CN107936176A - 白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法及应用。本发明采用针对性改进的沉淀聚合法，针对模板分子白藜芦醇，合理确定功能单体和溶剂，精确确定聚合反应的关键影响因素，总结得到关于模板分子、功能单体、溶剂、交联剂等关键试剂的用量比，制得的分子印记聚合物为分布均匀、形态规则的微球，并总结出所述微球形态和吸附量方面的影响因素和吸附特性，分子印迹微球对白藜芦醇具有优良的结合亲和性，为后续吸附和检测白藜芦醇奠定技术基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子印迹微球的制备技术领域，更具体地，涉及一种白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法及应用。
背景技术
分子印迹聚合物(MIP)是一种对目标模板分子具有特异选择性识别能力的吸附分离材料，在液相色谱、生物传感器、固相萃取、催化合成等许多领域具有的良好的应用前景。其中分子印迹微球(MIPs)由于制备和应用相对方便、色谱效率高且便于功能设计，近年逐渐成为研究的热点。
白藜芦醇是多酚类化合物，主要来源于花生、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物。白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，又称为芪三酚，是肿瘤的化学预防剂，也是对降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂。美国农业部的研究结果表明，花生红衣与仁中也含有相当多的白藜芦醇。2014年，科学家对人体摄入白藜芦醇的水平及各种慢性病导致的总死亡率进行研究分析，结果发现，膳食摄入白藜芦醇和长寿、炎症、癌症和心血管健康并没有明显相关性。目前未见适用于制备合成白藜芦醇的分子印迹聚合物及其制备方法的相关技术报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有分子印迹微球尤其是适用于白藜芦醇制备提纯方面的分子印迹微球制备技术的不足，提供一种白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法。
本发明另一要解决的技术问题是提供所述分子印迹聚合物的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供一种白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.称取一定量的模板分子白藜芦醇、功能单体甲基丙烯酸，溶解于甲醇溶剂中；
S2.将步骤S1所得混合物置于恒温水浴下预聚合反应，然后加入交联剂和引发剂，经超声脱氧和通N2隔绝氧气后密封，恒温水浴下聚合反应；
S3.将步骤S2所得聚合产物过滤，干燥，洗脱模板分子，干燥，即得白藜芦醇印迹聚合物(MIPs)。
所述功能单体为α-甲基丙烯酸(MAA)。
优选地，所述预聚合反应是在回旋振荡条件下进行。优选地，所述预聚合反应的时间为1小时。
优选地，所述聚合反应是在回旋振荡条件下进行。优选地，所述聚合反应的时间为24小时。
优选地，所述恒温水浴的温度为50～60℃。进一步优选为55℃。
优选地，所述模板分子白藜芦醇：功能单体甲基丙烯酸(MAA)的摩尔比为1：2～10。进一步优选地，所述模板分子白藜芦醇：功能单体甲基丙烯酸(MAA)的摩尔比为1：4。
优选地，所述模板分子白藜芦醇：交联剂的摩尔比为1：10～30。进一步优选地，所述模板分子白藜芦醇：交联剂的摩尔比为1：15～30；更优选地，所述模板分子白藜芦醇：交联剂的摩尔比为1：20～25。最优选地，所述模板分子白藜芦醇：交联剂的摩尔比为1：25。
进一步优选地，所述模板分子白藜芦醇：功能单体甲基丙烯酸(MAA)和交联剂的摩尔比为1：4：25。
优选地，所述交联剂采用二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)。
优选地，所述引发剂采用偶氮二异丁腈(AIBN)。
更为优选地，所述模板分子白藜芦醇：功能单体甲基丙烯酸(MAA)和交联剂的摩尔比为1：4：25，所述恒温水浴的温度为55℃
本发明采用回旋振荡的方法，在恒温振荡下合成白藜芦醇分子印迹聚合物MIPs，当白藜芦醇：MAA：EGDMA为1：4：25(摩尔比)时，合成的MIPs吸附效果最好。
优选地，步骤S2所述超声脱氧的时间为10min；所述通N2的时间为10min。
