CN110891619A - 含丝心蛋白的纤维聚合物材料以及包含其的聚合物支架 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料及其用途的领域，特别是用于生产植入物以支持生物组织的生长和恢复。本发明更具体地涉及包含纤维聚合物材料，其包含第一层的对齐的丝心蛋白纤维；第二层丝心蛋白纤维，其中，在所述第二层内所述丝心蛋白纤维随机地取向；第三层对齐的丝心蛋白纤维；以及包含其的聚合物支架。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料及其用途的领域，特别是用于生产植入物以支持生物组织的生长和恢复。本发明更具体地涉及含丝心蛋白(fibroin)纤维的纤维聚合物材料，以及包含其的聚合物支架。
背景技术
神经系统由中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)组成。CNS包括脑和脊髓，而PNS包括从CNS分支出的所有神经。PNS中的神经包含感觉或传入神经元，其携带信息到CNS，和运动或传出神经元，其从CNS传输信息。虽然运动和感觉神经元的细胞体分别位于脊髓和背根神经节中，但这些神经元具有称为轴突的长延伸，其使神经遍及全身的各种器官。由于CNS中的环境限制，不会发生损伤后的自发性神经元修复。然而，PNS的不同之处在于支持创伤后轴突再生的这一特征，无论有无手术干预。
周围神经严重损伤后，创伤远端的轴突段开始退化，并且在一个称为沃勒退化(Wallerian degeneration)的过程中，肌肉以及皮肤被去神经，因此可能会出现局部功能丧失。一旦远端轴突段降解，近端轴突桩在来自增殖的Schwann细胞的生化线索和结构指导的帮助下，开始向它们各自的神经支配靶重新生长。在许多轻微的神经损伤情况下，神经会自然再生，使得功能恢复，而不需要手术干预。然而，对于更严重的损伤，必须植入神经移植物，以弥合神经近端和远端之间的间隙。
严重神经损伤后治疗的黄金标准程序是神经自体移植，其由用直接取自患者的神经样品移植受损的神经组成。然而，这种技术有几个缺点，诸如需要多次手术、可用性有限、供体部位功能丧失，以及在供体部位发展成疼痛神经瘤的风险。
为了克服这些问题，已经开发了合成神经导管(NGC)来代替自体移植物，但是没有系统能够始终显示出足够的优越性。在其他医学领域(诸如在动脉狭窄的治疗中)，已经使用了也被称为支架移植物的聚合物支架，诸如在国际申请WO 02/49536中公开的支架移植物。然而，支架移植物被设计成具有顺应性壁(天然血管的特征)和重要的生物稳定性。顺应性是中空器官(脉管)随着透壁压力的增加而膨胀和增加体积的能力，或者是中空器官在施加膨胀或压缩力时抵抗向其原始尺寸回弹的趋势。这些性质对于引导周围神经再生没有用处，其中，支架的稳健性和生物降解性是必需的。
NGC的抗张强度是一个非常重要的考虑因素，因为手术后植入物的过度张力会导致再生不良。因此，植入物必须在压力下保持一定的稳定性，以获得长度相对较小的导管和促进健康神经元生长的环境。
天然聚合物丝心蛋白已经显示出用于制造NGC的有前景的材料，因为它与其他天然材料相比具有生物相容性、可生物降解性、易于功能化、易于化学改性，并且具有稳健的机械性能。例如，Madduri等人描述了用于引导周围神经再生的丝心蛋白神经导管(Biomaterials,Elsevier Science Publishers Bv.,Barking,Gb,vol.31,no.8,1March2010)。然而，尚未报道具有与自体移植物相似性质的丝心蛋白NGC的制造，可能是因为在该过程中需要克服许多技术难题。
