CN107929242A - 基于纳米金刚石的药物载体、药物复合体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米金刚石的药物载体，所述药物载体为稀土元素铕和钆掺杂的纳米金刚石药物载体，其制备方法包括以下步骤：纳米金刚石表面的硅烷化化学改性，得到表面硅烷化的纳米金刚石，即ND‑APTES；α‑噻吩甲酰三氟丙酮的硅烷化修饰，得到硅烷化的α‑噻吩甲酰三氟丙酮，即TTA‑Si；表面硅烷化的纳米金刚石、硅烷化的有机配体在溶剂中与Eu+3和Gd+3反应，生成基于纳米金刚石的药物载体ND‑TTA:RE+3。本发明多功能纳米金刚石药物运输载体不仅能够负载盐酸阿霉素，而且能够负载其他的药物，可适应不同的疾病从而实现不同药物的运输。

Description

基于纳米金刚石的药物载体、药物复合体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于纳米材料与纳米医药学技术领域，具体涉及一种基于纳米金刚石的药物载体、药物复合体及其制备方法和应用。
背景技术
纳米材料指尺寸介于1-100nm的材料，其纳米级的尺寸特点使其在纳米医药学领域的研究得到了广泛的关注。传统的抗癌药物，如阿霉素，顺氯氨铂，紫杉醇等能有效的抑制癌细胞的生长和繁殖。而由于药物分子不具有靶向性，因此临床治疗中将药物直接注射入病人体内的给药方式在杀伤癌细胞的同时也会损害人体正常的组织和器官。将纳米材料作为药物运输载体，使其装载药物并靶向运输至病灶部位，则可以有效的解决这些问题。目前，关于纳米材料作为药物运输载体的研究和相关技术已有许多报道，如碳纳米管，石墨烯，二氧化硅等，其实验研究结果初步说明了其具有一定的改善药物疗效的作用，但其可能存在生物毒性。纳米金刚石具有尺寸可控，表面易修饰，生物毒性低，化学稳定性好等特点，与其他纳米药物载体相比具有独特的优势。此外，多功能纳米药物载体同时具有成像、诊断、治疗等多种功能，它可以同时实现疾病的诊断和治疗，监控药物运输过程等过程，因此，构以纳米金刚石为基体材料的多功能纳米药物载体在生物医学领域具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种基于纳米金刚石的药物载体及其制备方法。
本发明的第二个目的是提供一种基于纳米金刚石的药物载体复合体，可以用于靶向杀伤癌细胞。
本发明的第三个目的是提供一种基于纳米金刚石的药物载体复合体在制备杀伤癌细胞药物中的应用。
本发明的目的是以下述方式实现的：
基于纳米金刚石的药物载体，所述药物载体为稀土元素铕和钆掺杂的纳米金刚石药物载体，其结构式如下：
其中，RE+3为Eu+3或Gd+3，结构式左侧的半球体为纳米金刚石载体。
如上述的基于纳米金刚石的药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)纳米金刚石表面的硅烷化化学改性，得到表面硅烷化的纳米金刚石，即ND-APTES；
(2)α-噻吩甲酰三氟丙酮的硅烷化修饰，得到硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮，即TTA-Si； (3)步骤(1)得到的表面硅烷化的纳米金刚石、步骤(2)得到的硅烷化的有机配体在溶剂中与Eu+3和Gd+3反应，生成基于纳米金刚石的药物载体ND-TTA:RE+3。
包括以下步骤：
(1)对纳米金刚石依次进行热退火处理、羧基化改性、酰氯化修饰和硅烷化修饰，得到表面硅烷化的纳米金刚石；
(2)α-噻吩甲酰三氟丙酮与异氰酸丙基三乙氧基硅烷反应，得到硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮；
(3)将硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮的乙醇溶液与EuCl3和GdCl3的乙醇溶液混合搅拌后，得溶液D，再将表面硅烷化的纳米金刚石的DMF溶液与溶液D混合搅拌后，加入浓氨水，搅拌得溶液E，将溶液E离心后取沉淀物，洗涤后得到固体沉淀F，将固体沉淀F干燥后得基于纳米金刚石的药物载体ND-TTA:RE+3。
步骤(1)具体为：
①将纳米金刚石分散在陶瓷坩埚中，然后置于马弗炉中在425-450℃下保温后退火5-8h；纳米金刚石要均匀平铺在磁舟底部。
②将退火后的纳米金刚石与浓硫酸和浓硝酸的混合溶液混合后超声震荡60min，超声池中超声功率为200W；
③将步骤②所得混合物移入磁力搅拌器中，搅拌速率400-700rpm，安装回流装置，搅拌、加热回流，温度为80-90℃，回流24-48h后，取出反应溶液进行离心，离心转速为7500-8500rpm，时间为5min；合适的温度和反应时间可以使纳米金刚石表面得到充分的羧基化改性，合适的转速可以保证粒径细小的纳米金刚石颗粒也能被离心下来，同时不会撑破离心管。
④将离心上清液倒入废酸桶中，将离心管壁上的固体沉淀依次进行碱洗和酸洗，再用离子水离心洗涤2～3次，干燥后得到表面羧基化的纳米金刚石粉末；
⑤将羧基化的纳米金刚石与氯化亚砜混合后在70-80℃下搅拌24-48h后，用四氢呋喃反复洗涤，得到酰氯化的纳米金刚石，密封保存，防止长时间暴露在空气中水解；
⑥将酰氯化的纳米金刚石溶于除水的DMF溶液，加入APTES，在氮气氛围下进行硅烷化，硅烷化的反应温度为60℃，时间为24h，反应结束后用DMF反复离心洗涤得到硅烷化的纳米金刚石，将其分散于无水的DMF中密封保存。
步骤(2)具体为：
