CN107922488A - Tnfrsf14/hvem蛋白及其使用方法 - Google Patents

Tnfrsf14/hvem蛋白及其使用方法 Download PDF

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Abstract

在一些方面，本发明提供一种治疗B细胞淋巴瘤的方法。一些这样的方法涉及给对其有需要的受试者施用HVEM胞外域多肽、抗HVEM抗体或抗BTLA抗体。一些这样的方法涉及使用CAR T细胞，诸如CD19特异性CAR T细胞。本发明还提供了用于这样的方法中的组合物。本文会进一步地描述本发明的这些或其他实施方案。

Description

TNFRSF14/HVEM蛋白及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年4月2日提交的美国临时专利申请No.62/142,450和于2016年3月4日提交的美国临时专利申请No.62/303,980的优先权，其内容通过引用而全部合并至本文中。
序列表
当前申请含有序列表，该序列是以ASCII格式电子递交的并通过引用将其全部合并至本文中。于2016年4月1日创建的所述ASCII副本被命名为MSKCC_008_WOl_SL.txt，并且大小为33,621字节。
政府支持声明
本发明是在由国立卫生研究院授予的授权号为R01CA183876-01和1R01CA19038-01的政府支持下进行的。政府对本发明有一定的权利。
著作权
本专利文件的公开内容的一部分含有受著作权保护的材料。著作权所有人不反对任何人对专利文件或专利公开进行复制(facsimile reproduction)，因为它在专利和商标局的专利文件或记录出现，但在其他方面保留任何所有的著作权权利。
通过引用的合并
对于允许通过引用而并入的国家，通过引用将所有本公开中引用的全部参考文献合并至本文中。此外，通过引用将任何引用的或提及的制造商的说明指示或产品目录合并至本文中。在本发明的实践中，可以使用通过引用而合并至这一文本的文件、或者其中的内容。
背景技术
滤泡性淋巴瘤(FL)是第二常见类型的淋巴瘤，并且通常被认为是用目前的治疗方案不可治愈的。FL源自生发中心(germinal center)(GC)B细胞——当遇到抗原后能够爆发式生长的高度专业化的免疫细胞群落。已知，FL是一种高度依赖于来自肿瘤微环境中的其他细胞的相互作用的疾病。但是，目前还不清楚这些多种相互作用中的哪些(哪个)对于疾病的发展和维持是重要的。尽管最近的基因组研究已经对最常见的FL突变进行了分类，为造成B细胞恶性化的机理提供了新的洞见，但是在该领域中仍然需要更好地去理解FL是怎样与肿瘤微环境进行相互作用的，并将这些理解转化为治疗滤泡性淋巴瘤及其他形式的癌症的新的且改进的方法。
肿瘤坏死因子受体超家族成员14(TNFRSF14)——也被称为疱疹病毒侵入介质或“HVEM”——是一种淋巴瘤中的多功能肿瘤抑制子。它是一种在造血系统中表达的细胞表面受体——特异性地表达在B细胞和T细胞上。HVEM在淋巴瘤(诸如滤泡性淋巴瘤(FL)和弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL))中频繁突变或缺失。HVEM在大约44％的FL患者中有突变。进一步地，HVEM的突变状况与FL患者的存活有关联。
发明内容
以下总结了本发明的一些主要方面。其他的方面被描述在本公开中的发明具体实施方式部分、实施例部分、附图部分和权利要求部分。本专利公开中每个部分的描述——无论是任何标题或副标题——意在结合所有其他部分来解读。进一步地，本公开的每个部分中所描述的各种实施方案可以以各种不同的方式组合，并且所有这样的组合意在落入本发明的范围内。
本发明部分地是基于被更详细地描述在本发明申请的“实施例”部分的某些发现。例如，现在已经发现了，TNFRSF14/HVEM的细胞表面表达的缺失会在体内小鼠模型中显著地加快滤泡性淋巴瘤(FL)的发展。进一步地，现已证明，用“可溶性HVEM胞外域多肽”进行治疗可以以BTLA依赖的方式在体外对B细胞淋巴瘤细胞系的增生进行抑制以及在体内对B细胞淋巴瘤肿瘤生长进行抑制。基于这些发现，本发明提供了各种用于治疗B细胞淋巴瘤的组合物和方法。
