CN103285409A - 具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂及其制备方法，所述具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，包括空心二氧化硅外壳，位于所述空心二氧化硅外壳中的具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒以及负载在所述空心二氧化硅外壳和钆掺杂上转换荧光纳米颗粒之间的具有放疗增敏功效的化疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于协同治疗的新型多功能纳米诊疗剂及其制备和应用，属于纳米生物医学领域。具体说，这种纳米诊疗剂既可以实现针对恶性肿瘤的磁共振/上转换荧光双模式成像造影用于高效诊断，又可以通过装载具有放疗增敏功效的药物，例如顺铂，用于实现原位化/放协同联合治疗。
背景技术
放疗是临床上治疗癌症的主要手段，其可以精确聚焦定位病人的肿瘤部位，并辅以高能X射线杀死癌细胞，达到抑制肿瘤生长的目的，已经在临床上针对某些恶性肿瘤（诸如食道癌肿瘤）取得了巨大的成功。然而，大多数乏氧肿瘤对X射线不敏感，从而限制了放疗在遏制乏氧肿瘤生长方面的进一步发展和应用。此外，如何通过其他治疗手段来辅助放疗，降低所用X射线的剂量，减小对周围正常组织的伤害，也是一个迫切需要解决的难题。目前，一些具有放疗增敏功效的药物，例如顺铂、紫杉醇等，已经被用于临床来辅助放疗，实现化疗和放疗的联合。然而，大量注射这些自由药物，无疑也会对人体的正常器官造成巨大的毒副作用。值得庆幸的是，近几年迅速发展的纳米生物技术以及纳米药物载体，可以有效地解决这一难题。
癌症早期诊断的传统方法主要是采用影像技术（如：荧光、PET、CT扫描、磁共振(MRI)成像等）寻找可疑的病灶区，然而目前临床采用的均是单一成像模式，无疑存在很多缺陷，诊断效果较差，且诊断出的癌症患者多数属于中晚期，往往错过了最佳治疗的时期，导致许多肿瘤患者因治疗无效而死亡。CT和MRI成像具有很高的空间分辨率，但灵敏度较低；而PET和荧光成像与之相反，具有很高的灵敏度高，但空间分辨率较低。因此，采用纳米技术，开发一种多模式成像探针，有利于整合不同成像模式之间的优势，实现针对癌症早期的高效诊断，以便患者及早治疗。近年来发展的稀土离子掺杂的上转换荧光纳米颗粒由于具有生物毒性低、穿透深度大、自发荧光少、信噪比高等优点被广泛认为是具有良好应用前景的新型上转换荧光探针。此外，掺杂钆离子可以同时引入实现MRI的加权成像，因此可以作为一种磁共振/上转换荧光双模式成像探针，同时具有高的空间分辨率和灵敏度。CN102391874A公开一种具有双重作用的钆掺杂NaYF4基上转换换荧光纳米颗粒，兼具上转换荧光和磁共振双模式成像功能。
发明内容
面对现有技术存在的问题，基于当前严峻的癌症形势以及未来纳米生物医学发展的趋势，本发明旨在提供一种能够实现针对恶性肿瘤的高效诊断以及原位治疗的新型多功能纳米诊疗剂，以克服目前癌症诊治领域出现的成像与治疗模式单一、诊治效果差、放疗对乏氧肿瘤的不敏感性等缺点，实现针对恶性肿瘤早期的磁共振/上转换荧光双模式高效诊断以及原位化/放协同治疗。
在此，本发明首先提供一种具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，包括空心二氧化硅外壳，位于所述空心二氧化硅外壳中的具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒以及负载在所述空心二氧化硅外壳和钆掺杂上转换荧光纳米颗粒之间的具有放疗增敏功效的化疗药物。
本发明提供具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂具有如下优点：（1）钆掺杂上转换荧光纳米颗粒，例如Gd-UCNP(NaYF4:Yb/ErNaGdF4)作为内核，可用于磁共振/上转换荧光双模式成像，具有较高的成像灵敏度和分辨率，有助于提高癌症早期的确诊率。（2）空腔结构的引入，可以实现抗癌药物，高效装载。装载的药物选用具有放疗增敏功效的化疗药物，例如顺铂，既可以作为一种化疗药物用于杀死肿瘤细胞，又可以作为一种放疗增敏剂用于增强乏氧肿瘤对X射线的杀伤作用，从而提高放疗的效果，达到协同治疗的目的。
较佳地，所述具有放疗增敏功效的化疗药物可为顺铂和/或紫杉醇。
较佳地，所述具有放疗增敏功效的装载量可为5～10%。
较佳地，所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的化学组成为NaYF4:Yb/ErNaGdF4，其中内核NaYF4:Yb/Er的直径为22.9～26.5nm，外壳NaGdF4的厚度为0.8～1.0nm。
较佳地，所述空心二氧化硅外壳的外径为55～60nm，内径为50～54nm。
