CN111184907A - 一种有序多孔神经导管材料的制备方法 - Google Patents

一种有序多孔神经导管材料的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种有序多孔神经导管材料的制备方法，针对不同的神经导管材料制备中出现的材料机械强度不高、不均一、有机溶剂较难去除等难点，本发明通过定向冷冻干燥法制备了一种有序多孔儿茶酚改性壳聚糖神经导管三维支架材料，并且通过掺入氧化石墨烯使神经导管材料具备一定导电性，同时增强材料的力学性能，形成一种高强有序多孔的神经导管三维支架材料，同时，利用高分化的嗜铬细胞瘤细胞（PC12）监测细胞迁移及增殖过程，为神经导管移植和神经再生医学应用的材料选择提供途径。

Description

一种有序多孔神经导管材料的制备方法
技术领域
本发明涉及神经导管材料相关技术领域，具体是一种有序多孔神经导管材料的制备方法。
背景技术
周围神经损伤已成为一种常见的疾病，全世界每年有超过100万人遭受此疾病。神经损伤后的再生和修复已成为当前医学领域重大难题之一。随着显微外科设备和技术的发展，周围神经损伤修复的临床疗效不断提高，自体移植仍是当今临床周围神经损伤修复的金标准，但其来源有限，需从身体其他部位获取等问题会对患者造成二次伤害。目前，随着组织工程的发展，用组织工程的基本方法和原理构建神经导管已成为神经损伤后的再生和修复的研究热点。神经导管是根据神经再生的生物学特性，以生物或非生物材料设计成管状材料，应用于神经损伤的修复。
在神经导管材料中，基于生物相容性良好的有序多孔的神经导管，具有力学性能较好、孔径大小可协调以适应不同身体部位及细胞和孔隙率高的孔洞结构能促进细胞的迁移和增值等优点，在神经损伤修复和组织工程材料中具有广泛应用。
目前研究的神经导管材料种类繁多，适用于神经修复的组织工程材料主要有生物相容性好、生物可降解性等特点天然高分子和合成高分子材料，如壳聚糖、胶原、丝素、纤维素及聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乳酸等。神经导管材料的制备方法也多种多样，主要有浸涂法、旋涂法、浇筑法、静电纺丝法和冷冻干燥法等。
浸涂法和旋涂法操作简单易行，能有效控制管壁厚度和导管的结构，但是可能会有一定的有机溶剂残留。浇筑法制备的神经导管材料技巧灵活，可以用于多种高分子上使用。静电纺丝法是一种简单、低成本、高效的神经导管材料的制备方法，但是通常制得的神经导管材料的机械强度不均一，结构的紧凑程度不同等对导管的植入和手术有影响。
发明内容
本发明的目的在于针对不同的神经导管材料制备中出现的材料机械强度不高、不均一、有机溶剂较难去除等难点，通过定向冷冻干燥法制备了一种有序多孔儿茶酚改性壳聚糖神经导管三维支架材料，并且通过掺入氧化石墨烯使神经导管材料具备一定导电性，同时增强材料的力学性能，形成一种高强有序多孔的神经导管三维支架材料，同时，利用高分化的嗜铬细胞瘤细胞（PC12）监测细胞迁移及增殖过程，提供一种高强有序多孔神经导管三维支架材料的制备方法。
一种有序多孔神经导管材料的制备方法，包括包括以下步骤：
步骤一，合成儿茶酚改性壳聚糖
在常温下，将0.5g壳聚糖溶解于100 mL 0.05 mol/L的HCl溶液中，过夜搅拌得到1wt.%的壳聚糖溶液；NaOH溶液逐滴滴加到壳聚糖溶液中，再向溶液中加入0.4g 3,4-二羟苯基丙酸，搅拌至澄清后得到溶液A；同时将0.48g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于50 mL 50vol.%乙醇溶液中，得到溶液B，将溶液B逐滴滴加至溶液A中反应，将反应液置于含有NaCl（1wt.%）的pH=5.0的HCl溶液中透析48小时，每12小时换一次透析液，再在去离子水中透析24小时，将透析后的反应液在冰箱中冷冻结冰，最后冷冻干燥3天得到儿茶酚改性壳聚糖；
步骤二：定向冷冻法制备有序多孔儿茶酚改性壳聚糖复合材料
将80mg的儿茶酚改性壳聚糖溶解于2mL的2vol.%醋酸溶液中，形成4wt.%的儿茶酚改性壳聚糖溶液，再加入20mg氧化石墨烯，搅拌均匀得到混合溶液，然后通过定向冷冻法得到有序多孔神经导管三维支架材料；
步骤三：原位交联制备有序多孔神经导管材料