在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸分子，包括：(a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，和(b)编码诸如可溶性HVEM胞外域多肽的HVEM胞外域多肽的核苷酸序列。在另外的实施方案中，本发明提供了一种核酸分子，包括：(a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，和(b)编码抗体的核苷酸序列，其中，该抗体是抗BTLA抗体或者抗HVEM抗体。在一些这样的实施方案中，CAR结合存在于B细胞淋巴瘤细胞表面上的细胞表面抗原。在一些这样的实施方案中，CAR结合选自由CD19、CD20、CD22、CD30、Igk和ROR1组成的组的细胞表面抗原。在一些优选的实施方案中，CAR结合CD19。在一些实施方案中，本发明提供了包括任何这样的核酸分子的载体——诸如表达载体和克隆载体。在一些实施方案中，本发明提供了包括任何这样的核酸分子或任何这样的载体的细胞——即，基因修饰细胞。在一些这样的实施方案中，细胞是T细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了基因修饰T细胞，包括：(a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，和(b)编码诸如可溶性HVEM胞外域多肽的HVEM胞外域多肽的核苷酸序列。在另外的实施方案中，本发明提供了基因修饰T细胞，包括：(a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，和(b)编码抗体的核苷酸序列，其中，该抗体是抗HVEM抗体或者抗BTLA抗体。这样的基因修饰T细胞是一类“CAR T细胞”。在一些这样的实施方案中，CAR结合存在于B细胞淋巴瘤细胞的表面上的细胞表面抗原。在一些这样的实施方案中，CAR结合选自由CD19、CD20、CD22、CD30、Igk和ROR1组成的组的细胞表面抗原。在一些优选的实施方案中，CAR结合CD19。在一些这样的实施方案中，编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列和编码可溶性HVEM胞外域多肽、抗HVEM抗体或抗BTLA抗体的核苷酸序列在同一个核酸分子内。相反地，在另外的实施方案中，编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列和编码可溶性HVEM胞外域多肽、抗HVEM抗体或抗BTLA抗体的核苷酸序列不在同一个核酸分子内(即，编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列和编码可溶性HVEM胞外域多肽、抗HVEM抗体或抗BTLA抗体的核苷酸序列可以被提供在不同的核酸分子中，例如，在不同的载体中)。
在一些实施方案中，本发明提供了某些非基于CAR的组合物，其可以用于HVEM胞外域多肽(诸如可溶性HVEM胞外域多肽)、抗HVEM抗体或抗BTLA抗体(即“活性剂”)向B细胞淋巴瘤细胞的靶向递送。例如，在一种实施方案中，本发明提供了一种组合物(例如药物组合物)，包括：(i)活性剂，和(b)结合B细胞淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原的“靶向抗体(targeting antybody)”(该术语包括抗原结合抗体片段)。在一些这样的实施方案中，活性剂和靶向抗体是共价连接的。相反地，在另外的实施方案中，活性剂和靶向抗体不是共价连接的。在一些实施方案中，活性剂和/或靶向抗体被提供在递送颗粒(delivery particle)中，诸如纳米颗粒、脂质体、聚合胶束、基于脂蛋白的药物载体，和/或树形分子。在一些这样的实施方案中，靶向抗体结合B细胞淋巴瘤细胞表面上的CD19、CD20、CD22、CD30、Igk或ROR1。在一些优选的实施方案中，靶向抗体结合CD19。在另外的优选的实施方案中，靶向抗体结合CD20。在一些这样的实施方案中，使用了抗CD20抗体利妥昔单抗(rituximab)或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗B细胞淋巴瘤的各种方法。在一些实施方案中，这样的方法包括给对其有需要的受试者施用有效量的HVEM胞外域多肽，诸如可溶性HVEM胞外域多肽。在一些实施方案中，这样的方法包括给对其有需要的受试者施用有效量的抗HVEM抗体或者抗BTLA抗体。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如人类、非人类灵长目动物或者小鼠。在优选的实施方案中，受试者是人类。