本发明还提供一种制备上述磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂的方法，包括：
（1）采用高温热解工艺，制备单层结构的上转换荧光纳米颗粒；
（2）采用晶核辅助外延生长工艺在所述上转换荧光纳米颗粒上外延生长含有钆的外壳从而得到具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒；
（3）利用反微乳液方法在所述具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒上包裹第一实心氧化硅层；
（4）利用水相再生长法继续在所述具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒上包括第二心氧化硅层；
（5）以聚乙烯吡咯烷酮为保护剂，通过高温热水腐蚀法选择性蚀刻所述第一实心氧化硅层，从而得到具有空腔的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒/二氧化硅的复合纳米结构；以及
（6）通过原位搅拌法和真空灌注法装载具有放疗增敏功效的化疗药物从而得到具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂。
较佳地，在步骤（3）中，采用注射泵匀速引入硅源TEOS。
较佳地，在步骤（4）中，控制水、氨水和乙醇的体积比为1：1：4，采用注射泵匀速引入硅源TEOS。
较佳地，在步骤（5）中，所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为40000以上。
较佳地，在步骤（5）中，高温热水腐蚀法的温度为95～100℃，反应时间为2.5～3小时。
本发明合成工艺简单易行、成本低、效率高，在纳米生物医学领域具有极高的研究价值和广阔的应用前景。
附图说明
图1A和1B为本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂合成示意图；
图2中（A）～（D）依次为本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂的合成过程中每一步反应产物的TEM照片；
图3为本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在细胞水平上的磁共振/上转换荧光双模式成像；
图4为本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在活体水平上的磁共振/上转换荧光双模式成像；
图5为本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂实现化/放协同治疗的示意图；
图6为本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在细胞水平上实现化/放协同治疗的评价；
图7为本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在活体水平上实现化/放协同治疗的评价；。
图8为荷瘤小鼠经过不同模式的治疗后所得到的肿瘤部位的H&E染色照片。
具体实施方式
以下，结合附图和下述实施方式进一步说明本发明。应理解，附图具体实施方式仅 用于说明本发明而非限制本发明。
本发明提供一种具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂。内核是具有核/壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒，该颗粒自身具有核壳结构，其内核可以在980nm近红外光激发下发出红光和绿光，用于荧光成像；此外，外壳钆离子的引入可以实现MRI的加权成像。钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的化学组成可以为NaYF4:Yb/ErNaGdF4，但应理解，不限于此，例如内核可以为其他NaYF4基的上转换荧光颗粒。在钆掺杂上转换荧光纳米颗粒中，内核（例如NaYF4:Yb/Er）的直径可为22.9～26.5nm，外壳（例如NaGdF4）的厚度可为0.8～1.0nm。通过优化最外层NaGdF4的厚度，可提高上转换荧光颗粒的纵向弛豫率，以接近甚至超过临床Gd剂的纵向弛豫率值。参见图3，其示出本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在细胞水平上的磁共振/上转换荧光双模式成像，从图(a)中可以看出，随着与细胞共培养的诊疗剂的浓度增加，细胞所呈现的MRI信号也逐渐增强；图(b)显示诊疗剂与细胞共培养一段时间后，可以大量的被细胞吞噬，且存在与细胞质中。参见图4，其示出本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在活体水平上的磁共振/上转换荧光双模式成像，从图中可以看出，将一定浓度的诊疗剂注入肿瘤中后，肿瘤区域的MRI信号和上转换荧光信号都比周围区域有明显增强。