四氢呋喃除水具体步骤为：先将四氢呋喃加入球形瓶中，再加入切成薄片的钠块，60℃下除水12h，再加入二苯甲酮指示剂，搅拌，加热回流。待溶液变蓝后对四氢呋喃在70℃下蒸馏得到无水四氢呋喃密封保存。对四氢呋喃进行除水要使用水浴锅和蒸馏装置，保持装置的气密性，防止空气中的水蒸气进入其中。
①将NaH和α-噻吩甲酰三氟丙酮溶于无水四氢呋喃中，在氮气氛围下60℃搅拌2h，再将异氰酸丙基三乙氧基硅烷(IPTES)分30min缓慢滴加入反应液中，抽真空除去空气充入氮气，在氮气氛围中反应12-24h，得到反应液A；
②将反应溶液A抽滤得到反应液B，将反应液B在55℃下旋蒸得到黄色油状液体C，即硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮(Si-TTA)。
步骤(3)具体为：
①将硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮溶于无水乙醇中，超声振荡20-60min，超声振荡功率为 800W，加入氯化钆和氯化铕的乙醇溶液，搅拌30min，搅拌速率为500rpm，，得到溶液D；
②取硅烷化的纳米金刚石的DMF溶液与溶液D混合后密封，超声振荡1h后转移至磁力搅拌器上搅拌5h，搅拌速率600rpm，再加入质量浓度为27％的浓氨水，继续搅拌8-15h得到溶液E；加入浓氨水是为了提供碱性环境促进硅烷偶联剂的水解提高反应速率；
③将溶液E进行离心后，离心转速8000rpm，时间5min，倒掉上清液，用无水乙醇对沉淀物反复洗涤，直至上清液中观察不到稀土Eu的红色荧光，得到固体沉淀F，将沉淀F置于真空干燥箱中干燥既得到灰白色粉末ND-TTA:RE+3。将得到灰白色粉末密封避光保存。长时间暴露与自然光中会导致荧光淬灭。
步骤①纳米金刚石的粒径为100-500nm，如颗粒粒径太小则会导致载药量下降，而颗粒粒径过大则会降低纳米粒子在溶液中的稳定性。步骤②浓硫酸和浓硝酸的混合溶液中，浓硫酸与浓硝酸的体积比为3:1，退火后的纳米金刚石与酸混合溶液的质量体积比为(0.3- 0.5)g：68mL；步骤④用0.1M的NaOH进行碱洗，用0.1M HCl溶液进行酸洗，碱洗和酸洗的条件为90℃下搅拌2h，合适的温度和洗涤时间可以保证将纳米金刚石表面多余的杂质充分洗去；退火后的纳米金刚石与APTES的质量体积比为(0.3-0.5)g：2mL。
步骤①NaH和α-噻吩甲酰三氟丙酮的摩尔比为(1-1.2)：2，NaH过量是保证TTA中的C＝O能够充分打开；α-噻吩甲酰三氟丙酮与异氰酸丙基三乙氧基硅烷的摩尔体积比为1mmol：1mL，硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮在5℃下密封保存。
硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮与无水乙醇的体积比为1:15，硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮与氯化钆和氯化铕的乙醇溶液的体积比为1:2；氯化钆乙醇溶液和氯化铕乙醇溶液的摩尔比为2:1-1:2，限定二者的比例是为了使稀土掺杂纳米金刚石药物复合体同时具有较强的荧光亮度和核磁共振造影效果。由于纳米金刚石表面结合位点是有限的，当Eu离子含量过高则会影响Gd的核磁共振显影特性，如果Gd离子含量过高则会降低铕离子的发光亮度，在优选的掺杂范围内可使稀土共掺材料同时具有良好的光致发光和磁共振显影。
氯化钆乙醇溶液和氯化铕乙醇溶液的浓度均为0.1M，硅烷化的纳米金刚石的DMF溶液在与溶液D混合之前先进行超声处理，超声处理功率为800W，时间为30min；氯化钆和氯化铕的乙醇溶液与27％的浓氨水的体积比为2：(1-3)；参与反应的硅烷化的纳米金刚石与硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮的质量比为100:1，控制二者的质量比是为了保证有机配体(即硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮)能够充分利用纳米金刚石表面的结合位点，从而最大限度地将稀土离子固定在纳米金刚石表面以更好的实现荧光和磁共振造影功能。有机配体比例太低时无法充分利用纳米金刚石表面的结合位点，有机配体比例太高时会自团聚形成稀土纳米颗粒影响产物的纯净程度。
利用上述的基于纳米金刚石的药物载体制备药物复合体的方法，具体步骤为：将基于纳米金刚石的药物载体溶于去离子水中超声振荡10-20min，超声振荡功率800W，将药物与上述溶液混合搅拌，温度为35-38℃，时间为24h，药物与基于纳米金刚石的药物载体的质量比为1:10-2:1，反应结束后，将溶液离心，离心转速为8000rpm，时间为5min，取固体沉淀进行干燥，得到药物复合体，并密封避光保存。
由上述的方法制备成的药物复合体。
如权利要求11所上述的药物复合体在制备杀伤癌细胞药物中的应用。
在本发明中，利用稀土Eu+3、Gd+3掺杂的纳米金刚石粒子作为药物载体结合药物离子，一方面可以利用纳米材料独特的纳米尺寸与癌症组织产生EPR效应形成被动靶向运输，将药物运输至病变部位，且本发明的稀土掺杂纳米金刚石药物复合物具有pH响应药物释放特性，其在pH低癌症组织环境中能够快速大量的释放药物而在正常生理环境pH中则具有较低的释放率，这可以延长药物在体内的循环时间，降低药物对正常组织的毒副作用，其掺杂的稀土离子使所述的多功能纳米金刚石药物复合物具有正的Zeta电势，可以增强细胞对纳米粒子的摄取，降低病变组织的耐药性，提高药物的疗效和利用率。另一方面，所述的多功能纳米金刚石药物载体中含有稀土Eu和Gd的配合物，因此其具有良好的光致荧光特性和顺磁特性，可用于荧光标记和成像以及核磁共振造影。