将10mL聚乙二醇双缩水甘油醚与10mL乙醇混合形成1:1的混合溶液，另外，将第二步制备的儿茶酚改性壳聚糖复合材料平均切成四份，浸泡与上述PEGDGE乙醇混合溶液中，在25℃下原位交联48小时，随后取出该复合材料，于PBS溶液中透析3天，最后冻干，得到有序多孔神经导管材料，交联后得到的导管材料的孔径大小及其有序的排列均不会改变。
作为本发明进一步的方案：步骤一中NaOH溶液逐滴滴加到壳聚糖溶液至溶液pH =4.5。
作为本发明进一步的方案：步骤一中溶液B逐滴滴加至溶液A并在30℃下反应12小时。
作为本发明进一步的方案：步骤二中定向冷冻法合成有序多孔神经导管三维支架材料的方法为：将混合溶液倒入预先冷却钢板表面的硅橡胶模具中，其中硅橡胶模具是高为2cm，内径为0.5cm的圆筒状模具，以液氮作为冷却源，使其完全结冰后置于冷冻干燥机中冻干24小时，得到孔径大小为20-30μm，且排列规整的有序多孔儿茶酚改性壳聚糖复合材料。
作为本发明进一步的方案：步骤三中儿茶酚改性壳聚糖复合材料平均切成四份的尺寸为直径0.5cm，长度0.5cm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、选择儿茶酚改性壳聚糖作为神经导管主体材料，一是壳聚糖具有良好的生物相容性、细胞粘附性以及抑菌性，在临床医学上具有良好的应用前景；二是儿茶酚是一种含有邻苯二酚的物质，这种物质具有很好的粘附性能，更有利于细胞在神经导管材料上粘附。
2、将氧化石墨烯掺杂在神经导管材料中既能使材料具备的一定的导电性能，同时能增强导管的力学性能。
3、利用定向冷冻法制备的有序多孔神经导管材料具有各向异性，能增强材料的力学性能，其孔径大小在20-30μm之间，有利于细胞的增殖和迁移。
4、选用聚乙二醇双缩水甘油醚作（PEGDGE）为交联剂，其交联条件温和，工序简单，而且与戊二醛等交联剂相比，其生物毒性低。
附图说明
图1所示为本发明中儿茶酚改性壳聚糖的制备原理图。
图2所示为本发明中儿茶酚改性壳聚糖的合成流程图。
图3所示为本发明中儿茶酚改性壳聚糖的H1NMR表征图。
图4所示为本发明中定向冷冻法制备的儿茶酚改性壳聚糖掺杂氧化石墨烯神经导管材料的横截面的SEM图。
图5所示为本发明中定向冷冻法制备的儿茶酚改性壳聚糖掺杂氧化石墨烯神经导管材料的纵截面的SEM图。
图6所示为本发明中壳聚糖与聚乙二醇双缩水甘油醚交联示意图。
图7所示为本发明中PC12细胞在有序多孔神经导管材料上不同时间增值和迁移的荧光图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一，制备神经导管材料，包括包括以下步骤：
第一步：合成儿茶酚改性壳聚糖，
在常温下，将0.5 g壳聚糖（CHI）溶解于100 mL 0.05 mol/L的HCl溶液中，过夜搅拌得到1 wt.%的CHI溶液；用0.1 mol/L NaOH溶液逐滴滴加到CHI溶液中，调节溶液pH = 4.5，再向溶液中加入0.4g 3,4-二羟苯基丙酸（儿茶酚，HCA），搅拌至澄清后得到溶液A；同时将0.48g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶解于50 mL 50vol.%乙醇溶液中，得到溶液B，将溶液B逐滴滴加至溶液A中，在30℃下反应12小时，反应结束后，将反应液置于含有NaCl（1wt.%）的pH=5.0的HCl溶液中透析48小时，每12小时换一次透析液，再在去离子水中透析24小时，将透析后的反应液在冰箱中冷冻结冰，最后冷冻干燥3天得到儿茶酚改性壳聚糖（儿茶酚改性壳聚糖），
如图1～3分别为本发明中儿茶酚改性壳聚糖（儿茶酚改性壳聚糖）的制备原理、合成流程以及儿茶酚改性壳聚糖的H1NMR表征图，通过计算苯环上的氢（δ6.6-6.9）的数量和峰面积和壳聚糖主链结构上氢（δ2.9-3.2）的位移数量和峰面积比，计算得出接枝率为21%；
第二步：定向冷冻法制备有序多孔儿茶酚改性壳聚糖复合材料
将80mg的儿茶酚改性壳聚糖溶解于2mL的2vol.%醋酸溶液中，形成4wt.%的儿茶酚改性壳聚糖溶液，再加入20mg氧化石墨烯（GO），搅拌均匀得到混合溶液，然后通过定向冷冻法得到有序多孔神经导管三维支架材料，具体过程如下：将混合溶液倒入预先冷却钢板表面的硅橡胶模具中，其中硅橡胶模具是高为2cm，内径为0.5cm的圆筒状模具，以液氮作为冷却源，使其完全结冰后置于冷冻干燥机中冻干24小时，得到孔径大小为20-30μm，且排列规整的有序多孔儿茶酚改性壳聚糖复合材料，图4、图5分别示意了儿茶酚改性壳聚糖（儿茶酚改性壳聚糖）掺杂氧化石墨烯（GO）神经导管材料的横截面和纵截面的SEM图，从SEM表征结果看，神经导管空洞呈明显有序多孔排列，孔径大小在20-30μm之间，这样的结构有利于种子细胞的增殖和迁移；
