CN108084065A - 一种金丝桃素衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种金丝桃素衍生物，该衍生物具有如下化学结构式：

Description

一种金丝桃素衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种金丝桃素衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)是近些年来世界最畅销草药之一，金丝桃素(Hypericin)是贯叶连翘中最具有生物活性的物质,具有抗病毒、抗抑郁等作用。国内外还完成了抗艾滋病的二期临床试验，治疗恶性神经胶质瘤的临床研究也在进行中。金丝桃素除了存在于贯叶连翘中外，还广泛分布于金丝桃属其它植物中。金丝桃素的多种药理作用，使其成为当前国际研究开发热点课题之一。近年来，在抗病毒(包括抗人类免疫缺陷病毒HIV)、癌症的光化学治疗、贯叶连翘抗抑郁机制研究等方面十分活跃。我国贯叶金丝桃资源比较丰富，主要分布于四川、陕西、河北、山东、江西、江苏等地，在甘肃陇南地区也有大量贯叶连翘，但目前我国对金丝桃素的研究应用还不多。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金丝桃素衍生物，该衍生物表现出比金丝桃素更强的抗犬瘟热病毒活性。

本发明的另一目的是提供上述金丝桃素衍生物的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种金丝桃素衍生物，具有如下化学结构式：

上述金丝桃素衍生物在制备抗犬瘟热病毒药物中的应用。

上述金丝桃素衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将氯磺酸滴入吡啶，得到酯化试剂；

(2)将金丝桃素加入酯化试剂中，于20～50℃反应2～10小时；

(3)用氢氧化钠中和步骤(2)的反应液，然后加入乙醇，醇沉得到金丝桃素衍生物；反应如下：

氯磺酸与吡啶反应剧烈，安全操作应先用冰盐水浴将吡啶充分冷却至0℃，然后边搅拌边逐滴加入氯磺酸，滴加完毕后，继续搅拌一段时间，最后撤去冰盐水浴。

优选地，氯磺酸与吡啶的体积比为0.2～0.3:1，更优选地，氯磺酸与吡啶的体积比为0.2～0.21:1。

优选地，按金丝桃素与氯磺酸的摩尔比为1:6～10，将金丝桃素加入酯化试剂中，更优选地，金丝桃素与氯磺酸的摩尔比为1:8。

优选地，步骤(3)中，用氢氧化钠将反应液中和至pH＝7～9，更优选地，用氢氧化钠将反应液中和至pH＝8。

优选地，步骤(3)醇沉时，乙醇体积浓度为70～80％，更优选地，乙醇体积浓度为75％。

优选地，步骤(2)的反应温度为40℃，反应时间为4小时。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是金丝桃素色谱峰面积与进样量的标准曲线；

图2是金丝桃素及其硫酸酯的红外光谱图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1.1试剂和仪器

氯磺酸，上海实验试剂有限公司；吡啶，国药集团化学试剂有限公司。甲醇、乙醇、乙酸乙酯、硫酸、乙醚，分析纯，上海化学试剂厂产品。

Waters 486型高效液相色谱仪，RE-52A型旋转蒸发仪，SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，HHS21-N型电热恒温水浴锅。

1.2金丝桃素的提取和纯化

1.2.1预处理精确称取粉碎的贯叶连翘1kg，装入渗漉柱中，分批加乙醚进行渗漉，前1-5次分别加乙醚2000ml、1750ml、1500ml、1250ml、1000ml(经过第5次渗漉后，渗漉液中叶绿素的颜色变淡)，合并渗漉液，用旋转蒸发仪回收乙醚(回收率70％)，即得除去叶绿素等脂溶性物质的贯叶连翘。