相对于现有技术，本发明中，纳米金刚石表面的官能团经过一系列的化学改性后得到表面硅醇(-Si-OH)化的纳米金刚石，随后硅烷化的稀土配合物(Si-TTA：RE+3)与其混合。在碱性条件下，硅醇之间脱水缩合形成Si-O-Si键将稀土配合物连接在纳米金刚石表面。此外，纳米金刚石表面还有一些未反应的羧基官能团，其水解后形成的羧酸根离子带负电能够吸引带正电的盐酸阿霉素，从而将盐酸阿霉素吸附在纳米金刚石表面。所合成的多功能纳米金刚石药物载体具有荧光成像，核磁共振造影和pH响应的药物释放功能，且其独特的纳米尺寸使其可以通过EPR效应被动靶向沉积到肿瘤部位。因此，本发明中所述的多功能纳米药物复合物兼具成像诊断和药物治疗的功能，对纳米药物的研究和临床应用具有重要意义。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的双模成像多功能药物复合体具有药物负载量大，稳定性好，粒径小易于实现被动靶向，pH响应药物释放等特点，可以有效提高药物的疗效和利用率。此外，其同时具有光致荧光和核磁共振显影特性，有望实现药物输运过程的可视化追踪以及病变部位的成像和诊断。实验结果表明，本发明的多功能纳米金刚石药物复合体相比于游离的盐酸阿霉素对胃癌细胞系具有更强的抑制效果。此外本发明多功能纳米金刚石药物运输载体不仅能够负载盐酸阿霉素，而且能够负载其他的药物，可适应不同的疾病从而实现不同药物的运输。
附图说明
图1为实施例1中所用的未修饰的纳米金刚石粉末的透射电镜及粒径分布图(A-D)，以及稀土掺杂纳米金刚石载体的透射电镜(e)和高分辨率透射电镜图(f)。
图2中：A为实施例1中所得到稀土掺杂纳米金刚石载体的X射线光电子能谱，其中出现了较为明显的稀土Eu和Gd的光电子峰；B-D为实施案例1得到的稀土掺杂纳米金刚石载体中S,Eu,Gd的精细结构谱。
图3为实施例1得到的稀土掺杂纳米金刚石载体的核磁共振显影图，直线表示氢质子的弛豫率随稀土掺杂纳米金刚石载体的浓度呈线性变化。
图4为实施例1得到的稀土掺杂纳米金刚石载体的光致发光谱(左)和紫外灯下荧光照片(左插图)，以及615nm发光峰的荧光寿命(右)。
图5中：a为所有实施例中稀土掺杂纳米金刚石药物复合体的制备和药物释放过程示意图；d为实施案1稀土掺杂纳米金刚石药物复合体制备过程中盐酸阿霉素的负载量随时间的变化；e为实施案1中稀土掺杂纳米金刚石药物复合体制备过程中，不同药物与载体比例时，盐酸阿霉素的负载量；f为实施例1中稀土掺杂纳米金刚石药物复合体药物释放过程与环境pH的响应关系。
图6中：a为实施例1中所用的未经处理的纳米金刚石与经稀土掺杂的纳米金刚石的 细胞毒性MTT检测结果；b为实施例1中细胞毒性实验过程中，不同浓度实验组中细胞密度与形态变化；c为实施例1中稀土掺杂纳米金刚石药物复合体与同样浓度盐酸阿霉素对胃癌细胞的杀伤效果对比；d为实施例1中稀土掺杂纳米金刚石药物复合体与同样浓度盐酸阿霉素的细胞杀伤对比实验中不同浓度组细胞密度和形态变化。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
以下实施案例中采集透射电镜照片所用的仪器是透射电子显微镜(FEOL-2010(Japan) microscope)。检测样品中元素种类及含量所用仪器为X射线光电子能谱仪(Thermol scientific Escalab 250Xi with Al radiation)。样品的光致发光谱和荧光寿命的的采集使用了荧光光谱仪(F-7000spectrophotometer)。样品的弛豫率与核磁共振图像的采集使用了3.0T超导核磁共振仪(German,Siemes).盐酸阿霉素的装载和释放实验中使用了分光光度计 (UH4150UV-Vis spectrophotometer(Hitachi))来得到阿霉素含量。最后，细胞毒性和细胞杀伤实验使用酶标仪进行MTT检测，另外细胞图像的采集使用了奥林巴斯荧光显微镜。
基于纳米金刚石的药物载体，所述药物载体为稀土元素铕和钆掺杂的纳米金刚石药物载体，其结构式如下：
其中，RE+3为Eu+3或Gd+3，结构式左侧的半球体为纳米金刚石载体。
如上述的基于纳米金刚石的药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)纳米金刚石表面的硅烷化化学改性，得到表面硅烷化的纳米金刚石，即ND-APTES；具体为：
①将纳米金刚石分散在陶瓷坩埚中，然后置于马弗炉中在425-450℃下保温后退火5-8h；纳米金刚石要均匀平铺在磁舟底部。
②将退火后的纳米金刚石与浓硫酸和浓硝酸的混合溶液混合后超声震荡60min，超声池中超声功率为200W；
③将步骤②所得混合物移入磁力搅拌器中，搅拌速率400-700rpm，安装回流装置，搅拌、加热回流，温度为80-90℃，回流24-48h后，取出反应溶液进行离心，离心转速为7500-8500rpm，时间为5min；合适的温度和反应时间可以使纳米金刚石表面得到充分的羧基化改性，合适的转速可以保证粒径细小的纳米金刚石颗粒也能被离心下来，同时不会撑破离心管。
④将离心上清液倒入废酸桶中，将离心管壁上的固体沉淀依次进行碱洗和酸洗，再用离子水离心洗涤2～3次，干燥后得到表面羧基化的纳米金刚石粉末；
