除冰水浴，在室温下继续反应24小时；薄层层析检测反应原料基本上消失后，倒入200 mL冷水中，以二氯甲烷萃取（30 mL×3）；有机相合并后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液真空浓缩；残余物进行柱层析分离（以甲醇/二氯甲烷=3:97为洗脱剂），得到黄褐色固体关键中间体PK-1；
（4）衍生物PK-2~PK20的制备：称取88 mg关键中间体PK-1（0.2 mmol）于10 mL干燥圆底烧瓶中，再按顺序依次加入69 mg 碳酸钾（0.6 mmol）和5 mL干燥二氯甲烷溶解；最后滴加0.3 mmol酰氯、酸酐、磺酰氯或卤代烃，室温下反应5-12h；薄层层析色谱检测反应结束后，加5 mL水搅拌30min；二氯甲烷层直接以甲醇/二氯甲烷=2:98为洗脱剂进行层析，分离得到衍生物PK-2~PK20。
步骤（4）所述的酰氯、酸酐、磺酰氯或卤代烃分别为：乙酸酐,
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喹啉查尔酮衍生物在与抗真菌药物联合使用抗耐药真菌的应用。
耐药真菌为耐药白念珠菌。
耐药真菌为耐药白念珠菌(CA23)。
抗真菌药物为氟康唑。
实施例1：
关键中间体PK-1的合成
化合物1的制备：称取2-氯喹啉-3-甲醛（3.84 g，20 mmol）和碳酸钾（5.52g， 40mmol）于100 mL圆底烧瓶中，加入50 mL干燥后的乙腈溶解。然后加入N-甲基哌嗪（4.0 g，40mmol），并加热回流反应过夜。薄层层析色谱检测原料消失后，冷却至室温，并倒入200 mL冷水中。以120 mL二氯甲烷分三次萃取，二氯甲烷层经无水硫酸钠干燥后过滤。真空浓缩，残余物不需要纯化，即可进行下一步反应。
化合物2的制备：依次称取2.762g 4-氟苯乙酮（20 mmol）和3.438g无水哌嗪（40mmol）于100 mL圆底烧瓶中，加入60 mL经过氢氧化钾干燥后的N,N-二甲基甲酰胺，最后加入5.522g碳酸钾（40 mmol），并置于油浴上115℃反应一天。反应结束后，将混合物倒入200mL冰水中搅拌，析出淡黄色固体。固体抽滤后用水洗涤（50 mL×3），真空干燥，得到浅色固体。1H NMR (400MHz, CDCl3) δ: 7.19(d, J=8.7Hz, 2H), 6.95(d, J=8.9Hz, 2H), 3.40(t, J=4.7Hz, 4H), 3.11 (t, J=4.8Hz, 4H), 2.07(s, 1H), 2.02(s, 3H); 13C NMR(100MHz, CDCl3) δ: 197.21, 146.26, 134.22, 122.31, 118.48, 46.70, 44.34,27.76。
关键中间体PK-1的合成：称取2.55g制备的化合物1（10mmol）和2.04g化合物2（10mmol）在100 mL圆底烧瓶中，加入40 mL无水甲醇溶解。然后在冰水浴冷却下分批加入4g氢氧化钠。待固体完全溶解后，移除冰水浴，在室温下继续反应24小时。薄层层析检测反应原料基本上消失后，倒入200 mL冷水中，以二氯甲烷萃取（30 mL×3）。有机相合并后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液真空浓缩。残余物进行柱层析分离（以甲醇/二氯甲烷=3:97为洗脱剂），得到黄褐色固体3.74g，收率 85%。
实施例2：
PK-2~PK20的制备：称取88 mg中间体3（0.2 mmol）于10 mL干燥圆底烧瓶中，再按顺序依次加入69 mg 碳酸钾（0.6 mmol）和5 mL干燥二氯甲烷溶解。最后滴加0.3 mmol酰氯、酸酐、磺酰氯或卤代烃，室温下反应5-12h。薄层层析色谱检测反应结束后，加5 mL水搅拌30min。二氯甲烷层直接以甲醇/二氯甲烷=2:98为洗脱剂进行层析，分离得到相应的目标产物。
化合物PK-9：1H NMR (400MHz, CDCl3) δ:8.22(s, 1H), 8.02(d, J=8.1Hz, 2H),7.95(d, J=8.6Hz, 2H), 7.75(d, J=8.4Hz, 2H), 7.62-7.66(m, 6H), 7.50(d, J=7.9Hz, 2H), 7.44(t, J=7.8Hz, 1H), 6.85(d, J=8.6Hz, 2H), 5.51(s, 2H), 3.99(s,4H), 3.89(d, J=14.7Hz, 2H), 3.69(d, J=10.9Hz, 2H), 3.61(s, 2H), 3.51(s, 3H),3.37(s, 4H), 2.57(s, 4H); 13CNMR(101MHz,CDCl3)δ:186.9, 157.4, 154.3, 146.8,143.8, 138.1, 137.2, 134.6, 132.7, 132.2, 131.9, 130.9, 130.8, 129.5, 127.9,127.7, 127.2, 125.7, 125.5, 124.4, 122.7, 118.9, 117.8, 114.5, 113.4, 111.0,62.3, 58.9, 53.5, 52.7, 47.1, 44.2。