优选地，所述步骤S3所述过滤采用布式漏斗过滤。
优选地，步骤S3所述洗脱是采用甲醇和乙酸按照体积比为8:2混合的混合液作为洗脱液，经索式提取7天洗去模板分子，干燥，即得到白藜芦醇印迹聚合物(MIPs)。
本发明同时提供所述白藜芦醇分子印迹聚合物在吸附白藜芦醇方面的应用。所述吸附时间在白藜芦醇分子印迹聚合物与白藜芦醇混合后的8小时达到吸附最大值，之后吸附量会下降直至稳定。同时，在选择性吸附实验中，MIPs对底物的识别性能，α为1.58。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法，采用针对性改进的沉淀聚合法，成功获得白藜芦醇分子印迹聚合物，整体方法简单高效，所得产品对白藜芦醇具有优良的吸附作用，为检测白藜芦醇打下良好的技术基础。
进一步地，本发明针对模板分子白藜芦醇，合理确定功能单体和溶剂，精确确定聚合反应的关键影响因素并指导获得模板分子、功能单体、溶剂、交联剂等关键试剂的用量比，获得的分子印记聚合物为分布均匀、形态规则的微球，并总结出所述微球形态和吸附量方面的的影响因素和吸附特性，为后续吸附和检测白藜芦醇奠定技术基础。
附图说明
图1白藜芦醇甲醇溶液浓度-吸附值标准曲线。
图2不同溶剂量制备聚合物的吸附值曲线。
图3本发明实施例获得的白藜芦醇分子印迹聚合物微球的电镜扫描图。
图4不同温度下制备聚合物的吸附值曲线。
图5不同功能单体用量下制备聚合物的吸附值曲线。
图6本发明实施例获得的白藜芦醇分子印迹聚合物微球的电镜扫描图。
图7不同交联剂用量下制备聚合物的吸附值曲线。
图8本发明实施例获得的白藜芦醇分子印迹聚合物微球的电镜扫描图。
图9白藜芦醇分子印迹聚合物的动态吸附曲线。
图10白藜芦醇分子印迹聚合物的吸附等温线。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂为常规市购或商业途径获得的试剂，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
实施例1
本实施例采用的材料和仪器如表1和表2所示，但并不因此限定本发明范围。
表1实验药品表
表2实验仪器表
一、采用沉淀聚合法制备分子印迹聚合物
制备步骤：
S1.称取一定量的模板分子白藜芦醇和功能单体MAA，溶解于甲醇溶剂中；
S2.在恒温水浴振荡器中回旋振荡预聚合1h，加入交联剂EDGMA和0.1g引发剂AIBN，超声脱氧10min后，通N210min隔绝氧气，密封，于恒温水浴中聚合24h。
S3.将聚合物取出，布式漏斗过滤，干燥。用V(甲醇):V(乙酸)＝8:2作为洗脱液,索式提取一个星期洗去模板分子，干燥，即得到白藜芦醇印迹聚合物(MIPs)。在不加模板分子白藜芦醇的条件下，以同样的方法制得空白印迹聚合物(NIPs)。
二、标准曲线的绘制
准确称取0.0228g白藜芦醇标样，用高效液相色谱醇溶解至100mL容量瓶中，定容，摇匀，得白藜芦醇母液。分别用移液管取1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL至10mL容量瓶中，定容。用高效液相色谱测其在吸光度306nm时的峰面积。以浓度为横坐标，吸附量为纵坐标，绘制标准曲线。
三、MIPs对模板分子的吸附实验
(1)吸附量Q的测定及计算：
称取0.005g所制得的聚合物于10mL容量瓶中，加入1mmol/L的白藜芦醇溶液，定容，振荡吸附24h，过滤，取上清液于高效液相色谱中，通过测定其在吸光度306nm时的吸收峰面积，得到所制得聚合物的吸附量。
式中：
Q---印迹聚合物的吸附量，μmol/g；
C0---白藜芦醇溶液的起始浓度，μg/mL；
C1---吸附后的浓度，μg/mL；
V---加入白藜芦醇溶液的体积，mL；
W---加入MIPs的重量，g；
228—白藜芦醇相对分子质量，g/mol。
(2)MIPs选择性能的表征
为评价MIPs特异吸附性的大小，可采用印迹因子(α)、静态分配系数(KD)、分离因子(β)和来表征。KD、α、β的计算公式如下：
α＝QMIPs/QNIPs
式中，QMIPs为印迹聚合物对底物的吸附量(μmol/g)，QMIPs为非印迹聚合物对底物的吸附量(μmol/g)。α表示MIPs对底物的识别性能，α越大则其识别性越高。
四、聚合条件的优化试验
(一)绘制白藜芦醇溶液浓度—吸附量标准曲线如附图1所示，测得白藜芦醇甲醇溶液的吸附标准曲线为y＝32555x+482.61，R2＝0.9999。
(二)聚合条件对合成MIPs的影响。
1、溶剂的影响
(1)溶剂种类的影响