⑤将羧基化的纳米金刚石与氯化亚砜混合后在70-80℃下搅拌24-48h后，用四氢呋喃反复洗涤，得到酰氯化的纳米金刚石，密封保存，防止长时间暴露在空气中水解；
⑥将酰氯化的纳米金刚石溶于除水的DMF溶液，加入APTES，在氮气氛围下进行硅烷化，硅烷化的反应温度为60℃，时间为24h，反应结束后用DMF反复离心洗涤得到硅烷化的纳米金刚石，将其分散于无水的DMF中密封保存。
步骤①纳米金刚石的粒径为100-500nm，如颗粒粒径太小则会导致载药量下降，而颗粒粒径过大则会降低纳米粒子在溶液中的稳定性。步骤②浓硫酸和浓硝酸的混合溶液中，浓硫酸与浓硝酸的体积比为3:1，退火后的纳米金刚石与酸混合溶液的质量体积比为(0.3- 0.5)g：68mL；步骤④用0.1M的NaOH进行碱洗，用0.1M HCl溶液进行酸洗，碱洗和酸洗的条件为90℃下搅拌2h，合适的温度和洗涤时间可以保证将纳米金刚石表面多余的杂质充分洗去；退火后的纳米金刚石与APTES的质量体积比为(0.3-0.5)g：2mL。
(2)α-噻吩甲酰三氟丙酮的硅烷化修饰，得到硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮，即TTA-Si；
具体为：
①将NaH和α-噻吩甲酰三氟丙酮溶于无水四氢呋喃中，在氮气氛围下60℃搅拌2h，再将异氰酸丙基三乙氧基硅烷(IPTES)分30min缓慢滴加入反应液中，抽真空除去空气充入氮气，在氮气氛围中反应12-24h，得到反应液A；
②将反应溶液A抽滤得到反应液B，将反应液B在55℃下旋蒸得到黄色油状液体C，即硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮(Si-TTA)。
步骤①NaH和α-噻吩甲酰三氟丙酮的摩尔比为(1-1.2)：2，NaH过量是保证TTA中的C＝O能够充分打开；α-噻吩甲酰三氟丙酮与异氰酸丙基三乙氧基硅烷的摩尔体积比为1mmol：1mL，硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮在5℃下密封保存。
(3)步骤(1)得到的表面硅烷化的纳米金刚石、步骤(2)得到的硅烷化的有机配体在溶剂中与Eu+3和Gd+3反应，生成基于纳米金刚石的药物载体ND-TTA:RE+3。
具体为：
①将硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮溶于无水乙醇中，超声振荡20-60min，超声振荡功率为 800W，加入氯化钆和氯化铕的乙醇溶液，搅拌30min，搅拌速率为500rpm，，得到溶液D；②取硅烷化的纳米金刚石的DMF溶液与溶液D混合后密封，超声振荡1h后转移至磁力搅拌器上搅拌5h，搅拌速率600rpm，再加入质量浓度为27％的浓氨水，继续搅拌8-15h得到溶液E；加入浓氨水是为了提供碱性环境促进硅烷偶联剂的水解提高反应速率；
③将溶液E进行离心后，离心转速8000rpm，时间5min，倒掉上清液，用无水乙醇对沉淀物反复洗涤，直至上清液中观察不到稀土Eu的红色荧光，得到固体沉淀F，将沉淀F置于真空干燥箱中干燥既得到灰白色粉末ND-TTA:RE+3。将得到灰白色粉末密封避光保存。长时间暴露与自然光中会导致荧光淬灭。
硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮与无水乙醇的体积比为1:15，硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮与氯化钆和氯化铕的乙醇溶液的体积比为1:2；氯化钆乙醇溶液和氯化铕乙醇溶液的摩尔比为2:1-1:2，限定二者的比例是为了使稀土掺杂纳米金刚石药物复合体同时具有较强的荧光亮度和核磁共振造影效果。由于纳米金刚石表面结合位点是有限的，当Eu离子含量过高则会影响Gd的核磁共振显影特性，如果Gd离子含量过高则会降低铕离子的发光亮度，在优选的掺杂范围内可使稀土共掺材料同时具有良好的光致发光和磁共振显影。
氯化钆乙醇溶液和氯化铕乙醇溶液的浓度均为0.1M，硅烷化的纳米金刚石的DMF溶液在与溶液D混合之前先进行超声处理，超声处理功率为800W，时间为30min；氯化钆和氯化铕的乙醇溶液与27％的浓氨水的体积比为2：(1-3)；参与反应的硅烷化的纳米金刚石与硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮的质量比为100:1，控制二者的质量比是为了保证有机配体(即硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮)能够充分利用纳米金刚石表面的结合位点，从而最大限度地将稀土离子固定在纳米金刚石表面以更好的实现荧光和磁共振造影功能。有机配体比例太低时无法充分利用纳米金刚石表面的结合位点，有机配体比例太高时会自团聚形成稀土纳米颗粒影响产物的纯净程度。
利用上述的基于纳米金刚石的药物载体制备药物复合体的方法，具体步骤为：将基于纳米金刚石的药物载体溶于去离子水中超声振荡10-20min，超声振荡功率800W，将药物与上述溶液混合搅拌，温度为35-38℃，时间为24h，药物与基于纳米金刚石的药物载体的质量比为1:10-2:1，反应结束后，将溶液离心，离心转速为8000rpm，时间为5min，取固体沉淀进行干燥，得到药物复合体，并密封避光保存。
本发明中涉及的反应的反应式为：
由上述的方法制备成的药物复合体。
如权利要求11所上述的药物复合体在制备杀伤癌细胞药物中的应用。
基于纳米金刚石的药物载体的制备：
实施例1：