化合物PK-10：1H NMR (400MHz, CDCl3) δ:8.14（s, 1H）， 7.92(d, J=8.1Hz,2H), 7.90(d, J=9.0Hz, 2H), 7.72(d, J=16.0Hz, 1H), 7.70(d, J=7.7Hz, 2H), 7.56-7.58(m, 6H), 7.47(d, J=8.0Hz, 2H), 7.39(t, J=7.2Hz, 1H), 6.78(d, J=9.0Hz,2H), 5.46(s, 2H), 4.01(d, J=9.6Hz, 2H), 3.94(d, J=12.4Hz, 2H), 3.86(d, J=14.8Hz, 2H), 3.66(d, J=11.0Hz, 2H), 3.57(s, 2H), 3.48(s, 3H), 3.32(t, J=4.4Hz, 4H), 2.55(t, J=4.6Hz, 4H); 13CNMR(101MHz,CDCl3)δ:187.0, 157.5, 154.3,146.9, 142.2, 138.2, 137.2, 134.3, 130.9, 130.7, 129.3, 128.0, 127.7, 126.0,125.6, 125.5, 125.4, 125.3, 124.4, 122.7, 113.4, 62.4, 58.9, 52.7, 47.1,46.2, 44.3。
化合物PK-13：1H NMR (400MHz, CDCl3) δ:8.23(s, 1H), 8.06(d,J=9.0Hz, 2H),8.01(d, J=15.9Hz, 1H), 7.93(d, J=8.2Hz, 2H), 7.85(d, J=8.6Hz, 1H), 7.74(s,1H), 7.72(d, J=7.3Hz, 1H), 7.63(t, J=7.0Hz, 1H), 7.38(t, J=5.9Hz, 1H), 7.28(d, J=7.2Hz, 2H), 6.96(d, J=9.1Hz, 2H), 3.87(s, 2H), 3.50(t, J=5.0Hz, 8H),2.79(t, J=5.0Hz, 4H), 2.68(s, 4H), 2.42(s, 3H), 2.39(s, 3H); 13CNMR(101MHz,CDCl3)δ:195.8, 187.7, 159.8, 154.3, 147.7, 144.5, 140.7, 136.9, 133.6, 130.9,130.4, 129.5, 128.4, 128.2, 127.8, 127.7, 125.0, 124.5, 123.4, 122.9, 113.7,64.3, 55.2, 53.3, 50.4, 47.3, 46.3, 21.8。
化合物PK-14：1H NMR (400MHz, CDCl3) δ:8.22(s, 1H), 8.14(d, J=8.6Hz,2H), 8.06(d, J=9.0Hz, 2H), 8.00(d, J=15.7Hz, 1H), 7.85(d, J=8.4Hz, 1H), 7.79(d, J=8.6Hz, 2H), 7.73(s, 1H), 7.71(d, J=8.6Hz, 1H), 7.59-7.63(m, 1H), 7.33-7.37(m, 1H), 6.95(d, J=9.0Hz, 2H), 3.87(s, 2H), 3.47(t, J=4.8Hz, 8H), 2.78(t,J=5.0Hz,4H),2.69(s,4H), 2.37(s, 3H); 13CNMR(101MHz,CDCl3)δ:195.2, 187.7,159.8, 154.2, 147.7, 140.8, 138.9, 136.9, 132.6, 131.0, 130.9, 130.4, 128.9,128.4, 127.8, 127.7, 125.0, 124.5, 123.4, 122.8, 117.9, 116.8, 113.8, 111.0,64.8, 55.2, 53.2, 50.4, 47.4, 46.3, 40.2。
化合物PK-17：1H NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.22(s, 1H), 8.07(d, J=9.0Hz,2H), 8.01(d, J=15.7Hz, 1H), 7.85(d, J=8.5Hz, 1H), 7.68-7.73(m, 2H), 7.63(t, J=8.4Hz, 1H), 7.38(t, J=1.1Hz, 1H), 6.96(d, J=9.0Hz, 2H), 3.45-3.50(m, 8H),3.37-3.39(m, 4H), 2.83(s, 3H), 2.66(s, 4H), 2.38(s, 3H); 13CNMR(101MHz,CDCl3)δ:187.8, 159.8, 153.7, 147.8, 141.1, 137.0, 130.8, 130.5, 129.3, 127.8,127.7, 125.0, 124.6, 123.2, 122.6, 114.6, 55.2, 50.4, 47.7, 46.2, 45.5, 34.8。
