CN103480006A

CN103480006A - 集发光/ct/mr多模式成像与肿瘤热疗于一体的多功能纳米诊疗剂的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN103480006A
Application number: CN201310437184.3A
Authority: CN
Inventors: 肖庆风; 步文博; 施剑林
Original assignee: Shanghai Institute of Ceramics of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Ceramics of CAS
Priority date: 2013-09-23
Filing date: 2013-09-23
Publication date: 2014-01-01

Abstract

本发明涉及集发光/CT/MR多模式成像与肿瘤热疗于一体的多功能纳米诊疗剂的制备方法及其应用，所述多功能纳米诊疗剂包括：具有近红外发光/CT/MR三模式成像性能的上转换发光纳米颗粒、包裹于所述上转换发光纳米颗粒表面的二氧化硅层、静电吸附于所述二氧化硅层表面的近红外光热转换剂颗粒、以及接枝于所述近红外光热转换剂颗粒表面的巯基功能化聚乙二醇。本发明的多功能纳米诊疗剂能够集发光/CT/MR多模式成像与肿瘤热疗于一体，通过单一波段激发，即可同时实现发光成像和肿瘤热疗。

Description

集发光/CT/MR多模式成像与肿瘤热疗于一体的多功能纳米诊疗剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种集发光&CT&MR多模式成像与肿瘤热疗于一体的多功能纳米诊疗剂及其制备方法和应用，具体地说，是设计和制备一种新颖的多功能纳米诊疗剂，该诊疗剂具有良好的生物相容性，不会对活体组织器官产生有毒损伤，具有优越的CT&MR&发光三模式成像性能，且能够将近红外光的光能转化为热能来杀死癌细胞，属于纳米生物医学诊疗范畴。

背景技术

CT成像在临床诊断领域已经被普遍使用，其优点主要在于，可以实现三维立体断层成像，而且X射线基本没有穿透深度的限制。当前使用的CT造影剂主要是小分子碘剂，其价格低廉，但是这种碘剂在人体内停留时间非常短，限制了其靶向成像应用，而且碘元素本身对X射线的衰减能力有限。因此，如果要获得明显的造影效果，必须注射大量的造影剂，这就很可能带来严重的肾毒性。为了克服传统碘剂的缺点，开发新的重金属纳米颗粒作为CT探针成为重中之重的研究工作。其中，Yb基上转换发光颗粒作为新兴的CT造影剂，因其X射线衰减系数大，生物相容性好等特点，近年来备受瞩目。

然而，尽管造影剂的使用可以显著改善CT造影效果，但仍难克服CT成像的固有缺点，即低的灵敏度和低的软组织分辨率，而CT成像模式与其它成像模式结合有可能弥补该缺陷。如，磁共振成像（MRI）对软组织有很好的成像效果，而发光成像具有较高的灵敏度，如果将MR、发光和CT成像三种模式集合在一起，CT成像模式的缺点就可以很好的被克服，从而获得一种高性能的CT&MR&发光三模式纳米探针。先前已有文献将量子点用作这种三模式探针，但其毒性和紫外激发等缺陷严重限制了在活体内的生物应用。相比之下，Yb基上转换发光颗粒，由于是近红外激发、活体弱的自体发光以及高的信噪比等优点、在活体发光成像领域备受关注。另外，通过钆元素的掺杂，MR成像可以被成功引入，因此，Yb基上转换发光颗粒是一种天然的优越的发光/MR/CT三模式成像纳米探针，可在肿瘤早期诊断上发挥重要作用。

近红外光热疗作为一种优越的局部治疗方法近年来备受瞩目，它主要是利用光热转换剂的光热转换功能，将吸收的穿透深度相对较深的近红外光光能转化为大量的局部热能，人为地升高肿瘤组织处的温度，以高热来直接杀死癌细胞。另外，光热治疗还可以作为化疗的辅助手段，增加肿瘤组织的通透性，提高其内部化疗药的浓度，以增强化疗药物的疗效。因此，近红外光热疗在肿瘤治疗领域发挥着重要作用，其中，光热转换剂的选择成为了最关键因素。在众多新兴的光热转换剂中，硫化铜显示出了明显的优势：1）合成硫化铜所需的原料十分廉价，且制备工艺简单易行；2）通过调整合成方法和相关参数，硫化铜的红外吸收峰位可以可控调节（例如，980nm），且光热转换效率可以大幅度提高。

