CN107952112B - 一种含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管及其制备方法 - Google Patents

一种含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管，神经导管由芯层和壳层组成，其中壳层为可降解高聚物圆柱体中空管状多孔导管，芯层为取向的丝素蛋白纳米纤维。本发明还公开了上述神经导管的制备方法：1)在壳层导管灌注丝素溶液并诱导凝胶化；2)将导管置于液氮环境中定向冷冻，在芯层形成定向丝素蛋白纳米纤维。本发明操作简单，制备的神经导管生物相容性良好，可生物降解。导管内部为定向排列的纳米纤维，而且可以装载生长因子，从而为神经细胞的生长提供物理引导信号和生物学刺激信号，根据实际情况可以制备成不同尺寸的导管用于脊髓和周围神经损伤修复。

Description

一种含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管及其制备 方法
技术领域
本发明涉及神经导管技术领域，尤其涉及一种含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管及其制备方法。
背景技术
神经损伤的修复是临床上尚未解决的难题。利用生物可降解材料研制具有促进神经再生功能的神经引导导管是组织工程领域研究的热点。目前研究较多的神经导管材料主要为空心管状结构，这类人工神经移植物的修复效果与自体神经相比还有较大的差距，重要原因之一就是，在神经再生过程中，由于缺乏合适的物理引导信号，会导致神经元的迁移和神经纤维束再生延伸会发生互相错位甚至缠绕成团的现象。在空管内添加凝胶、薄膜等可以在一定程度上促进细胞迁移和神经再生，但这些材料没有微纳米定向引导信号，不利于引导神经轴突的生长和穿越病灶区，神经损伤的修复效果较差。
大量的研究表明，取向排列的纳米纤维能够引导神经元迁移和轴突生长，从而为神经再生提供物理引导信号。通过静电纺丝法可以获得取向的纳米纤维用于制备神经再生支架，如国际刊物Biomaterials上发表的研究(Clements I P,et al.Biomaterials,2009,30(23):3834-3846.)中，研究人员将静电纺纳米纤维膜到聚合物导管内，可以促进大鼠的外周神经再生。但是，静电纺纤维只能作为薄膜填充在导管内部，难以在导管内部形成三维纳米纤维网络。公布号为CN104739473A的发明专利将静电纺纳米纱线填充在空心导管内，形成纳米引导信号，但是纱线内部也没有足够的孔隙率为细胞生长提供空间。而且，静电纺丝大多需要有机溶解，不利于装载蛋白类的生长因子。
蚕丝丝素蛋白是由蚕后部绢丝腺的内皮细胞分泌的高纯度蛋白质，不含细胞器和其他生物杂质，生物安全性高。蚕丝丝素蛋白由乙氨酸、丙氨酸、丝氨酸等二十种氨基酸组成，生物相容性好，可被生物降解且最终降解产物为多肽和游离氨基酸容易被机体代谢。研究显示，丝素蛋白材料也能够很好地支持神经元和神经干细胞的生长。丝素蛋白制备的导管材料，体内炎症反应低、可降解，能够促进周围神经缺损的功能性恢复。授权公布号为CN100382772C的发明专利利用蚕丝纤维和丝素蛋白制备神经导管，但是导管内部不具备定向引导的三维微纳米引导信号。
发明内容
为了克服现有技术的不足，实现绿色、温和的条件下在神经导管内部构建取向排列的丝素蛋白纳米纤维结构，本发明提供一种含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管及其制备方法，神经导管由芯层和壳层组成，其中壳层为可降解高聚物圆柱体中空管状多孔导管，芯层为取向的丝素蛋白纳米纤维。本发明还公开了上述神经导管的制备方法：1)在壳层导管灌注丝素溶液并诱导凝胶化；2)将导管置于液氮环境中定向冷冻，在芯层形成定向丝素蛋白纳米纤维。本发明操作简单，制备的神经导管生物相容性良好，可生物降解。导管内部为定向排列的纳米纤维，而且可以装载生长因子，从而为神经细胞的生长提供物理引导信号和生物学刺激信号，根据实际情况可以制备成不同尺寸的导管用于脊髓和周围神经损伤修复。
本发明采取的技术方案是：