化合物PK-18：1H NMR (400MHz, CDCl3) δ: 8.20(s, 1H), 8.03(d, J=9.0Hz,2H), 7.99(d, J=15.6Hz, 1H), 7.84(d, J=8.5Hz, 1H), 7.70(d, J=10.6Hz, 1H), 7.67(d, J=8.2Hz, 2H), 7.62(t, 1H), 7.32-7.34(m, 3H), 6.87(d, J=9.0Hz, 2H), 3.43(s, 8H), 3.15(d, J=4.7Hz, 4H), 2.64(s, 4H), 2.42(s, 3H), 2.36(s, 3H); 13CNMR(101MHz,CDCl3)δ:187.6, 159.7, 153.5, 147.7, 144.1, 140.9, 136.9, 132.3,130.7, 130.3, 129.9, 128.9, 127.9, 127.8, 127.6, 124.9, 124.5, 123.1, 122.5,114.3, 55.1, 50.3, 47.2, 46.2, 45.7。
化合物PK-19：1H NMR (400MHz, CDCl3) δ:8.21(s, 1H), 8.04(d, J=9.0Hz,2H), 8.00(d, J=15.8Hz, 1H), 7.80-7.84(m, 3H), 7.70(d, J=15.6Hz, 1H), 7.63(t, J=7.0Hz, 1H), 7.37(t, J=8.0Hz, 1H), 7.27(d, J=4.6Hz, 1H), 7.23(d, J=8.6Hz,1H), 6.90(d, J=9.0Hz, 2H), 3.47(t, J=5.1Hz, 8H), 3.19(t, J=5.1Hz, 4H), 2.64(s, 4H), 2.37(s, 3H); 13CNMR(101MHz,CDCl3)δ:187.7, 166.8, 164.2, 159.8, 153.5,147.7, 141.1, 137.0, 130.8, 130.6, 130.5, 130.4, 129.2, 127.8, 127.7, 124.9,124.5, 123.2, 122.5, 116.8, 116.5, 114.5, 55.2, 50.4, 47.3, 46.3, 45.7。
化合物PK-20：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:8.24(s, 1H), 8.02(d, 3H), 7.90-7.93(m, 3H), 7.83(d, J=8.3Hz, 3H), 7.75(d, J=7.7Hz, 1H), 7.67(d, J=15.6Hz, 1H),7.63(d, J=8.1Hz, 2H), 7.37-7.41(m, 1H), 6.89(d, J=9.0Hz, 2H), 3.60(s, 4H),3.47(t, J=4.6Hz, 4H), 3.21(t, J=5.0Hz, 4H), 3.03(s, 4H), 2.66(s, 3H); 13CNMR(101MHz,CDCl3)δ:187.5, 158.7, 153.5, 147.4, 140.0, 137.1, 130.8, 130.6,129.0, 128.3, 127.8, 127.7, 126.6, 126.5, 126.4, 125.5, 125.4, 125.1, 125.0,123.1, 122.9, 114.5, 54.4, 48.9, 47.2, 46.1, 45.7, 45.2。
实施例3：
喹啉查尔酮衍生物PK-1~PK20对ATCC14053的抗真菌活性
I 材料和方法
一、药物和培养基
喹啉查尔酮衍生物PK-1~PK20由实施例1和实施例2制备。
将样品PK-1~PK20用DMSO配制为50mg/ml的储备液，置于4℃的冰箱里保存备用。取氟康唑分散片，研磨，用DMSO进行充分溶解，超声30min，7000rpm离心5min，取上清液，配成50mg/mL的储备液4℃冰箱保存，备用。
沙氏液体培养基（SDB）：称取本品50.1g,加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管或三角瓶，115℃高压灭菌15min。储存于4℃保存，备用。
沙氏固体培养基（SDA）：称取本品65.1g,加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管或三角瓶，115℃高压灭菌15min，待高压灭菌锅温度降至60℃时，取出混匀后分装至无菌培养皿，储存于4℃保存，备用。
SD培养基：分别取255、15、30 mL纯水于3个试剂瓶中，115℃高压灭菌15min，纯水冷却至60℃，将2.01g 1×YNB倒入装有10 mL纯水的试剂瓶中，4g葡萄糖倒入装有20 mL纯水的试剂瓶中，分别混匀后，再将3种不同溶液混在一起，摇匀，冷却至室温后置于4℃冰箱保存，备用。
Spider培养基：精确称取2g即用型营养肉汤加入200mL去离子水充分混匀至完全溶解，115℃高压灭菌30min，冷却至60℃左右加入2g 甘露糖。0.4g磷酸氢二钾，冷却至室温后，储存于4℃保存，备用。
PBS磷酸盐缓冲液：于PBS缓冲液粉剂中加入适量去离子蒸馏水充分溶解，定容至2L,121℃高压灭菌30min,冷却至室温后，于4℃冰箱分装保存备用。
二、实验方法
