CN107970285A - 一种微波辅助提取高乌头中总生物碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微波辅助提取高乌头总生物碱的方法，包括以下步骤：1)原料预处理：将高乌头粉末原料进行烘干和粉碎，产物过筛，取细粉作为原料进行提取；2)超声提取：配制一定浓度的乙醇作为提取溶剂，先向提取溶剂中加入浓度为1‑2％的盐酸调节混合溶剂的pH＝2‑6，然后将步骤1)所得的乌头粉末与混合溶剂进行充分混合，静置浸泡20‑60min后，在微波功率为700‑900W下提取2‑10min,滤去不溶物，得滤液；3)重复步骤2)的提取过程0‑3次，合并几次提取滤液得最终滤液。本发明具有操作简单快捷，提取率高，速度快，效率高，节约能源的优点。

Description

一种微波辅助提取高乌头中总生物碱的方法

技术领域

本发明涉及一种生物碱的提取方法，特别是一种微波辅助提取高乌头中总生物碱的方法。

背景技术

高乌头为毛茛科乌头属植物，产于我国西部、中部，中药常以其根入药，具有活血化瘀、止痛消肿等功效，可治疗风寒关节冷痛、风湿等疾病。近年来，对高乌头生物碱的研究一直都比较活跃，从总生物碱中分离出各成分，再经过药理筛选出和开发具有镇痛、麻醉作用，镇痛效果好，无成瘾性或具有活血化瘀、止痛消肿等其它药理作用的多种生物碱药物，将具有很好的市场应用及开发前景。

高乌头药材中主要活性成分是二萜类生物碱，迄今从高乌头根中共分离鉴定了28种化合物，其中27种为二萜生物碱，如高乌碱甲(sinaconifine A)、高乌碱乙(sinaconitine B)、冉乌碱(ranaconitine)，去乙酰冉乌碱(N-deacetylranaconitine)、高乌宁甲(sinomontanineA)、高乌宁乙(sinomontanine B)、高乌宁己(sinomontanine F)、高乌宁辛(sinomontanine H)、刺乌宁(1appaconine)、刺乌定(lappaconidine)、excelsine、8-O-acetylexcelsine、高乌宁庚(sinomontanine G)、高乌宁丁(sinomontanine D)、高乌宁戊(sinomontanineE)、高乌宁丙(sinomontanine C)、高乌宁壬(sinomontanine I)、高乌亭甲(sinomon tanitine A)、高乌亭乙(sinomontanitine B)、septatisine、牛扁酸单甲酯(lycaconitic acidmonomethyl ester)、去亚甲光飞燕草碱(demethylenedelcorin)、硬飞燕草碱(18-Omethylgigactonine)、来本宁(lepenine)、ranaconidine和N-(chloromethyl)taspine等。

目前，生物碱的提取方法很多，考虑到方法简便和节约生产成本，现有技术中虽然有公开微波辅助法的提取方法，但是很少报道有微波辅助法提取高乌头中的总生物碱。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足而提供一种微波辅助提取高乌头中总生物碱的方法，该方法操作简单快捷，提取率高，速度快，效率高，节约能源。

本发明的技术方案是：一种微波辅助提取高乌头总生物碱的方法，包括以下步骤：

1)原料预处理：将高乌头粉末原料进行烘干和粉碎，产物过筛，取细粉作为原料进行提取；

2)超声提取：配制一定浓度的乙醇作为提取溶剂，先向提取溶剂中加入浓度为1-2％的盐酸调节混合溶剂的pH＝2-6，然后将步骤1)所得的乌头粉末与混合溶剂进行充分混合，静置浸泡20-60min后，在微波功率为700-900W下提取2-10min,滤去不溶物，得滤液；

3)重复步骤2)的提取过程0-3次：每次提取完后过滤，滤渣再按照步骤2)进行重复提取，合并几次提取滤液得最终滤液。

本发明进一步的技术方案为：所述步骤2)中乙醇的浓度为50-90％，该浓度乙醇的极性大小与高乌头总生物碱的极性大小相近，对高乌头总生物碱的溶解度大，而对杂质溶解度相对较小，因而对高乌头总生物碱的提取较快，杂质提取少，纯度也相应较高。

进一步的，所述步骤2)中静置浸泡过程在20-35℃的温度下进行，在该温度下浸泡，使混合提取溶剂能充分渗透到药材颗粒中，溶剂进入药材颗粒内部后，进入的盐酸使高乌头总生物碱成盐而更易溶于混合提取溶剂，有利于高乌头总生物碱的提取。