一些这样的治疗方法涉及用CAR T细胞来将HVEM胞外域多肽(例如，可溶性HVEM胞外域多肽)、抗HVEM抗体或者抗BTLA抗体(即，活性剂)靶向至受试者中的肿瘤细胞。例如，一些这样的治疗方法涉及给对其有需要的受试者施用以上描述的或在本专利公开内容的其他地方描述的任何基因修饰T细胞。相反地，一些这样的治疗方法涉及使用其他手段(即，非基于CAR T细胞的方法)来将活性剂靶向至受试者中的肿瘤细胞。在一些这样的方法中，使用了结合B细胞淋巴瘤/淋巴瘤细胞表面上的抗原的“靶向抗体”(该术语包括抗原结合抗体片段)，来将活性剂靶向至B细胞淋巴瘤/淋巴瘤细胞。在一些这样的实施方案中，靶向抗体结合B细胞淋巴瘤细胞上的CD19、CD20、CD22、CD30、Igk或ROR1相结合。在一些优选的实施方案中，靶向抗体结合CD19。在另外的优选的实施方案中，靶向抗体结合CD20。在一些这样的实施方案中，使用了抗CD20抗体利妥昔单抗或其抗原结合片段。在一些这样的实施方案中，活性剂共价附接(attach)于靶向抗体。在一些实施方案中，活性剂与靶向抗体存在于单个融合蛋白中。在一些实施方案中，活性剂不需要被共价附接于靶向抗体。在一些实施方案中，活性剂和/或靶向抗体可以被提供在递送颗粒中，诸如纳米颗粒、脂质体、聚合胶束、基于脂蛋白的药物载体和/或树形分子。
任何以上描述的和本专利公开中的其他地方描述的治疗方法都可以与在B细胞淋巴瘤治疗中有用的一种或多种其他治疗方法组合。这样的其他治疗方法包括但不限于：用抗CD20抗体、利妥昔单抗、依鲁替尼(ibrutinib)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、多柔比星(doxorubicin，阿霉素)、长春新碱(vincristine)、泼尼松(prednisone，强的松)和/或艾代拉利司(idelalisib)的治疗，和/或通过化学疗法、放射疗法、免疫疗法或外科手术的治疗。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗B细胞淋巴瘤的组合物，其中，这样的组合物包括诸如可溶性HVEM胞外域多肽的HVEM胞外域多肽。在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗B细胞淋巴瘤的组合物，其中，这样的组合物包括抗HVEM抗体或者抗BTLA抗体。在另外的实施方案中，本发明提供了用于治疗B细胞淋巴瘤的组合物，其中，该组合物包括编码诸如可溶性HVEM胞外域多肽的HVEM胞外域多肽的核苷酸序列。类似地，在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗B细胞淋巴瘤的组合物，其中，该组合物包括编码抗HVEM抗体或抗BTLA抗体的核苷酸序列。
在以上描述的或者在本专利公开中其他地方描述的那些涉及HVEM胞外域多肽(诸如可溶性HVEM胞外域多肽)的实施方案中，在一些这样的实施方案中，该多肽包括HVEMCRD1结构域、由HVEM CRD1结构域组成，或者主要由HVEM CRD1结构域组成。在一些这样的实施方案中，该多肽包括HVEM CRD1结构域和HVEM CDR2结构域。在一些这样的实施方案中，该多肽包括HVEM CRD1结构域、HVEM CDR2结构域和HVEM CDR3结构域。在一些这样的实施方案中，该多肽不包括HVEM CDR3结构域。在一些这样的实施方案中，该多肽不包括HVEM CRD2结构域。在一些这样的实施方案中，该多肽不包括HVEM CRD2结构域并且不包括HVEM CDR3结构域。在一些这样的实施方案中，该多肽包括HVEM CDR1结构域和HVEM CDR2结构域，但不包括HVEM CDR3结构域。