外壳可选用空心二氧化硅，上述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒可动地位于空心二氧化硅中，而在两者之间形成空腔。空心二氧化硅外壳的外径可为55～60nm，内径可为50～54nm。在空心二氧化硅外壳和钆掺杂上转换荧光纳米颗粒之间的空腔内可以负载具有放疗增敏功效的化疗药物。具有放疗增敏功效的装载量为5～10%。具有放疗增敏功效的化疗药物包括但不限于顺铂和/或紫杉醇。参见图5，其示出本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂实现化/放协同治疗的示意图，空腔中的顺铂释放出来之后，可以增强放疗对乏氧肿瘤的杀伤作用，发挥化疗和放疗的协同作用。
这样，本发明一方面具有双重成像功能，可实现高效成像而用于肿瘤的高效诊断，另一方面通过负载具有放疗增敏功效的化疗药物，则可在诊断过程中实现原位放疗，并且由于放疗药物兼具放疗增敏功效，同时可原位协同增放疗对乏氧肿瘤的杀伤力。参见图6，其示出本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在细胞水平上实现化/放协同治疗的评价，从中可以看出，单纯放疗只有在高剂量X射线的照射下才有明显的杀伤效果，而在低剂量的照射下效果不高，但是如果加入低浓度的顺铂后，可以实现化疗和放疗的协同作用，几乎可以全部杀死肿瘤细胞，效果优于任何单一模式的治疗。此外，该诊疗剂的治疗效果明显优于自由顺铂，体现了纳米药物载体的优势。参见图7，其示出本发 明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在活体水平上实现化/放协同治疗的评价：当将诊疗剂注入荷瘤裸鼠的肿瘤内部之后，再辅助放疗，可以发现肿瘤的生长得到了明显的抑制，且效果优于任何单一模式的治疗。参见图8，其示出荷瘤小鼠经过不同模式的治疗后所得到的肿瘤部位的H&E染色照片，可以发现，经过化/放协同治疗后，肿瘤组织是最疏松的，也间接的证明了化/放协同治疗在抑制肿瘤生长方面的重要作用。
制备工艺
参见图1A和1B，其示出本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂合成示意图。
在步骤S1中，通过高温热解法和晶核辅助外延生长法合成自身具有核壳结构的内核（钆掺杂上转换荧光纳米颗粒(Gd-UCNP)）。首先，采用高温热解法，制备单层上转换荧光纳米颗粒，例如NaYF4:Yb/Er：按照各种稀土离子掺杂的比例，准确称取所用稀土离子的氯化物作为前驱体，然后在氩气作为保护气的气氛下，将稀土离子前驱体与油酸和十八烯搅拌加热除水后，加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液搅拌，甲醇除去后高温回流0.5～2小时，随后升温至280～290℃，进行高温热解反应1.5小时，冷却至室温之后离心收集样品（上转换荧光纳米颗粒（UCNP））收集的UCNP的直径为22.9～26.5nm。其次，采用晶核辅助外延生长法，制备核/壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒Gd-UCNP（例如NaYF4:Yb/ErNaGdF4）：按照钆离子的掺杂量准确称取钆离子的氯化物作为前驱体，在氩气作为保护气的气氛下，将钆离子前驱体与油酸和十八烯搅拌加热除水后，注入NaYF4:Yb/Er的环己烷溶液，加热除去环己烷后，加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液搅拌，甲醇除去后高温回流0.5～2小时，随后升温至260～270℃，进行高温热解反应1.5小时（此处高温热解反应温度比上一步要低20℃左右），冷却至室温之后离心收集样品（钆掺杂上转换荧光纳米颗粒(Gd-UCNP)），收集的Gd-UCNP的直径为23.7～27.5nm，外层Gd的厚度为0.8～1.0nm。应理解，钆掺杂上转换荧光纳米颗粒具体投料比和更为详细的工艺参数可以参见现有技术，例如CN102391874A。
在步骤S2，通过反微乳液法和水相再生法依次在上述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒上包裹两层实心二氧化硅层得到Gd-UCNPd1-SiO2d2-SiO2。首先采用反微乳液法，实现第一实心氧化硅层的包裹：以CO-520作为表面活性剂，少量的氨水作为催化剂，使用注射泵匀速的将稀释后的硅源TEOS加入到内核（Gd-UCNP）的环己烷溶液体系中，搅拌反应36小时后，滴加甲醇破坏范围乳液体系，随后离心收集样品。在此步反应中，搅拌不要太快，搅拌子不要露出液面。其次，采用水相再生长法，实现第二实心氧化硅层的包裹：将前面收 集的样品加入到水/氨水/乙醇溶液体系中，使用注射泵匀速地往体系中注入稀释后的硅源TEOS，搅拌反应24小时后，离心收集样品。在该步反应中，应严格控制溶剂水/氨水/乙醇的体积比为1：1：4，搅拌不要太慢，搅拌子要露出液面。通过控制硅源的用量来实现第一和第二氧化硅层厚度的调控，第一氧化硅层厚度可为9～11nm，第二氧化硅层厚度可为4～6nm。
