CN108478877A - 仿生定向壳聚糖/氧化石墨烯复合骨组织工程支架材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

仿生定向壳聚糖/氧化石墨烯复合骨组织工程支架材料及其制备方法涉及生物医用骨组织工程。本发明通过定向冷冻的方法制备了具有定向多孔结构的壳聚糖/氧化石墨烯复合支架材料，仿生成熟的骨组织的主要部分板层骨的天然定向排列的细胞外有序组织结构，用于引导小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3‑E1细胞定向排列生长。通过调节冷冻前分散液的固含量，可以调控孔通道宽度从7.5μm到40μm。壳聚糖与氧化石墨烯复合并化学交联后，在孔通道的方向上，支架材料压缩强度随着氧化石墨烯增加而增强。由于细胞的贴附和增殖倾向于沿着所附着区域凸起部分排列的天然属性，支架的定向孔结构排布促使细胞沿着孔通道方向定向排列，很好的模拟了天然骨组织中板层骨的结构。

Description

仿生定向壳聚糖/氧化石墨烯复合骨组织工程支架材料及其 制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用骨组织工程支架材料的制备技术，具体涉及一种壳聚糖/氧化石墨烯复合支架材料及其制备方法。

背景技术

构建理想的组织工程支架材料是组织工程的一个重要核心。壳聚糖来源于天然产物虾、蟹壳，其分子结构与细胞外基质的主要成份氨基葡聚糖相似。壳聚糖具有无毒、生物可降解性、抗菌性以及良好的生物相容性，被广泛的应用在组织工程领域。目前，在骨组织工程支架领域，由于壳聚糖的脆性和遇水高度溶胀性，提升壳聚糖类支架材料的机械强度以使其具有实用性是一个亟待解决的难题。同时，为保持支架结构的高度仿生，模拟骨的微观物理结构，在保持优异生物相容性的基础上，制备定向可调节孔道的组织工程支架可以高度仿生板层骨的有序排列蜂窝状多孔结构，有效诱导细胞定向生长和排列，具有很好的应用前景。在壳聚糖为主体材料的支架中，引入少量氧化石墨烯作为增强组份，利用其表面丰富的官能团(如羟基、羧基)可以与壳聚糖基体通过化学键相互作用，从而提高支架的结构稳定性和机械强度。同时，氧化石墨烯表面的官能团还能与钙离子发生螯合作用，提高支架的矿化活性；氧化石墨烯与蛋白质分子之间通过相互作用，促进支架对蛋白质的吸附，该过程是细胞在支架表面和内部粘附、增殖、分化等系列生物反应的第一步，进而促进细胞在支架上的粘附和增殖。和其它传统的无机增强组份相比，由于氧化石墨烯质轻、比表面积大、在基体中分散良好，因此，只需要少量添加即可达到目的。本发明提供的材料制备方法在骨修复方面有很好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有定向孔结构能够诱导细胞沿着孔通道方向定向排列的骨组织工程支架材料的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：仿生定向壳聚糖/氧化石墨烯复合骨组织工程支架材料及其制备方法，其特征在于：该生物支架具有孔径可调的三维通孔结构，细胞在不同孔径结构的支架上的生长状况可调控，氧化石墨烯含量增加，支架的强度随之增加。

一种壳聚糖/氧化石墨烯复合生物支架材料的制备方法，其特征在于，通包括下述步骤：

(1)将壳聚糖溶解在0.2mol·L^-1的醋酸溶液中，搅拌得到壳聚糖溶液；得到质量百分比浓度为0.5％-2％的壳聚糖溶液；

将1份天然石墨，1份硝酸钠，30份浓硫酸加入三口烧瓶中，浓硫酸为质量百分比浓度是98％的硫酸；冰浴搅拌下加入3份高锰酸钾，升温至35℃并保持6小时，加入40份蒸馏水，升温至90℃保温，加入10份双氧水，静置后水洗离心至中性；冷冻干燥得到氧化石墨烯粉末；氧化石墨烯粉末重新分散在去离子水中，超声，配制浓度为10-20mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液，以上的份数均为质量份数；

按照氧化石墨烯与壳聚糖的质量比为1～5：100将氧化石墨烯分散液加入到壳聚糖溶液中，搅拌24h，得到壳聚糖氧化石墨烯均匀分散液；

(2)把铜柱放在一个盛有液氮的容器中，把其余部位绝热只有底端导热的模具放在铜柱上，将上述分散液加入到放置在铜柱的模具中，当模具中的上层分散液完全结冰时，定向冷冻过程结束；

