CN114732956A

CN114732956A - 一种体内降解与神经再生高度匹配的神经支架的制备方法

Info

Publication number: CN114732956A
Application number: CN202210418887.0A
Authority: CN
Inventors: 代方银; 兰东维; 李智; 吴柏青; 张海强; 李霞
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2022-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2022-07-12

Abstract

本发明公开了一种体内降解与神经再生高度匹配的神经支架的制备方法，所述定向多通道导管包括丝素蛋白定向多通道导管。采用静电纺丝方法，通过调节不同的静电纺丝转速制备具有定向或随机排列的纳米纤维层的丝素蛋白纳米纤维膜；然后将丝素蛋白纳米纤维膜沿纤维定向排列方向卷绕、定型，形成多通道导管结构；最后采用聚赖氨酸对多通道导管结构的丝素蛋白纳米纤维膜进行修饰。本发明制备的聚赖氨酸修饰的定向多通道神经导管可促进神经细胞的黏附、增殖，体内降解速度与神经生长的速度高度匹配，在周围神经损伤修复中具有巨大的潜在应用价值。

Description

一种体内降解与神经再生高度匹配的神经支架的制备方法

技术领域

本发明属于组织工程支架的制备领域，特别涉及一种体内降解与神经再生高度匹配的神经支架的制备方法，具体属于周围神经损伤修复领域。

背景技术

周围神经损伤导致运动和感觉功能丧失，甚至残疾。端-端缝合和自体移植是修复周围神经损伤的传统方法。然而端-端缝合不能修复长距离的周围神经缺损，且自体神经来源受限。因此神经导管成为修复周围神经缺损的重要方法，然而不可降解的神经导管长期滞留在体内会导致神经压迫和炎症，需要二次手术将其取出，对机体造成二次伤害因此。而应用可降解材料开发的神经导管在体内的降解速度与神经生长难以匹配。新生轴突通常需要4周才能穿过坐骨神经10毫米的间隙，如果神经支架的降解时间太快(少于4周),则难以支持神经细胞的迁移、增殖和功能化，不能为轴突的定向生长提供足够的物理引导和机械支撑，导致受损神经无法修复。而当神经支架降解时间太慢(大于4周)，则易引起神经压迫和炎症，不利于神经感觉和运动功能得恢复。因此，如何设计体内降解速度与神经再生高度匹配的神经支架是神经再生领域需要解决的重要问题之一。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的为提供一种降解速度与神经生长相匹配且可修复长距离的周围神经缺损的神经导管及其制备方法。

本发明的体内降解与神经再生高度匹配的神经支架，在具有多通道导管结构的丝素蛋白纳米纤维膜表面修饰有聚赖氨酸。聚赖氨酸的修饰能够赋予丝素蛋白更优异的可降解性，降解产物为生物体可吸收的营养物质氨基酸，同时多通道导管结构有利于神经缺损再生，并且再生速度能够与生物降解高度匹配。

其中，所述丝素蛋白纳米纤维膜为具有至少一层定向排列的纳米纤维层，优选为具有定向+随机+定向排列的三层纳米纤维膜。这种三层复合结构中，上下两层的定向纳米纤维可在神经导管的内外表面均形成定向的拓扑结构，有利于促进神经细胞的增殖和新生轴突的生长，另外也可以提高神经导管的强力，中间层的随机纳米纤维可增加神经导管的柔韧性，这为手术移植和神经的生长提供了足够的机械支撑。

其中，所述多通道导管结构的通道方向与所述三层纳米纤维膜的定向排列层的纤维定向方向相同。纤维定向的多通道导管使通道形成顺应神经生长需求，物理方面便于通道的形成并减小内部应力，增加结构定向强度和韧性，生化方面使神经细胞和新生轴突在通道内的增长顺应定向纤维的引导和辅助，促进神经生长速度的提升，促成与降解速度的匹配。

其中，所述聚赖氨酸通过氨基(H-N-H)与丝素蛋白的羧基(O-C＝O)形成N-C＝O键进行修饰连接；丝素蛋白的O-C＝O转化率(修饰率)可为30％以上，还依次优选为50％、60％、70％、80％、90％以上。键合修饰提高了聚赖氨酸在丝素蛋白表面的长期稳定性，同时，能够实现的更高的修饰率可以进一步促进降解速率的提升和调控，促成与神经生长速度的匹配。

