CN111671920B - 一种花菁类光敏剂核酸纳米聚集体的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药材料领域,公开了一种花菁类光敏剂核酸纳米聚集体的制备方法及应用。本发明提出的花菁类光敏剂核酸纳米聚集体以核酸纳米材料DNA四面体(Td)为载体,通过静电吸附完成花菁类光敏剂IR780同Td的自组装,得到IR780负载的核酸纳米聚集体。该方法得到的花菁类光敏剂核酸纳米聚集体制备方法简单、快速,可大量制备,同时具有水溶性好,生物相容性好及光热效率高等优势,有效提高了其在血液循环中的稳定性,降低了毒副作用,最终提高了其成像和抗肿瘤效果。在成像指导的肿瘤治疗中具有很高的研究价值,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药材料技术领域,特别涉及一种花菁类光敏剂 核酸纳米聚集体的制备及应用。
背景技术
癌症是一个严重的全球健康问题,其严重影响人类的健康和寿命。 由于传统药物配方的治疗效果较差,大多数癌症患者常规采用手术治 疗,同时辅以放疗、化疗等,患者创伤面积大,且毒副作用高。因此 仍需探索更有效的方法来提高恶性肿瘤的治愈率。
光热治疗因其对较低的毒副作用近年来被广泛研究,其主要通过 光敏剂在肿瘤部位积聚后,在特定波长激光照射下,将光能转化为热 能,从而杀伤周围的肿瘤细胞。所以,良好的肿瘤光疗制剂应具备良 好的肿瘤靶向和滞留能力,同时应在近红外区有强的吸收。
以IR780为代表的近红外染料(Near-infrared dye,NIR dye),是 一类波长范围在700~1000nm的小分子荧光探针,因被广泛用于光学 成像,因其在吸收近红外光后可产生热量和活性氧(ROS),因而在 光疗方面具有潜力。但是其自身在应用方面却存在很多缺陷,如亲水 性差,在水溶液中易聚集产生聚集诱导荧光淬灭(ACQ)效应,同时 其自身毒性也较大,因而限制了其在进一步应用。近年来陆续有研究 将其修饰在金属载体上或脂质体上制备纳米粒,但是其材料本身的毒 性或稳定性不容忽视,因此难以达到增强疗效并降低其毒副作用的效 果,限制了其临床转化。
DNA四面体,是一种带负电的通过精确的碱基互补配对形成的 DNA立体结构,其制备过程简单,同时其生物相容性好、具有可生 物降解性等优点,因此,现已广泛用作药物载体,在今后的临床应用 上具有很大潜力。但是其自身粒度较小,无主动的肿瘤靶向性,也无法实现肿瘤滞留效应,同时据现研究数据显示其大多通过共价修饰进 行药物负载,负载效率低,难以达到临床的治疗剂量。
发明内容
为更好地解决上述问题,本发明提供了一种花菁类光敏剂核 酸纳米聚集体。其中,IR780的结构如下式(I)所示:
再者,本发明还提供了一种花菁类光敏剂核酸纳米聚集体的 制备方法以及应用。
再者,本发明提供了上述花菁类光敏剂核酸纳米聚集体在肿 瘤的诊断和治疗当中的应用。
第一点,本发明是通过以下技术方案从而实现的:
一种花菁类光敏剂核酸纳米聚集体的制备方法,共包含如下 的制备步骤:
(1).通过四条DNA单链的合成,将所得粉末用超纯水溶解, 计算并测量DNA浓度,于4℃条件下保存备用;
(2).DNA四面体的制备:将步骤(1)中四条DNA单链等比例加 入TM buffer中,置于PCR仪内,迅速加热至95℃,后逐渐冷却 至4℃,得DNA四面体纳米颗粒。
(3).DNA四面体负载IR780纳米粒的制备:将IR780小分子 与步骤(2)中所得DNA四面体在室温下避光共孵育12-48h,充分 吸附后离心纯化,去除多余的IR780,于-20℃条件下保存备用。
优选地,步骤(1)中的DNA单链的浓度为1~100μM。
优选地,步骤(2)中所述的TM buffer为pH=8.0的10mM Tris-HCl,50mM MgCl2。
优选地,步骤(3)中的孵育温度是4~30℃;所述孵育时间是12-48h。
优选地,步骤(3)中孵育条件为避光。
优选地,步骤(3)中包括把IR780换成其他任何疏水性带正电 的化合物制备的纳米粒。
优选地,步骤(3)中的IR780浓度为0.01~1mM。
优选地,步骤(3)中的DNA四面体和IR780比例为1:(1~1000)。