(3)将制得的定向冷冻的壳聚糖/氧化石墨烯支架放到冷冻干燥机中冷冻干燥，温度 -50℃以下，压力20Pa以下，干燥48h以上得到氧化石墨烯壳聚糖复合支架，通过调整壳聚糖溶液的质量百分比浓度0.5％增加到2％，所制备的支架孔道宽度为40μm降低到7.5 μm；随着氧化石墨烯添加量与壳聚糖的质量比从1:100增加到5:100，支架的压缩强度增加。

以0.2mol·L^-1的醋酸溶液为溶剂配制0.5％质量百分比浓度的壳聚糖溶液；按照氧化石墨烯与壳聚糖质量比为1:100将浓度为15mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液加入到壳聚糖溶液中，搅拌24h，得到壳聚糖氧化石墨烯均匀分散液；制备出的支架孔道宽度为40μm；将壳聚糖溶液的质量百分比浓度调整为0.75％，则支架孔道宽度为30μm；将壳聚糖溶液的质量百分比浓度调整为2％，则支架孔道宽度为7.5μm。

对于孔道宽度为7.5μm的支架，随着氧化石墨烯添加量与壳聚糖的质量比从1:100增加到5:100，支架的压缩强度从60kPa增长到140kPa。

上述支架孔直径从7.5-40μm变化，孔隙率95％。

将支架用50％(质量百分比浓度)戊二醛溶液在37℃下蒸汽交联24h。

附图说明

图1是不同孔径的壳聚糖氧化石墨烯复合支架材料的SEM图

其中a、b、c为横截面图，d、e、f为纵截面图

图2是壳聚糖氧化石墨烯复合支架材料的压缩性能曲线

图3是支架可以制备成任意形状并可反复压缩的数码照片

图4是壳聚糖氧化石墨烯复合支架材料上小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1细胞生长的扫描电镜图

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步说明：以下份数没有特别说明都是质量份数，浓度没有特别说明都是质量百分比浓度。

实施例1

将1份天然石墨，1份硝酸钠，30份浓硫酸(98％浓度)加入三口烧瓶中，冰浴搅拌下加入3份高锰酸钾，升温至35℃并保持6小时，加入40份蒸馏水，升温至90℃保温，加入10份双氧水，静置后水洗离心至中性。冷冻干燥得到氧化石墨烯粉末；氧化石墨烯粉末重新分散在去离子水中，超声，配制浓度为15mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液。

以0.2mol·L^-1的醋酸溶液为溶剂配制0.5％浓度的壳聚糖溶液。按照氧化石墨烯与壳聚糖质量比为1:100将氧化石墨烯分散液加入到壳聚糖溶液中，搅拌24h，得到壳聚糖氧化石墨烯均匀分散液。

把铜柱放在一个盛有液氮的泡沫中，把其余部位绝热只有底端导热的模具放在铜柱上，将上述分散液加入到放置在铜柱的模具中，当模具中的上层分散液完全结冰时，定向冷冻过程结束。

将制得的定向冷冻的壳聚糖/氧化石墨烯支架放到冷冻干燥机中冷冻干燥，温度低于 -50℃，压力低于20Pa，干燥48h即可得到氧化石墨烯壳聚糖复合支架，得到的支架孔直径为40μm。将支架用50％戊二醛溶液在37℃下蒸汽交联24h。支架的压缩强度为40kPa。

将上述支架先用消毒的PBS缓冲溶液浸泡24小时以完成残留的溶剂置换，再用75％ (体积浓度)的乙醇溶液消毒24h并换溶液4次，再用高温蒸汽杀菌，灭菌温度125℃，压力103kPa，灭菌时间25分钟，将支架分别放置在24孔板中，每孔大约接种1.5×10⁴个MC3T3-E1个细胞并加入培基。在37℃，5％CO₂的条件下体外培养72小时后，将样品取出。再用甲醛溶液对样品进行固定，24h以后，使用乙醇溶液逐级脱水。采用扫描电子显微镜观察细胞形貌和粘附生长状况。

上述实施例制备的样品孔道形貌如扫描电镜图1f所示，细胞在支架上的定向生长状况如图4c所示。

实施例2

氧化石墨烯的制备过程同实施例1；

以0.2mol·L^-1的醋酸溶液为溶剂配制0.75％浓度的壳聚糖溶液。按照氧化石墨烯与壳聚糖质量比为1:100将浓度为15mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液加入到壳聚糖溶液中，搅拌 24h，得到壳聚糖氧化石墨烯均匀分散液。定向冷冻过程以及后续支架的冷冻干燥过程同实施例1，得到的支架孔直径为30μm。将支架用50％戊二醛溶液在37℃下蒸汽交联24h。支架的压缩强度为60kPa。