取冻存于-80℃的白念珠菌SC5314敏感菌和CA23耐药菌接种于沙氏琼脂培养基上，连续活化2次，在挑取1-3个菌落于沙氏液体培养基中,30 ℃,150 rpm振荡培养16-17 h进行活化，使其处于对数生长期。用PBS磷酸盐缓冲液洗涤三次，再用培养基调整至所需菌浓度为2×105CFU/mL。配制终浓度为400 µg/mL的PK-1~PK-24，氟康唑(FLC)单个药物及终浓度为400 µg/mL+400 µg/mL的PK-1~PK-24联合氟康唑药物工作溶液。取无菌96孔平底培养板，第一排分别加入125 µL上述终浓度的单个药物及联合药物溶液，每种药物每个浓度均设置3个复孔。自第二排起1-12号孔均加入沙氏液体培养基100 µL ,最后一排加沙氏液体培养基200 µL作空白对照；第七排为生长对照孔（Control，100µL沙氏液体培养基+100µL菌液）。用排枪将第一排吸出25 µL转移到对应列的下一排的孔中，混匀后从第二排每孔吸出25 µL再转移至第三排的对应列的孔中并混匀，以此类推，进行5倍倍比稀释至第六排后弃掉25 µL，使得自第一排到第六排PK-1~PK-24和氟康唑各孔的药物浓度分别为200、40、8、1 .6、0 .32、0 .064 µg/mL，PK-1~PK-20联合氟康唑各孔的药物浓度分别为200+200、40+40、8+8、1.6+1.6、0.32+0.32、0.064+0.064µg/mL，成5倍减少，各孔中DMSO的含量均低于1%。自第一排至第七排每孔分别加入100 µl制备好的浓度为2×105 CFU/mL的白念珠菌菌液，使每孔最终总体积为200 µL。将制备好的培养板置于30 ℃的恒温培养箱中培养24 h。酶标仪测定630nm下的OD值。上述实验重复操作3次。
三、计算公式
最低抑菌浓度（MIC80）终点判定：与生长对照组相比，药物以≥80％生长抑制所对应的最低药物浓度为其MIC80。抑制率及MIC80的计算:将吸光度值按照以下计算方法计算各用药孔对白念珠菌的抑制率:抑制率=[100 -(OD样品组吸光度 -OD空白对照组吸光度)]/(OD对照组吸光度-OD空白对照组吸光度)× 100%，MIC80值通过GraPhpad Prism 8.0软件进行计算。两药联用时的相互作用评价:用部分抑菌浓度指数(Fractional Inhibitory Concentration Index，FICI)判定。
FICI=FICIA+FICIB=MICcomb A/MICAlone A+ MICcomb B/MICAlone B 其中MICAloneA和 MICAlone B分别为药物A和药物B单独应用时的MIC值;MICcombA和 MICcombB为药物A和药物B同时使用时的MIC值。当MIC值高于检测最高限时以做高限浓度的两倍值用以计算FICI。判定标准为:当FICI<0.5时，两种药为协同作用;当0.5≤FICI<4时，两种药为无关作用;当FICI≥4时，两种药为拮抗作用。
四、试验结果
表1 PK-1~PK-20与氟康唑单独及联合用药对白念珠菌SC5314和CA23的抑制活性
Figure DEST_PATH_IMAGE058
Figure 919093DEST_PATH_IMAGE059
Figure 238079DEST_PATH_IMAGE060
从表1可以看出，PK-10单独使用对白念珠菌SC5314敏感株和CA23耐药株均具有抑制作用，且MIC80分别为27.77µg/mL和174.73µg/mL。PK-1、PK-4、PK-7、PK-8、PK-9、PK-10单独使用对白念珠菌SC5314敏感株均具有抑制作用，且MIC80分别为172.03、155.70、155.78、106.53、182.11、27.77µg/mL。与氟康唑联合使用对白念珠菌SC5314敏感株和CA23耐药株均具有协同抑制作用的样品有PK-1、PK-5、PK-6、PK-10、PK-21。与氟康唑联合使用只对白念珠菌SC5314敏感株有协同抑制作用的样品有PK-12，与氟康唑联合使用只对白念珠菌CA23耐药株有协同抑制作用的样品有PK-4、PK-7、PK-8、PK-9、PK-13、PK-14、PK-15、PK-16、PK-17、PK-18、PK-19、PK-20、PK-22、PK-23。从上述结果可以看出PK-6、PK-10联合氟康唑对SC5314和CA23协同抗菌作用最强。
取冻存于-80℃的白念珠菌CA187、CA808、CA381、CA602、CA550、CA800、CA799、CA3816、CA4508、CA3511、CA4574、ATCC10231接种于沙氏琼脂培养基上，连续活化2次，在挑取1-3个菌落于沙氏液体培养基中,30℃,150 rpm振荡培养16-17 h进行活化，使其处于对数生长期。用PBS磷酸盐缓冲液洗涤三次，再用培养基调整至所需菌浓度为2×105CFU/mL。将PK-6、PK-10配制为终浓度为80 µg/mL,氟康唑配制为终浓度为80 µg/mL，PK-6、PK-10联合氟康唑配制为终浓度为80+80 µg/mL。取无菌96孔平底培养板，第一排分别加入125µL上述终浓度的单个药物及联合药物溶液，每种药物每个浓度均设置3个复孔。自第二排起1-12号孔均加入沙氏液体培养基25 µL ,最后一排加沙氏液体培养基200 µL作空白对照；第七排为生长对照孔（Control，100µL沙氏液体培养基+100µL菌液）。用排枪将第一排吸出25 µL转移到对应列的下一排的孔中，混匀后从第二排每孔吸出25µL再转移至第三排的对应列的孔中并混匀，以此类推，进行5倍倍比稀释至第六排后弃掉25 µL，使得自第一排到第六排PK-6、PK-10和氟康唑各孔的药物浓度分别为40、8、1.6、0.32、0.064、0.0128 µg/mL，PK-6、PK-10联合氟康唑各孔的药物浓度分别为40+40、8+8、1.6+1.6、0.32+0.32、0.064+0.064、0.0128+0.0128 µg/mL，成5倍减少，各孔中DMSO的含量均低于1%。自第一排至第七排每孔分别加入100 µL制备好的浓度为2×105 CFU/mL的白念珠菌菌液，使每孔最终总体积为200 µL。将制备好的培养板置于30 ℃的恒温培养箱中培养24 h。酶标仪测定630nm下的OD值。上述实验重复操作3次。