进一步的，所述步骤2)中乌头粉末与混合溶剂按料液比为1:5-1:25g/ml进行充分混合，使用加入浓度为1％-2％的盐酸溶液(调pH到2)与乙醇混合的混合溶剂，高乌头总生物碱在酸性溶液里成盐，从而更易溶解于我们的提取溶剂，高乌头总生物碱在混合溶剂中溶解更快，提取更快更彻底。

进一步的，所述步骤2)中的微波反应在微波反应仪中进行，通过微波辅助提取，微波加热迅速，微波产生的电磁场还可加速被萃取组分的分子由固体内部向固液界面扩散的速率，缩短萃取组分的分子由固体内部扩散至固液界面的时间，使萃取速率提高数倍，微波可对萃取物质中的不同组分进行选择性加热，从而可提高萃取效率和产品纯度。同时节省50％-90％的时间和能量，微波辅助提取具有高效节能，安全环保等特点。

进一步的，所述步骤1)中的筛为150-250目筛，高乌头粉碎过150-250目筛，药材颗粒细，混合溶剂渗透进入药材颗粒内部快，同时高乌头总生物碱更易溶解于混合溶剂，还能迅速扩散到固液界面，因而提取更快。

上述步骤3)所得滤液中生物碱提取率的测定方法为：取滤液0.5ml定容至50ml容量瓶中，采用紫外分光光度法测定滤液的吸光度A，根据回归方程C＝52.574A-0.9863计算测定滤液中总生物碱的浓度C，再根据高乌头中总生物碱提取率＝C×50×10^-4/所用原料重量×100％，计算得出步骤2)所得滤液中生物碱提取率，所述滤液吸光度A的测定过程在200-600nm波长范围内以2nm/s的扫描速度进行。

本发明采用微波辅助提取的原理是：微波萃取过程中，高频电磁波穿透萃取介质，到达被萃取物料的内部，微波能迅速转化为热能而使细胞内部的温度快速上升，加热迅速，当细胞内部的压力超过细胞的承受能力时，细胞就会破裂，有效成分即从胞内流出，并在较低的温度下溶解于萃取介质。微波所产生的电磁场还可加速被萃取组分的分子由固体内部向固液界面扩散的速率。从而缩短萃取组分的分子由固体内部扩散至固液界面的时间，结果使萃取速率提高数倍，最大限度地保证萃取物的质量。微波可对萃取物质中的不同组分进行选择性加热，因而可使目标组分与基体直接分离开来，从而可提高萃取效率和产品纯度。同时微波加热时，主要是物料吸收微波能，金属材料只能反射而不能吸收微波，因此，热损失仅占总能耗的极少部分，与传统的溶剂提取法相比，可节省50％-90％的时间和能量，微波辅助提取具有高效节能，安全环保等特点。

本发明与现有技术相比具有如下特点：本发明先提取溶剂中加入酸性试剂调节提取溶剂的pH值为酸性，然后加入原料进行浸泡一定时间，酸性混合提取溶剂能充分渗透到药材细小颗粒中，溶剂进入药材颗粒内部后，进入的盐酸使高乌头总生物碱成盐而更易溶于混合提取溶剂，使高乌头总生物碱在混合溶剂中溶解更快，因药材颗粒细小，高乌头总生物碱还能迅速扩散到固液界面，因而提取更快，提取更快更彻底，有利于后续高乌头总生物碱的提取，浸泡后再进行微波提取，微波能迅速加热药材颗粒及渗透到里面的溶剂，高乌头总生物碱在较高温度下更易和更快的溶解于混合溶剂中，通过这些优化的组合工艺，不仅总的制备时间较短(不超过30分钟)，而且最终高乌头总生物碱的提取率较高。

以下结合附图和具体实施方式对本发明的详细工艺过程作进一步描述。

附图说明

图1为本发明实施例1中乙醇浓度对总生物碱提取率影响的比较图；

图2为本发明实施例2中溶液pH对总生物碱提取率影响的比较图；

图3为本发明实施例3中料液比对总生物碱提取率影响的比较图；

图4为本发明实施例4中微波时间对总生物碱提取率影响的比较图；

图5为本发明实施例5中微波功率对总生物碱提取率影响的比较图；

图6为本发明具体实施方式中高乌头中总生物碱浓度与吸光度之间关系的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1：

准确称取高乌头粉末5.0g于烧杯中，按1:10料液比，分别加入50％、60％、70％、80％、90％的乙醇溶液，提取前用2％盐酸调pH到3，同时30℃浸泡40分钟，在波功率为700W下提取4min，滤去不溶物，取滤液0.5mL定容至50mL容量瓶中，测量吸光度，得出最佳提取溶剂。根据回归方程C＝52.574A-0.9863计算测定液中的生物碱含量，再根据下式计算生物碱提取率：总生物碱提取率(％)＝C×50×10-3(g)/所用原料重量(g)×100％(式中：C表示计算出的总生物碱浓度)结果如下表1和附图1：