在一些这样的实施方案中，该多肽具有选自由以下所组成的组的一种或多种活性：BTLA结合、BTLA激活、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞的增生、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤的生长、刺激CD8+T细胞的活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体的激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK的激活。在一些这样的实施方案中，该多肽包括SEQ ID NO：4、6或8。在一些这样的实施方案中，该多肽是通过包括SEQ ID NO：3、5或7的核苷酸序列来编码的。在一些这样的实施方案中，该多肽是通过亦编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子来编码的，诸如，例如，在本文提供为SEQ ID NO：9的核酸分子。
在以上描述的或者在本专利公开中的其他地方描述的那些涉及抗HVEM抗体或者抗BTLA抗体的实施方案中，在一些这样的实施方案中，该抗体是人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些这样的实施方案中，抗体是抗体片段，诸如，例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或纳米抗体(nanobody)抗体片段。进一步地，在一些这样的实施方案中，抗体具有选自由以下所组成的组的一种或多种活性：HVEM激活、BTLA激活、抑制BTLA+ B细胞淋巴瘤细胞增生、抑制BTLA+ B细胞淋巴瘤生长、刺激CD8+ T细胞活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+ B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK的激活。
以上描述的或者在本专利公开中的其他地方描述的那些涉及B淋巴瘤或B细胞淋巴瘤细胞的实施方案中，在一些这样的实施方案中，B细胞淋巴瘤/淋巴瘤细胞是生发中心(“GC”)B细胞淋巴瘤/淋巴瘤细胞。在一些这样的实施方案中，B细胞淋巴瘤/淋巴瘤细胞是滤泡性淋巴瘤(FL)或者FL细胞。在一些这样的实施方案中，B细胞淋巴瘤/淋巴瘤细胞是弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或者DLBCL细胞。在一些这样的实施方案中，B细胞淋巴瘤/淋巴瘤细胞是BTLA+。在一些这样的实施方案中，B细胞淋巴瘤/淋巴瘤细胞是BTLAhi。在一些这样的实施方案中，B细胞淋巴瘤/淋巴瘤细胞是HVEM-。在一些这样的实施方案中，B细胞淋巴瘤/淋巴瘤细胞包括HVEM突变。
以上总结了本发明的一些主要实施方案。其他的方面将在本专利申请的附图简要说明部分、发明的具体描述部分、实施例部分、权利要求部分和附图部分中提供并描述。进一步地，应当理解，本文所描述的每种实施方案的变化和组合也被考虑到了，并且意在落入本发明的范围内。
附图说明
图1A-I：HVEM-BTLA相互作用在大多数的人类FL中被破坏。图1A：141个FL样本中的HVEM突变的概括；图1B：在具有(harbor)HVEM拷贝数(CN)变化的41个患者中，CN状况的分布；图1C：FL患者中所发现的每种类型突变的百分比；图1D：染色体1p36缺失影响HVEM位点(MSKCC队列(cohort)，n＝64)；图1E：GISTIC分析表明，纯合性HVEM缺失频繁；图1F：由惰性FL中的结合性造成的缺失频率。图1G：在针对HVEM和BTLA染色的TMAs上对所代表的阳性或阴性案例进行量化。图1H和图1I：免疫组织化学染色。在第一组中(图1H)，在恶性细胞群落中观察到了强烈的对抗HVEM抗体的染色，而BTLA却大致保持阴性。第二组中(图II)，所有的肿瘤细胞对HVEM都是阴性的，但却显示出对BTLA强烈的阳性。原始放大x400，比例尺等于50μm。