表2 PK-10与氟康唑单独及联合用药对不同临床白念珠菌的抑制活性
Figure DEST_PATH_IMAGE061
从表2可以看出，PK-6、PK-10联用氟康唑对不同白念珠菌菌株均具有抑制作用且作用方式均为协同作用。PK-10联用氟康唑协同抑菌效果优于PK-6联用氟康唑。因此，后续将以PK-10为研究对象进行机制探究。
喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对白念珠菌ATCC14053的时间-杀菌曲线
时间-杀菌曲线的测定药液浓度以MIC80为依据。共分为6组，分别为生长对照组（Control），PK-10（终浓度为1µg/mL）,氟康唑（终浓度为FLC,1µg/mL），PK-10+氟康唑低剂量组（PK-10+FLC（L）,终浓度为0.5µg/mL+1µg/mL），PK-10+氟康唑中剂量组（PK-10+FLC（M）,终浓度为1µg/mL+1µg/mL），PK-10+氟康唑高剂量组（PK-10+FLC（H）,终浓度为2µg/mL+1µg/mL），每组终体积各10mL，加入处于对数生长期的白念珠菌菌液，使每组菌液终浓度为1×105CFU/mL。混匀后置于30℃ 150rpm恒温摇床中培养，分别于0、4、8、12、24、36、48h取出，混匀，每组取200µL 于96孔培养板中，三个复孔，用酶标仪测定630nm处的OD值。以时间为横坐标，以OD630值为纵坐标，绘制时间-杀菌曲线。实验重复三次。
从图5可以看出，与control组相比， PK-10单用组对白念珠菌ATCC14053无抑制作用，药物联用组从8h开始，抑菌活性优于氟康唑组，且呈现一定的剂量依赖性，至48h时仍可抑制白念珠菌ATCC14053的生长，差异具有统计学意义（**** P<0.0001）。
喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对白念珠菌ATCC14053形态转换的影响
收集对数生长期的白念珠菌，用SD+10% FBS和Spider培养基调整菌浓度为1×105CFU/mL。将1mL含PK-10（终浓度为1µg/mL）,氟康唑（终浓度为1µg/mL），PK-10+氟康唑（终浓度为1µg/mL+1µg/mL）和不含药物的白念珠菌菌液（终浓度为1×105CFU/mL）加入到24孔培养板中，置于30℃ 恒温培养箱中分别培养2、4、8h后，取出培养板，在倒置显微镜明场下观察白念珠菌菌丝形成情况并拍照。实验重复三次。
由SD+10%FBS和Spider培养基诱导的白念珠菌菌丝如图6,7所示，结果表明，与control相比，培养2h时，PK-10组，氟康唑单用组以及PK-10联用氟康唑组均具有较小的芽管无明显差异，均无抑制作用，但当培养4h时，control，PK-10组均形成了细长而疏松的菌丝，氟康唑单用组以及PK-10联用氟康唑组形成了长的菌丝，菌丝短于control组和PK-10组，且PK-10联用氟康唑组视野内菌丝量少于氟康唑组，培养8h时，control，PK-10组均形成了很长的且交错的菌丝，且菌丝旁攀附着许多酵母相、假菌丝相的白念珠菌，氟康唑单用组以及PK-10联用氟康唑组均未形成长的菌丝，仍然有许多假菌丝细胞且PK-10联用氟康唑组假菌丝簇少于氟康唑组。
喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对白念珠菌外排泵功能的影响
利用外排泵的荧光色素底物罗丹明6G(R6G)测定各组药物对白念珠菌外排泵功能的影响。收集对数生长期的白念珠菌，用沙氏液体培养基调整菌浓度为1×107CFU/mL。设置白念珠菌生长组(Control);氟康唑组（FLC,1µg/mL);PK-10组（PK-10，1µg/mL)；PK-10联合氟康唑组（PK-10+FLC,（1µg/mL+1µg/mL)。每组体积10mL，置于30℃ 恒温摇床中孵育4h,PBS磷酸缓冲液洗涤三次，用无菌的PBS磷酸缓冲液重悬，调整每组菌浓度为1×107CFU/mL。继续放入恒温摇床中孵育1h，使白念珠菌中葡萄糖充分耗尽，避光条件下加入条件下加入Rh6G，使每组终浓度达到10uM，继续放入恒温摇床中避光孵育2h，使白念珠菌细胞与Rh 6G荧光染色剂充分接触融合。孵育完成后，各组置于冰水浴中避光孵育10min，使白念珠菌细胞终止吸收Rh 6G。冰水浴后，离心收集各组菌细胞，用事先预冷好的PBS清洗菌悬液3次，除去白念珠菌细胞中的外源性Rh6G，离心收集细胞并用含5%葡萄糖PBS磷酸缓冲液进行重悬。混匀后置于30℃ 150rpm恒温摇床中培养，分别于0、30、60、90、120min取出，混匀，每组取1mL于EP管中，4℃ 12000g离心2min，取上清液100uL于96孔培养板黑板中，每组设置3个复孔，采用多功能酶标仪测定其荧光值（激发波长 488nm，发射波长525nm)。操作时注意避光操作。实验重复三次。