基于纳米金刚石的药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)纳米金刚石表面的硅烷化化学改性，得到表面硅烷化的纳米金刚石，即ND-APTES；具体为：
①将纳米金刚石分散在陶瓷坩埚中，然后置于马弗炉中在425℃下保温后退火5h；纳米金刚石要均匀平铺在磁舟底部。
②将退火后的纳米金刚石与浓硫酸和浓硝酸的混合溶液混合后超声震荡60min，超声池中超声功率为200W；
③将步骤②所得混合物移入磁力搅拌器中，搅拌速率400rpm，安装回流装置，搅拌、加热回流，温度为80℃，回流24h后，取出反应溶液进行离心，离心转速为7500rpm，时间为5min；
④将离心上清液倒入废酸桶中，将离心管壁上的固体沉淀依次进行碱洗和酸洗，再用离子水离心洗涤2次，干燥后得到表面羧基化的纳米金刚石粉末；
⑤将羧基化的纳米金刚石与氯化亚砜混合后在70℃下搅拌24h后，用四氢呋喃反复洗涤，得到酰氯化的纳米金刚石，密封保存，防止长时间暴露在空气中水解；
⑥将酰氯化的纳米金刚石溶于除水的DMF溶液，加入APTES，在氮气氛围下进行硅烷化，硅烷化的反应温度为60℃，时间为24h，反应结束后用DMF反复离心洗涤得到硅烷化的纳米金刚石，将其分散于无水的DMF中密封保存。
步骤①纳米金刚石的粒径为100nm，步骤②浓硫酸和浓硝酸的混合溶液中，浓硫酸与浓硝酸的体积比为3:1，退火后的纳米金刚石与酸混合溶液的质量体积比为0.3g：68mL；步骤④用0.1M的NaOH进行碱洗，用0.1M HCl溶液进行酸洗，碱洗和酸洗的条件为90℃下搅拌2h，退火后的纳米金刚石与APTES的质量体积比为0.3g：2mL。
(2)α-噻吩甲酰三氟丙酮的硅烷化修饰，得到硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮，即TTA-Si；
具体为：
①将NaH和α-噻吩甲酰三氟丙酮溶于无水四氢呋喃中，在氮气氛围下60℃搅拌2h，再将异氰酸丙基三乙氧基硅烷(IPTES)分30min缓慢滴加入反应液中，抽真空除去空气充入氮气，在氮气氛围中反应12h，得到反应液A；
②将反应溶液A抽滤得到反应液B，将反应液B在55℃下旋蒸得到黄色油状液体C，即硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮(Si-TTA)。
步骤①NaH和α-噻吩甲酰三氟丙酮的摩尔比为1：2，NaH过量是保证TTA中的 C＝O能够充分打开；α-噻吩甲酰三氟丙酮与异氰酸丙基三乙氧基硅烷的摩尔体积比为 1mmol：1mL，硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮在5℃下密封保存。
(3)步骤(1)得到的表面硅烷化的纳米金刚石、步骤(2)得到的硅烷化的有机配体在溶剂中与Eu+3和Gd+3反应，生成基于纳米金刚石的药物载体ND-TTA:RE+3。
具体为：
①将硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮溶于无水乙醇中，超声振荡20min，超声振荡功率为800W，加入氯化钆和氯化铕的乙醇溶液，搅拌30min，搅拌速率为500rpm，，得到溶液D；②取硅烷化的纳米金刚石的DMF溶液与溶液D混合后密封，超声振荡1h后转移至磁力搅拌器上搅拌5h，搅拌速率600rpm，再加入质量浓度为27％的浓氨水，继续搅拌8h得到溶液E；
③将溶液E进行离心后，离心转速8000rpm，时间5min，倒掉上清液，用无水乙醇对沉淀物反复洗涤，直至上清液中观察不到稀土Eu的红色荧光，得到固体沉淀F，将沉淀F置于真空干燥箱中干燥既得到灰白色粉末ND-TTA:RE+3。
硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮与无水乙醇的体积比为1:15，硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮与氯化钆和氯化铕的乙醇溶液的体积比为1:2；氯化钆乙醇溶液和氯化铕乙醇溶液的摩尔比为2:1，氯化钆乙醇溶液和氯化铕乙醇溶液的浓度均为0.1M，硅烷化的纳米金刚石的 DMF溶液在与溶液D混合之前先进行超声处理，超声处理功率为800W，时间为30min；氯化钆和氯化铕的乙醇溶液与27％的浓氨水的体积比为2：1；参与反应的硅烷化的纳米金刚石与硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮的质量比为100:1。
实施例2-6的部分实验数据如表1所示，其他同实施例1。
表1实施例2-6的部分实验数据
选用盐酸阿霉素作为模型药物进行药物的负载：
实施例7：
利用上述的基于纳米金刚石的药物载体制备药物复合体的方法，具体步骤为：将基于纳米金刚石的药物载体溶于去离子水中超声振荡10min，超声振荡功率800W，将盐酸阿霉素与上述溶液混合搅拌，温度为35℃，时间为24h，药物与基于纳米金刚石的药物载体的质量比为 1:10，反应结束后，将溶液离心，离心转速为8000rpm，时间为5min，取固体沉淀进行干燥，得到药物复合体，并密封避光保存。
实施例8：
利用上述的基于纳米金刚石的药物载体制备药物复合体的方法，具体步骤为：将基于纳米金刚石的药物载体溶于去离子水中超声振荡11min，超声振荡功率800W，将盐酸阿霉素与上述溶液混合搅拌，温度为36℃，时间为24h，药物与基于纳米金刚石的药物载体的质量比为 1:5，反应结束后，将溶液离心，离心转速为8000rpm，时间为5min，取固体沉淀进行干燥，得到药物复合体，并密封避光保存。