因此需要一种基于丝心蛋白的经改进的生物材料，其可用于制造经改进的NGC。
发明内容
发明人已经建立了含丝心蛋白纤维的纤维聚合物材料，其具有特定的结构，使其在用作植入物时特别有用。本发明的纤维聚合物材料由若干层丝心蛋白聚合物组成，其中，纤维以保持很大的抗张强度的同时促进组织恢复的方式排列。这种效果是通过三层结构获得的，其中两个外层包含经对齐的丝心蛋白纤维，并且内层包括随机排列的丝心蛋白纤维。
外层的丝心蛋白纤维的对齐通过引导细胞生长促进最佳组织恢复。丝心蛋白纤维的随机排列为纤维聚合物材料提供了合适的抗张强度，因此进一步增强了组织再生。本发明的纤维聚合物材料特别适用于制备可用作植入物(特别是用作神经引导导管(NGC))的聚合物支架。
用本发明的纤维聚合物材料制备的聚合物支架具有优异的性能，这使得它们特别适合用作NGC。特别地，本发明的聚合物支架具有非常好的抗伸长性，与天然神经相当。此外，它们在永久变形之前显示出有趣的弹性，并且比用较不复杂的丝心蛋白材料制备的聚合物支架更不易碎。
在第一实施方案中，本发明涉及纤维聚合物材料，包含
第一层的对齐的丝心蛋白纤维；
第二层的丝心蛋白纤维，其中，在所述第二层内丝心蛋白纤维随机地取向；
第三层的对齐的丝心蛋白纤维；
在本发明的上下文中，“对齐的丝心蛋白纤维的层”是指含丝心蛋白纤维的层，其中，大部分丝心蛋白纤维(即大于90％，优选大于95％的丝心蛋白纤维)，在所述层内彼此平行。术语平行不应严格地解释，并且应当理解，当它们各自的方向形成小于10弧度的角度时，仍然可以认为两个丝心蛋白纤维是平行的。
在本发明的上下文中，应该理解的是，第一、第二和第三层按此顺序组织在纤维聚合物材料中。
在本发明的上下文中，丝心蛋白可以例如从诸如蚕(例如来自Bombyx mori、Anthéroea
和Anthéroea
物种的蚕)的鳞翅目幼虫(Lepidopteran larvae)、蛾(例如来自天蚕蛾属(Antheraea)、大蚕蛾属(Cricula)、樗蚕蛾属(Samia)和枯叶蛾属(Gonometa)的蛾)、蜘蛛、蚂蚁或蜜蜂产生的丝中获得。优选地，在本发明中使用的丝心蛋白来自蚕，优选选自由Bombyx mori、Anthéroea
和Anthéroea
组成的列表中物种的蚕，但优选来自Bombyx mori。
生丝由两种主要蛋白质组成，丝胶蛋白和丝心蛋白，丝心蛋白可以通过处理丝除去丝胶蛋白而获得。通常，使用简单的基于碱或酶的脱胶方法从丝中纯化丝心蛋白(Kunduet a1.,Advanced Drug Delivery Reviews,65(4):457-470,2013)。
对齐的纤维的层和随机排列的纤维的层可以使用本领域已知的方法通过静电纺丝获得，例如Wittmer等人的详细描述(Acta Biomater.；7(10):3789—95；2011)的。
有利地，丝心蛋白纤维的直径为100nm至900nm，优选为250nm至650nm。
优选地，本发明的纤维聚合物材料为片(sheet)形状。有利地，本发明的纤维聚合物材料的厚度为0.05-0.15mm，但优选为0.07-0.1mm。优选地，在本发明的材料中，所有三个层具有相同的厚度。
已经表明，功能化的丝纤维能帮助促进中枢神经系统中的轴突再生。在一个有利的实施方案中，纤维聚合物材料通过添加至少一种生物分子而功能化，所述生物分子优选选自由神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)和表皮生长因子(EGF)、神经营养因子3(NT-3)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子4/5(NT-4/5)组成的列表。这种功能化纤维聚合物材料的制备可以使用本领域已知的方法进行，例如Wittmer(Adv FunctMater.,21(22):4202；2011)或Dinis等人所公开的方法(PLoS One.,9(10):e109770,2014)。