从图8可以看出，各组MFI值均呈上升趋势，表明白念珠菌细胞内各组药物外排活性随时间推移而增强。与control组相比，PK-10组，氟康唑组或PK-10联合氟康唑组在30min后,均能明显抑制了这种上升，60-120min时段这种抑制作用依旧显著(**** P<0.0001）。这说明PK-10单独或联合氟康唑使用降低了菌株的外排能力。
喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对白念珠菌细胞内线粒体膜电位的影响
采用荧光探针JC-1测定线粒体膜电位。将处于对数生长期的白念珠菌菌悬液用氟康唑（FLC,1µg/mL);PK-10（PK-10，1µg/mL)；PK-10联合氟康唑（PK-10+FLC,（1µg/mL+1µg/mL)处理后，根据制造商提供的说明书，避光条件下，将JC-1荧光探针加入各组菌悬液使其终浓度为10 µg/mL，充分混匀，于30℃,150rpm恒温摇床中孵育20 min,孵育完成后，各组菌悬液均用PBS洗涤2次，离心（12000g,4℃,2min）取上清液100µL于96孔板中，每组三个复孔，采用全波长多功能酶标仪测定其红色（激发波长525nm ,发射波长590nm)和绿色荧光值(激发波长490nm ,发射波长530nm)，膜电位用红绿荧光的比值确定。
从图9可以看出，与control组相比，PK-10并未较少细胞内JC-1 MFI的表达量,而氟康唑组和PK-10联用氟康唑组均显著减少了白念珠菌细胞内JC-1 MFI的表达量，表明白念珠菌细胞中线粒体膜电位不稳定，并显著下调，差异具有统计学意义（**** P<0.0001）。
喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对白念珠菌细胞内线粒体膜电位的影响
采用DCFH-DA作为荧光探针检测白念珠菌细胞内的活性氧水平。将处于对数生长期的白念珠菌菌悬液用氟康唑（FLC,1µg/mL);PK-10（PK-10，1µg/mL)；PK-10联合氟康唑（PK-10+FLC,（1µg/mL+1µg/mL)处理后，根据制造商提供的说明书，加入DCFH-DA，置于30℃，150rpm条件下孵育30min，使探针与白念珠菌充分融合，PBS洗涤两次后重悬，离心（12000g,4℃,2min）取上清液100 µL于96孔板中，每组三个复孔，采用多功能酶标仪测定其荧光值（激发波长 488nm，发射波长525nm)。实验重复三次。
从图10可以看出，与control组相比，氟康唑组和PK-10联用氟康唑组白念珠菌细胞内ROS积累明显高于control组（**** P<0.0001），而PK-10组中ROS的积累无明显变化。研究结果提示，PK-10联合氟康唑有较好抗菌作用与诱导 ROS在白念珠菌细胞内的积累相关，而PK-10组无抗菌作用与其无法诱导ROS 的积累有关。
喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对白念珠菌细胞内ATP的影响
使用增强型ATP检测试剂盒检测细胞中的ATP水平，将处于对数生长期的白念珠菌用SDB培养基调整菌液终浓度为1×105CFU/mL，用不同的药物处理，各组药物分组情况如下:白念珠菌组(Control);氟康唑处理组（FLC,1µg/mL);
PK-10处理组（PK-10，1µg/mL):PK-10联合氟康唑处理组（PK-10+FLC,（1µg/mL+1µg/mL)。置于30℃ 恒温摇床中孵育16h,PBS磷酸缓冲液洗涤三次，调整每组菌浓度为1×107CFU/mL，离心收集细胞，根据制造商提供的说明书，
各组加入ATP检测裂解液，剧烈涡旋使裂解液充分接触并裂解细胞。裂解后4ºC12000g离心5分钟，取上清，用于后续的测定。按照每个样品/标准品需100µL检测工作液加入到96孔黑板检测孔中，室温放置5min，然后在检测孔中加入20µL样品/标准品，迅速混合，每组设置3个复孔。采用多功能酶标仪检测化学发光Luminometer。实验重复三次。为了消除样品制备时由于蛋白量的差异而造成的误差，使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定样品中的蛋白浓度。
从图11可以看出，与Control 相比，PK-10单用对白念珠菌细胞内ATP含量无影响，但与氟康唑联用后细胞内ATP含量明显降低，差异具有统计学意义（**** P<0.0001）。
喹啉查尔酮衍生物PK-10与氟康唑单独或联合使用对RAS1-cAMP-EFG1信号通路相关基因的影响
为评价PK-10的分子机制，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定了RAS1
-cAMP-EFG1信号通路相关基因RAS1、CYR1、EFG1、ECE1、ALS3、HWP1的表达。白念珠菌菌悬液1×105 CFU/mL与FLC(终浓度1µg/mL)或PK-10(终浓度1µg/mL)或FLC+PK-10(终浓度1+1µg/mL)共孵育，30℃振荡16h。设置无药物的生长对照。3500rpm离心5分钟，用PBS洗涤3次。收集真菌细胞用液氮研磨，用Trizol试剂提取总RNA。用NanoDroplite分光光度计测定RNA的浓度和纯度，用电泳法测定RNA的完整性。使用GoScript逆转录试剂盒(Promega)将RNA(1µg)逆转录成cDNA。并通过qPCR(Thermo)检测相关基因的表达。使用2-(∆∆Ct)方法计算相对基因表达量。使用NCBI设计引物，在擎科生物技术公司合成。引物序列见表3。