实施例9：
利用上述的基于纳米金刚石的药物载体制备药物复合体的方法，具体步骤为：将基于纳米金刚石的药物载体溶于去离子水中超声振荡12min，超声振荡功率800W，将盐酸阿霉素与上述溶液混合搅拌，温度为37℃，时间为24h，药物与基于纳米金刚石的药物载体的质量比为 1:3，反应结束后，将溶液离心，离心转速为8000rpm，时间为5min，取固体沉淀进行干燥，得到药物复合体，并密封避光保存。
实施例10：
利用上述的基于纳米金刚石的药物载体制备药物复合体的方法，具体步骤为：将基于纳米金刚石的药物载体溶于去离子水中超声振荡14min，超声振荡功率800W，将盐酸阿霉素与上述溶液混合搅拌，温度为38℃，时间为24h，药物与基于纳米金刚石的药物载体的质量比为1:2，反应结束后，将溶液离心，离心转速为8000rpm，时间为5min，取固体沉淀进行干燥，得到药物复合体，并密封避光保存。
实施例10：
利用上述的基于纳米金刚石的药物载体制备药物复合体的方法，具体步骤为：将基于纳米金刚石的药物载体溶于去离子水中超声振荡15min，超声振荡功率800W，将盐酸阿霉素与上述溶液混合搅拌，温度为38℃，时间为24h，药物与基于纳米金刚石的药物载体的质量比为 2:3，反应结束后，将溶液离心，离心转速为8000rpm，时间为5min，取固体沉淀进行干燥，得到药物复合体，并密封避光保存。
实施例11：
利用上述的基于纳米金刚石的药物载体制备药物复合体的方法，具体步骤为：将基于纳米金刚石的药物载体溶于去离子水中超声振荡16min，超声振荡功率800W，将盐酸阿霉素与上述溶液混合搅拌，温度为37℃，时间为24h，药物与基于纳米金刚石的药物载体的质量比为 1:1，反应结束后，将溶液离心，离心转速为8000rpm，时间为5min，取固体沉淀进行干燥，得到药物复合体，并密封避光保存。
实施例12：
利用上述的基于纳米金刚石的药物载体制备药物复合体的方法，具体步骤为：将基于纳米金刚石的药物载体溶于去离子水中超声振荡18min，超声振荡功率800W，将盐酸阿霉素与上述溶液混合搅拌，温度为36℃，时间为24h，药物与基于纳米金刚石的药物载体的质量比为 3:2，反应结束后，将溶液离心，离心转速为8000rpm，时间为5min，取固体沉淀进行干燥，得到药物复合体，并密封避光保存。
实施例13：
利用上述的基于纳米金刚石的药物载体制备药物复合体的方法，具体步骤为：将基于纳米金刚石的药物载体溶于去离子水中超声振荡20min，超声振荡功率800W，将盐酸阿霉素与上述溶液混合搅拌，温度为35℃，时间为24h，药物与基于纳米金刚石的药物载体的质量比为 2:1，反应结束后，将溶液离心，离心转速为8000rpm，时间为5min，取固体沉淀进行干燥，得到药物复合体，并密封避光保存。
实验例：
在本实验例中，多功能纳米金刚石药物复合体的制备方法和步骤如下：
(1)纳米金刚石的表面硅烷化修饰
取0.4g纳米金刚石平铺在磁舟中，置于马弗炉中425℃煅烧5h后退火至室温
将17ml浓硝酸与51ml浓硫酸混合后倒入100ml圆底烧瓶中，然后缓慢加入0.4g退火的纳米金刚石粉末得到反应液A。
将盛有A液的圆底烧瓶用玻璃塞密封后置于200W超声振荡池中超声振荡1h。
超声振荡1h后，将圆底烧瓶转移至磁力搅拌器上80℃，600rpm连续搅拌48h 反应结束后，将反应液进行离心。离心转速8000rpm，时间5min。分别用0.1M NaOH和 0.1M的HCl对沉淀进行洗涤2h，最后用去离子水清洗3次，将沉淀置于真空干燥箱中干燥 24h得到表面羧基化的纳米金刚石粉末
取0.3g羧基化的纳米金刚是粉末与40ml氯化亚砜混合后，在70℃条件下加热5h,然后加入2ml无水DMF，继续搅拌24h。
反应结束后，离心倒掉多余的氯化亚砜液体，用无水四氢呋喃反复清洗离心沉淀3次，得到酰氯化修饰的纳米金刚石。
将酰氯化的纳米金刚石溶于40ml无水DMF溶液中在氮气氛围下70℃恒温搅拌，在搅拌过程中逐滴加入2ml APTES。
反应24h后，离心除去上清液得到固体沉淀，并用无水DMF洗涤三次，将最终产物分散与40ml无水DMF中密封避光保存。
(2)稀土有机配体的硅烷化修饰
使用金属钠作为干燥剂，采用蒸馏法对四氢呋喃进行除水处理。具体地，将100ml四氢呋喃 装入球形瓶中之后将钠块切成薄片小心加入到四氢呋喃溶液中，60℃回流12h。
回流12h之后，加入二苯甲酮指示剂，继续搅拌直至溶液变蓝后升温至70℃，将四氢呋喃进行蒸馏。
取2mmolNaH和1mmolTTA溶于50ml无水四氢呋喃溶液中，在氮气氛围下恒温 60℃搅拌2h，随后取2ml IPTES在氮气氛围下分30min缓慢滴加入溶液中，继续搅拌12h 得到溶液A
反应结束后，将溶液A进行抽滤两次得到溶液B，然后对溶液B进行旋蒸，温度55℃，最终得到黄色油状液体C。
将黄色油状液体C装入玻璃瓶中，密封避光保存。
(3)稀土掺杂纳米金刚石药物载体的制备
将第(2)部分所得黄色油状液体C溶于20ml无水乙醇，并置于超声清洗池中超声振荡20min，之后加入1ml EuCl3(0.1M)好2ml GdCl3(0.1M)，搅拌10min得到D液。
取30ml ND-Si的DMF溶液置于超声池中超声振荡20min，之后向其中加入20ml D液，在室温下搅拌5h后加入2ml 27％的氨水，继续搅拌24h。
反应结束后，将溶液8000rpm离心倒掉上清液，使用无水乙醇对离心沉淀反复洗涤3 次左右，将终产物置于真空干燥箱中24h得到灰白色粉末(ND-TTA:RE+3)。