1.2.2提取将乙醚处理过的贯叶连翘药粉装入圆底烧瓶中，加乙醇2500ml在50℃的水浴锅中热浸提取2h后取出，冷却、过滤,滤液备用。在此期间用薄层层析(TLC)进行跟踪(金丝桃素在254nm的紫外灯下呈橙红色的荧光斑点，若滤液中有与金丝桃素对照液Rf相同的斑点，表明滤液中含有金丝桃素)。反复热浸提取，直到薄层层析检测不到橙红色的荧光斑点为止(重复提取10次，TLC结果显示滤渣中已无金丝桃素存在)。合并滤液，减压浓缩为浸膏，回收乙醇(回收率75％)。然后将浸膏用50℃的热水悬浮，用乙酸乙酯萃取，再将乙酸乙酯萃取物减压蒸馏，即得到除去脂溶性和水溶性杂质的金丝桃素浸膏(粗提物)。

1.2.3分离与纯化将树脂装入洗脱柱中，然后将浓缩得到的浸膏用50ml乙醇溶解，加到洗脱柱中，用乙醇作为洗脱剂进行树脂柱层析，利用洗脱液呈玫瑰红色的特性结合薄层层析检查，分段接收不同组分的洗脫液，合并与金丝桃素对照品溶液Rf相同的组分，将其洗脫液经旋转蒸发仪减压蒸馏，真空干燥，即为所得产品。

1.2.4金丝桃素含量的测定

1.2.4.1色谱柱KromasilC18(250mm@416mm,5Lm)，流动相:乙腈-双蒸水(140B10,内含1％的冰醋酸)，柱温:30℃，流速:1ml/min，检测波长:284nm。

1.2.4.2标准液的配制精确称取金丝桃素对照品1mg，用甲醇溶解，用注射器吸出移至10ml容量瓶中，用甲醇反复洗涤，加甲醇定容。

1.2.4.3样品液的配制精确称取样品85mg，用甲醇溶解，移至10ml的容量瓶中，用甲醇洗涤多次，加甲醇定容。

1.2.4.4标准曲线的绘制分别吸取2.5μl、5.0μl、7.5μl、10.0μl、15.0μl的金丝桃素对照品溶液进样，以峰面积y对其进样量x(Lg)的标准曲线如图1。

所得回归方程为y＝1.64×10⁶x-96901，R²＝0.9990

1.2.4.5样品含量测定精确吸取10μl的样品液进样，计算求出样品中金丝桃素的含量。

1.2.4.6该工艺所得产品中金丝桃素的含量为92％。

1.3金丝桃素衍生物的制备

1.3.1酯化试剂的制备

将带有搅拌(磁力搅拌)和冷凝装置的三颈烧瓶置冰盐水浴中，加入25mL无水吡啶，快速搅拌，充分冷却至0℃，边搅拌边逐滴加5.2mL氯磺酸(约0.08mol)，于40min内滴加完毕，维持反应30min，撤去冰盐水浴和磁力搅拌装置。

1.3.2用氯磺酸-吡啶硫酸化修饰方法

精确称取金丝桃素5.04g，加入上述酯化试剂中，设定的水浴温度为40℃，和反应时间4h搅拌反应，反应结束后冷却至室温，反应液加入预冷的100mL冰水中，用15％氢氧化钠溶液中和至pH＝8.0，边摇边缓慢加入为反应液3倍体积的无水乙醇，静置24h，离心，取沉淀，用少量水洗3遍，在不超过40℃情况下减压干燥，所得的白色固体即为目标化合物。

1.3.3结构测定

红外光谱分析

金丝桃素(B)及其衍生物(A)的红外光谱图，见图2，分析图谱可知，在3343cm处有1个强而宽的吸收峰，是分子间氢键缔合的羟基O-H的伸缩振动产生的，而形成的硫酸酯中的这处峰变窄变弱，表明由于硫酸基团的取代使分子的羟基数量减少，局部结构发生了改变。并且衍生物在819和1251cm^-1具有硫酸酯的特征吸收，其中819cm-1处是C-S-O的伸缩振动，1251cm^-1处为C-S-O，中S＝O双键的伸缩振动，表明此方法下，经过硫酸化修饰的金丝桃素仍具有母体金丝桃素结构。