图2A-G：HVEM在FL小鼠模型中起到肿瘤抑制子的作用。图2A：vavPBcl2镶嵌小鼠模型的示意图。图2B：无病生存期的Kaplan-Meier分析(载体，n＝11；shRNA对抗HVEM，n＝19)。图2C：对从正常的脾、从对照组淋巴瘤(vavPBcl2载体)和从表达有对抗HVEM的shRNA的两个独立淋巴瘤(vavPBcl2-shHVEM)中分离的B淋巴细胞中的表面HVEM进行FACS分析。图2D：对HVEM的FACS测量进行量化(对于每种基因型，n＝5，*p<0.01)。图2E：不同的小鼠细胞群落——HSCs(预先注入小鼠)、CD4+、CD8+、B220+(在将小鼠擒杀(sacking)之后)(n＝5)——中shHVEM的GFP表达。图2F：针对鼠类淋巴瘤上的所示标记的病理学测试和免疫组织化学测试，比较了对照组淋巴瘤(vavPBcl2载体)和缺HVEM的淋巴瘤(vavPBcl2-HVEM)；比例尺＝100μm。图2G：在鼠类的对照组淋巴瘤(载体)和缺HVEM(shHVEM)上进行如所示探测的免疫印迹。
图3A-F：BTLA的缺乏强调了HVEM的丢失在体内对淋巴瘤发展的作用。图3A：无病生存期的Kaplan-Meier分析(载体，n＝11：shRNA对抗BTLA，n＝16，p<0.01)。图3B：在对照组(载体)和BTLA(shBTLA)淋巴瘤中对BTLA的mRNA的表达进行qRT-PCR分析。图3C：对包括H&E、Ki67、PNA和BCL6等代表性的部分染色的shBTLA肿瘤进行病理学分析，比例尺＝100μm。图3D：对shBTLA肿瘤中的Ki67染色进行量化(n＝6，p<0.01)。图3E：对vavPBcl2载体肿瘤和vavPBcl2-shBTLA肿瘤进行表面分析。图3F：在代表性的肿瘤上进行如所示探测的免疫印迹。
图4A-E：HVEM以细胞自主的和依赖于BTLA的方式阻滞了BCR信号传递。图4A和图4B：在存在solHVEM(10μg/ml)或依鲁替尼(10nM)的情况下、不含有(图4A)或含有(图4B)BTLA敲低(shBTLA)中，对用抗IgM对BCL1细胞刺激之后的BCL1细胞中的磷酸化BTK(pBTK)表达的FACS分析进行量化。图4C：对纯化的原发性人类FL B细胞上的BTLA表达进行FACS分析，区别了含有高的(BTLAhi)表面BTLA表达的样本和低的(BTLAlo)表面BTLA表达的样本；在存在或不存在可溶性HVEM胞外域(solHVEM；10μg/ml)的情况下，在用抗人类IgG(3min；10μg/ml和1mM的H202)刺激中，对BTLAhi或者BTLAlo的人类原发性FL B细胞中所示的信号传递分子进行DFACS分析(右)。图4E：通过比较pSyk+/-solHVEM的MFI的比例计算了对pSyk进行抑制的百分比，并且该百分比与MFI的BTLA比例进行了关联(r＝0.697，p＝0.03，纯化的FL B细胞，n＝10，第1级别和第2级别)。
图5A-I：淋巴基质在B细胞淋巴瘤中的异常激活。图5A：在对照组淋巴瘤(载体)和HVEM敲低的淋巴瘤(shHVEM)上，对FDC标记物CD21/35和FRC标记物I型胶原进行免疫组织荧光染色(对于每组，n＝3，比例尺＝100μm)。图5B和图5C：在对照组(载体)和缺HVEM(shHVEM)的淋巴瘤中，分别基于每只小鼠的T细胞地段中的12个区域和B细胞地段中的30个区域，对CD21/35(左)和I型胶原(右)进行系统性的量化；通过参数t检验，**p<0.01；***p<0.001。图5D和图5E：在对照组(载体)和HVEM敲低(shHVEM)的淋巴瘤上通过进行qRT-PCR的CXCL13(图5D)和CCL19(图5E)的表达(四个复本(replicates)的平均数，误差棒表示标准偏差，*p<0.01)。图5F，对从载体小鼠和shHVEM小鼠(n＝3)的脾中分离的B细胞中的LTa、LTb和TNFamRNA表达进行qRT-PCR测量。图5G-I：用solHVEM(10μg/ml)治疗24小时后，对B细胞系BCL1中的TNFa(图5G)、LTa(图5H)和LTb(图5I)进行qRT-PCR测量。