综上所述，如果能把Yb基的上转换发光颗粒与廉价的CuS光热转换剂相结合，我们将获得一种集诊断和治疗于一体的纳米诊疗剂。通过调节硫化铜制备参数，该结构可以吸收980nm近红外光并转化成大量的局部热能，而这个波段正好与Yb基发光探针的激发波段一致，也就是说通过单一波段激发，可以同时实现发光成像和肿瘤热疗，这对于肿瘤细胞热疗过程中的实时定位和观察有重要作用。如果再同时引入Gd³⁺，就可以实现近红外发光&MR&CT三模式成像和光热治疗的有效结合，这将有利于精确定位病灶位置，显著提高临床诊断的准确率，继而以光热治疗杀死癌细胞，真正做到早发现早治疗。

所以，研究一种高效的多功能纳米诊疗剂可用于近红外发光&CT&MR多模式成像和肿瘤光热治疗，具有重要意义和价值。

发明内容

针对上述需求，本发明的目的是提供一种高效多功能纳米诊疗剂，可用于近红外发光&CT&MR多模式成像和肿瘤光热治疗。

在此，一方面，本发明提供一种集发光/CT/MR多模式成像与肿瘤热疗于一体的多功能纳米诊疗剂，所述多功能纳米诊疗剂包括：具有近红外发光/CT/MR三模式成像性能的上转换发光纳米颗粒、包裹于所述上转换发光纳米颗粒表面的二氧化硅层、静电吸附于所述二氧化硅层表面的近红外光热转换剂颗粒、以及接枝于所述近红外光热转换剂颗粒表面的巯基功能化聚乙二醇。

本发明的多功能纳米诊疗剂以上转换发光纳米颗粒为基体，由其提供近红外发光&CT&MR三模式成像性能。颗粒外表面吸附的近红外光热转换剂颗粒能够赋予整个颗粒优越的光热转换性能，从而在受近红外光激发时发出大量热量，以杀死肿瘤细胞。同时，聚乙二醇（PEG）的存在可以增强颗粒的分散性和在体内的生物相容性。因此本发明的多功能纳米诊疗剂能够集发光/CT/MR多模式成像与肿瘤热疗于一体，通过单一波段激发，即可同时实现发光成像和肿瘤热疗，且在水及生理盐水中具有良好的分散性，并具有良好的生物相容性，不会对活体组织器官产生有毒损伤，可广泛用于疾病尤其是肿瘤领域的早期诊断和高效治疗，在临床医学实际应用中具有非常重要意义。

较佳地，所述上转换发光纳米颗粒的化学组成为NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺，其中Er³⁺的掺杂浓度可以为2%，Gd³⁺的掺杂浓度可以为20%。通过在Yb基上转换发光颗粒中引入Er³⁺、Gd³⁺，可以实现近红外发光/CT/MR三模式成像，从而有利于精确定位病灶位置，显著提高临床诊断的准确率。

较佳地，所述上转换发光纳米颗粒的粒径为25nm。

较佳地，所述近红外光热转换剂颗粒由CuS组成，其粒径为2.7nm。合成硫化铜所需的原料十分廉价，且制备工艺简单易行，另外，通过调整合成方法和相关参数，CuS可以吸收近红外光并转化成大量的局部热能，而该波段正好与所述上转换发光纳米颗粒的激发波段一致，因此，通过单一波段激发，即可以同时实现发光成像和肿瘤热疗，这对于肿瘤细胞热疗过程中的实时定位和观察有重要作用。

较佳地，所述二氧化硅层为氨基功能化且表面带有正电荷的二氧化硅层。由于表面带正电，因此可以通过静电作用吸附带负电的近红外光热转换剂颗粒，又，由于近红外光热转换剂颗粒与巯基配位键作用，因此可以与巯基功能化的聚乙二醇通过配位键相嫁接。