在步骤S3，通过高温热水腐蚀工艺选择性地蚀刻内层二氧化硅而引入空腔结构（UCSNs）：以高分子量的PVP（例如Mw=40000）作为保护剂将样品Gd-UCNPd1-SiO2d2-SiO2加入到95～100℃热水中回流反应2.5～3小时后，冷却至室温，离心收集样品。应理解PVP的分子量不限于40000，大于该分子量也是适用的。可以通过控制高温热水腐蚀反应的时间来实现空腔大小的调控。
在步骤S4，通过原位搅拌法或真空灌注法原位装载具有放疗增敏功效的化疗药物（例如顺铂）得到UCSNs-CDDP。原位搅拌法是利用浓度差扩散原理将顺铂载入空腔中：将UCSNs加至含有具有放疗增敏功效的化疗药物的溶液中，搅拌24小时后离心收集样品，冷冻干燥后备用。真空灌注法则是利用真空状态下的巨大压力差将顺铂载入空腔中：对含有UCSNs的去离子水溶液进行抽真空处理，加入具有放疗增敏功效的化疗药物的溶液，抽真空进行真空灌注，最后冲入空气，离心收集样品，冷冻干燥后备用。药物装载量可为5～10%。相比原位搅拌法，真空灌注的效果更好，可以装载更多的药物。
参见图2A～2D，其依次示出本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂的合成过程中每一步反应产物的TEM照片，从中可以看出，每一种产物都是形貌规则，尺寸均一，且分散性非常好，有利于后续的生物学应用。本发明将钆掺杂上转换荧光纳米颗粒与空腔氧化硅结构有机地复合到同一个结构中，并且将整体尺寸控制在100nm以下，保证了良好的分散性和稳定性。这种新型的多功能纳米诊疗剂，既可以实现磁共振/上转换荧光双模式高效诊断，其内部的空腔又可以用来装载具有放疗增敏功效的顺铂药物，实现化/放协同联合治疗。此外，这种结构也可以用来装载光敏剂和热敏剂，同时实现光动力学治疗和光热疗，将为癌症早期的高效诊断与治疗提供更好、更有效的方案。
本发明进一步示出以下实施例以更好地说明本发明。应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的数值也仅是合适范围中的一个示例，即、本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通 常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
钆掺杂上转换荧光颗粒Gd-UCNP的制备
a.首先通过高温热解法制备单层上转换荧光纳米颗粒NaYF4:Yb/Er
1.稀土氯化物的准备，注意用粉末样品，皆是氯化物，现配现用。分别称取1.6mmol(485.376mg)YCl3-H2O，0.36mmol(139.4964mg)YbCl3-6H2O，0.04mmol(15.2684mg)ErCl3-6H2O。这些粉末放置于同一个样品瓶中，然后用4mL的去离子水溶解。然后小心转入100mL的三口烧瓶中；
2.向三口瓶中加入15mL的油酸，30mL的十八烯，室温下搅拌1h；然后开始通5min的氩气，除去瓶中的空气，体系开始进行缓慢的除水过程；先升温到80度保持1h或者更长时间（将自由水除尽）；随后升到120度，保持1h；然后升到156度左右，保持1h。最后可以获得黄色澄清液；停止加热，让体系自然降温至室温；
3.准备NaOH(上海凌锋)-200mg，NH4F(Sigma)-296.3mg，用10mL的甲醇溶解，超声加速分散。然后小心加入体系中。室温下搅拌2h，促进离子之间的交换和前驱体的形成，期间，将氩气撤去，塞住三口瓶；
4.2h后，体系开始进入除甲醇环节，同样是缓慢进行，先通5min氩气，然后升温到50度1h；80～100度1h，直到体系中看不见白色气泡为止，表明甲醇已除完，也可以升到120度，保持1h；确保甲醇基本去除干净；
5.甲醇除完之后，将冷凝管接好，然后开始升温，将最后的温度稳定在280度，并保持1.5h，自然降至室温；
6.清洗过程：首先向体系中加入20mL的桶装酒精，搅拌30min，然后分装到两个50mL的离心管中，用10000r/min，离心10min；收集到略带黄色的产物（第一次）；随后各加入5～10mL的环己烷，小心摇晃，并超声，可以发现产物迅速溶解，获得浑浊溶液，然后加入15mL的酒精，超声约5min，同样的离心收集（第二次），重复清洗3～5次，最后产物（直径为22.9～26.5nm）用20mL环己烷分散，获得100mM的内核。
b.其次，通过晶核辅助外延生长工艺制备核/壳结构钆掺杂上转换荧光纳米颗粒Gd-UCNP(NaYF4:Yb/ErNaGdF4)