Figure 184518DEST_PATH_IMAGE062
从图12可以看出，与生长对照组(Control)相比，PK-10+FLC组能下调RAS1、CYR1、 EFG1、ECE1、ALS3、HWP1等蛋白基因的表达水平，差异具有统计学意义（**** P＜0.0001）。
救援试验
为了验证cAMP在PK-10处理后对cAMP-EFG1通路的影响，分别用SD+10%FBS和Spider液体培养基制备白念珠菌细胞培养基(1×105 CFU/mL)与PK-10(最终浓度为1μg/mL)或FLC(最终浓度为1μg/mL)或PK-10+FLC(最终浓度为1+1μg/mL)溶液共培养于24孔板中，30℃孵育4h和8h，加入或不加入二丁基-cAMP(db-cAMP)。无db-cAMP组作为对照组。使用倒置显微镜获取图像。
如图13、14所示，加入外源性cAMP后，白念珠菌菌丝的形成更加密集，并且药物联合组在SD+10%FBS和Spider液体培养基中，菌丝的形成相比未加外源性cAMP都有一定的恢复，表明外源性cAMP的加入可以部分挽救PK-10联合氟康唑对白念珠菌所产生的抑制作用。
小鼠系统性白念珠菌感染模型评价喹啉查尔酮衍生物PK-10与FLC体内抗真菌活性
使用BALB/C雄性小鼠（6-8周；体重18-22g）建立小鼠系统性白念珠菌感染模型。首先，连续3天腹腔注射环磷酰胺(100mg/Kg,0.1mL/10g,1次/日)，造成小鼠系统性免疫缺陷。随后，小鼠被随机分配到以下实验组：
Figure 196336DEST_PATH_IMAGE063
然后，第四天小鼠经尾侧静脉接种5×105 CFU/只的白念珠菌悬液。感染2h后，各给药组分别灌胃给药0.2 mL/10g,1次/天。空白组，对照组，模型组灌胃给水0.2 mL/10g,1次/天。连续给药6天。在连续6天的治疗过程中，观察并记录了小鼠的一般状况（活动情况、毛发状况、体重和生存情况）。麻醉后颈椎脱位处死小鼠，取适量肾、肺、肝称重，加入0.9%生理盐水，用研磨液研磨制成匀浆液，取10μL涂布于含1%青霉素、链霉素的沙氏固体平板上，置于30℃ 恒温培养箱中培养48h，计数菌落数。
从图15可以看出，Blank组、Control组小鼠均无死亡情况，存活率为100%；Model组小鼠存活率为20%，FLC组、PK-10组小鼠存活率为30%，PK-10+FLC联用低，中剂量组小鼠存活率为90%。两个联用组均明显提高了系统性白念珠菌感染小鼠的存活率，且效果优于FLC、PK-10单用组。
从图16可以看出，PK-10与氟康唑联用组小鼠体重与给药前无显著差异，表明联合用药可以恢复感染小鼠的生存状态。
从图17可以看出，与Model组或FLC组相比，PK-10单用或与氟康唑联用均能显著降低小鼠肾脏的菌落数（与Model组比，**** P<0.0001；与FLC组比，#### P<0.0001）。而对肺脏和肝脏菌落数无显著变化。
从图18可以看出，与Model组或FLC组相比，PK-10与氟康唑联用低，中剂量均能显著增加小鼠脾脏系数（与Model组比，**** P<0.0001；与FLC组比，#### P<0.0001）。与Model组，PK-10与氟康唑联用低，中剂量均能显著增加小鼠胸腺系数（与Model组比，**** P<0.0001）；与FLC组相比，PK-10与氟康唑联用中剂量能显著增加小鼠胸腺系数（与FLC组比，#### P<0.0001）。

Claims (7)

1.一种喹啉查尔酮衍生物，其特征在于，结构式如下：
Figure 174130DEST_PATH_IMAGE001
，其中R=H,
Figure 684745DEST_PATH_IMAGE002
,
Figure 933324DEST_PATH_IMAGE003
,
Figure 62954DEST_PATH_IMAGE004
,
Figure 221534DEST_PATH_IMAGE005
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Figure 778417DEST_PATH_IMAGE006
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Figure 779872DEST_PATH_IMAGE007
,
Figure 572247DEST_PATH_IMAGE008
,
Figure 975547DEST_PATH_IMAGE009
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Figure 814583DEST_PATH_IMAGE010
,
Figure 303333DEST_PATH_IMAGE011
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Figure 509187DEST_PATH_IMAGE012