图6A-I：增加的TFH细胞募集(recruitment)支持缺HVEM的淋巴瘤B细胞。图6A：基于标记CD3pos、CD4pos、CD25neg、PDlhi和CXCR5hi，对衍生于人类GC的TFH细胞的进行FACS鉴定和分选；左图：同型对照组；右图：用抗BTLA抗体染色。图6B和图6C：，对对照组和缺HVEM的鼠类淋巴瘤中的瘤内TFH细胞进行FACS测量(图6B)和量化(图6C)。图6D和图6E：对分选的瘤内T细胞中(N＝？)的IL21(图6D)和IL4(图6E)进行qRT-PCR测量；图6F：对从载体小鼠和shHVEM小鼠的脾中分离的T细胞中的LTa、LTb和TNFa mRNA表达进行qRT-PCR测量，*p<？。图G-I：在存在或不存在可溶性HVEM(solHVEM，10μg/ml)的情况下，对与抗CD3/抗CD28Mabs一起培养的分选了细胞的TFH(n＝4)中的TNFa(图6G)、LTa(图6H)和LTb(图6I)进行qRT-PCR测量；每个标志都代表一个独立的TFH样本。
图7A-H：solHVEM(Leu39-Val202或者Pro37-Val202)蛋白修复了HVEM的肿瘤抑制作用。图7A和图7B：在存在或不存在Pro37-Val202solHVEM(5μg/ml)或者BTK抑制剂依鲁替尼(10nM)的情况下，在用抗IgG刺激的DOHH2淋巴瘤细胞中，对磷酸化BTK(pBTK)进行FACS测量；在图(B)中被量化(*表示p<0.01)；图7C：用Leu39-Val202solHVEM(5μg/ml)治疗之后在myc/bcl2细胞上进行如所示探测的免疫印迹。图7D：对用Leu39-Val202solHVEM(5μg/ml)治疗的跨BTLAhi和BTLAlo组的淋巴瘤细胞系的细胞增生进行分析。图7E：对植入的myc-bcl2鼠类淋巴瘤进行体内治疗的代表性照片。图7F：在形成可触知的75mm3肿瘤后，用赋形剂或Leu39-Val202HVEM胞外域对植入的myc-bcl2鼠类淋巴瘤进行体内治疗，每三天注射20μg的Leu39-Val202solHVEM(通过箭头表示)。图7G：在来自Leu39-Val202治疗和未治疗的淋巴瘤的溶解产物上进行如所示探测的免疫印迹。图7H：在用Leu39-Val202治疗或未治疗的淋巴瘤上进行显微病理检测，染色如所示，比例尺＝100μm。
图8A-G：在人类淋巴瘤中的HVEM突变和缺失。图8A：在第二系列的FL中(UNMC，n＝198)的染色体1p36缺失；插图：对DNA拷贝数的GISTIC分析表明频繁的纯合性丢失。图8B：在转性(transformed)FL中就合子而言的缺失频率。图8C：布置在TMA上的FL组织样本中HVEM阳性肿瘤细胞的百分比的分布；颜色代表染色强度。图8D：在HVEM wt(野生型)的样本(左)和HVEM突变或缺失的样本(右)中，人类FL样本中HVEM的表达。图8E：示出在滤泡性淋巴瘤细胞中，对CD272(BTLA)表现出各自的染色强度的案例数量。图8F：在HVEM+或者HVEM-的案例中，人类FL中的BTLA染色强度。图8G：数字表示TMA个体部分是如何得分的拆分。
图9A-E：HVEM的敲低促进了体内FL发展。图9A：与空载体相比，用第二种对抗HVEM的shRNA(shHVEM-2)对肿瘤的始发进行Kaplan-Meier分析(载体，n＝11；shHVEM-2，n＝12；p<0.01)。图9B：对对照组(载体)和HVEM(shHVEM)淋巴瘤中的HVEM mRNA表达进行qRT-PCR分析。图9C：对缺HVEM的淋巴瘤上(shHVEM)的所示的表面标记进行FACS分析。图9D：对vavPBcl2载体肿瘤和vavPBcl2-HVEM肿瘤中的Ki67进行量化(n＝6；平均数±标准偏差；t检测：*p<0.01)。图9E：对缺HVEM的淋巴瘤上(shHVEM)的所示表面标记进行FACS分析。
图10A-C：对小鼠肿瘤的VDJ区域中的变体进行分析。图10A：对来自shHVEM小鼠的三个样本的μ重链转录本进行分析，以估测克隆性(clonality)和监测样本内的克隆型(clonotype)。表格代表扩增高于1％的克隆(对照样本中没有任何高于0.66％的)。在最后一列中，将含有相同VDJ连接的并在V和JH节段的区别最小化的克隆代表为变体。图10B：进化树示出，通过将CDR3区域中观察到的变体与shHVEM样本#2中的(VH8.12/D2.4/JH1)连接，占主导地位的克隆进行着持续的克隆进化。图10C：饼状图代表用三个样本(和对照组)对VH家族进行分析，以整体地评估每个样本中的B细胞库。样本2和3中充足的克隆增生相应地示出清晰的库偏倚(repertoire biases)。
