CN107937462A - 一种牦牛胶原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牦牛胶原蛋白的制备方法,包括:脱脂与酶解,将牦牛蹄筋以L‑酒石酸二甲酯的丁酮溶液脱脂后以氢氧化钠溶液浸泡除杂,然后以酸性蛋白酶对脱脂牦牛蹄筋粉进行酶解,酶解后以蒸馏水进行浸提,浸提后加入氯化钠盐析,取沉淀干燥得牦牛胶原蛋白。有益效果为:丁酮具有较高的脱脂能力,可以去除牛蹄筋中多余的脂肪,提高蛋白质含量,L‑酒石酸二甲酯可以与丁酮形成部分氢键作用,能够有效缓解丁酮脱脂时的发粘现象,提高丁酮的脱脂效果;酶解体系中加入(2R,4R)‑戊二醇可以降低酶与底物之间的能量壁垒,增大酶与底物之间的反应活性,提高反应效率,加快酶解反应的进行,降低了时间成本。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白领域,尤其是涉及一种牦牛胶原蛋白的制备方法。
技术背景
牦牛(学名:Bos mutus或Bos grunniens,英文名称:wild yak),属于哺乳纲、真兽亚纲、偶蹄目、反刍亚目、牛科、牛亚科动物,是以中国青藏高原为中心,及其毗邻高山、亚高山高寒地区的特有珍稀牛种之一,草食性反刍家畜。牦牛能适应高寒气候,是世界上生活在海拔最高处的(除人类外)哺乳动物,分布于中国青藏高原海拔[1]3000米以上地区。牦牛的藏语叫雅客,世界通称为“yak”,即藏语译音。 牦牛叫声像猪鸣,所以又称猪声牛。西方国家因其主产于中国青藏高原藏族地区,也称西藏牛。牦牛尾如马尾,所以又名马尾牛。
牦牛全身都是宝,藏族人民衣食住行烧耕都离不开它。人们喝牦牛奶,吃牦牛肉,烧牦牛粪。它的毛可做衣服或帐篷,皮是制革的好材料。它既可用于农耕,又可作高原运输工具,为当地牧民提供奶、肉、毛、役力、燃料等生产生活必需品,是青藏高原牧民的重要生活和经济来源,也是当地畜牧业经济中不可缺少的重要畜种。牦牛作为一种“全能”家畜,在遗传上是一个极为宝贵的基因库,对人类有着不可忽视的社会及经济意义。
胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性,因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。比如中国传统的胶原保健品“阿胶”,主要是以驴皮为原料(其实就是驴皮中所含胶原蛋白),具有较高的滋补保健作用,有中药三宝之一的美誉。
关于牦牛胶原蛋白的制备技术有很多方法,现有技术如授权公众号为CN103783254 B的中国发明专利,公开了一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法,该发明方法的工艺过程包括原料前处理、明胶提取、分离胶原蛋白提取液、复合酶解、灭酶灭菌、分离肽液、脱色脱腥、浓缩干燥,具有制备过程完备,工序完整的优点,但是该发明方法工序太过复杂,一次性投产成本太高,而且其复合酶酶解太为彻底,会把胶原蛋白酶解为多肽、小肽甚至氨基酸分子,从而造成胶原蛋白的获取率较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牦牛胶原蛋白的制备方法,本制备方法简单,脱脂过程中不易发生粘结,牦牛胶原蛋白的得率较高。
本发明针对背景技术中提到的问题,采取的技术方案为:一种牦牛胶原蛋白的制备方法,包括:脱脂与酶解,具体包括以下步骤:
脱脂:将牛蹄筋切成2-3mm的小丁,以料液比1:10-18加入丁酮溶液,丁酮溶液的质量分数为8-10%,浸泡脱脂18-24小时,每4-6小时换1次丁酮溶液,每次换液后以双频率超声波处理30-45秒;脱脂后的牛蹄筋经蒸馏水冲洗至无异味残留,按照料液比1:15-16(m/v)加入0.20-0.21M氢氧化钠溶液,持续缓慢搅拌18-24小时,蒸馏水冲洗去除残留的氢氧化钠,低温干燥后粉碎,过60-120目筛后得脱脂粉;丁酮具有较高的脱脂能力,可以去除牛蹄筋中多余的脂肪,提高蛋白质含量,为进一步的酶解做准备;高能量超声波处理可以对液体进行高强度的翻动,增加油脂与丁酮的作用,同时以较大的机械冲刷力将组织从容器壁上撕掉或冲击下来,避免牛蹄筋组织的粘附,提高脱脂效果;
酶解:取脱脂粉按照料液比1:28-30加入0.5-0.6M的乙酸,缓慢搅拌溶胀8-10小时,然后在0-4℃、8000-8500r/min离心30-45分钟,取沉淀加入10-12倍蒸馏水中,添加2000-2500U/g酸性蛋白酶,再加入酸性蛋白酶重量20-35‰的(2R,4R)-戊二醇,酶解45-60分钟后灭酶,酶解液中加入等量蒸馏水浸提,浸提结束后,过滤并收集滤液,在滤液中加入18-23%的氯化钠进行盐析,离心后取沉淀进行透析至无氯离子检出,将透析后的溶液冷冻干燥得到固体胶原蛋白;酶解体系中加入(2R,4R)-戊二醇可以与酸性蛋白酶的活性中心发生络合反应,增大蛋白酶的活性,同时还可以降低酶与底物之间的能量壁垒,增大酶与底物之间的反应活性,提高反应效率,加快酶解反应的进行,降低了时间成本。
作为优选,丁酮溶液中L-酒石酸二甲酯的含量为0.98-1.05‰,L-酒石酸二甲酯可以与丁酮形成部分氢键作用,能够有效缓解丁酮脱脂时的发粘现象,提高丁酮的脱脂效果。
作为优选,双频率超声波的超声频率为25-35kHz、80-95kHz,超声密度为0.6-0.85W/cm2、1.5-1.8W/cm2;双频率超声波的两个空化效应可以产生叠加与协同作用,其所产生的崩溃效应也远远大于两个超声波的简单叠加,具有较好的分散效果。
作为优选,酸性蛋白酶为重量比为2-5:1的胃蛋白酶与菠萝蛋白酶;选用复合蛋白酶酶解可以发挥复合蛋白酶的协同作用,提高酶解效率。
作为优选,酶解的pH为2.3-3.5,反应温度为32-37℃,反应时间为1.5-2.5小时。
与现有技术相比,本发明的优点在于:1)丁酮具有较高的脱脂能力,可以去除牛蹄筋中多余的脂肪,提高蛋白质含量,L-酒石酸二甲酯可以与丁酮形成部分氢键作用,能够有效缓解丁酮脱脂时的发粘现象,提高丁酮的脱脂效果;2)酶解体系中加入(2R,4R)-戊二醇可以降低酶与底物之间的能量壁垒,增大酶与底物之间的反应活性,提高反应效率,加快酶解反应的进行,降低了时间成本。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明:
实施例1:
一种牦牛胶原蛋白的制备方法,包括以下步骤:
1)将牛蹄筋切成2mm的小丁,以料液比1:10加入丁酮溶液,丁酮溶液的质量分数为8%,浸泡脱脂18小时,每4小时换1次丁酮溶液,每次换液后以双频率超声波处理30秒;脱脂后的牛蹄筋经蒸馏水冲洗至无异味残留,按照料液比1:15加入0.20M氢氧化钠溶液,持续缓慢搅拌18小时,蒸馏水冲洗去除残留的氢氧化钠,低温干燥后粉碎,过60目筛后得脱脂粉;2)取脱脂粉按照料液比1:28加入0.5M的乙酸,缓慢搅拌溶胀8小时,然后在0℃、8000r/min离心30分钟,取沉淀加入10倍蒸馏水中,添加2000U/g酸性蛋白酶,再加入酸性蛋白酶重量20‰的(2R,4R)-戊二醇,酶解45分钟后灭酶,酶解液中加入等量蒸馏水浸提,浸提结束后,过滤并收集滤液,在滤液中加入18%的氯化钠进行盐析,离心后取沉淀进行透析至无氯离子检出,将透析后的溶液冷冻干燥得到固体胶原蛋白。
实施2:
一种牦牛胶原蛋白的制备方法,包括:脱脂与酶解,具体包括以下步骤:
1)脱脂:将牛蹄筋切成3mm的小丁,以料液比1:18加入丁酮溶液,丁酮溶液的质量分数为10%,丁酮溶液中L-酒石酸二甲酯的含量为0.98‰,浸泡脱脂24小时,每6小时换1次丁酮溶液,每次换液后以双频率超声波处理45秒,超声频率为25kHz、80kHz,超声密度为0.6 W/cm2、1.5W/cm2;脱脂后的牛蹄筋经蒸馏水冲洗至无异味残留,按照料液比1:16加入0.21M氢氧化钠溶液,持续缓慢搅拌24小时,蒸馏水冲洗去除残留的氢氧化钠,低温干燥后粉碎,过120目筛后得脱脂粉;丁酮具有较高的脱脂能力,可以去除牛蹄筋中多余的脂肪,提高蛋白质含量,为进一步的酶解做准备,L-酒石酸二甲酯能够有效缓解丁酮脱脂时的发粘现象,提高丁酮的脱脂效果;高能量超声波处理可以对液体进行高强度的翻动,增加油脂与丁酮的作用,同时以较大的机械冲刷力将组织从容器壁上撕掉或冲击下来,避免牛蹄筋组织的粘附,提高脱脂效果;
2)酶解:取脱脂粉按照料液比1:30加入0.6M的乙酸,缓慢搅拌溶胀10小时,然后在4℃、8500r/min离心45分钟,取沉淀加入12倍蒸馏水中,添加2500U/g酸性蛋白酶,酸性蛋白酶为重量比为2:1的胃蛋白酶与菠萝蛋白酶,再加入酸性蛋白酶重量35‰的(2R,4R)-戊二醇,pH为2.3,反应温度为32℃,反应时间为1.5小时,酶解60分钟后灭酶,酶解液中加入等量蒸馏水浸提,浸提结束后,过滤并收集滤液,在滤液中加入23%的氯化钠进行盐析,离心后取沉淀进行透析至无氯离子检出,将透析后的溶液冷冻干燥得到固体胶原蛋白;酶解体系中加入(2R,4R)-戊二醇可以与酸性蛋白酶的活性中心发生络合反应,增大蛋白酶的活性,同时还可以降低酶与底物之间的能量壁垒,增大酶与底物之间的反应活性,提高反应效率,加快酶解反应的进行,降低了时间成本。
实施3:
一种牦牛胶原蛋白的制备方法,包括:脱脂与酶解,具体包括以下步骤:
脱脂:将牛蹄筋切成2mm的小丁,以料液比1:15加入丁酮溶液,丁酮溶液的质量分数为9%,浸泡脱脂20小时,每4小时换1次丁酮溶液,每次换液后以双频率超声波处理40秒;脱脂后的牛蹄筋经蒸馏水冲洗至无异味残留,按照料液比1:15加入0.21M氢氧化钠溶液,持续缓慢搅拌20小时,蒸馏水冲洗去除残留的氢氧化钠,低温干燥后粉碎,过100目筛后得脱脂粉;丁酮具有较高的脱脂能力,可以去除牛蹄筋中多余的脂肪,提高蛋白质含量,为进一步的酶解做准备;高能量超声波处理可以对液体进行高强度的翻动,增加油脂与丁酮的作用,同时以较大的机械冲刷力将组织从容器壁上撕掉或冲击下来,避免牛蹄筋组织的粘附,提高脱脂效果;
酶解:取脱脂粉按照料液比1:28加入0.55M的乙酸,缓慢搅拌溶胀8小时,然后在2℃、8200r/min离心35分钟,取沉淀加入10倍蒸馏水中,添加2400U/g酸性蛋白酶,再加入酸性蛋白酶重量25‰的(2R,4R)-戊二醇,pH为3.5,反应温度为37℃,反应时间为2.5小时,酶解45分钟后灭酶,酶解液中加入等量蒸馏水浸提,浸提结束后,过滤并收集滤液,在滤液中加入20%的氯化钠进行盐析,离心后取沉淀进行透析至无氯离子检出,将透析后的溶液冷冻干燥得到固体胶原蛋白;酶解体系中加入(2R,4R)-戊二醇可以与酸性蛋白酶的活性中心发生络合反应,增大蛋白酶的活性,同时还可以降低酶与底物之间的能量壁垒,增大酶与底物之间的反应活性,提高反应效率,加快酶解反应的进行,降低了时间成本。
丁酮溶液中L-酒石酸二甲酯的含量为1.05‰,L-酒石酸二甲酯可以与丁酮形成部分氢键作用,能够有效缓解丁酮脱脂时的发粘现象,提高丁酮的脱脂效果。
双频率超声波的超声频率为35kHz、95kHz,超声密度为0.85W/cm2、1.8W/cm2;双频率超声波的两个空化效应可以产生叠加与协同作用,其所产生的崩溃效应也远远大于两个超声波的简单叠加,具有较好的分散效果。