,
Figure 891626DEST_PATH_IMAGE013
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Figure 55891DEST_PATH_IMAGE014
,
Figure 766358DEST_PATH_IMAGE015
,
Figure 651269DEST_PATH_IMAGE016
,
Figure 763581DEST_PATH_IMAGE017
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Figure 833169DEST_PATH_IMAGE018
,
Figure 155566DEST_PATH_IMAGE019
,
Figure 968801DEST_PATH_IMAGE020
。
2.一种如权利要求1所述的喹啉查尔酮衍生物的合成方法，其特征在合成路线如下：
Figure 309521DEST_PATH_IMAGE021
，
具体步骤为：
（1）化合物1的制备：称取2-氯喹啉-3-甲醛（3.84 g，20 mmol）和碳酸钾（5.52g， 40mmol）于100 mL圆底烧瓶中，加入50 mL干燥后的乙腈溶解；然后加入N-甲基哌嗪（4.0 g，40mmol），并加热回流反应过夜；薄层层析色谱检测原料消失后，冷却至室温，并倒入200 mL冷水中；以120 mL二氯甲烷分三次萃取，二氯甲烷层经无水硫酸钠干燥后过滤；真空浓缩，残余物为化合物1；
（2）化合物2的制备：依次称取2.762g 4-氟苯乙酮（20 mmol）和3.438g无水哌嗪（40mmol）于100 mL圆底烧瓶中，加入60 mL经过氢氧化钾干燥后的N,N-二甲基甲酰胺，最后加入5.522g碳酸钾（40 mmol），并置于油浴上115℃反应一天；反应结束后，将混合物倒入200mL冰水中搅拌，析出淡黄色固体；固体抽滤后用水洗涤（50 mL×3），真空干燥，得到浅色固体化合物2；
（3）关键中间体PK-1的合成：称取2.55g制备的化合物1（10mmol）和2.04g化合物2（10mmol）在100 mL圆底烧瓶中，加入40 mL无水甲醇溶解；然后在冰水浴冷却下分批加入4g氢氧化钠；待固体完全溶解后，移除冰水浴，在室温下继续反应24小时；薄层层析检测反应原料基本上消失后，倒入200 mL冷水中，以二氯甲烷萃取（30 mL×3）；有机相合并后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液真空浓缩；残余物进行柱层析分离（以甲醇/二氯甲烷=3:97为洗脱剂），得到黄褐色固体关键中间体PK-1；
（4）衍生物PK-2~PK20的制备：称取88 mg关键中间体PK-1（0.2 mmol）于10 mL干燥圆底烧瓶中，再按顺序依次加入69 mg 碳酸钾（0.6 mmol）和5 mL干燥二氯甲烷溶解；最后滴加0.3 mmol酰氯、酸酐、磺酰氯或卤代烃，室温下反应5-12h；薄层层析色谱检测反应结束后，加5 mL水搅拌30min；二氯甲烷层直接以甲醇/二氯甲烷=2:98为洗脱剂进行层析，分离得到衍生物PK-2~PK20。
3.一种如权利要求2所述的喹啉查尔酮衍生物的合成方法，其特征在于，步骤（4）所述的酰氯、酸酐、磺酰氯或卤代烃分别为：乙酸酐,
Figure 815589DEST_PATH_IMAGE022
,
Figure 235069DEST_PATH_IMAGE023
,
Figure 976629DEST_PATH_IMAGE024
,
Figure 797954DEST_PATH_IMAGE025
,
Figure 474923DEST_PATH_IMAGE026
,
Figure 257066DEST_PATH_IMAGE027
,
Figure 412103DEST_PATH_IMAGE028
,
Figure 478148DEST_PATH_IMAGE029
,
Figure 326019DEST_PATH_IMAGE030
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Figure 985670DEST_PATH_IMAGE031
,
Figure 55651DEST_PATH_IMAGE032
,
Figure 851568DEST_PATH_IMAGE033
,
Figure 604761DEST_PATH_IMAGE034
,
Figure 876342DEST_PATH_IMAGE035
,
Figure 638762DEST_PATH_IMAGE036
,
Figure 289186DEST_PATH_IMAGE037
,
Figure 88646DEST_PATH_IMAGE038
,
Figure DEST_PATH_IMAGE039
。
4.一种如权利要求1所述的喹啉查尔酮衍生物，其特征在于与抗真菌药物联合使用抗耐药真菌的应用。
5.一种如权利要求4的应用，其特征在于所述的耐药真菌为耐药白念珠菌。
6.一种如权利要求4的应用，其特征在于所述的耐药真菌为耐药白念珠菌(CA23)。
7.一种如权利要求4的应用，其特征在于所述的抗真菌药物为氟康唑。
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