较佳地，所述二氧化硅层的厚度为10nm。

另一方面，本发明还提供上述多功能纳米诊疗剂的制备方法，包括：

（1）采用高温热解法制备上转换发光纳米颗粒；

（2）采用反微乳液法在所述上转换发光纳米颗粒的外表面包裹一层表面带正电的氨基功能化二氧化硅；

（3）借助静电吸附作用将带负电荷的近红外光热转换剂颗粒吸附于所述带正电的氨基功能化二氧化硅的表面；以及

（4）借助硫化铜和巯基之间的配位键在近红外光热转换剂颗粒（CuS）的表面接枝巯基功能化聚乙二醇。

较佳地，在步骤（1）中，在所述上转换发光纳米颗粒上形成有疏水基团。

较佳地，在步骤（2）中，所述反微乳液法所采用的反微乳液体系由NP-5与环己烷混合而成，且保持温度在17℃。

较佳地，在步骤（2）中，所述带正电的氨基功能化二氧化硅可以通过氨水、正硅酸乙酯和氨基硅烷偶联剂反应而得。

本发明合成工艺简单易行、成本低、效率高，低污染且重复性好，可以进行大规模应用。

再一方面，本发明还提供上述多功能纳米诊疗剂在近红外发光成像、CT造影成像、磁共振成像和/或肿瘤热疗中的应用。

与以往的纳米诊疗剂相比较，本发明能够将发光成像与肿瘤热疗在单一波段下整合起来：上转换发光颗粒内核在980nm激光的照射下，可以发射出各个波段的光，为发光成像奠定基础；硫化铜在980nm激光照射下，可以发出大量的热量，反映其作为光热转换剂的巨大潜力。值得一提的是，颗粒中高原子序数稀土元素的存在，赋予了材料良好的CT造影性能。Gd³⁺的引入，还可以使材料具有高效的磁共振造影性能。所以，这种多功能纳米诊疗剂可广泛用于多种疾病尤其是癌症的早期诊断和早期治疗，这在医学临床应用中具有非常重要意义。

附图说明

图1为本发明一个示例的多功能纳米诊疗剂的结构示意图；

图2为实施例1制得的各纳米颗粒的透射电镜（TEM）照片，其中图a、b、c、d分别为实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺颗粒、NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂颗粒、CuS颗粒、以及NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG颗粒的TEM照片；

图3为实施例1制得的各纳米颗粒的EDS图谱，其中图a、b、c分别为实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺颗粒、NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂颗粒、以及NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG颗粒的EDS图谱；

图4为实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺颗粒、NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂颗粒、以及NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG颗粒的红外图谱；

图5为实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG颗粒在980nm激光激发下的发光光谱；

图6为实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒水溶液在细胞水平上的荧光成像；

图7a为实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒水溶液不同浓度下的CT成像图片；

图7b为实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒瘤内注射前后的肿瘤CT成像图片（150μl,稀土含量：8mg/mL）；

图8a为实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒水溶液不同浓度下的磁共振成像图片；

图8b为实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒瘤内注射前后的肿瘤磁共振成像图片（150μl,1.97mg/mL）；

图9为实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒的不同浓度水溶液在980nm激光照射下的温度变化曲线；

图10为实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒瘤内注射后，在980nm激光不同照射时间下的肿瘤部位红外热成像图片(1.2mg/mL,150μL)；

图11为PBS（图a）和实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒（图b）瘤内注射，再经980nm激光照射10min后，肿瘤部位H&E染色图片(1.4mg/mL,150μL)；

图12为实施例1制得的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒的活体组织毒性评价（H&E染色）。

具体实施方式

以下，结合附图和下述实施方式进一步说明本发明。应理解，以下附图和具体实施方式仅用于说明本发明而非限制本发明。

本发明一方面提供一种集发光/CT/MR多模式成像与肿瘤热疗于一体的多功能纳米诊疗剂。图1示出本发明一个示例的多功能纳米诊疗剂的结构示意图。如图1所示，该多功能纳米诊疗剂包括：具有近红外发光/CT/MR三模式成像性能的上转换发光纳米颗粒（UCNP）、包裹于所述上转换发光纳米颗粒表面的二氧化硅层（silica）、静电吸附于所述二氧化硅层表面的近红外光热转换剂颗粒（在图1的示例中为CuS）、以及接枝于所述近红外光热转换剂颗粒表面的巯基功能化聚乙二醇（PEG）。

其中，上转换发光纳米颗粒的化学组成可为NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺，其中Er³⁺的掺杂浓度可为2%，Gd³⁺的掺杂浓度可为20%。上转换发光纳米颗粒的粒径可为25nm。应理解，本发明的上转换发光纳米颗粒不限于NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺，还可以是掺杂了其它稀土离子的Yb基上转换发光颗粒。