图11：HVEM对鼠类和人类FL B细胞的作用。对纯化的人类FL B细胞上的BTLA表达进行的FACS分析区别开了含有高(BTLAhi)和低(BTLAlo)的表面BTLA表达的样本(顶部)。在存在或不存在可溶性HVEM胞外域(solHVEM；10μg/ml)的情况下，用抗人类IgG(3分钟和10分钟；10μg/ml和1mM的H202)刺激下，对人类原发性的BTLAhi或BTLAlo的FL B细胞中所示的信号传递分子进行FACS分析。
图12A-F：对B细胞淋巴瘤中的淋巴基质进行分析。图12A：对反应性淋巴结和两个分开的人类滤泡性淋巴瘤组织样本中的CD20pos B细胞、转谷氨酰胺酶pos FRC和CD21LposFDC进行免疫组织荧光染色。图12B：对FRC密度进行图像处理的流程图(I型胶原)；简言之，将图像阈值化、并转化为二进制图像，然后运用分水岭算法、并通过ImageJ软件对多边形的数量进行估测与分析。图12C：多边形的数量表明了对照组淋巴瘤(载体)和HVEM敲低的淋巴瘤中的FRC密度，显示出FRC的贡献没有区别。在每只小鼠中的T细胞地段选择了40个区域、并进行了分析(每组中，n＝3)。图12D-F：对小鼠B细胞系EuMyc-Bcl2中的TNFa(图12D)、LTa(图12E)和Ltb(图12F)进行qRT-PCR测量。
图13A-E：对缺HVEM的淋巴瘤中的TFH细胞功能进行分析。图12A和图12B：对纯化的淋巴B细胞中的IL21的受体(IL-21ra；A)和IL4的受体(IL4ra；B)进行qRT-PCR测量。图12C：纯化的鼠类TFH细胞的存活率(样本：n＝4)；所述TFH细胞在存在或不存在可溶性HVEM胞外域(solHVEM：10μg/ml)的情况下、在含有或不含有抗CD3/抗CD28的刺激下被培养了3天。图12D和图12E：在存在或不存在solHVEM的情况下、与抗CD3/抗CD28Mabs一起培养分选的细胞GC-TFH；通过ELISA对产出的CXCL13(图12D)和IL-21(图12E)进行评估。
图14A-E：solHVEM(Leu39-Val202或Pro37-Val202)对鼠类和人类FL B细胞的作用。图14A和14B：在存在或不存在Pro37-Val202solHVEM(5μg/ml)的情况下，对用抗IgG刺激的DOHH2淋巴瘤细胞中的pSYK水平进行量化(*表明p<0.01)；(图14B)中是代表性的FACS测量。图14C：在一组包括鼠类myc/bcl2淋巴瘤和人类细胞系(DOHH2、Su-DHL6、Granta、Lyl0)的淋巴瘤细胞系中，对BTLA表达进行FACS分析。图14D：来自小鼠肿瘤的代表性的照片。图14E：小鼠肿瘤的肿瘤重量(n＝3，p<0.01)。
图15A-B：sTFRSF14通过降低P-BTK来抵抗B细胞受体在淋巴瘤B细胞中的信号传递。用TNFRSF14的可溶性胞外域(sTNFRSF14)Pro 37-Val202(5μg/ml)或者用BTK抑制剂依鲁替尼对B细胞淋巴瘤细胞系(DOHH2)进行了一个小时的预处理，然后在37℃下用抗IgG分子刺激了5分钟。随后，将细胞固定并进行了透化，并且用磷酸流式(phospo-flow)抗体探测了pBTK的表达，并在BD Fortessa上进行了分析。图15A：代表性的FACS曲线图。图15B：对用赋形剂或药物治疗后的磷酸BTK的平均荧光强度进行量化。
图16A-B：sTFRSF14通过降低P-SYK来抵抗B细胞受体在淋巴瘤B细胞中的信号传递。用TNFRSF14的可溶性胞外域(sTNFRSF14)Pro 37-Val 202(5μg/ml)或者用BTK抑制剂依鲁替尼对B细胞淋巴瘤细胞系(DOHH2)进行了一个小时的预处理，然后在37℃下用抗IgG分子刺激了5分钟。随后，将细胞固定并进行了透化，并用磷酸流式(phospo-flow)抗体探测了pSYK的表达，并在BD Fortessa上进行了分析。图16A：代表性的FACS曲线图。图16B：对用赋形剂或药物治疗后的磷酸-SYK的平均荧光强度进行量化。
图17：sTNFRSF14在体外抑制了淋巴瘤细胞系的生长。将三种淋巴瘤细胞系(Myc-Bcl2、LY-10、Granta)按照1x 105细胞/ml装盘，并且用sTNFRSF14(5μg/ml)或赋形剂进行了长达72小时的每天治疗。72小时后，用血球计对细胞数量进行了计数。每个条形图代表三组独立实验的平均数。