在固定配比的情况下，分别采用多种溶剂进行试验，以30.0mL氯仿、乙腈、甲醇作为代表溶剂进行说明，在60℃发生聚合反应的比较结果。氯仿做溶剂时，在聚合24h后，溶剂变色，没有聚合物生成；乙腈做溶剂时，聚合24h后，溶剂变成乳白色，没有聚合物生成；在甲醇做溶剂时，聚合24h生成较小粒径的分散微球。通过大量实验总结，本发明选取甲醇作为反应溶剂效果最佳。
(2)溶剂用量的影响
在模板分子：功能单体：交联剂为1:4:20，反应温度为60℃的情况下，改变甲醇溶剂的用量，分别选择为10.0、15.0、20.0、30.0、40.0mL甲醇，聚合24h。探究在溶剂量不同的情况下制得的微球在形态和吸附量上的差异。不同溶剂用量的影响结果见表3所示，不同溶剂用量制备聚合物的吸附值曲线见附图2所示。
表3不同溶剂用量的影响
从图4可以看出，随着溶剂用量的增加，吸附量Q值有个先增加再减小的过程。这是因为溶液体系的粘度大，当溶剂用量较小时，在聚合反应开始一段时间后，分子移动困难，使得聚合物链包裹模板分子的程度降低；而溶剂用量较多时，会使反应溶液浓度较低从而使聚合反应速率变慢，在相同的合成时间内，聚合反应不完全。实验选择溶剂甲醇用量20.0mL作为最佳溶剂用量。
将MIPs5、MIPs6与MIPs7进行电镜扫描，结果如图3所示。通过比较我们可以得到当溶剂用量为20.0mL时，制得的聚合物微球形态更圆，当溶剂用量为10.0mL时，由于粘度较大，导致制得的聚合物聚集成团状且形态不如MIPs6，而当溶剂用量为30mL时，制得的聚合物粒径较大。
(3)不同温度的影响
在溶剂用量为20.0mL，模板分子：功能单体：交联剂为1：4：20，改变反应温度，分别选用50、55、60、60℃，聚合24h。探究在温度不同的情况下制得的微球在形态和吸附量上的差异。不同温度的影响见表4所示。不同温度制备聚合物的吸附值曲线见图4所示。
表4不同温度的影响
从图4可以看出，随着温度的上升，吸附量Q值先增加后减少。分析总结认为这是因为随着温度的升高，分子的运动加快，促进了聚合反应的发生，使得模板分子被聚合物链包裹的程度上升。但是白藜芦醇在遇到高温时，会产生分解反应，模板分子减少，聚合物链包裹模板分子的程度有所降低。因此，选择55℃作为最佳反应温度。
(4)功能单体用量的影响
在模板分子：交联剂为1:20，反应温度为55℃的情况下，在甲醇溶剂中合成，改变功能单体的用量，分别选择为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25mmoL功能单体，聚合24h。探究在功能单体用量不同的情况下制得的微球在形态和吸附量上的差异。不同功能单体用量制备聚合物的吸附值曲线见图5所示。
表5不同功能单体用量的影响
由图5可知，随着MAA用量的增加，吸附量Q值会先增加后减少，单体比为1:4时达到了最大值。这是因为当MAA用量较少时，只有少量的白藜芦醇能与功能单体形成复合物，单体于模板分子的结合位点还没达到饱和，这样形成的MIPs中会有较少的白藜芦醇识别位点，致使吸附容量较低；当MAA用量增加时，白藜芦醇与MAA之间的自组装进行得更加充分，形成稳定的复合物。
但功能单体过量，可能引发其自身的缔合，致使非选择性吸附位点增加，选择性吸附位点数减少。因此，实验选择n(白藜芦醇)：n(MAA)＝1:4，作为最佳功能单体用量。
将MIPs13、MIPs14与MIPs15进行电镜扫描，结果如图6所示。通过比较我们可以得到当功能单体为0.50mmoL时，制得的聚合物微球分布均匀，形态优良，当功能单体为0.50mmoL时制得的聚合物微球成团聚集在一起且粒径较大，而当功能单体为0.75mmoL时，制得的聚合物分布均匀但形态有些不规则。
(5)交联剂用量的影响
在模板分子：功能单体为1:4，反应温度为55℃的情况下，在甲醇溶剂中合成，改变交联剂的用量，分别选择为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25mmoL交联剂，聚合24h。探究在功能单体用量不同的情况下制得的微球在形态和吸附量上的差异。不同交联剂用量的影响见表6所示，不同交联剂用量制备聚合物的吸附值曲线见图7所示。
表6不同交联剂用量的影响
从图7可以看出，随着交联剂EGDMA用量的增加，吸附量Q值有一个从小变大再变小的过程。分析总结认为这是因为交联剂控制着聚合物的形态和结合位点的稳定性及其机械稳定性。当交联剂的用量较低时，在洗脱后，不能保持空穴原来的形状和大小，导致聚合物的特异性识别能力减低，对白藜芦醇的吸附性能不是很佳；交联剂用量增加使聚合物的刚性增强，在不同溶剂中聚合物的溶胀减少，容量下降，其识别位点的可接近性差从而特异性吸附能力下降。当n(模板分子):n(MAA):n(EHGDMA)＝1:4:25时，由于交联度适中，制得的聚合物对白藜芦醇的吸附性能最佳。将MIPs20、MIPs21与MIPs22进行电镜扫描，结果如图8所示。通过比较我们可以得到当交联剂为1.00mmoL时，制得的聚合物微球分布均匀，形态优良，当交联剂为0.75mmoL和1.25mmoL时制得的聚合物微球成团聚集在一起且形态不太规则。