Yb基上转换发光颗粒具有近红外激发、活体弱的自体发光以及高的信噪比等优点，在近红外激光的照射下，可以发射出各个波段的光，为发光成像奠定基础。图5示出本发明一个示例的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG颗粒在980nm激光激发下的发光光谱，从图可知，该颗粒在980nm激光激发下，可以发射出绿光和红光，这为该纳米探针在细胞成像中的应用提供了条件。图6示出本发明一个示例的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒水溶液在细胞水平上的荧光成像，从图可知，该纳米颗粒被细胞吞噬后，在980nm激光激发下，可以清楚地显示出细胞的位置，起到了细胞荧光示踪作用。

另外，本发明的多功能纳米诊疗剂因高原子序数稀土元素的存在（Yb,Er,Gd）而拥有优越的CT造影性能，可应用于CT成像。图7a示出本发明一个示例的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒水溶液不同浓度下的CT成像图片，由图可知，该纳米颗粒具有优越的CT造影效果，为肿瘤部位CT成像奠定基础。图7b示出本发明一个示例的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒瘤内注射前后的肿瘤CT成像图片，由图可知，该纳米颗粒局部注入到肿瘤组织，产生局部的射线高吸收区域，从而实现肿瘤CT成像。因其在体内好的造影效果，因此这种纳米颗粒可以用于肿瘤的早期诊断。

此外，钆离子的引入，还可以使本发明的多功能纳米诊疗剂具有高效的磁共振造影性能，有利于获得清晰的体内磁共振成像。图8a示出本发明一个示例的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒水溶液不同浓度下的磁共振效果，由图可知，该纳米颗粒具有良好的磁共振造影效果，T₁和T₂加权图像随浓度变化明显，为体内成像奠定基础。图8b示出本发明一个示例的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒瘤内注射前后的肿瘤磁共振成像图片，由图可知，该纳米颗粒局部注入到肿瘤组织，对肿瘤内部水分子的弛豫产生影响，从而带来明显的肿瘤磁共振造影增强。

如上所述，本发明的多功能纳米诊疗剂具有良好的近红外发光&MR&CT三模式成像，有利于精确定位病灶位置，是一种新型高效的多模式成像纳米探针。

此外，本发明的多功能纳米诊疗剂因近红外光热转换剂颗粒的存在而具有优越的光热转换性能。在图1的示例中，近红外光热转换剂颗粒为CuS，其粒径可为2.7nm。但应理解，本发明中的近红外光热转换剂不限于CuS，还可以是其它具有近红外光热转换性能的物质。合成硫化铜所需的原料十分廉价，且制备工艺简单易行，另外，通过调整合成方法和相关参数，CuS可以吸收近红外光（例如980nm激光）并转化成大量的局部热能，而该波段正好与所述上转换发光纳米颗粒的激发波段一致，因此，通过单一波段激发，即可以同时实现发光成像和肿瘤热疗，这对于肿瘤细胞热疗过程中的实时定位和观察有重要作用。图9示出本发明一个示例的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒的不同浓度水溶液在980nm激光照射下的温度变化曲线，由图可知，该纳颗粒在1.2mg/mL浓度下，温度迅速上升15度左右，即使在相对较低浓度下（0.6mg/mL），温度也能够上升10度，这种温度变化反映了该纳米探针良好的体外光热转换性能。图10示出本发明一个示例的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒瘤内注射后，在980nm激光不同照射时间下的肿瘤部位红外热成像图片(1.2mg/mL,150μL)，由图可知，该纳米颗粒（1.2mg/mL）局部注入到肿瘤组织，吸收980nm激光的光能并将其转换为热能，从而引起肿瘤组织表面温度上升。图11中的图a、b分别示出PBS（作为空白对照）和本发明一个示例的NaYbF₄: Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒用于肿瘤组织热疗后所对应的H&E染色切片，对比图a、和图b可知，肿瘤组织经热疗处理，显示出明显的不规则稀疏化。该表征反映了此纳米诊疗剂可成功用于肿瘤的光热治疗。

二氧化硅层可为氨基功能化且表面带有正电荷的二氧化硅层。通过表面带正电，可以借助静电作用吸附带负电的近红外光热转换剂颗粒。又，二氧化硅层的厚度可为10nm。

本发明的多功能纳米诊疗剂在近红外光热转换剂颗粒表面接枝巯基功能化的聚乙二醇。它的存在可以增强颗粒的分散性和在体内的生物相容性。图12示出本发明一个示例的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒的活体组织毒性评价（H&E染色），由图可知，该纳米诊疗剂注入老鼠体内后在不同时间段观察（剂量：150μL,10.5mg/kg），既没有发现短期的即性损伤，也没有明显的长期毒性，这说明该探针在体内显示低毒性，具有较高的应用安全性。