通过电镜观察，本实施例中所制备的稀土掺杂纳米金刚石药物载体团簇粒径在200- 300nm范围，从高分辨率电镜图像中可以看到3-5nm的金刚石颗粒四周包覆有无定型的硅烷化稀土配合物，如图1所示。
随后，使用XPS对所制备样品中包含的元素种类和含量进行了表征分析。结果如图2所示，survey图表示样品含有，C、N、O、S、Eu、Gd等元素。精细谱更明确的显示出了 Eu、Gd的特征光电子峰，证明了稀土离子成功掺入。
将样品配置成一系列不同浓度的水溶液，在3.0T超导核磁共振仪中对不同浓度的样品进行T1加权扫描成像，结果表明实验例所制备的稀土掺杂纳米金刚石药物载体具有明显的核磁共振造影效果，且经过计算可得，随着浓度增加，水质子的弛豫率呈线性增加，如图 3所示。这与其中掺杂的稀土Gd元素有关。
如图4所示，实验例中所制备的稀土掺杂纳米金刚石药物载体具有的光致发光特性，在365nm紫外光照射下发出明亮的红光，荧光寿命检测结果显示其615nm处发光峰的荧光寿命达到0.68ms。这些特性来自于稀土Eu的掺入。
药物负载实验：
1.将盐酸阿霉素溶于50ml去离子水中，然后加入ND-TTA-Eu，超声30-60min，然后在室温(避光)搅拌24-36h；
2.将溶液离心(7000-8000rpm)，5min-10min，得到沉淀物；
3.将沉淀物置于真空干燥箱中室温干燥24-48h得到粉末ND-TTA:Eu-Dox；
4.实施例中，我们将盐酸阿霉素与ND-TTA：Eu以质量比1:2混合溶于去离子水中，超声30min，然后避光搅拌24h。之后，离心除去上清液，将离心沉淀置于真空干燥箱中常温干燥24h得到ND-TTA：Eu-Dox药物复合物。
药物负载实验结果表明，当药物与载体的质量比为3:2时，药物负载率最高，达到37.5％。
药物释放实验：
将先前制备的ND-TTA:Eu-Dox分别溶于50ml pH 5.7和pH 7.4的PBS中，在室温下搅拌(500-600rpm)，定时取样(如，每隔1h取一次样)，每次取样后对溶液进行离心处理，用分光光度法检测离心上清液中盐酸阿霉素的含量。从而得到不同pH环境中盐酸阿霉素的释放量随时间的变化关系。
如图5所示，不同pH环境中药物释放结果表明，药物复合体在酸性条件下释放速率更快，而在中性环境中具有较低的释放速率。这个结果表明实验例所制备的纳米金刚石药物载体能有效的负载盐酸阿霉素，且所制备的药物复合体具有pH响应药物释放特性。
细胞毒性MTT检测实验：
1.将肺癌细胞SGC-7901移植到96孔细胞培养板中，(浓度为每孔8000)，然后在37℃室温下在5％二氧化碳氛围中培养48h。
2.用DMEM培养基对肺癌细胞进行洗涤后加入100ul新鲜的DMEM溶液。随后分别加入不同浓度梯度的ND，ND-TTA:RE，ND-TTA:RE-Dox，Dox(每个浓度三个复孔)在 37℃，5％CO2培养箱中培养24h。然后，向每个细胞孔中加入10ul MTS试剂继续在培养箱中培养2h。随后，使用酶标仪检测490nm的吸光度，从而得到各个实验组细胞的存活率。
最后，我们对所制备的多功能药物复合体的细胞杀伤特性进行了检验，为了排除单独的药物载体的细胞毒性，我们对未处理的纳米金刚石和未装载阿霉素的药物载体进行了 MTT检测，如图6所示，结果显示两者在所用浓度范围内没有表现出明显的细胞毒性。而我们所制备的多功能药物复合体与游离盐酸阿霉素的细胞杀伤结果表明，多功能药物复合体相比于游离的盐酸阿霉素对胃癌细胞具有更明显的抑制作用。这可能得益于其较高的表面正电势导致的细胞摄取增强，从而降低了癌细胞的耐药性。
本申请中关于物质的简写说明：
盐酸阿霉素：Dox；
纳米金刚石：ND；
α-噻吩乙酰三氟丙酮：TTA；
硅烷化的α-噻吩乙酰三氟丙酮：Si-TTA或有机配体；
APTES：3-氨丙基三乙氧基硅烷；
DMF：N，N-二甲基甲酰胺；
异氰酸丙基三乙氧基硅烷：IPTES；
基于纳米金刚石的药物载体：ND-TTA:RE+3；
药物复合体：ND-TTA:RE+3-Dox(以盐酸阿霉素为药物模型)；
表面硅烷化的纳米金刚石：ND-APTES。
申请人声明，本发明通过上述实例来说明本发明的荧光/磁共振双模成像多功能药物复合体及其制备和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加，具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (12)

1.基于纳米金刚石的药物载体，其特征在于：所述药物载体为稀土元素铕和钆掺杂的纳米金刚石药物载体，其结构式如下：
其中，RE+3为Eu+3或Gd+3，结构式左侧的球体为纳米金刚石载体。
2.如权利要求1所述的基于纳米金刚石的药物载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)纳米金刚石表面的硅烷化化学改性，得到表面硅烷化的纳米金刚石，即ND-APTES；
(2)α-噻吩甲酰三氟丙酮的硅烷化修饰，得到硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮，即TTA-Si；
(3)步骤(1)得到的表面硅烷化的纳米金刚石、步骤(2)得到的硅烷化的有机配体在溶剂中与Eu+3和Gd+3反应，生成基于纳米金刚石的药物载体ND-TTA:RE+3。
3.根据权利要求2所述的基于纳米金刚石的药物载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)对纳米金刚石依次进行热退火处理、羧基化改性、酰氯化修饰和硅烷化修饰，得到表面硅烷化的纳米金刚石；