其中,IR780可替换为其他花菁类光敏剂小分子化合物,Td 可替换为其他核酸纳米材料,其制备过程类似,从而得到任意一 种花菁类光敏剂核酸纳米聚集体。
第二点,本发明提供了一种花菁类光敏剂核酸纳米聚集体, 具体通过IR780和DNA四面体通过非共价吸附而形成,制备方法 简单,条件温和,便于量产从而临床应用。
优选地,其DNA四面体和IR780比例为1:(1~1000)。
优选地,其纳米粒为不规则球型,粒径大小为50~300nm。
该纳米粒度下的纳米粒具有肿瘤滞留效应,是作为肿瘤治疗 和临床诊断的优秀材料,具备很好的应用前景。
第三点,本发明提供了一种花菁类光敏剂核酸纳米聚集体在 肿瘤治疗和诊断方面的应用。
优选地,这些肿瘤包括人非小细胞肺癌、人宫颈癌、人胃癌、 黑色素瘤、人成骨肉瘤、乳腺癌或脑胶质瘤等。
优选地,纳米粒的给药方式包括口服、注射、植入、外用、 喷雾、吸入或它们的组合。
第四点,本发明提供了一种花菁类光敏剂核酸纳米聚集体, 其有以下优点或提升:
(1)具体通过IR780和DNA四面体通过非共价吸附而形成, 水溶性和稳定性得到了显著提高,同时因DNA四面体的加入其生 物相容性提高,治疗带来的副作用明显减小。
(2)由于其粒度的增大,借助EPR效应从而具有一定的肿瘤 靶向和滞留效应,从而做到精准的诊断和治疗,减少其对其他组 织和器官的损伤。
(3)该纳米粒的制备方法简单,条件较为温和,同时负载率 ≥50%,具有很高的负载率。因此便于产业化生产和应用。
(4)该纳米粒相较于IR780,发生荧光淬灭的概率大大减小, 因此其成像能力光敏性大大增强,有助于提升其成像治疗效果。
(5)花菁类光敏剂核酸纳米聚集体相较于游离IR780,其具 有了更好的光热效率和细胞摄取效率,具有更好的肿瘤细胞杀伤 效果。
(6)花菁类光敏剂核酸纳米聚集体相较于游离IR780,在体 内实验中能够明显抑制肿瘤的生长,具有更好的抗肿瘤效果。
(5)该方法同样适用于其他疏水性光敏剂和其他核算纳米载 体负载,因而极大得拓宽了其应用。
附图说明
图1为该纳米粒制备流程示意图。
图2为3%琼脂糖凝胶电泳图。泳道:1为S1,2为S1+S2,3为 S1+S2+S3,4为S1+S2+S3+S4。
图3为Td和IR780核酸纳米聚集体的DLS动态光散射粒度图。
图4为IR780核酸纳米聚集体的TEM透射电镜图。
图5为激光共聚焦显微镜测定IR780和IR780核酸纳米聚集体细 胞摄取效率图。
图6为MTT测定IR780核酸纳米聚集体细胞存活率图。
图7为荷瘤小鼠生理盐水、游离IR780和IR780核酸纳米聚集体 尾静脉注射24h后,用NIR激光照射肿瘤部位,肿瘤部位的升温 曲线。
图8为荷瘤小鼠在IR780核酸纳米聚集体尾静脉注射24h后主要 器官内聚集体荧光图。
图9为荷瘤小鼠在IR780核酸纳米聚集体作用下肿瘤体积生长曲 线。
具体实施方式
下述实施方式为优选地实施方式,本发明所保护的范围包括 但不限于此。在本发明所保护的范围内,原理为此时,任何对本 实施方式的改进和修改都在本发明保护范围。
实施例一
(1)通过四条DNA单链的合成,将所得粉末高速离心,从 而确保其保存在试管底部,在用超纯水溶解,计算并测量DNA浓 度,使其最终浓度为100μM,于4℃条件下保存备用。
S1:
5’-ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAG TTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA-3’(SEQ ID NO:1);
S2:
5’-ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCT ACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG-3’(SEQ ID NO:2);
S3:
5’-ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGT AATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC-3’(SEQ ID NO:3);
S4:
5’-ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTG ATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG-3’(SEQ ID NO:4)。
(2)DNA四面体的制备:将步骤(1)中四条DNA单链等比例 加入TM buffer(10mMTris-HCl,50mM MgCl2,pH 8.0)中,使 其终浓度为1μM,混匀后,置于PCR仪内,迅速加热至95℃保 持10min,后逐渐冷却至4℃保持20min,得DNA四面体纳米颗 粒,于-20℃保存备用。
(3)DNA四面体负载IR780纳米粒的制备:将IR780溶于 DMSO中,得IR780母液,再用超纯水将母液稀释至100μM,得 IR780工作液,将IR780工作液与步骤(2)中所得DNA四面体于离 心管中混合,在室温下避光共孵育24h,充分吸附后10000rpm离 心,弃掉含有未吸附的IR780的上清液,得到DNA四面体负载IR780纳米粒,于-20℃条件下保存备用。
通过该方法,通过透射电镜的图片图4可以看出,得到的纳 米粒为不规则球型,通过DLS粒度分析图3可看出,粒径大小为 50~300nm。
实施例二
称取0.9g琼脂糖于30mL 1×TAE中制得琼脂糖凝胶,将2μL loading buffer和8μL每个样品混合,混匀后,加样于4个胶孔中, 于电泳仪中跑胶,条件为110V,30min。结束后于多功能成像仪 成像。
结果:如图2所示,可以看出随着核酸链数的增加,其迁移 速率明显变慢,4条带均无明显杂带,说明该纳米结构有很高的合 成效率。
实施例三
分别将Td和IR780核酸纳米聚集体用超纯水稀释至一定浓度, 置于检测皿中,于纳米粒度仪中检测。
结果:如图3所示,Td的粒度约为11nm,IR780核酸纳米聚 集体的粒度约为248nm,且分布较为均匀,形成效率较高。
实施例四
将导电铜网放入离心管中固定,纳米粒制备完成后,取10μL 溶液滴于铜网上,待其自然风干,于透射电镜进样检测。
结果:如图4所示,IR780核酸纳米聚集体的TEM透射电镜 图像显示,其粒度与DLS粒度相符,且分布均匀,说明纳米粒的 成功制备。
实施例五
激光共聚焦显微镜细胞摄取效率的测定:
将MCF-7细胞接种在35mm共聚焦专用细胞培养皿中,密度 为3×105/ml,后于恒温培养箱培养24h。取实施例1中制备好的 IR780和IR780核酸纳米聚集体均为10μM,加入共聚焦皿中,继 续培养箱培养6h。弃掉培养基,用PBS洗2遍,之后再用4%多 聚甲醛固定。固定后加入1×DAPI染液染细胞核,避光持续15min, 弃掉染液,于激光共聚焦显微镜上样检测。其中纳米粒和IR780 的激发波长为633nm,DAPI激发为488nm。
结果:如图5所示,相较于游离IR780,肿瘤细胞对于IR780 核酸纳米聚集体具有更好的摄取效率,游离IR780摄取非常有限。 这也有利于我们之后的肿瘤诊断和治疗。
实施例六
MTT法测定细胞杀伤效率:
(1)将MCF-7细胞接种于96孔细胞培养板,密度为5×103每孔,继续培养24h。
(2)取实施例1中制备好的IR780和IR780核酸纳米聚集体 均为10μM,每孔100μL加入孔中,继续培养箱培养24h。于37℃ 条件下,808nm激光器,1W/cm2每孔照射5min,后于培养箱继 续恒温培养24h。
(3)向每孔加20μL 5mg/mL的mtt溶液,继续于培养箱培 养4h。后弃掉孔中加入MTT的培养基溶液,按每孔150μL分别 向孔中加入DMSO以充分溶解甲瓒结晶。后于酶标仪测定每个孔 在562nm处的吸光度,记录上述每孔的OD值。细胞存活率计算 公式为:相对存活率=(各实验组OD值—空白孔OD值/细胞 对照组OD值—空白孔OD值)×100%
结果:如图6所示,IR780即使激光照射,对肿瘤细胞的杀 伤也有限,无法起到真正的肿瘤治疗效果,而IR780核酸纳米聚 集体在无光照的情况下肿瘤杀伤效果并不明显,说明其生物安全 性好,然而当增加激光照射之后,其表现出明显的细胞杀伤效果, 几乎能杀死95%以上的肿瘤细胞,作为肿瘤治疗药物表现出非常 好的潜力。同时,从Td组可以看出,其对细胞没有明显杀伤,表 明其作为药物载体的安全性和可靠性。