综上所述，本发明提供的基于NaYbF₄和硫化铜的纳米诊疗剂，既具有良好发光&CT&MR三模式造影能力，实现了优越的肿瘤组织成像，又具有显著的光热转换性能，实现了显著的肿瘤光热治疗效果。所以，这两种功能优势集于一体对其今后广泛用于肿瘤的早期诊断和治疗大有裨益，这在临床医学实际应用中具有重要意义。

本发明另一方面提供上述多功能纳米诊疗剂的制备方法。首先采用高温热解法，制备了疏水性NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺,然后通过反微乳液法，在其外表面包裹一层氨基功能化的二氧化硅（表面带正电），再借助静电吸附作用，将事先制备好的带负电荷的硫化铜纳米颗粒吸附于表面，最后再在最外面嫁接聚乙二醇（PEG）。具体地，作为示例，可以包括如下步骤。

采用高温热解法制备NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺疏水纳米颗粒的工艺，包括如下具体步骤：将稀土离子前驱体与油酸和十八烯混合搅拌，加热除水后，升温至140～180度，并在此温度下保温1～2小时，以充分溶解稀土离子，形成油酸前驱体；然后加入氢氧化钠和氟化铵的甲醇溶液搅拌1～2小时，使得油酸前驱体与氢氧化钠和氟化铵充分混合；甲醇除去后，在惰性气体保护下于280～290度回流1～2小时，即得到NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺疏水纳米颗粒。上述稀土离子前驱体为稀土氯化物（YbCl₃,ErCl₃,GdCl₃）。参见图2中的图a，其示出NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺纳米颗粒的TEM照片，由图可知该纳米颗粒分散良好，粒径均一。参见图3中的图a，其示出NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺纳米颗粒的EDS能谱，图中该纳米颗粒的元素Na,Yb,F,Er,Gd都可以检测出来。参见图4中的曲线A，其示出NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺纳米颗粒的红外光谱，图中该纳米颗粒表面的油酸分子所对应的O-H键和C-H键都能显示出来。

所述高温热解合成的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺疏水颗粒，可以经环己烷/酒精反复离心清洗3～5次，最后分散在环己烷中。

采用反微乳液法，在NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺纳米颗粒外表面均匀包裹一层氨基功能化的二氧化硅，使其带有正电荷。包括如下步骤：将疏水纳米颗粒NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺加入反微乳液体系，搅拌均匀后，再加入氨水，此时最好是密封反应体系，避免氨水挥发，然后将正硅酸乙酯用环己烷稀释5倍，再用注射泵缓慢引入体系，体系搅拌36小时，然后加入氨基硅烷偶联剂（NH₂-silane），继续搅拌4小时，即得到NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂纳米颗粒。其中，反微乳液体系可由NP-5与环己烷充分混合而成，并且保持温度在17度。另外，在本示例中使用正硅酸乙酯作为硅源，但应理解，不限于此，还可以是其它公知的硅源例如正硅酸甲酯、正硅酸丙酯等。又，在本示例中使用氨基硅烷偶联剂使二氧化硅氨基功能化，但应理解，不限于此。又，在本示例中使用氨水作为碱催化剂，但应理解，不限于此，还可以是其它能够使正硅酸乙酯水解的碱催化剂。参见图2中的图b，其示出NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂纳米颗粒的TEM照片，由图可知所述纳米颗粒有良好的分散性和单包效果。参见图3中的图b，其示出NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂纳米颗粒的EDS能谱，由图可知所述纳米颗粒的元素Na,Yb,F,Er,Gd,Si,O都可以检测出来。参见图4中的曲线B，其示出NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂纳米颗粒的红外光谱，图中所述纳米颗粒表面油酸分子的C-H键消失，而Si-O键出现，证明了氧化硅的成功包裹。

所述NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂可以经去离子水反复离心清洗3～5次，以稳定分散在水中。