本发明的含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管由可降解天然高聚物外层中空导管和由取向排列的丝素蛋白纳米纤维芯层组成。
所述的外层中空导管为多孔结构，其孔径为10～500μm。
所述的芯层纳米纤维直径为10～1000nm，沿神经导管长轴方向取向排列。
本发明的含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管的制备方法的具体步骤如下：
(1)神经导管外层中空导管的制备：将可降解天然高聚物溶液导入神经导管制备模具中，加入制孔剂或者通过冷冻干燥的方法，得到外层中空导管；
(2)将冷冻的外层导管一端封闭，将丝素蛋白溶液注入到导管中空结构内，诱导其凝胶化；
(3)将导管垂直插入到保温材料中，沿导管轴向缓慢浸入到液氮中，进行定向冷冻；
(4)将冷冻的导管置于冻干机进行冷冻干燥，在导管内部形成取向排列的丝素蛋白纳米纤维。
步骤(1)中，所述的天然高聚物为丝素蛋白、丝胶蛋白、壳聚糖、胶原、明胶的一种或者两种及以上的共混物。
步骤(1)中，所述的制孔剂为氯化钠、蔗糖、果糖、石蜡中的一种或者两种及以上混合物，所述制孔剂的粒径大小为10～500μm。
步骤(2)中，所述的丝素蛋白溶液为质量分数0.01～0.5％。
步骤(3)中，导管插入液氮速度为1×10-6～1×10-3m/s。
步骤(4)中，冷冻干燥时间为24-48小时。
本发明的积极效果如下：
(1)利用丝素蛋白自组装的原理和定向冷冻干燥手段可以得到尺寸在10-1000nm之间的取向排列的丝素蛋白纳米纤维，该法工艺过程简单、可控，能够为导管内构建细胞和神经轴突所需的物理引导信号。
(2)采用冷冻干燥制备的丝素蛋白纳米纤维，制备过程中无需添加任何辅助试剂，不会引起丝素蛋白生物相容性的降低，可以装载生物活性物质，在生物医用方面表现出明显的优势。
附图说明
图1是实施例一制备的丝素蛋白壳层导管SEM图片。
图2是实施例一制备的导管内部的取向丝素蛋白纳米纤维SEM图片。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：
将100g家蚕生丝浸入5L的0.05％Na2CO3溶液中，于98～100℃下煮沸处理30min，重复3次，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维；将丝素纤维加入到9.3mol/L的LiBr溶液中，在60℃下搅拌溶解1h得到丝素蛋白混合溶液；将所得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，得到纯化的丝素蛋白溶液；
将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到5％，灌入神经导管模具，在-80℃下冷冻24h成丝素蛋白冷冻固体，然后置于-4℃下3天诱导丝素蛋白结构转变，再进行冷冻干燥，得到外层导管。
根据专利CN106421902A公布的方法，制备快速凝胶化的丝素蛋白溶液。
将溶液稀释到0.2％，灌入到上述壳层导管内，并置于37℃下12小时诱导凝胶化。
将导管垂直插入到保温材料中，沿导管轴向以速度1×10-2m/s浸入到液氮中，进行定向冷冻；
将冷冻的导管置于冻干机进行冷冻干燥，在导管内部形成取向排列的丝素蛋白纳米纤维，形成含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管。
将实施例1制备过程中得到的丝素蛋白壳层导管进行电镜观察，检测结果如图1所示。
将实施例1制备过程中得到的定向丝素蛋白纳米纤维进行电镜观察，检测结果如图2所示。
实施例二：
将2％的壳聚糖溶液，灌入神经导管模具，在-80℃下冷冻24h，再进行冷冻干燥，得到外层壳聚糖导管。
根据专利CN101502670B公布的方法，制备快速凝胶化的丝素蛋白溶液。
将溶液稀释到0.5％，灌入到上述壳层导管内，并置于37℃下2小时诱导凝胶化。
将导管垂直插入到保温材料中，沿导管轴向以速度1×10-6m/s浸入到液氮中，进行定向冷冻；
将冷冻的导管置于冻干机进行冷冻干燥，在胶原导管内部形成取向排列的丝素蛋白纳米纤维，形成含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管。