表1乙醇浓度的影响

由表1和附图1可以看出，随着乙醇浓度的增加，总生物碱提取率也随之增大，当乙醇浓度达到70％时，总生物碱提取率最大，之后随着乙醇浓度的增加总生物碱提取率反而降低。在微波的影响下，在70％乙醇中的溶解度最大，乙醇体积分数小于70％时生物碱并未完全浸出，而在大于70％时，一些脂溶性物质的溶解度增加，影响了生物碱的溶解，加上微波高温的破坏降解，提取率反而降低，故将乙醇体积分数选定在70％。

实施例2：

准确称取高乌头粉末5.0g于烧杯中，按上述最佳提取溶剂，用2％盐酸调节溶液pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，同时35℃浸泡30分钟，再调节微波功率800W，分别进行微波提取4min，滤去不溶物，取滤液0.5mL定容至50mL容量瓶中，测量吸光度，得出最佳提取溶剂pH。根据公式C＝52.574A-0.9863计算出提取率。结果如下表2和附图2所示：

表2溶液pH的影响

由表2和附图2可以看出，不同的pH对生物碱提取效果有较显著的影响。pH值越低，提取效果越好，pH＝2.0与pH＝3.0提取效果相差不大，而pH越低对设备可能会造成损伤，增加工艺成本。故选定溶液最佳pH值为3.0。

实施例3：

准确称取高乌头粉末5.0g于烧杯中，分别加入料液比为1:5g/ml、1:10g/ml、1:15g/ml、1:20g/ml、1:25g/ml、1:30g/ml的上述最佳提取溶剂，提取前用4％盐酸调pH到3，同时25℃浸泡45分钟，再分别在微波功率为700W进行超声提取4min，滤去不溶物，取滤液0.5mL定容至50mL容量瓶中，测量吸光度，得出最佳料液比。根据回归方程C＝52.574A-0.9863计算测定液中的生物碱含量，再根据下式计算生物碱提取率：总生物碱提取率(％)＝C×50×10-4(g)/所用原料重量(g)×100％(式中：C表示计算出的总生物碱浓度μg/mL)结果如下表3和附图3所示：

表3料液比的影响

由表3和附图3可以看出，当料液比达到1:15g/ml之后，再增加料液比，总生物碱提取率得率基本保持不变，料液比太小时提取率低，提取不充分，料液比太大造成浪费。故选择料液比1:15g/ml为最佳料液比。

实施例4：

准确称取上述200目高乌头粉末5.0g于烧杯中，按上述最佳提取条件分别进行微波提取2min、4min、6min、8min、10min，提取前用1％盐酸调pH到2，同时25℃浸泡50分钟，滤去不溶物，取滤液0.5mL定容至50mL容量瓶中，测量吸光度，得出最佳超声时间。根据公式C＝52.574A-0.9863计算出提取率，结果如下表4和附图4：

表4微波时间的影响

从表4和附图4中可以看出：微波提取时间越长，总生物碱提取率先上升后下降，在4min时达到提取率最大值，造成这种结果可能是因为微波辐射时间太长，总生物碱部分被降解，影响生物碱的提取率，导致生物碱提取率降低。

实施例5：

分别准确称取高乌头粉末5.0g于各烧杯中，按上述最佳提取条件，分别调节微波功率1、2、3、4、5档(功率对应约为700W、750W、800W、850W、900W)分别进行微波提取4min，滤去不溶物，取滤液0.5mL定容至50mL容量瓶中，测量吸光度，得出最佳超声时间。根据公式C＝52.574A-0.9863计算出提取率，结果如下表5和附图5所示：

表5微波功率的影响

由表5和附图5可知，随着微波功率的升高，总生物碱提取率也不断升高，当微波功率达到800W之后，继续增大火力，总生物碱提取率升高得非常缓慢，故微波功率控制在800W为最佳。

正交实验：

为系统考查微波辅助法的工艺参数对提取结果的影响和优选最佳提取工艺条件，选用L9(34)进行正交试验来确定最佳的提取工艺。根据单因素试验结果，确定微辅助提取高乌头总生物碱的正交试验的因素水平范围如下表6和表7所示：

表6因数水平表

表7正交试验结果

由正交实验表7直观分析可知4种因素最佳组合为A1B2C2D2。根据极差R的大小，进行因素影响的主次排序，R越大，该因素对实验的影响越大。四个因素的主次关系是D>C>A>B，即微波功率>微波时间>料液比>乙醇浓度。最优水平为A因素即料液比1:15g/ml为宜，B因素即乙醇浓度以70％为宜，C因素微波时间以4min为宜，D因素即微波功率以850W为宜，提取溶剂pH＝3,提取前浸泡40分钟，微波提取3次，在此最优条件下，总生物碱提取率为1.347％。