采用柠檬酸三钠为保护剂制备带负电的超小CuS纳米颗粒，包括如下步骤：将氯化铜、柠檬酸三钠、硫化钠混合搅拌5～10分钟，然后置于80度水浴锅中，再搅拌10～15分钟，从而得到带负电的硫化铜纳米颗粒，取出后置于4℃冰箱中。图2中的图c为CuS纳米颗粒的TEM图片，图中所述硫化铜纳米颗粒粒径超小且均一，有良好的分散性。

采用静电吸附法制备NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS纳米颗粒的工艺，包括如下具体步骤：将已制备好的带负电的超小CuS纳米颗粒加入到NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂体系（带有正电）中去，在室温下搅拌30～50分钟后离心收集，即得到NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS纳米颗粒。

所述NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS纳米颗粒可以再经去离子水反复清洗3～5次，最终离心收集。

采用巯基PEG在NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS表面嫁接生物相容性良好的聚二乙醇（PEG），包括如下具体步骤：清洗后的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS纳米颗粒分散在去离子水中后，加入含巯基PEG的水溶液，搅拌8～12小时，即得到NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒。参见图2中的图d，其示出NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒的TEM照片，由图可知所述的纳米颗粒呈现“核-卫星”结构，拥有良好的分散性和均匀的粒径。参见图3中的图c，其示出NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒的EDS能谱，由图可知该纳米颗粒的元素Na,Yb,F,Er,Gd,Si,Cu,S都可以检测出来。参见图4中的曲线C，其示出NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒的红外光谱，图中所述纳米颗粒表面C-H的键的再次出现，证明聚乙二醇的成功修饰。

所述NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG还可以经酒精/水反复离心清洗3～5次，以良好地分散在水中。

本发明的制备方法合成工艺简单易行、成本低、效率高，低污染且重复性好，可以进行大规模应用。

本发明进一步示出以下实施例以更好地说明本发明。应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的数值也仅是合适范围中的一个示例，即、本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、NaYbF₄:2%Er³⁺/20%Gd³⁺疏水纳米颗粒的制备（2mmol组）：

1.稀土氯化物的准备：分别称取1.56mmol(604.4mg)YbCl₃·6H₂O，0.04mmol(15.34mg)ErCl₃·6H₂O和0.4mmol(148.7mg)GdCl₃·6H₂O粉末，用3mL去离子水溶解备用；

2.向三口烧瓶中加入15mL油酸，30mL十八烯，然后加入预先配置的氯化物水溶液，室温下搅拌1h。然后开始通15min氩气，除去瓶中空气，然后体系开始进行缓慢的除水过程。除水完毕后，体系升到160度左右，保持1h。获得淡黄色澄清液。然后停止加热，让体系自然降温至室温；

3.慢慢滴加15mL甲醇溶液（含200mg NaOH、296mg NH₄F），在室温下密封搅拌2h；溶液呈黄白色；除甲醇：通氩气，80℃搅拌1.5h,120℃搅拌0.5h；

4.甲醇除完之后。将冷凝管接好，体系开始升温，将最后的温度稳定在280度左右，并保持1h。然后自然降至室温；

5.产物清洗过程：首先向体系中加入20mL无水乙醇，室温搅拌30min。用13000r/min，离心10min；然后加入5mL环己烷，并超声约5min，再加入20mL酒精，超声约5min，离心收集。重复清洗3次，最后的产物用5mL环己烷溶液分散，获得无色澄清溶液。980nm激光照射下，产物可以发射有较强的黄绿光。

图2中的图a为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺纳米颗粒的TEM图片，图中：所述的纳米颗粒分散良好，粒径均一。图3中的图a为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺纳米颗粒的EDS能谱，图中：所述纳米颗粒的元素Na,Yb,F,Er,Gd都可以检测出来。图4中的曲线A为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺纳米颗粒的红外光谱，图中：所述纳米颗粒表面的油酸分子所对应的O-H键和C-H键都能显示出来。

二、NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂纳米颗粒的制备：

1.反微乳液体系的制备：将1mL NP-5(CO-520)与20mL环己烷置于100mL三口瓶中，调整体系温度为17度，搅拌1h；

2.向体系中加入1.5mL NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺环己烷溶液，搅拌3h；

3.向体系中逐滴加入140μL氨水，继续搅拌2h；

4.正硅酸乙酯（TEOS）的环己烷溶液制备：将2mLTEOS与8mL环己烷混合，并且搅拌均匀，即用环己烷将TEOS稀释5倍；

5.用注射泵将TEOS的环己烷溶液引入体系，引入速度为1mL/h，注射时间持续1h，注射结束后继续搅拌36h；

6.向体系中分五次加入总量为50μL氨基丙基三乙氧基硅烷，每次10μL，加完后继续搅拌4h；

7.产物清洗过程：向体系中加入2mL甲醇用于破坏反微乳液体系，继续搅拌20min，然后用13000r/min，离心15min；加入10mL无水乙醇，超声分散后再离心收集，此过程重复三次，最后产物用20mL无水乙醇分散。