(2)α-噻吩甲酰三氟丙酮与异氰酸丙基三乙氧基硅烷反应，得到硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮；
(3)将硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮的乙醇溶液与EuCl3和GdCl3的乙醇溶液混合搅拌后，得溶液D，再将表面硅烷化的纳米金刚石的DMF溶液与溶液D混合搅拌后，加入浓氨水，搅拌得溶液E，将溶液E离心后取沉淀物，洗涤后得到固体沉淀F，将固体沉淀F干燥后得基于纳米金刚石的药物载体ND-TTA:RE+3。
4.根据权利要求3所述的基于纳米金刚石的药物载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)具体为：
①将纳米金刚石分散在陶瓷坩埚中，然后置于马弗炉中在425-450℃下保温后退火5-8h；
②将退火后的纳米金刚石与浓硫酸和浓硝酸的混合溶液混合后超声震荡60min；
③将步骤②所得混合物移入磁力搅拌器中，搅拌、加热回流，温度为80-90℃，回流24-48h后，取出反应溶液进行离心，离心转速为7500-8500rpm，时间为5min；
④将离心管壁上的固体沉淀依次进行碱洗和酸洗，再用离子水离心洗涤，干燥后得到表面羧基化的纳米金刚石粉末；
⑤将羧基化的纳米金刚石与氯化亚砜混合后在70-80℃下搅拌24-48h后，用四氢呋喃洗涤，得到酰氯化的纳米金刚石，密封保存；
⑥将酰氯化的纳米金刚石溶于除水的DMF溶液，加入APTES，在氮气氛围下进行硅烷化，硅烷化的反应温度为60℃，时间为24h，反应结束后用DMF反复离心洗涤得到硅烷化的纳米金刚石，将其分散于无水的DMF中密封保存。
5.根据权利要求3所述的基于纳米金刚石的药物载体的制备方法，其特征在于：步骤(2)具体为：
①将NaH和α-噻吩甲酰三氟丙酮溶于无水四氢呋喃中，在氮气氛围下60℃搅拌2h，再将异氰酸丙基三乙氧基硅烷滴加入反应液中，在氮气氛围中反应12-24h，得到反应液A；
②将反应溶液A抽滤得到反应液B，将反应液B在55℃下旋蒸得到黄色油状液体C，即硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮。
6.根据权利要求3所述的基于纳米金刚石的药物载体的制备方法，其特征在于：步骤(3)具体为：
①将硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮溶于无水乙醇中，超声振荡20-60min，加入氯化钆和氯化铕的乙醇溶液，搅拌，得到溶液D；
②取硅烷化的纳米金刚石的DMF溶液与溶液D混合后密封，超声振荡1h后转移至磁力搅拌器上搅拌5h，再加入质量浓度为27％的浓氨水，继续搅拌8-15h得到溶液E；
③将溶液E进行离心后，倒掉上清液，用无水乙醇对沉淀物洗涤2～3次得到固体沉淀F，将沉淀F置于真空干燥箱中干燥既得到灰白色粉末ND-TTA:RE+3。
7.根据权利要求4所述的基于纳米金刚石的药物载体的制备方法，其特征在于：步骤①纳米金刚石的粒径为100-500nm，步骤②浓硫酸和浓硝酸的混合溶液中，浓硫酸与浓硝酸的体积比为3:1，退火后的纳米金刚石与酸混合溶液的质量体积比为(0.3-0.5)g：68mL；步骤④用0.1M的NaOH进行碱洗，用0.1M HCl溶液进行酸洗，碱洗和酸洗的条件为90℃下搅拌2h；退火后的纳米金刚石与APTES的质量体积比为(0.3-0.5)g：2mL。
8.根据权利要求5所述的基于纳米金刚石的药物载体的制备方法，其特征在于：步骤①NaH和α-噻吩甲酰三氟丙酮的摩尔比为(1-1.2)：2，α-噻吩甲酰三氟丙酮与异氰酸丙基三乙氧基硅烷的摩尔体积比为1mmol：1mL，硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮在5℃下密封保存。
9.根据权利要求6所述的基于纳米金刚石的药物载体的制备方法，其特征在于：硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮与无水乙醇的体积比为1:15，硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮与氯化钆和氯化铕的乙醇溶液的体积比为1:2，氯化钆乙醇溶液和氯化铕乙醇溶液的摩尔比为2:1-1:2，氯化钆乙醇溶液和氯化铕乙醇溶液的浓度均为0.1M，硅烷化的纳米金刚石的DMF溶液在与溶液D混合之前先进行超声处理，氯化钆和氯化铕的乙醇溶液与27％的浓氨水的体积比为2：(1-3)，参与反应的硅烷化的纳米金刚石与硅烷化的α-噻吩甲酰三氟丙酮的质量比为100:1。
10.利用权利要求1所述的基于纳米金刚石的药物载体制备药物复合体的方法，其特征在于：具体步骤为：将基于纳米金刚石的药物载体溶于去离子水中超声振荡10-20min，将药物与上述溶液混合搅拌，温度为35-38℃，时间为24h，药物与基于纳米金刚石的药物载体的质量比为1:10-2:1，反应结束后，将溶液离心，取固体沉淀进行干燥，得到药物复合体，并密封避光保存。
11.由权利要求10所述的方法制备成的药物复合体。
12.如权利要求11所述的药物复合体在制备杀伤癌细胞药物中的应用。
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