细胞培养过程同实施例1。

上述实施例制备的样品孔道形貌如扫描电镜图1e所示，细胞在支架上的定向生长状况如图4b所示。

实施例3

氧化石墨烯的制备过程同实施例1；

以0.2mol·L^-1的醋酸溶液为溶剂配制0.75％浓度的壳聚糖溶液。按照氧化石墨烯与壳聚糖质量比为3:100将浓度为15mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液加入到壳聚糖溶液中，搅拌 24h，得到壳聚糖氧化石墨烯均匀分散液。定向冷冻过程以及后续支架的冷冻干燥过程同实施例1，得到的支架孔直径为20μm。将支架用50％戊二醛溶液在37℃下蒸汽交联24h。支架的压缩强度为78kPa。

细胞培养过程同实施例1。

实施例4

氧化石墨烯的制备过程同实施例1；

以0.2mol·L^-1的醋酸溶液为溶剂配制2％浓度的壳聚糖溶液。按照氧化石墨烯与壳聚糖质量比为4:100将浓度为15mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液加入到壳聚糖溶液中，搅拌24h，得到壳聚糖氧化石墨烯均匀分散液。定向冷冻过程以及后续支架的冷冻干燥过程同实施例 1，得到的支架孔直径为7.5μm。将支架用50％戊二醛溶液在37℃下蒸汽交联24h。

细胞培养过程同实施例1。上述实施例制备的样品孔道形貌如扫描电镜图1d所示，细胞在支架上的定向生长状况如图4a所示。

实施例5

氧化石墨烯的制备过程同实施例1；

以0.2mol·L^-1的醋酸溶液为溶剂配制2％浓度的壳聚糖溶液。按照氧化石墨烯与壳聚糖质量百分比为5:100将浓度为15mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液加入到壳聚糖溶液中，搅拌24h，得到壳聚糖氧化石墨烯均匀分散液。定向冷冻过程以及后续支架的冷冻干燥过程同实施例1，得到的支架孔直径为7.5μm。将支架用50％戊二醛溶液在37℃下蒸汽交联24h。支架的压缩强度为140kPa。

Claims (3)

1.一种壳聚糖/氧化石墨烯复合生物支架材料的制备方法，其特征在于，通包括下述步骤：

(1)将壳聚糖溶解在0.2mol·L^-1的醋酸溶液中，搅拌得到壳聚糖溶液；得到质量百分比浓度为0.5％-2％的壳聚糖溶液；

将1份天然石墨，1份硝酸钠，30份浓硫酸加入三口烧瓶中，浓硫酸为质量百分比浓度是98％的硫酸；冰浴搅拌下加入3份高锰酸钾，升温至35℃并保持6小时，加入40份蒸馏水，升温至90℃保温，加入10份双氧水，静置后水洗离心至中性；冷冻干燥得到氧化石墨烯粉末；氧化石墨烯粉末重新分散在去离子水中，超声，配制浓度为10-20mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液，以上的份数均为质量份数；

按照氧化石墨烯与壳聚糖的质量比为1～5：100将氧化石墨烯分散液加入到壳聚糖溶液中，搅拌24h，得到壳聚糖氧化石墨烯均匀分散液；

(2)把铜柱放在一个盛有液氮的容器中，把其余部位绝热只有底端导热的模具放在铜柱上，将上述分散液加入到放置在铜柱的模具中，当模具中的上层分散液完全结冰时，定向冷冻过程结束；

(3)将制得的定向冷冻的壳聚糖/氧化石墨烯支架放到冷冻干燥机中冷冻干燥，温度-50℃以下，压力20Pa以下，干燥48h以上得到氧化石墨烯壳聚糖复合支架，通过调整壳聚糖溶液的质量百分比浓度0.5％增加到2％，所制备的支架孔道宽度为40μm降低到7.5μm；随着氧化石墨烯添加量与壳聚糖的质量比从1:100增加到5:100，支架的压缩强度增加。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

以0.2mol·L^-1的醋酸溶液为溶剂配制0.5％质量百分比浓度的壳聚糖溶液；按照氧化石墨烯与壳聚糖质量比为1:100将浓度为15mg·mL^-1的氧化石墨烯分散液加入到壳聚糖溶液中，搅拌24h，得到壳聚糖氧化石墨烯均匀分散液；制备出的支架孔道宽度为40μm；将壳聚糖溶液的质量百分比浓度调整为0.75％，则支架孔道宽度为30μm；将壳聚糖溶液的质量百分比浓度调整为2％，则支架孔道宽度为7.5μm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

对于孔道宽度为7.5μm的支架，随着氧化石墨烯添加量与壳聚糖的质量比从1:100增加到5:100，支架的压缩强度从60kPa增长到140kPa。