生物分子的浓度梯度影响生物组织中的细胞行为和生长。优选地，当纤维聚合物材料被功能化时，至少一种生物分子作为沿着材料的第一和第三层的对齐纤维的浓度梯度，但优选作为增加的浓度梯度存在。使用本领域已知的方法(特别是Dinis等人公开的方法)，可以容易地获得这种梯度(ACS Appl Mater Interfaces,6(19):16817-26.2014)。
发明人进一步定义了制备本发明纤维聚合物材料的最佳条件。所述最佳条件特别包括制备具有适当浓度的丝心蛋白的溶液，其进一步包含聚(环氧乙烷)，随后根据特定方案，在适于形成根据本发明的纤维聚合物材料的条件下静电纺丝该溶液。
在第二实施方案中，本发明涉及生产根据本发明的纤维聚合物材料的方法，包括制备丝心蛋白和聚(环氧乙烷)的溶液，并通过对所述溶液静电纺丝形成丝心蛋白纤维。
优选地，上述公开的方法包括:
制备丝心蛋白的溶液，其中，该溶液包含4％-15％丝心蛋白，并进一步包含聚(环氧乙烷)，以及；
通过对所述溶液静电纺丝形成丝心蛋白纤维，其中：
a)首先以高于3500RPM的收集器转速分散溶液，以产生对齐的纤维的层，
b)然后以小于1000RPM的收集器转速分散溶液，以产生随机地组织的纤维的层，以及；
c)最后，在与步骤a)相同的条件下分散溶液。
还优选地，上述公开的方法包括:
制备丝心蛋白的溶液，其中，该溶液包含8％-10％丝心蛋白，并进一步包含聚(环氧乙烷)，以及；
通过对所述溶液静电纺丝形成丝心蛋白纤维，其中：
d)首先以高于3500RPM的收集器转速分散溶液，以产生对齐的纤维的层，
e)然后以小于500RPM的收集器转速分散溶液，以产生随机地组织的纤维的层，以及；
f)最后，在与步骤a)相同的条件下分散溶液。
在一个有利的实施方案中，上述公开的方法包括：
制备丝心蛋白溶液，其中，该溶液包含8％丝心蛋白，并进一步包含聚(环氧乙烷)，以及；
通过对所述溶液静电纺丝形成丝心蛋白纤维，其中：
g)首先以4000RPM的收集器转速分散溶液，以产生对齐的纤维的层，
h)然后以400RPM的收集器转速分散溶液，以产生随机地组织的纤维的层，以及；
i)最后，在与步骤a)相同的条件下分散溶液。
聚(环氧乙烷)在本领域已知的静电纺丝方法中经典地与生物纤维一起使用。因此，本领域技术人员可以根据自己的知识调节其在包含丝心蛋白的溶液中的浓度。通常，本发明的丝心蛋白溶液包含约1％的聚(环氧乙烷)。
在第三实施方案中，本发明涉及包含本发明的纤维聚合物材料的聚合物支架。
本发明的聚合物支架可以形成多种形状。已经发现当本发明的纤维聚合物材料用于通常具为管状的神经引导导管中时特别有用。在一个有利的实施方案中，本发明的聚合物支架为管状。
使用本发明的纤维聚合物材料制备聚合物支架可以容易地使用本领域已知的方法进行。通常，为了获得导管的形状，将纤维聚合物材料卷制成圆柱形。为了确保随着时间的推移保持形状，可以对纤维聚合物材料进行处理以诱导在丝心蛋白纤维内形成β-片。
大多数用作神经引导导管的管状聚合物支架通常具有空心内部。然而，发明人设计了复杂的管状，其中，内部不是空心的而是构造成多个内部导管，这特别是在用作神经引导导管时对组织恢复具有有利的影响。不受理论的束缚，与空心神经引导相比，多通道设计增加了表面积，并且假定额外的表面积进一步有助于轴突引导。
在一个有利的实施方案中，本发明的聚合物支架具有管状形状，其内部具有多通道结构。