五、MIPs的吸附试验
1、MIPs的动态吸附实验
根据MIPs在不同吸附时间下的吸附量，作出的动态吸附曲线如图9所示。由图9结果可知：MIPs在前8h时，对模板分子的吸附量逐渐上升，超过8h时，其吸附量下降。原因是在刚开始吸附时，由于微球中的结合位点未达到饱和，模板分子与其仍有结合的能力，吸附量增大；当达到8h时的吸附平衡后，溶液中白藜芦醇的浓度降低，出现了外吐的现象，使得吸附量降低。
2、MIPs的吸附等温线
分别称取30mg的MIPs21和NIPs21各6份，加入浓度约为1～8mmol/L的白藜芦醇甲醇溶液，在室温下回旋振荡吸附24h，测其吸附量。绘制出吸附等温线如图10所示。由图10结果可知：在一定浓度范围内，聚合物的吸附量随白藜芦醇溶液的浓度增大而增大，最终趋于平衡。有加模板分子的印迹聚合物的饱和吸附量比空白聚合物的饱和吸附量大。这是由于印迹聚合物以白藜芦醇为模板，洗脱去模板分子后，聚合物拥有了与模板分子大小、形态一样的三维孔穴。其具有的孔穴使得对模板分子有更高的特意识别性和亲和力，吸附量也大大增加。
3、MIPs的选择吸附性试验
表7 MIPs与NIPs对不同底物的吸附量
| 底物 | MIPs | NIPs | ɑ |
| 白藜芦醇 | 72.7 | 45.9 | 1.58 |
Claims (10)
1.一种白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.称取一定量的模板分子白藜芦醇、功能单体甲基丙烯酸，溶解于甲醇溶剂中；
S2.将步骤S1所得混合物置于恒温水浴下预聚合反应，然后加入交联剂和引发剂，经超声脱氧和通N2隔绝氧气后密封，恒温水浴下聚合反应；
S3.将步骤S2所得聚合产物过滤，干燥，洗脱模板分子，干燥，即得白藜芦醇印迹聚合物。
2.根据权利要求1所述白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述预聚合反应和聚合反应是在回旋振荡条件下进行。
3.根据权利要求1所述白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述预聚合反应的时间为1小时；所述聚合反应的时间为24小时。
4.根据权利要求1所述白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述恒温水浴的温度为50～60℃；优选为55℃。
5.根据权利要求1所述白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述模板分子白藜芦醇：功能单体甲基丙烯酸的摩尔比为1：2～10；优选所述模板分子白藜芦醇：功能单体甲基丙烯酸的摩尔比为1：4。
6.根据权利要求1所述白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述模板分子白藜芦醇：交联剂的摩尔比为1：10～30；优选所述模板分子白藜芦醇：交联剂的摩尔比为1：15～30；更优选所述模板分子白藜芦醇：交联剂的摩尔比为1：20～25；最优选所述模板分子白藜芦醇：交联剂的摩尔比为1：25。
7.根据权利要求1、5或6所述白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述模板分子白藜芦醇：功能单体甲基丙烯酸和交联剂的摩尔比为1：4：25。
8.根据权利要求7所述白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述交联剂采用二甲基丙烯酸乙二醇酯；所述引发剂采用偶氮二异丁腈。
9.根据权利要求1所述白藜芦醇分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤S2所述超声脱氧的时间为10 min；所述通N2 的时间为10 min；
步骤S3所述洗脱是采用甲醇和乙酸按照体积比为8:2混合的混合液作为洗脱液。
10.权利要求1至9任一项所述制备方法制备得到的白藜芦醇分子印迹聚合物及其在吸附白藜芦醇方面的应用。
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