本发明上述体内降解与神经再生高度匹配的神经支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用静电纺丝方法，通过调节不同的静电纺丝转速(高转速和低转速)制备具有定向或随机排列的纳米纤维层的丝素蛋白纳米纤维膜；

(2)将丝素蛋白纳米纤维膜沿纤维定向排列方向卷绕、定型，形成多通道导管结构；

(3)采用聚赖氨酸(PLL)对步骤(2)获得的多通道导管结构的丝素蛋白纳米纤维膜进行修饰。

其中，所述步骤(1)中，用于制备纳米纤维层的纺丝液是浓度为(10±3)％(w/v)的丝素蛋白溶液，所采用的溶剂可以包括六氟异丙醇、98％的甲酸、去离子水等，以六氟异丙醇为佳。

其中，所述步骤(1)中，用于形成定向排列的纳米纤维层的转速为2000rpm以上，优选为(3000±500)rpm，用于形成随机排列的纳米纤维层的转速为800rpm以下，优选为(400±200)rpm。

其中，所述步骤(2)中，卷绕过程包括使形成每个通道结构的丝素蛋白纳米纤维膜沿纤维定向排列方向卷绕不少于1.2-2周(432°～720°)，以1.5周(540°)为佳，保证通道侧壁不会过厚，同时避免通道之间因卷绕重叠不足出现连通。

其中，所述步骤(2)中，定型过程包括使卷绕完成的多通道导管结构的丝素蛋白纳米纤维膜在75vt％的乙醇中浸润后，再在20-37℃下干燥。

其中，所述步骤(3)中，修饰过程为：首先将多通道导管结构的丝素蛋白纳米纤维膜在MES(吗啉乙磺酸)\NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)\EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)混合溶液中浸润，然后再将多通道导管结构的丝素蛋白纳米纤维膜在聚赖氨酸溶液中浸润，完成修饰。所述MES\NHS\EDC混合溶液中，EDC能够对丝素蛋白中的羧基具有良好的活化作用，而NHS能够对氨基酸具有稳定和保护作用，MES有利于NHS和EDC的稳定互溶，并促进NHS和EDC浸润丝素蛋白纳米纤维膜表面，通过MES\NHS\EDC体系的交联促进，有助于聚赖氨酸在丝素蛋白表面的键合修饰。

进一步，所述MES\NHS\EDC混合溶液由20mL去离子水和浓度分别为0.1moL/mLMES、5mg/mL NHS、5mg/mL EDC构成。

进一步，所述聚赖氨酸溶液的聚赖氨酸浓度为(10±5)mg/mL。

本发明和现有技术相比，具有如下显著性特点：

1.聚赖氨酸修饰的丝素蛋白定向多通道神经导管的定向多通道结构仿生天然的神经结构，使细胞定向生长，更有利于神经细胞的黏附、增殖。

2.聚赖氨酸修饰的丝素蛋白定向多通道神经导管具有抗菌性和降解性，且降解后的产物是生物体内可吸收的氨基酸，不会产生代谢时间和安全性问题。

3.聚赖氨酸修饰的丝素蛋白定向多通道神经导管能很好的修复神经缺损再生，尤其对于10mm坐骨神经的缺损再生，能够在体内4周完全降解，其体内降解速度与神经生长的速度高度匹配。

4.聚赖氨酸修饰的丝素蛋白定向多通道神经导管修复损伤神经12周后，具有优异的运动功能恢复和神经再生效果。

5.本发明原料成本低廉，制备方法快速简便有效，易于工业化生产。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为本发明的制备流程图。

图2为本发明聚赖氨酸修饰的丝素蛋白定向多通道神经导管的结构和力学性能。其中，仿生天然神经结构(a)、外观形貌(b)、截面结构(c)、表面结构(d)和力学性能(e)。

图3为本发明丝素蛋白定向多通道神经导管和聚赖氨酸修饰的丝素蛋白定向多通道神经导管在修复10mm的大鼠坐骨神经缺损4周后的降解和再生效果。其中，SF(ARA)MNGC为无修饰对照组，SF(ARA)+PLL MNGC为实验组。