所得的目标化合物的化学结构式如下：

化学名：金丝桃素硫酸酯。

实施例2金丝桃素衍生物制备工艺的优化

2.1.材料与仪器

2.1.1实验药品及试剂

金丝桃素，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所药物研究室制备；

其余试剂全部为分析纯，天津试剂厂。

2.1.2实验仪器

85-2恒温加热磁力攒拌器，杭州仪表电机有限公司；RE-2000旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；101A-4电热鼓风干燥箱，上海实验仪器厂。量筒、移液管、洗耳球、烧杯、精密试纸、玻璃棒、滴管等常规试验器材若干。

2.2.方法与结果

将带有搅拌(磁力搅拌)和冷凝装置的三颈烧瓶置冰盐水浴中，加入25mL无水吡啶，快速搅拌，充分冷却后0℃，滴加5.2mL氯磺酸，边搅拌边逐滴加氯磺酸，于40min内滴加完毕，维持反应30min，撤去冰盐水浴和磁力搅拌装置。

精确称取5.04g金丝桃素，加入上述酯化试剂中，设定的水浴温度为40℃，和反应时间4h搅拌反应，反应结束后冷却至室温，反应液加入预冷的100mL冰水中，用15％氢氧化钠溶液中和至pH8.0，边摇边缓慢加入3倍体积的无水乙醇，静置24h，离心，取沉淀，用少量水洗3遍，不超过40℃情况下减压干燥，所得的白色固体及为金丝桃素硫酸酯。

2.2.1合成工艺优化

2.2.1.1原料配比的影响

固定水浴温度为40℃，反应时间4h，用15％氢氧化钠溶液中和至pH8.0。考察收率，原料金丝桃素/氯磺酸摩尔配比，结果见表1。

表1原料配比对收率的影响

由表1可知，随着金丝桃素/氯磺酸摩尔配比提高，产物收率増加明显，但金丝桃素/氯磺酸酯摩尔配比提高到1:8后，收率增加并不明显，而且造成原料浪费。

因此，最佳原料配比为1:8。

2.2.1.2反应时间对收率的影响

固定水浴温度为40℃，原料金丝桃素/氯磺酸摩尔配比为1:8，用15％氢氧化钠溶液中和至pH8.0。考察收率，考察反应时间对产物收率的影响，结果见表2。

表2反应时间对收率的影响

由表2可知，随着反应时间的增加，产物收率增加。当大于4h后，收率增加不明显。

确定最佳反应时间为4h。

2.2.1.3反应温度对收率的影响

固定原料配比为1:8，反应时间为4h，用15％氢氧化钠溶液中和至pH8.0。考察反应温度对产物收率的影响，结果见表3。

表3反应温度对收率的影响

由表3可知，从20到50℃时，随着反应温度的增加，产物收率增加。当大于40℃后，收率增加不明显。

确定最佳反应温度为40℃。

2.2.1.4碱性环境对对收率的影响

固定原料配比为1:8，反应时间为4h，反应温度为40℃，考察pH值对产物收率的影响，结果见表4。

表4pH值对反应收率的影响

由表4可知，pH值对收率的影响较大。

确定最佳pH值为8。

实施例3金丝桃素与金丝桃素硫酸酯体外抗犬瘟热病毒的活性比较

犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种高度接触性传染病，具有发病率高、死亡率高等特点，临床上以高热、呼吸道症状和神经症状为主，是当前对宠物饲养业危害最大的疫病之一。目前，犬瘟热病毒的免疫预防主要依赖于弱毒疫苗，但弱毒疫苗在一定程度上可损害神经系统，甚至造成免疫抑制。因此，寻求更为安全有效的疫苗或药物迫在眉睫。金丝桃素为藤黄科金丝桃属多年生草本植物的提取物，是贯叶连翘提取物中最具生物活性的物质。现代药理研究发现，金丝桃素具有抗抑郁、抗肿瘤、抗病毒及止血消炎等作用。由于金丝桃素的多种生物学活性，近年它已成为国际上新药研发的热点之一。但金丝桃素本身的性质不稳定，限制了其在临床中的推广应用。本发明通过对金丝桃素结构修饰，研发出了稳定性好，生物活性更强的衍生物，为了验证其生物活性，本试验初步比较了金丝桃素与金丝桃素硫酸酯体外抗犬瘟热病毒的结果比较。为今后进一步开发金丝桃素硫酸酯奠定基础。