图2中的图b为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂纳米颗粒的TEM图片，图中：所述纳米颗粒有良好的分散性和单包效果。图3中的图b为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂纳米颗粒的EDS能谱，图中：所述纳米颗粒的元素Na,Yb,F,Er,Gd,Si,O都可以检测出来。图4中的曲线B为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂纳米颗粒的红外光谱，图中：所述纳米颗粒表面油酸分子的C-H键消失，而Si-O键出现，证明了氧化硅的成功包裹。

三、超小CuS纳米颗粒的制备：

1.称取17mg（0.1mmol）CuCl₂·6H₂O，20mg(0.068mmol)柠檬酸三钠（C₆H₅Na₃O₇·₂H₂O）粉末，加入100mL去离子水并搅拌溶解；

2.称取22mg(0.1mmol)Na₂S·9H₂O，用1mL去离子溶解；

3.将2中得到的溶液逐滴加入到溶液1中，搅拌5分钟，然后将混合溶液置于80度水浴中搅拌并保持10min，取出后快速冷却，并置于4度冰箱中保存。

图2中的图c为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺纳米颗粒的TEM图片，图中：所述硫化铜纳米颗粒粒径超小且均一，有良好的分散性。

四、NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒的制备：

1.取出60mL已经制备好的超小硫化铜悬浮液，然后将10mL NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂-NH₂纳米颗粒悬浮液加入到体系中去,搅拌40分钟后收集产物，最终分散到20mL去离子水中。再称量60mg PEG₅₀₀₀-SH加入到体系中去，搅拌12小时；

2.产物清洗过程：停止搅拌，以13000r/min的速率，离心15min；加入10mL去离子水，超声分散后再离心收集，此过程重复三次，最后产物可以很好地分散在去离子水中。

图2中的图d为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒的TEM图片，图中：所述的纳米颗粒呈现“核-卫星”结构，拥有良好的分散性和均匀的粒径。图3中的图c为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒的EDS能谱，图中：所述纳米颗粒的元素Na,Yb,F,Er,Gd,Si,Cu,S都可以检测出来。图4中的曲线C为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒的红外光谱，图中：所述纳米颗粒表面C-H键的再次出现，证明聚乙二醇的成功修饰。

五、纳米诊疗剂-NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG的发光性能：

所制备的纳米诊疗剂在980nm激光的照射下，可以发射出绿光和红光，这为该纳米探针在细胞成像中的应用提供了条件。图4为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG的发光光谱，图中：所述纳米颗粒在980nm激光激发下，可以发射出红光和绿光。图6为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒与细胞共培养后的共聚焦图片。图中：所述纳米颗粒被细胞吞噬后，在980nm激光激发下，可以清楚地显示出细胞的位置，起到了细胞荧光示踪作用。

六、纳米诊疗剂-NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG的CT性能：

所制备的纳米诊疗剂因稀土元素的存在（Yb,Er,Gd,）而拥有优越的CT造影性能，可应用于Balb/c鼠的瘤内CT成像。图7a为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG 纳米颗粒水溶液在不同浓度条件下对应的CT成像图片。图中：所述纳米探针具有优越的CT造影效果，为肿瘤部位CT成像奠定基础。图7b为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒瘤内注射后肿瘤部位的CT成像图片。图中：所述纳米颗粒局部注入到肿瘤组织，产生局部的射线高吸收区域，从而实现肿瘤CT成像。因其在体内好的造影效果，预期这种纳米颗粒可以用于肿瘤的早期诊断。

七、纳米诊疗剂-NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG的MRI性能：

所制备的纳米诊疗剂具有良好的磁共振造影性能，有利于获得清晰的体内磁共振成像。图8a本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG在不同浓度条件下对应的MRI图片。图中：所述纳米诊疗剂具有良好的磁共振造影效果，T₁和T₂加权图像随浓度变化明显，为体内成像奠定基础。图8b为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒瘤内注射后肿瘤部位的MRI成像图片。图中：所述纳米颗粒局部注入到肿瘤组织，对肿瘤内部水分子的弛豫产生影响，从而带来明显的肿瘤磁共振造影增强。