图4为本发明通过对手术侧大鼠腓肠肌进行Masson染色结果。其中，Autograft为自体神经移植对照组，SF(ARA)+PLL MNGC为实验组。

图5为术后12周的再生神经的透射电子显微形态结构图。其中，Autograft为自体神经移植对照组，SF(ARA)+PLL MNGC为实验组。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

一、神经支架的制备

图1显示了本发明神经支架的一种示例性制备流程。具体的：

10％(w/v)的丝素蛋白(SF)被溶解在六氟异丙醇(或其与98％的甲酸、去离子水中的一种或多种溶剂的混合)中，通过改变静电纺丝转速(高转速(3000rpm)：定向，低转速(400rpm)：随机)制备定向+随机+定向(ARA)的三层纳米纤维膜。

将ARA纳米纤维膜沿纤维定向排列方向剪成2×8cm长方形，用特制的模具(如金属棒)沿着ARA纤维定向排列的方向卷绕540°，然后再插入另一根模具(另一根金属棒)再卷绕540°，重复此步骤直至卷绕10根模具。根据具体的应用需求，可选择不同直径大小的金属棒，形成不同的通道大小。

将卷绕后的纳米纤维膜浸入75％的乙醇进行后处理，然后抽出模具，最后将其在20-37℃条件下干燥后，形成定向多通道导管(ARA MNGC)。

将0.1moL/mL吗啉乙磺酸(MES)溶解在20mL去离子水中，再将5mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和5mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解在MES溶液中制成MES\NHS\EDC混合溶液。然后向其中加入多通道导管ARAMNGC，室温下浸泡1小时后，用MES溶液冲洗。最后在室温下，将多通道导管ARAMNGC在10mg/mL的聚赖氨酸溶液中浸渍24小时完成修饰，用纯水冲洗后得到聚赖氨酸修饰的丝素蛋白定向多通道神经导管(SF(ARA)+PLL MNGC)。测得PLL成功修饰在SF上，其中SF中羧基O-C＝O的转化率为90.5％。

二、结果与表征

图2显示了本发明聚赖氨酸修饰的丝素蛋白定向多通道神经导管结构和力学性能。天然周围神经由很多神经纤维组成，功能相同的神经纤维被集合在一起形成神经束，从而有序地发挥神经传导功能(图2a)。因此，SF(ARA)+PLL MNGC的多通道结构模拟了周围神经的神经束结构(图2b-c)。图2b显示了SF(ARA)+PLL MNGC均匀的外观结构，图2c的截面结构表现出所制备的SF(ARA)+PLL MNGC具有均匀的多通道仿生结构。从图2d可以看出，SF(ARA)+PLL MNGC的表面有大量纤维呈现定向排列，这有利于神经细胞的生长和新生神经轴突的定向生长。通过万能电子试验机测得的SF(ARA)+PLL MNGC的应力-应变曲线被展现在图2e中，可以看出SF(ARA)+PLL MNGC的最大应力和最大应变分别为13.18MPa和7.36％，这足以克服手术缝合的张力，并在修复损伤神经时为神经细胞的生长和新生轴突的延伸提供足够的机械支持。

大鼠坐骨神经是大鼠体内最粗的周围神经，位于皮肤下方，被肌肉所包围，适合建立动物实验模型，分离出的SD大鼠坐骨神经的直径约为1mm,切除10mm的神经缺损，将长度为12mm神经支架桥接并缝合在神经缺损处,对肌肉和皮肤进行手术缝合。图3为本发明丝素蛋白定向多通道神经导管(无修饰对照组SF(ARA)MNGC)和聚赖氨酸修饰的丝素蛋白定向多通道神经导管(实验组SF(ARA)+PLL MNGC)在修复10mm的大鼠坐骨神经缺损4周后的降解和再生效果，左图为丝素蛋白支架的神经修复效果及未降解的丝素蛋白支架，右图为聚赖氨酸修饰的丝素蛋白定向多通道神经导管的神经修复效果且修复完成后，聚赖氨酸修饰的丝素蛋白定向多通道神经导管已完全降解。新生轴突通常需要4周才能穿过坐骨神经10毫米的间隙，图3表明SF(ARA)+PLL MNGC体内降解速度与神经再生在高度匹配。