优选地，当本发明的聚合物支架为管状时，本发明的纤维聚合物材料的第一层的丝心蛋白纤维与管的轴线对齐。换句话说，在本发明的聚合物支架中，本发明的纤维聚合物材料的第一层的丝心蛋白纤维平行于所述管的轴线。
为了易于制备，本发明的聚合物支架可以使用本发明的纤维聚合物材料以片形式制造。因此，本发明纤维聚合物材料的单个片可用于制备具有管状的聚合物支架，在这种情况下，管的壁当然将具有与制成纤维聚合物材料的单个片的厚度相同的厚度。
尽管可以证明本发明的纤维聚合物材料的单个片是足够的，但是在制备聚合物支架时，将两个或更多个所述片彼此叠置在一起可能是有利的，以增加使用的整个材料的抗拉强度。如图7所示，例如，本发明人已经通过将本发明的纤维聚合物材料的三个片结合在一起来证明抗张强度和撕裂强度的增加。例如，本发明纤维聚合物材料的两片或更多片可用于结合在一起并卷制，以获得具有管状形状的聚合物支架，在这种情况下，管的壁当然将具有与制成纤维聚合物材料的片的一些厚度对应的厚度。
在一个有利的实施方案中，本发明的聚合物支架包含2片或更多片，优选3片本发明的纤维聚合物材料，其中所述片结合在一起。
在一个实施方案中，本发明的聚合物支架为管状，其中内部具有多通道结构，并聚合物支架具有由两片或更多片本发明的纤维聚合物材料形成的外部，其中，所述片结合在一起。优选地，由两片或更多片本发明的纤维聚合物材料形成的外部在管的每个端部上延伸超过多通道结构。通过在管的每个端部上形成空心袋，发明人已示出，当用作神经引导导管时该特征有助于将聚合物支架缝合到神经上。
此外，发明人已确定了本发明的聚合物支架的特别有用的实施方案，其中，当所述支架用作神经引导导管(NGC)时，所述特征是最佳的。
在一个有利的实施方案中，本发明的聚合物支架为管状，其中内部具有多通道结构，并且聚合物支架具有由两片或更多片本发明的纤维聚合物材料形成的外部，其中，所述片结合在一起，并且其中由两片或更多片本发明的纤维聚合物材料形成的外部在所述管的每个端部上延伸超过所述多通道结构。优选地，在该实施方案中，本发明的纤维聚合物材料如上所述被功能化。
本发明的另一方面是一种生产聚合物支架的方法，该方法包括将本发明的纤维聚合物材料折叠成感兴趣的形状，并处理所述纤维聚合物材料以诱导β-片的形成，优选用甲醇溶液(还优选包含至少99％甲醇的溶液)或水蒸气退火(annealing)处理。
使用甲醇水性溶液诱导丝心蛋白的β-片形成的方法在本领域中是已知的，并且例如已在Tsukada等人中充分描述(Journal of Polymer Science Part B PolymerPhysics,32(5):961-968；1994)。使用水蒸气诱导丝心蛋白的β-片形成的方法在本领域中是已知的，并且例如已在Xu等人中充分描述(Biomacromolecules,12(5):1686-96,2011)。
有利地，在制备聚合物支架的方法中，将本发明的纤维聚合物材料折叠成管状，优选折叠成其内部具有多通道结构的管状。
优选地，将本发明的纤维聚合物材料折叠成感兴趣的形状的步骤是使用具有感兴趣的形状的涂覆有特氟隆(Teflon)的物体，更优选地是涂覆有特氟隆的圆柱体来进行的。
优选地，用甲醇溶液处理纤维聚合物材料以诱导β-片形成的步骤进行1至15分钟，优选3至8分钟，优选5分钟。
优选地，用水蒸气退火处理纤维聚合物材料以诱导β-片形成的步骤进行3至8小时，优选3至6小时，优选4小时。
用甲醇处理纤维聚合物材料的步骤后若接着对纤维聚合物材料进行干燥的步骤将是有利地，优选对纤维聚合物材料进行空气干燥。对纤维聚合物材料进行干燥的步骤优选进行30至90分钟，优选进行约60分钟。