实施例七
将得到的IR780核酸纳米聚集体尾静脉注射到荷瘤小鼠体内, 剂量为1.3mgIR780/kg,24h后处死小鼠并将主要组织离体,用 成像系统观察聚集体在各组织的聚集情况。
结果:如图7所示,IR780核酸纳米聚集体于肿瘤部位积聚明 显,说明其具有一定的肿瘤靶向和滞留能力。
实施例八
将得到的IR780核酸纳米聚集体尾静脉注射到荷瘤小鼠体内, 剂量为1.3mgIR780/kg,24h后用NIR激光照射肿瘤部位,观察 肿瘤部位的升温情况。
结果:如图8所示,IR780核酸纳米聚集体在肿瘤部位的升温 效果明显优于游离的IR780,说明其具有更好的光热效率。
实施例九
荷瘤小鼠建立后,待肿瘤生长到100mm3左右时,给予其三 次尾静脉注射给药和激光照射,于治疗过程中监测其肿瘤生长情 况,肿瘤体积=(长×宽2)/2
结果:如图9所示,IR780核酸纳米聚集体组明显抑制了肿瘤 体积的增长,说明其具有良好的抗肿瘤能力,而游离IR780组抗 肿瘤能力则有限。
以上实施例仅为本发明的某些具体实施例,但本发明的保护 范围不限于此,在对该技术领域熟悉的技术人员来说,在不脱离 本发明基本原理和方法的基础上,通过对本发明所述的进行简单 替换,或任何修饰和改动,均应受到本发明要求的保护范围之内。
<110> 南开大学
<120> 一种花菁类光敏剂核酸纳米聚集体的制备及应用
S1:
5’-atttatcacccgccatagtagacgtatcaccaggcagttgagacgaacattcctaagtctgaa-3’(SEQ ID NO:1);
S2:
5’-acatgcgagggtccaataccgacgattacagcttgctacacgattcagacttaggaatgttcg-3’(SEQ ID NO:2);
S3:
5’-actactatggcgggtgataaaacgtgtagcaagctgtaatcgacgggaagagcatgcccatcc-3’(SEQ ID NO:3);
S4:
5’-acggtattggaccctcgcatgactcaactgcctggtgatacgaggatgggcatgctcttcccg-3’(SEQ ID NO:4)。
Claims (5)
1.一种花菁类光敏剂核酸纳米聚集体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1). 通过四条DNA单链的合成,将所得粉末用超纯水溶解,计算并测量DNA浓度,于4 °C条件下保存备用;
(2). DNA四面体的制备:将步骤(1)中四条DNA单链等比例加入TM buffer,所述的TMbuffer为pH=8.0的10 mM Tris-HCl,50 mM MgCl2,置于PCR仪内,迅速加热至95 °C,后逐渐冷却至4 °C,得DNA四面体纳米颗粒;
(3). DNA四面体负载IR780纳米粒的制备:将IR780与步骤(2)中所得DNA四面体在室温下避光共孵育12~48 h,充分吸附后离心纯化,去除多余的IR780,于-20 °C条件下保存备用;
步骤(1)所述DNA四面体由序列如SEQ ID NO.1-4的四种单链DNA分子通过碱基互补配对组成;所述DNA单链的浓度为1~100 μM;
步骤(3)所述的孵育温度是4~30 °C;所述孵育时间是12~48 h;所述的IR780溶剂为二甲基亚砜,IR780浓度为0.01~1 mM,DNA四面体和IR780比例为1:(1~1000)。
2.一种花菁类光敏剂核酸纳米聚集体,其特征在于:通过权利要求1所述方法制备得到,所述纳米粒为不规则球型,粒径大小为50~300 nm。
3.权利要求2所述的花菁类光敏剂核酸纳米聚集体在制备肿瘤诊断探针中的应用。
4.权利要求2所述的花菁类光敏剂核酸纳米聚集体在制备肿瘤光热治疗/光动力治疗药物中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的花菁类光敏剂核酸纳米聚集体的应用,其特征在于:所述的肿瘤为人非小细胞肺癌、人宫颈癌、人胃癌、黑色素瘤、人成骨肉瘤、乳腺癌或脑胶质瘤。
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