图4显示了本发明通过对手术侧大鼠腓肠肌进行Masson染色，得到丝素蛋白定向多通道神经导管在术后12周的腓肠肌的运动功能恢复效果，胶原纤维(蓝色)越少，表明腓肠肌恢复越好，本发明神经支架的左图(SF(ARA)+PLL MNGC)与自体神经移植的对照组右图(Autograft)对比，显示出基本相当的腓肠肌的运动功能效果。

图5显示了本发明通过透射电子显微镜对术后12周的再生神经的形态结构进行观察，从中可以看出，本发明左图(SF(ARA)+PLL MNGC)与自体神经移植的对照组右图(Autograft)相比，再生神经轴突的直径和神经髓鞘的面积与自体移植神经相似，同样表现出优异的神经再生效果。

综合上述分析，本发明所制备的聚赖氨酸修饰的丝素蛋白定向多通道神经导管(SF(ARA)+PLL MNGC)具有良好的力学能和可降解性以及对长距离周围神经损伤的修复能力，例如SF(ARA)+PLL MNGC的最大应力和应变分别为13.18MPa和7.36％，在术后4周SF(ARA)+PLL MNGC完全降解并且修复了10mm的大鼠坐骨神经缺损。说明所制备SF(ARA)+PLLMNGC在周围神经损伤修复领域具有非常好的潜在应用价值。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种体内降解与神经再生高度匹配的神经支架，在具有多通道导管结构的丝素蛋白纳米纤维膜表面修饰有聚赖氨酸。

2.根据权利要求1所述的体内降解与神经再生高度匹配的神经支架，其特征在于，所述丝素蛋白纳米纤维膜为具有至少一层定向排列的纳米纤维层，优选为具有定向+随机+定向排列的三层纳米纤维膜。

3.根据权利要求1所述的体内降解与神经再生高度匹配的神经支架，其特征在于，所述多通道导管结构的通道方向与所述三层纳米纤维膜的定向排列层的纤维定向方向相同。

4.根据权利要求1所述的体内降解与神经再生高度匹配的神经支架，其特征在于，所述聚赖氨酸通过氨基与丝素蛋白的羧基形成N-C＝O键进行修饰连接；丝素蛋白的羧基转化率为30％以上，还依次优选为50％、60％、70％、80％、90％以上。

5.权利要求1-4任一项所述体内降解与神经再生高度匹配的神经支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用静电纺丝方法，通过调节不同的静电纺丝转速制备具有定向或随机排列的纳米纤维层的丝素蛋白纳米纤维膜；

(3)采用聚赖氨酸对步骤(2)获得的多通道导管结构的丝素蛋白纳米纤维膜进行修饰。

6.根据权利要求5所述的体内降解与神经再生高度匹配的神经支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，用于制备纳米纤维层的纺丝液是浓度为(10±3)％(w/v)的丝素蛋白溶液，所采用的溶剂包括六氟异丙醇、98％的甲酸、去离子水中的一种或多种。

所述步骤(1)中，用于形成定向排列的纳米纤维层的转速为2000rpm以上，优选为(3000±500)rpm，用于形成随机排列的纳米纤维层的转速为800rpm以下，优选为(400±200)rpm。

7.根据权利要求5所述的体内降解与神经再生高度匹配的神经支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，卷绕过程包括使形成每个通道结构的丝素蛋白纳米纤维膜沿纤维定向排列方向卷绕不少于1.2-2周，以1.5周为佳；

所述步骤(2)中，定型过程包括使卷绕完成的多通道导管结构的丝素蛋白纳米纤维膜在75vt％的乙醇中浸润后，再在20-37℃下干燥。

8.根据权利要求5所述的体内降解与神经再生高度匹配的神经支架的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，修饰过程为：首先将多通道导管结构的丝素蛋白纳米纤维膜在MES\NHS\EDC混合溶液中浸润，然后再将多通道导管结构的丝素蛋白纳米纤维膜在聚赖氨酸溶液中浸润，完成修饰。

9.根据权利要求8所述的体内降解与神经再生高度匹配的神经支架的制备方法，其特征在于，所述MES\NHS\EDC混合溶液由20mL去离子水和浓度分别为0.1moL/mL MES、5mg/mLNHS、5mg/mL EDC构成；所述聚赖氨酸溶液的聚赖氨酸浓度为(10±5)mg/mL。