1.首先称取0.337mmol（88.83mg）的GdCl3-xH2O，用4mL去离子水分散。称取0.8425mmol（33.7mg）NaOH和1.348mmol（49.93mg）NH4F，用10mL甲醇溶解。外层使用的前躯体是：0.5mL上述的GdCl3-xH2O水溶液；
2.向三口瓶中加入15mL的油酸，30mL的十八烯，将预先计算好的前躯体水溶液加入三口瓶中，室温下搅拌1h。然后开始通5min的氩气，除去瓶中的空气，体系开始进行缓慢的除水过程。先升温到80度保持1h；随后升到100～120度，保持1.5h；然后升到156度左右，保持30min，最后可以获得黄色澄清液；
3.加入1mmol的内核，室温下搅拌约30min，然后在80～100度下，除去环己烷，继续搅拌30min；
4.加入1.25mL的NaOH+NH4F的甲醇溶液；室温下搅拌2h，促进离子之间的交换和前驱体的形成，期间，将氩气撤去，塞住三口瓶；
5.2h后，体系开始进入除甲醇环节，同样是缓慢进行，先通5min氩气，然后升温到50度1h；80～100度1h，直到体系中看不见白色气泡为止，表明甲醇已除完，可以进行热解反应；
6.甲醇除完之后，将冷凝管接好，然后开始升温，将最后的温度稳定在260-270度，并保持1.5h。自然降至室温；
7.清洗，最后产物（直径为23.7～27.5nm，壳层厚度为0.8～1.0nm，其TEM照片参见图2中的（A））用20mL环己烷分散，得到50mM的溶液。
实施例2
Gd-UCNP外两层实心氧化硅的包裹Gd-UCNPd1-SiO2d2-SiO2
a.通过反微乳液法实现第一层实心氧化硅的包裹：1mL NP-5加入20mL环己烷中，磁力搅拌40min；2mL50mM Gd-UCNP的环己烷溶液加入到NP-5/环己烷体系中，无色透明，密封搅拌3h；0.14mL30%氨水逐滴加入混合液，密封搅拌2h。0.2mL的TEOS溶于0.8ml环己烷以1mL/h的速率引入体系中；36h后加入甲醇破坏反微乳液体系，搅拌30min后离心收集，整个过程用乙醇清洗并且超声分散，重复三次，收集样品（二氧化硅的包裹层的厚度为9～11nm，其TEM照片参见图2中的（B）），最后分散在5mL去离子水中；
b.通过水相再生长工艺实现第二层实心氧化硅的包裹：将上述样品加入到体积比为1:1:4的水/氨水/乙醇反应体系中，密封搅拌0.5h后，0.1mL的TEOS溶于0.9mL乙醇以0.2mL/h的速率引入体系中；反应24h后用乙醇清洗并且超声分散，重复三次，收集样品（第二层二氧化硅的包裹层的厚度为4～6nm，其TEM照片参见图2中的（C）），最后分散在10mL去离子水中。
实施例3
空腔氧化硅结构的引入UCSNs：将10mL Gd-UCNPd1-SiO2d2-SiO2的去离子水溶液加入 到10mL25mg/mL的PVP的去离子水溶液中，搅拌0.5h后升温至95度，反应2.5h后用乙醇清洗并且超声分散，重复三次，收集样品（其TEM照片参见图2中的（D））最后分散在10mL去离子水中。
实施例4
顺铂药物的装载UCSNs-CDDP
a.通过原位搅拌法装载顺铂：将10mg UCSNs加入至10mL1mg/mL的顺铂的溶液中，搅拌24h后离心收集样品，冷冻干燥后备用（顺铂的装载量为5%）；
b.通过真空灌注法装载顺铂：将10mL1mg/mL的UCSNs的去离子水溶液置于一玻璃容器的底部，并进行抽真空处理。20min后，关闭真空泵。10ml1mg/mL的顺铂去离子水溶液从上部加入到玻璃瓶中。然后，打开真空泵，并持续大约5min后关闭。最后，充入空气让玻璃容器中的压力与大气压相同。离心收集样品，冷冻干燥后备用（顺铂的装载量为10%）。
实施例5
该纳米多功能纳米诊疗剂的磁共振/上转换荧光双模式成像性能：体外表征：将诊疗剂与Hela细胞共培养后，一部分细胞离心至小试管中做磁共振测试；另一部分细胞用于共聚焦成像实验。参见图3，其示出本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在细胞水平上的磁共振/上转换荧光双模式成像，从图(a)中可以看出，随着与细胞共培养的诊疗剂的浓度增加，细胞所呈现的MRI信号也逐渐增强；图(b)显示诊疗剂与细胞共培养一段时间后，可以大量的被细胞吞噬，且存在与细胞质中。体内表征：将诊疗剂注入至荷瘤小鼠的肿瘤内部，30min后进行磁共振测试和上转换荧光测试。参见图4，其示出本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在活体水平上的磁共振/上转换荧光双模式成像，从图中可以看出，将一定浓度的诊疗剂注入肿瘤中后，肿瘤区域的MRI信号和上转换荧光信号都比周围区域有明显增强。
实施例6