优选地，特别是当聚合物支架将被用作植入物时，该方法可以进一步包括从纤维聚合物材料中提取聚(环氧乙烷)的步骤，优选地通过在缓冲溶液(诸如PBS缓冲溶液)中润洗聚合物支架来进行。有利地，从纤维聚合物材料中提取聚(环氧乙烷)的步骤是通过将所述纤维聚合物材料在37℃下在Milli-Q水中浸泡过夜，然后在室温下在Milli-Q水中清洗所述纤维聚合物材料3次而进行的。
附图说明
图1：典型的静电纺丝装置；a)装有聚合物溶液的注射器；b)注射泵；C)喷丝头；d)泰勒锥；e)旋转鼓收集器；f)高压电源。
图2：A)在中间随机层顶部的最初的第三对齐层；B)最终顶部的对齐层；C和D)在液氮中速冻并纵向切割后的三层材料的横截面的SEM图像。
图3：丝材料和原生坐骨神经的平均最大应力测量值(左)和平均杨氏模量(右)。
图4：第一层的对齐纤维的SEM图像。
图5：根据本发明的管状聚合物支架的横截面，其内部具有多通道结构。
图6：移植过程。(A)暴露并固定大鼠坐骨神经；(B)将植入物在远端神经段以180°缝合两次；(C)将近端神经节段置于植入物腔内；(D)将植入物在近端神经段以180°缝合两次。
图7：由含单层对齐的纤维的片、本发明的纤维聚合物材料的片(含三层纤维)和三片本发明的纤维聚合物材料的组合形成的材料的抗拉强度分析。
图8：由含单层对齐的纤维的片、本发明的纤维聚合物材料的片(包含三层纤维)和三片本发明的纤维聚合物材料的组合形成的材料在最大拉力时的平均力—位移。
图9：在使用提出的丝心蛋白装置(未用任何生物分子功能化)手术后4个月，大鼠坐骨神经在植入部位远端的横截面。免疫染色包括DAPI(染色细胞核)、β-III微管蛋白(染色神经元轴突)和鬼笔环肽(染色肌动蛋白、细胞外基质)。
图10：健康大鼠坐骨神经的横截面。免疫染色包括DAPI(染色细胞核)、β-III微管蛋白(染色神经元轴突)和鬼笔环肽(染色肌动蛋白、细胞外基质)。
具体实施方式
方法
1、丝的丝心蛋白溶液的制备
将Bombyx mori蚕的蚕茧切成小块，并在0.02M Na2CO3(Sigma-Aldrich)水性溶液中煮30分钟。在冷去离子水中将丝心蛋白(SF)纤维清洗3次，然后在室温下干燥24小时。将干燥的SF纤维在60℃下于9.3M LiBr(Sigma-Aldrich)溶液中溶解长达4个小时。
使用Slide-a-Lyzer透析盒(Thermo Fisher Scientific)将SF溶液对去离子水透析3天，以去除盐分。将SF溶液离心两次以去除固体颗粒。最终浓度约为6-8wt％。通过让水从溶液中蒸发过夜，获得10wt％SF溶液。得到的10wt％SF溶液在4℃下储存长达6周。
2、静电纺丝
以4∶1的比例将10wt％SF溶液与5wt％聚(环氧乙烷)(PEO，平均Mv～900000，Sigma-Aldrich)溶液混合，得到8wt％SF(1wt％PEO)纺丝溶液。纺丝溶液通过19G不锈钢喷丝头(Ramé-Hart Instrument Co.)以1毫升/hr的流速分散，同时给针施加10-15kV之间的电压。内部制造的静电纺丝转鼓收集器的直径为12.8厘米，厚度为3厘米，并且位于与喷丝头相同的轴上，距离喷丝头尖端12.5厘米。整个系统被封闭在有机玻璃密封区域，湿度控制范围为25-35％。为了获得对齐的纤维材料(SF-A)，纺丝溶液连续分散90分钟，同时收集器以4000RPM的速度旋转。为了获得三层(对齐的-随机的-对齐的)纤维材料(SF-ARA)，纺丝溶液被分散总共90分钟：收集器转速为4000RPM时30分钟，然后立即在400RPM时30分钟，然后在4000RPM时30分钟。为了获得随机纤维材料(SF-RA，纺丝溶液连续分发90分钟，收集器转速为400RPM。标准铝箔用于在每个过程之前覆盖收集器表面，以使得能够更容易回收样品。