验证实验：

通过上述分析得到的最佳提取工艺条件下进行重复实验3次，3次实验得到总生物碱提取率分别为1.325％、1.356％、1.288％，高乌头总生物碱平均率为1.323％。

上述实施例均采用高乌头中总生物碱为对照品，用紫外分光光度法对高乌头提取液中总生物碱含量进行测定，为总生物碱提取过程中的跟踪监测提供简便可靠的检测，并对产品的实际品质检测提供精确高效的方法；而且上述实施例均包含下述过程：

(1)标准溶液的配制

精确称取高乌头中总生物碱标准品15mg于50mL的容量瓶中，加适量甲醇溶液溶解，完全溶解并定容制得贮备液(0.3mg/mL)。精密吸取该标准品1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制得浓度为30μg/mL的高乌头中总生物碱标准溶液。

(2)最适波长的选择

取上述标准溶液2mL，以甲醇作空白对照，用紫外可见分光光度计在波长200～600范围内以2nm为间隔单位进行扫描，实验扫描结果可知，溶液在波长为252～254nm处有最大吸收峰，确定最大吸收波长为252nm。

(3)标准曲线的制作

精密称取高乌头中总生物碱标准品50.5mg，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并定容制得贮备液，精密吸取该对照品溶液，置于50mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。分别吸取此液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL置于10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，以甲醇为空白，在252nm波长处测定吸光度。

用浓度对吸光度进行线性回归，回归方程为：C＝52.574A-0.9863,R²＝0.9988，对照品溶液在4.37-39.86μg/mL范围内成线性关系，如图6所示。

取样品溶液在室温，避光放置0、20、24、41h，在252nm波长处测定吸光度，结果表示稳定性良好。

(4)高乌头提取液中总生物碱含量测定

准确高乌头粉末5g，加入适量的提取溶剂，用超声波辅助提取法进行提取，过滤后，吸取0.5mL滤液，加入提取溶剂定容到50mL的容量瓶中，在最适波长处测吸光度，将测得值代入标准曲线的回归方程，求出提取液中总生物碱的浓度C(μg/mL)，并按下式计算总生物碱的提取率：

总生物碱提取率(％)＝C×50×10-4(g)/所用原料重量(g)×100％，上式中：C表示计算出的总生物碱浓度。

对比例1：

准确称取高乌头粉末5.0g于烧杯中，提取溶剂为50毫升的50-90％乙醇，也同时35℃浸泡30分钟，随后用加热回流提取三次，合并三次滤液并浓缩到5050mL，取滤液0.5mL定容至50mL容量瓶中，测量吸光度，计算提取率。重复三次实验，计算平均提取率为1.143％，比我们微波提取的得率(1.347％)低15.15％，传统加热回流提取时间长，每次提取2小时，总共需要花费6小时提取，提取时加温到90℃左右，高乌头总生物碱因长时间加热破坏，因而提取率低于微波提取的提取率，因而能耗远大于微波提取，微波提取三次只要12分钟，提取时间为传统加热回流提取的1/30，因而微波提取具有高效节能、周期极短、综合成本低、提取率较高等明显优势。

Claims (6)

1.一种微波辅助提取高乌头中总生物碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)原料预处理：将高乌头粉末原料进行烘干和粉碎，产物过筛，取细粉作为原料进行提取；

2)超声提取：配制一定浓度的乙醇作为提取溶剂，先向提取溶剂中加入浓度为1-2％的盐酸调节混合溶剂的pH＝2-6，然后将步骤1)所得的乌头粉末与混合溶剂进行充分混合，静置浸泡20-60min后，在微波功率为700-900W下提取2-10min,滤去不溶物，得滤液；

3)重复步骤2)的提取过程0-3次：每次提取完后过滤，滤渣再按照步骤2)进行重复提取，合并几次提取滤液得最终滤液。

2.根据权利要求1所述的微波辅助提取高乌头中总生物碱的方法，其特征在于，所述步骤2)中乙醇的浓度为50-90％。

3.根据权利要求1所述的微波辅助提取高乌头中总生物碱的方法，其特征在于，所述步骤2)中静置浸泡过程在20-35℃的温度下进行。

4.根据权利要求1所述的微波辅助提取高乌头中总生物碱的方法，其特征在于，所述步骤2)中乌头粉末与混合溶剂按料液比为1:5-1:25g/ml进行充分混合。

5.根据权利要求1所述的微波辅助提取高乌头中总生物碱的方法，其特征在于，所述步骤2)中的微波反应在微波反应仪中进行。

6.根据权利要求1所述的微波辅助提取高乌头中总生物碱的方法，其特征在于，所述步骤1)中的筛为150-250目筛。