3.1材料与方法

3.1.1试验药物

金丝桃素与金丝桃素硫酸酯，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所药物室制备，用0.5％CMC-Na将金丝桃素与金丝桃素硫酸酯配制成混悬液。

非洲绿猴肾细胞(Vero)，由甘肃兰州民海生物公司惠赠。

犬瘟热病毒(CDV)，购自中国兽医药品监察所。

MEM培养基，胎牛血清，购自美国HyClone公司；100mL/L胎牛血清细胞生长液，胰蛋白酶，购自美国Difco公司，上海生物化学试剂公司分装；碳酸氢钠等均为国产分析纯试剂。

3.1.2病毒半数细胞感染量(TCID50)

按常规方法，将Vero细胞进行消化传代，加至96孔细胞培养板中，0.1mL/孔，50mL/L CO₂、37℃培养。待细胞长成单层后，接种稀释度分别为10^-1-10^-10的病毒液，每个稀释度接种6孔，另设细胞对照，50mL/L CO₂、37℃培养72h，每天观察CPE(cytopathic effect，细胞病变)情况。计算TCID₅₀。

3.1.3药物对细胞无毒浓度(TC0)的测定

将药物原液连续倍比稀释后，加至长成单层的Vero细胞96孔培养板上，0.1mL/孔，每个稀释度重复6孔，另设细胞对照,置于50mL/L CO₂培养箱、37℃培养72h，每天观察CPE情况。

3.1.4药物体外抗CDV试验

用100TCID₅₀的CDV感染Vero细胞，设细胞对照组、病毒对照组和金丝桃素与金丝桃素硫酸酯组(0.039-0.312 5g/L)共4个浓度组。采用3种方式加药：药物的阻断作用(先药后毒)；先将药物加入Vero细胞，37℃培养2h后，再接种病毒；药物对病毒的抑制作用(先毒后药)：将病毒先感染Vero细胞，37℃培养2h后，再加入各浓度的药物；药物的直接作用(药毒同加)：37℃将病毒与药物同时加入到Vero细胞中。此后各组细胞置于50mL/L CO₂、37℃培养，每天观察CPE情况，当病毒对照组的CPE达到++++时，记录CPE情况。

3.2结果

3.2.1病毒TCID₅₀的测定

将病毒接种Vero细胞后第72h，测得CDV的TCID₅₀为10^-5.68/0.1mL。

3.2.2药物对细胞TC0的测定

药物加入Vero细胞后第72h，测得药物对细胞的TC0为0.312g/L。结果见表5。

表5药物对细胞无毒浓度(TC₀)的测定

3.2.3细胞培养与细胞病变的观察

Vero细胞加入96孔板后，第24h时可长成致密的单层，正常细胞呈多角形、圆形等多种形态,细胞轮廓清楚。细胞接种CDV后第72h和第96h时，细胞逐渐失去多角形轮廓，开始脱落、变圆、聚集成堆。

3.2.4不同给药方式下药物对病毒的作用

3.2.4.1药物对病毒的阻断作用结果显示，在第72h时病毒对照组的视野中到处可见圆细胞或死亡细胞，病变特征非常明显。试验组(金丝桃素)视野中同样可见大量圆细胞或死亡细胞，细胞单层破坏严重。第96h时，试验组细胞单层几乎完全遭到破坏。而试验组(金丝桃素硫酸酯)有一定的抗病毒效果作用，见表6。

表6药物对病毒的阻断作用

3.2.4.2药物对病毒的抑制作用结果显示，第72h时试验组细胞单层基本完整，大部分细胞生长良好，偶尔出现圆细胞或死细胞。第96h时病毒对照组细胞已全部发生病变，而试验组细胞虽遭到病毒的破坏，但细胞单层基本良好，细胞折光性跟正常细胞基本一致。金丝桃素硫酸酯较金丝桃素抗病毒效果明显，见表7。