3、扫描电子显微镜成像
静电纺丝的纤维材料被镀金涂覆，并使用扫描电子显微镜在材料表面和边缘进行分析。为了观察SF-ARA样品的三个层，先将材料在液氮中速冻，再切割成干净的、钝的边缘以进行分析。
4、抗拉强度测试
将静电纺丝的SF-R、SF-A和SF-ARA样品卷(roll)(对于样品SF-A和SF-ARA，垂直于纤维排列)4圈，以生产空心管。将管进行水蒸气退火4小时，然后在37℃下浸入Milli-Q水中过夜，以从纤维中提取PEO。随后清洗管，然后浸入PBS中储存。
为了进行抗拉强度测试，每个标距长度为3毫米的样品被连续地纵向固定在上夹持器和下夹持器之间。每次试验以0.06毫米/秒的十字头速度进行，同时每100毫秒记录一次载荷测量值。每种材料的检测一式三份。
5、植入物制造-分层、多通道设计
将三层电纺材料从铝箔上缓慢剥离，并用干净的手术刀刀片切割出5毫米(平行于对齐的纤维)乘3厘米(垂直于对齐的纤维)的矩形材料。然后将材料的长边对折，以封闭先前与铝箔接触的材料表面，获得5毫米乘1.5厘米的矩形。然后对材料进行卷制，每卷制半圈加入涂有特氟隆的棒(直径0.2毫米)。一旦完全卷制，材料的自由边缘被紧紧地压到卷制管的外部，并且管立即浸入甲醇中5分钟以诱导β-片形成。将管风干1小时，并且然后去除涂有特氟隆的棒，得到5毫米长的多通道管。
从三层电纺材料中，切割并放置一个7毫米(平行于对齐的纤维)乘3厘米(垂直于对齐的纤维)的矩形，使得先前与铝箔接触的表面面朝下。多通道管被放置在该矩形的底部中心(沿相同方向对齐的纤维)。然后将较大的材料绕着管卷3圈，形成一个“外套”。将边缘紧紧地压在管上，并且整个系统在室温下进行水蒸气退火4小时，以诱导β-片的形成。植入物在37℃下浸泡在Milli-Q水中过夜，然后清洗三次，以消除微量的PEO。然后植入物在70％乙醇中消毒过夜。最后用无菌水润洗三次，并浸入无菌PBS中储存。
6、手术
在整个手术过程中，12只6周大的雄性Sprague Dawley大鼠均被氟烷麻醉。大鼠的左后肢都被剃光并消毒。对每只大鼠，切开一个平行于股骨的切口，并且暴露、隔离坐骨神经，并用两个相隔10毫米的微型夹子固定。神经在固定部分的远端被切断，并且植入物的外层在包围神经外膜和神经束的180°处缝合到远端部分的神经外膜两次。从近端神经节段，提取并丢弃3-4毫米的神经部分。将暴露的近端神经节段的神经束膜和成簇插入植入物的开口中，并将植入物的外层以180°缝合两次至神经外膜。然后清洗手术区域，闭合伤口并缝合。
结果
静电纺丝
在总共90分钟的静电纺丝后，获得3厘米宽、40厘米长、0.08毫米(±0.01毫米)厚的纤维丝心蛋白材料。使用ImageJ软件分析纤维直径，在250纳米和650纳米之间变化，平均为390纳米。SF-ARA材料通过扫描电镜分析清楚地呈现出三个不同的层(图2)。SF-ARA的对齐的纤维表面也显示完全覆盖了中心的随机纤维层(图2B)，验证了这种材料的导向系数没有受到损害。
静电纺丝装置如图1所示
抗拉强度测试
材料样品SF-A、SF-ARA和SF-R的平均抗拉强度结果见图3所示的应力应变图。分别使用等式(1)和(2)计算应力和应变:
其中σ是拉伸应力，F是力，A是横截面积(通过材料厚度乘以材料宽度计算：A＝0.08毫米x30毫米)，ε是应变，Δl是长度变化，l0是初始长度。