实施例三：
将2％的胶原溶液，灌入神经导管模具，在-80℃下冷冻24h，再进行冷冻干燥，得到外层胶原导管。
根据专利CN106421902A公布的方法，制备快速凝胶化的丝素蛋白溶液。
将丝素蛋白溶液稀释到0.01％，灌入到上述壳层导管内，并置于37℃下24小时诱导凝胶化。
将导管垂直插入到保温材料中，沿导管轴向以速度1×10-4m/s浸入到液氮中，进行定向冷冻；
将冷冻的导管置于冻干机进行冷冻干燥，在胶原导管内部形成取向排列的丝素蛋白纳米纤维，形成含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管。
实施例四：
将脱胶的丝素纤维加入到摩尔比1:2:8的CaCl2/CH3CH2OH/H2O三元溶液中，在72℃下搅拌溶解1h得到丝素蛋白混合溶液；将所得到的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，得到纯化的丝素蛋白溶液；
将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到3％，析袋中，用去离子水透析3天，得到纯化的丝素蛋白溶液；
将丝素蛋白溶液的质量浓度调整到7％，灌入神经导管模具，加入平均直径为400μm的NaCl颗粒，室温放置2天后，置于去离子水浸泡去除NaCl，再进行冷冻干燥，得到壳层导管。
将上述丝素蛋白溶液稀释到0.1％，灌入到上述壳层导管内，并置于37℃下一周诱导凝胶化。
将导管垂直插入到保温材料中，沿导管轴向以速度1×10-4m/s浸入到液氮中，进行定向冷冻；
将冷冻的导管置于冻干机进行冷冻干燥，在导管内部形成取向排列的丝素蛋白纳米纤维，形成含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管，其特征在于：所述神经导管由可降解天然高聚物外层中空导管和由取向排列的丝素蛋白纳米纤维芯层组成；
所述的含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管的制备方法的具体步骤如下：
(1)神经导管外层中空导管的制备：将可降解天然高聚物溶液导入神经导管制备模具中，加入制孔剂或者通过冷冻干燥的方法，得到外层中空导管；
(2)将冷冻的外层导管一端封闭，将丝素蛋白溶液注入到导管中空结构内，诱导其凝胶化；
(3)将导管垂直插入到保温材料中，沿导管轴向缓慢浸入到液氮中，进行定向冷冻；
(4)将冷冻的导管置于冻干机进行冷冻干燥，在导管内部形成取向排列的丝素蛋白纳米纤维；
步骤(1)中，所述的天然高聚物为丝素蛋白、丝胶蛋白、壳聚糖、胶原、明胶的一种或者两种及以上的共混物。
2.如权利要求1所述的含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管，其特征在于：所述的外层中空导管为多孔结构，其孔径为10～500μm。
3.如权利要求1所述的含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管，其特征在于：所述的芯层纳米纤维直径为10～1000nm，沿神经导管长轴方向取向排列。
4.如权利要求1所述的含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管，其特征在于：步骤(1)中，所述的制孔剂为氯化钠、蔗糖、果糖、石蜡中的一种或者两种及以上混合物，所述制孔剂的粒径大小为10～500μm。
5.如权利要求1所述的含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管，其特征在于：步骤(2)中，所述的丝素蛋白溶液为质量分数0.01～0.5％。
6.如权利要求1所述的含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管，其特征在于：步骤(3)中，导管插入液氮速度为1×10-6～1×10-3m/s。
7.如权利要求1所述的含丝素蛋白纳米纤维定向引导功能的神经导管，其特征在于：步骤(4)中，冷冻干燥时间为24-48小时。
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