表7药物对病毒的抑制作用

3.2.4.3药物对病毒的直接杀灭作用结果显示，第72h时大部分试验组细胞与病毒对照组一致，都遭受严重破坏，细胞病变典型，第96h时细胞单层严重残缺，基本不成单层。试验组(金丝桃素硫酸酯)结果有一定的抗病毒效果作用，见表8。

表8药物对病毒的直接杀灭作用

3.3讨论

近年来，随着我国军犬、警犬、试验用犬和宠物犬饲养量的大幅度增加和生态环境的改变，犬瘟热在我国犬属动物中的发病率和致死率均呈现明显的上升趋势。当前对犬瘟热的治疗还没有特效药，主要采用大剂量注射犬瘟热超免疫血清和结合抗菌药物、皮质激素类药物及维生素等进行对症治疗，同时配合良好的护理，对早期病犬可获得一定疗效，因此，研发新型抗病毒药物用于治疗犬瘟热具有非常重要的意义。

金丝桃素是从贯叶连翘中提取的有效活性成分之一，它对艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、口蹄疫病毒、流感病毒等均有一定的抑制作用。为了比较修饰前后生物活性，课题组将金丝桃素用于治疗犬瘟热，并初步探讨金丝桃素、金丝桃素硫酸酯体外抗犬瘟热病毒的作用效果，通过对两种化合物的活性比较，金丝桃素硫酸酯抗犬瘟热的活性明显高于金丝桃素。相关研究表明，抗病毒作用的机理主要有两种途径，一是直接杀灭病毒作用，二是抑制病毒的增殖。本试验中通过三种不同给药方式来观察金丝桃素、金丝桃素硫酸酯抗犬瘟热病毒的作用：药物对病毒的抑制作用(先毒后药)，旨在观察药物能否对细胞内的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟释放；药物通过增强细胞的抵抗力而表现出抗病毒感染细胞的作用(先药后毒)，旨在观察药物能否进入细胞或吸附细胞表面以阻止病毒的吸附和增殖；药物和病毒同时加入细胞中(药毒同加)，旨在观察药物对病毒的直接杀灭作用。试验结果表明，金丝桃素、金丝桃素硫酸酯在先感染病毒后给药的情况下，病毒对照组细胞发生明显病变，但试验组细胞生长良好，细胞折光性跟正常细胞基本一致，特别是金丝桃素硫酸酯组对病毒表现出良好的抑制作用；在先给药后感染病毒情况下，金丝桃素、金丝桃素硫酸酯对Vero细胞的保护作用较弱，金丝桃素硫酸酯有一定的抗病毒效果作用，原因可能与药物作用时间过短，细胞未能将药物完全吸收，间接降低了所加入药物的作用浓度有关。

综上所述，金丝桃素、金丝桃素硫酸酯在体外细胞试验中对CDV的抑制作用较强，且其金丝桃素硫酸酯组明显强于金丝桃素组。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种金丝桃素衍生物，具有如下化学结构式：

2.权利要求1所述金丝桃素衍生物的应用，其特征在于，所述金丝桃素衍生物在制备抗犬瘟热病毒药物中的应用。

3.权利要求1所述金丝桃素衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将氯磺酸滴入吡啶，得到酯化试剂；

(2)将金丝桃素加入酯化试剂中，于20～50℃反应2～10小时；

(3)用氢氧化钠中和步骤(2)的反应液，然后加入乙醇，醇沉得到金丝桃素衍生物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：将氯磺酸滴入吡啶时，维持体系温度为0℃。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：氯磺酸与吡啶的体积比为0.2～0.3:1。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：氯磺酸与吡啶的体积比为0.2～0.21:1。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：按金丝桃素与氯磺酸的摩尔比为1:6～10，将金丝桃素加入酯化试剂中，优选地，金丝桃素与氯磺酸的摩尔比为1:8。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，用氢氧化钠将反应液中和至pH＝7～9，优选地，用氢氧化钠将反应液中和至pH＝8。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)醇沉时，乙醇体积浓度为70～80％，优选地，乙醇体积浓度为75％。

10.根据权利要求3～9任一所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)的反应温度为40℃，反应时间为4小时。