SF-A和SF-ARA样品显示具有相似的平均最大应力测量值，分别为2.98牛顿/mm2和2.63牛顿/mm2，它们略高于天然坐骨神经(2.55牛顿/mm2)，并显著高于SF-R样品(表明平均最大应力为0.49牛顿/mm2)。然而，发现SF-A样品比SF-ARA和SF-R样品的抗伸长性明显更低，SF-ARA和SF-R样品在破裂前出现的平均最大应力下表现出0.85mm/mm的平均应变。这种行为与应变值为0.80mm/mm的天然神经相当。SF-ARA和SF-R样品在各自的平均最大应力点(分别为2.63mm/mm和2.50mm/mm)具有相似的应变测量值。SF-ARA和SF-R样品在永久变形前也表现出一定的弹性，而平均SF-A曲线不表现出任何明显的弹性特征。最后，与SF-A样品相比，SF-ARA样品在破裂点之后(紧接在最大平均应力点之后)应力测量值逐渐下降；SF-A样品经历了应力的突然/急剧下降，对应于更剧烈的破裂。该结果表明，与SF-A样品相反，SF-ARA样品在初始破裂后保持一定的连续性。
缝合的SF-ARA和SF-A材料样品的平均抗拉强度结果如图7和图8所示。在距每个样品纵向边缘1毫米处缝合(无结)SF-A或SF-ARA材料的单个层或3个层的。未缝合的边缘和两个缝合端被固定在器械的夹具内。虽然SF-ARA材料的平均缝合的单个层在撕裂前抵抗的拉力是SF-A材料的平均缝合的单个层的3.5倍以上，但平均缝合的3个层的SF-ARA材料在撕裂前抵抗的拉力是SF-ARA材料的缝合的单个层的2.5倍以上。经缝合的单个层和三个层的SF-ARA材料样品，尽管达到了它们的最大作用力，但在实验过程中保持了相当大的连续性，直到达到最大位移(4毫米)。在实验期间达到最大位移(4毫米)之前，缝合的单层SF-A材料失去了连续性或几乎所有的连续性。因此，与缝合的单层样品相比，3层的SF-ARA材料表现出更好的抗撕裂性。
植入物设计/制备
在对三层材料进行SEM分析后，发现从铝箔收集器上剥离材料的行为导致许多对齐的纤维拉伸、断裂和卷曲，这是由于纤维与铝箔的轻微粘附(图4)。这是不希望的结果，因为纤维的卷绕否定/抵消了纤维的对齐，因此消除了表面导向因素。因此，在将材料卷制多通道管之前，将材料对折，以隐藏有缺陷的表面(图5)。植入物的最终直径约为1.1毫米。
手术
通过遵循图6所示的4步过程，在所有12只大鼠的右坐骨神经上成功地进行了手术。植入物很容易缝合到远端神经节段，同时避免了由于包围多通道导管的“外套”提供的小的中空袋而对神经束的任何干扰。然后，当中空袋将神经固定在最终缝合的正确位置时，植入物被容易地定位用于缝合到近端神经节段(如图6所示)。发现三层材料具有足够的抗撕强度来承受缝线穿刺，而SF-A材料的情况并非如此。术后4个月和8个月评估植入的结果。固定大鼠坐骨神经，用DAPI、抗β-III微管蛋白抗体和鬼笔环肽染色横截面样品(图9)。健康的大鼠坐骨神经被类似地处理，并用作对照(图10)。
观察证实，在植入丝引导导管后8个月，神经再生水平很高。由于坐骨神经内存在几种类型的神经元，并且它们的轴突直径都不同，因此在8个月的样品和对照样品中测量了37500μm2截面区域中的50个最大轴突。在8个月的横截面中发现轴突的平均直径为1.34μm±0.24μm，而在对照横截面中发现轴突的平均直径为1.48μm±0.24μm。因此，这表明在接近从健康神经对照样品获得的结果的丝引导导管的支持下，8个月后神经再生明显改善。
Claims (15)
1.一种纤维聚合物材料，包括：
第一层的对齐的丝心蛋白纤维；
第二层的丝心蛋白纤维，其中，在所述第二层内所述丝心蛋白纤维随机地取向；
第三层的对齐的丝心蛋白纤维。
2.权利要求1所述的纤维聚合物材料，其中，所述丝心蛋白来自蚕，优选选自由Bombyxmori、Anthéroea
和Anthéroea
组成的列表中物种的蚕，但优选来自Bombyx mori。