该纳米多功能纳米诊疗剂的化/放协同治疗性能：体外表征：将诊疗剂与Hela细胞共培养后，分别施加2Gy和4Gy的X射线的照射，观察并对比有无照射情况下细胞的存活率。参见图6，其示出本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在细胞水平上实现化/放协同治疗的评价，从中可以看出，单纯放疗只有在高剂量X射线的照射下才有明显的杀伤效果，而在低剂量的照射下效果不高，但是如果加入低浓度的顺铂后，可以实现化疗和放疗的协同作用，几乎可以全部杀死肿瘤细胞，效果优于任何单一模式的治 疗。此外，该诊疗剂的治疗效果明显优于自由顺铂，体现了纳米药物载体的优势。体内表征：将诊疗剂注入荷瘤小鼠的肿瘤内部，30min后进行8Gy的X射线照射，并且与任何单一模式的治疗做对比，每隔一天测量肿瘤的体积，观察肿瘤的生长情况。参见图7，其示出本发明的具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂在活体水平上实现化/放协同治疗的评价：当将诊疗剂注入荷瘤裸鼠的肿瘤内部之后，再辅助放疗，可以发现肿瘤的生长得到了明显的抑制，且效果优于任何单一模式的治疗。参见图8，其示出荷瘤小鼠经过不同模式的治疗后所得到的肿瘤部位的H&E染色照片，可以发现，经过化/放协同治疗后，肿瘤组织是最疏松的，也间接的证明了化/放协同治疗在抑制肿瘤生长方面的重要作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，其特征在于，包括空心二氧化硅外壳，位于所述空心二氧化硅外壳中的具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒以及负载在所述空心二氧化硅外壳和钆掺杂上转换荧光纳米颗粒之间的具有放疗增敏功效的化疗药物。
2.根据权利要求1所述的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，其特征在于，所述具有放疗增敏功效的化疗药物为顺铂和/或紫杉醇。
3.根据权利要求1或2所述的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，其特征在于，所述具有放疗增敏功效的装载量为5～10%。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，其特征在于，所述钆掺杂上转换荧光纳米颗粒的化学组成为NaYF4:Yb/ErNaGdF4，其中内核NaYF4:Yb/Er的直径为22.9～26.5 nm，外壳NaGdF4的厚度为0.8～1.0 nm。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂，其特征在于，所述空心二氧化硅外壳的外径为55～60 nm，内径为50～54 nm。
6.一种制备权利要求1～5中任一项所述的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂的方法，其特征在于，包括：
（1）采用高温热解工艺，制备单层结构的上转换荧光纳米颗粒；
（2）采用晶核辅助外延生长工艺在所述上转换荧光纳米颗粒上外延生长含有钆的外壳从而得到具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒；
（3）利用反微乳液方法在所述具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒上包裹第一实心氧化硅层；
（4）利用水相再生长法继续在所述具有核壳结构的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒上包括第二心氧化硅层；
（5）以聚乙烯吡咯烷酮为保护剂，通过高温热水腐蚀法选择性蚀刻所述第一实心氧化硅层，从而得到具有空腔的钆掺杂上转换荧光纳米颗粒/二氧化硅的复合纳米结构；以及
（6）通过原位搅拌法和真空灌注法装载具有放疗增敏功效的化疗药物从而得到具有化/放疗协同作用的磁共振/上转换荧光双模式成像造影剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，采用注射泵匀速引入硅源TEOS。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，控制水、氨水和乙醇的体积比为1：1：4，采用注射泵匀速引入硅源TEOS。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤（5）中，所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为40000以上。
10.根据权利要求6～9中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤（5）中，高温热水腐蚀法的温度为95～100 ℃，反应时间为2.5～3小时。
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