第三步：原位交联制备有序多孔神经导管材料
图6示意了壳聚糖与聚乙二醇双缩水甘油醚交联原理，将10mL聚乙二醇双缩水甘油醚（PEGDGE）与10mL乙醇混合形成1:1的混合溶液，另外，将第二步制备的儿茶酚改性壳聚糖复合材料平均切成四份（直径为0.5cm，长度为0.5cm），浸泡与上述PEGDGE乙醇混合溶液中，在25℃下原位交联48小时，随后取出该复合材料，于PBS溶液中透析3天，最后冻干，得到有序多孔神经导管材料，交联后得到的导管材料的孔径大小及其有序的排列均不会改变。
实施例二，将上述制得的神经导管材料用于细胞迁移：
将神经导管材料浸泡在75vol.%乙醇中，同时用紫外灯照射30min消毒，再用PBS溶液清洗3次除去乙醇，得到的神经导管材料浸泡在PC12基础培养基中，使培养基没过神经导管材料高度2/3，在材料顶部加入20μL含有105个PC12细胞液，置于5% CO2的浓度，37℃培养箱中分别培养3小时、6小时、12小时和24小时观测细胞增殖和迁移的情况，如图7，为PC12细胞在有序多孔神经导管材料上不同时间（3小时、6小时、12小时和24小时）增值和迁移荧光图，结果表明，PC12细胞能从神经导管材料顶部迁移到底部，并且能有效增殖。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种有序多孔神经导管材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一，合成儿茶酚改性壳聚糖
在常温下，将0.5g壳聚糖溶解于100mL 0.05 mol/L的HCl溶液中，过夜搅拌得到1wt.%的壳聚糖溶液；NaOH溶液逐滴滴加到壳聚糖溶液中，再向溶液中加入0.4g 3,4-二羟苯基丙酸，搅拌至澄清后得到溶液A；同时将0.48g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶解于50mL 50vol.%乙醇溶液中，得到溶液B，将溶液B逐滴滴加至溶液A中反应，将反应液置于含有NaCl（1wt.%）的pH=5.0的HCl溶液中透析48小时，每12小时换一次透析液，再在去离子水中透析24小时，将透析后的反应液在冰箱中冷冻结冰，最后冷冻干燥3天得到儿茶酚改性壳聚糖；
步骤二：定向冷冻法制备有序多孔儿茶酚改性壳聚糖复合材料
将80mg的儿茶酚改性壳聚糖溶解于2mL的2vol.%醋酸溶液中，形成4wt.%的儿茶酚改性壳聚糖溶液，再加入20mg氧化石墨烯，搅拌均匀得到混合溶液，然后通过定向冷冻法得到有序多孔神经导管三维支架材料；
步骤三：原位交联制备有序多孔神经导管材料
将10mL聚乙二醇双缩水甘油醚与10mL乙醇混合形成1:1的混合溶液，将步骤二制备的儿茶酚改性壳聚糖复合材料平均切成四份，浸泡与上述PEGDGE乙醇混合溶液中，在25℃下原位交联48小时，随后取出该复合材料，于PBS溶液中透析3天，最后冻干，得到有序多孔神经导管材料，交联后得到的导管材料的孔径大小及其有序的排列均不会改变。
2.根据权利要求1所述的一种有序多孔神经导管材料的制备方法，其特征在于：步骤一中NaOH溶液逐滴滴加到壳聚糖溶液至溶液pH=4.5。
3.根据权利要求1所述的一种有序多孔神经导管材料的制备方法，其特征在于：步骤一中溶液B逐滴滴加至溶液A并在30℃下反应12小时。
4.根据权利要求1所述的一种有序多孔神经导管材料的制备方法，其特征在于：步骤二中定向冷冻法合成有序多孔神经导管三维支架材料的方法为：将混合溶液倒入预先冷却钢板表面的硅橡胶模具中，其中硅橡胶模具是高为2cm，内径为0.5cm的圆筒状模具，以液氮作为冷却源，使其完全结冰后置于冷冻干燥机中冻干24小时，得到孔径大小为20-30μm，且排列规整的有序多孔儿茶酚改性壳聚糖复合材料。
5.根据权利要求1所述的一种有序多孔神经导管材料的制备方法，其特征在于：步骤三中儿茶酚改性壳聚糖复合材料平均切成四份的尺寸为：直径0.5cm，长度0.5cm。
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