八、纳米诊疗剂-NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG的光热转化性能：

如上所述，所制备的纳米诊疗剂具有良好的近红外光发光&CT&MR成像性能，是一种新型高效的多模式成像纳米探针。此外，超小硫化铜纳米颗粒的存在也赋予整个颗粒优越的光热转换性能。图9为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒水溶液在980nm激光照射下的温度变化曲线。图中：所述的纳米探针在1.2mg/mL浓度下，温度迅速上升15度左右，即使在相对较低浓度下（0.6mg/mL），温度也能够上升10度，这种温度变化反映了该纳米探针良好的体外光热转换性能。图10为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒PBS溶液经局部注入肿瘤组织后，在980nm激光照射下（5min），肿瘤组织表面的温度变化图片。图中：所述纳米颗粒（1.2mg/mL）局部注入到肿瘤组织，吸收980nm激光的光能并将其转换为热能，从而引起肿瘤组织表面温度上升。图11中的图a和图b分别为PBS和本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒用于肿瘤组织热疗后所对应的H&E染色切片。图中：肿瘤组织经热疗处理，显示出明显的不规则稀疏化。该表征反映了此纳米诊疗剂可成功用于肿瘤的光热治疗。

图12为本实施例制备的NaYbF₄:Er³⁺/Gd³⁺SiO₂CuS-PEG纳米颗粒的活体组织毒性评价（H&E染色）。图中：所述的纳米诊疗剂注入老鼠体内后在不同时间段观察（剂量：150μL,10.5mg/kg），既没有发现短期的即性损伤，也没有明显的长期毒性，这说明该探针在体内显示低毒性。

综上所述，本发明提供的基于NaYbF₄和硫化铜的纳米诊疗剂，既具有良好发光 &CT&MR三模式造影能力，实现了优越的肿瘤组织成像，又具有显著的光热转换性能，实现了显著的肿瘤光热治疗效果。所以，这两种功能优势集于一体对其今后广泛用于肿瘤的早期诊断和治疗大有裨益，这在临床医学实际应用中具有重要意义。

Claims

1.一种集发光/CT/MR多模式成像与肿瘤热疗于一体的多功能纳米诊疗剂，其特征在于，包括：具有近红外发光/CT/MR三模式成像性能的上转换发光纳米颗粒、包裹于所述上转换发光纳米颗粒表面的二氧化硅层、静电吸附于所述二氧化硅层表面的近红外光热转换剂颗粒、以及接枝于所述近红外光热转换剂颗粒表面的巯基功能化聚乙二醇。

2.根据权利要求1所述的多功能纳米诊疗剂，其特征在于，所述上转换发光纳米颗粒的化学组成为NaYbF₄: Er³⁺/Gd³⁺，其中Er³⁺的掺杂浓度为2%，Gd³⁺的掺杂浓度为20%。

3.根据权利要求1或2所述的多功能纳米诊疗剂，其特征在于，所述上转换发光纳米颗粒的粒径为25 nm。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多功能纳米诊疗剂，其特征在于，所述近红外光热转换剂颗粒由CuS组成，其粒径为2.7 nm。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的多功能纳米诊疗剂，其特征在于，所述二氧化硅层为氨基功能化且表面带有正电荷的二氧化硅层。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的多功能纳米诊疗剂，其特征在于，所述二氧化硅层的厚度为10 nm。

7.一种权利要求1至6中任一项所述的多功能纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，包括：

（1）采用高温热解法制备上转换发光纳米颗粒；

（4）借助硫化铜和巯基之间的配位键在近红外光热转换剂CuS颗粒的表面接枝巯基功能化的聚乙二醇。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，在所述上转换发光纳米颗粒上形成有疏水基团。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述反微乳液法所采用的反微乳液体系由NP-5与环己烷混合而成，且保持温度在17 ℃；所述带正电的氨基功能化二氧化硅通过氨水、正硅酸乙酯和氨基硅烷偶联剂反应而得。

10.权利要求1至6中任一项所述的多功能纳米诊疗剂在近红外发光成像、CT造影成像、磁共振成像和/或肿瘤热疗中的应用。