酸性蛋白酶为重量比为5:1的胃蛋白酶与菠萝蛋白酶;选用复合蛋白酶酶解可以发挥复合蛋白酶的协同作用,提高酶解效率。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知,在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明,应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例,并不用于限制本发明,凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种牦牛胶原蛋白的制备方法,其特征在于:包括以下方法:
脱脂:将牛蹄筋切成2-3mm的小丁,加入L-酒石酸二甲酯的丁酮溶液,浸泡脱脂18-24小时,每4-6小时换1次丁酮溶液,每次换液后以双频率超声波处理30-45秒;脱脂后的牛蹄筋经蒸馏水冲洗至无异味残留,加入氢氧化钠溶液,持续缓慢搅拌18-24小时,蒸馏水冲洗去除残留的氢氧化钠,低温干燥后粉碎,过60-120目筛后得脱脂粉;
酶解:取脱脂粉加入乙酸溶液,缓慢搅拌溶胀8-10小时,然后在0-4℃、8000-8500r/min离心30-45分钟,取沉淀加入10-12倍蒸馏水中,添加酸性蛋白酶,再加入(2R,4R)-戊二醇,酶解45-60分钟后灭酶,酶解液中加入等量蒸馏水浸提,浸提结束后,过滤并收集滤液,在滤液中加入18-23%的氯化钠进行盐析,离心取沉淀进行透析至无氯离子检出,将透析后的溶液冷冻干燥得到固体胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种牦牛胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述脱脂步骤中所加入丁酮溶液的料液比为1:10-18,丁酮溶液的质量分数为8-10%。
3.根据权利要求1所述的一种牦牛胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述脱脂步骤中丁酮溶液中L-酒石酸二甲酯的含量为0.98-1.05‰。
4.根据权利要求1所述的一种牦牛胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述脱脂步骤中双频率超声波的超声频率为25-35kHz、80-95kHz,超声密度为0.6-0.85W/cm2、1.5-1.8W/cm2。
5.根据权利要求1所述的一种牦牛胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述脱脂步骤中所加入氢氧化钠溶液的料液比1:15-16,氢氧化钠溶液的浓度为0.20-0.21M。
6.根据权利要求1所述的一种牦牛胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述酶解步骤中所加入乙酸溶液的料液比为1:28-30,乙酸溶液的浓度为0.5-0.6M。
7.根据权利要求1所述的一种牦牛胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述酶解步骤中的酸性蛋白酶的添加量为2000-2500U/g,酸性蛋白酶为重量比为2-5:1的胃蛋白酶与菠萝蛋白酶。
8.根据权利要求1所述的一种牦牛胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述酶解步骤中(2R,4R)-戊二醇的重量为酸性蛋白酶重量的20-35‰。
9.根据权利要求1所述的一种牦牛胶原蛋白的制备方法,其特征在于:所述酶解步骤中酶解的pH为2.3-3.5,反应温度为32-37℃,反应时间为1.5-2.5小时。
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