3.权利要求1或2所述的纤维聚合物材料，其中，所述丝心蛋白纤维的直径为100nm至900nm，优选为250nm至650nm。
4.权利要求1至3中任一项所述的纤维聚合物材料，其中，所述纤维聚合物材料通过添加至少一种生物分子而功能化，所述生物分子优选选自由神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)和表皮生长因子(EGF)、神经营养因子3(NT-3)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子4/5(NT-4/5)组成的列表。
5.生产根据权利要求1至4中任一项所述的纤维聚合物材料的方法，包括制备丝心蛋白和聚(环氧乙烷)的溶液，并通过对所述溶液静电纺丝形成丝心蛋白纤维。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述方法包括：
制备丝心蛋白的溶液，其中，所述溶液包含4％-15％的丝心蛋白，并进一步包含聚(环氧乙烷)，以及；
通过对所述溶液静电纺丝形成丝心蛋白纤维，其中：
a)首先以高于2000RPM的收集器转速分散所述溶液，以产生对齐的纤维的层，
b)然后以小于1000RPM的收集器转速分散所述溶液，以产生随机地组织的纤维的层，以及；
c)最后，在与步骤a)相同的条件下分散所述溶液。
7.一种聚合物支架，其包括权利要求1所述的纤维聚合物材料。
8.权利要求7所述的聚合物支架，其中，所述支架为管状。
9.权利要求7或8所述的聚合物支架，其中，本发明的所述纤维聚合物材料的所述第一层的丝心蛋白纤维与所述管的轴线对齐。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的聚合物支架，其中，所述聚合物支架为管状，其内部具有多通道结构。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的聚合物支架，其中，所述聚合物支架包括2片或更多片，优选3片的本发明的所述纤维聚合物材料，其中，所述片结合在一起。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的聚合物支架，其中，所述聚合物支架为管状，其中所述内部具有多通道结构，并且所述聚合物支架具有由两片或更多片的本发明的所述纤维聚合物材料形成的外部，其中，所述片结合在一起。
13.根据权利要求7至12中任一项所述的聚合物支架，其中，所述聚合物支架为管状，其中所述内部具有多通道结构，并且所述聚合物支架具有由两片或更多片的本发明的所述纤维聚合物材料形成的外部，其中，所述片结合在一起，并且其中，所述由两片或更多片的本发明的所述纤维聚合物材料形成的外部在所述管的每个端部上延伸超过所述多通道结构。
14.根据权利要求13所述的聚合物支架，其中，所述纤维聚合物材料通过添加至少一种生物分子而功能化，所述生物分子优选选自由神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)和表皮生长因子(EGF)、神经营养因子3(NT-3)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子4/5(NT-4/5)组成的列表。
15.一种生产权利要求7至14中任一项所述的聚合物支架的方法，包括将权利要求1至5中任一项所述的纤维聚合物材料折叠成感兴趣的形状，以及处理所述纤维聚合物材料以诱导β-片形成，优选用甲醇水性溶液或水蒸气退火来处理。
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