图18：sTNFRSF14在体外降低了细胞的存活率，将myc-Bcl2淋巴瘤细胞系的细胞按照1x 105细胞/ml的密度装盘，并且用sTNFRSF14(5μg/ml)或赋形剂对这些细胞进行了治疗。在治疗24小时之后，用CellTiterGlo试剂评估了细胞的存活率。
图19：sTNFRSF14在体外的作用。对用5μg/ml的sTNFRSF14治疗的细胞系进行免疫印迹。如所示的探测了印迹。
图20：sTNFRSF14在体内抑制了肿瘤生长。在小鼠的侧腹中生长了异种移植的myc-bcl2淋巴瘤。当肿瘤到达接近0.5cm3的体积时，通过使用在PBS中稀释的20μg/ml的sTNFRSF14对侧腹进行瘤内注射，以每隔一天地对小鼠进行了治疗。用PBS来治疗对照组(载体)动物。将肿瘤称重，并且每周两次对体积进行了测量。
图21：sTNFRSF14在异种移植模型中降低了淋巴瘤生长。将5百万个myc-Bcl2细胞与基质胶(Matrigel)混合，并通过皮下注入了小鼠J:Nu无胸腺裸小鼠(Foxnl nu/Foxnlnu)的侧腹。根据IUCAC协议将动物牺牲掉。牺牲后，对肿瘤称重并进行了测量。
图22：外源施用sTNFRSF14抑制了小鼠淋巴瘤异种移植物。在第11天将动物牺牲掉，并且从动物的侧腹切除了异种移植的肿瘤。对来自每个侧腹的、治疗的(sTNFRSF14)或未治疗的(赋形剂)肿瘤进行了称重。条形图代表n＝4的小鼠的平均值。
图23：用sTNFRSF14治疗之后，体内肿瘤的分子表征。
图24：对异种移植的肿瘤进行免疫组织化学分析。对用sTNFRSF14治疗的和用赋形剂治疗的小鼠淋巴瘤进行病理学分析。从动物的侧腹切除了肿瘤，并将肿瘤在4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)中固定过夜。对肿瘤进行了切片并通过IHC对特别的肿瘤标记进行了染色。代表性的针对HE、TUNEL和Ki67的染色被示出。
图25A-B.图25A：用CD19特异性的嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(被修饰为组成性地分泌可溶性HVEM)，将可溶性HVEM多肽递送至淋巴瘤细胞的示意图。图25B：包括可溶性HVEM序列(HVEM P37-V202)的嵌合抗原受体(CAR)分子的示意图。
图26A-B：solHVEM在T细胞的存活率或激活上没有作用。图26A：在存在或不存在可溶性HVEM胞外域(solHVEM：10μg/ml)的情况下、与含有或不含有抗CD3/抗CD28刺激下一起培养了24小时的纯化的鼠类OT1细胞的存活率(n＝2)。图26B：通过FACS鉴定的激活的鼠类OT1细胞的百分比；像图26A中那样培养OT1细胞。
图27A-B：与19-28T细胞相比，19-28-HVEM修饰的T细胞显示出增加的HVEM生产和分泌。(图27A)：在FACS分选的CAR-T上进行WB，并且对HVEM进行探测。(图27B)：HVEM上的ELISA试验示出提高的HVEM水平(p<0.1)。
图28A-D。图28A：19-28-HVEM修饰的T细胞在体外呈现出对B细胞升高的细胞毒性，伴随着与对照组19-28T细胞相比更高的BTLA表达。在指定的T(靶标)对E(效应T细胞)的比例下，将DOHH2或Raji细胞与用GFP标记的CAR-T细胞一起进行了培育。在所示的时间下，用Annexin V和DAPI标记了细胞，并且通过FACS评估了GFP存活细胞的百分比。图28B：对B细胞系上的BTLA表达进行FACS分析，区别了含有高和低表面BTLA表达的样本。图28C-D：与对照组的19-28T细胞相比，19-28-HVEM修饰的T细胞在体内DOHH2肿瘤上呈现出升高的细胞毒性。通过将与基质胶(BD)混合的5Mio DOHH2人类淋巴瘤细胞皮下注入至NOD/SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/J)小鼠的侧腹中，生成了异种移植物。当形成肉眼可见的肿瘤时(20mm3)，给小鼠施予单剂的含有或者不含有HVEM分泌的1Mio抗CD19CAR T细胞。含有前列腺特异性膜抗原(PSMA)scFv的T细胞被用作对照组的CAR。图28C：小鼠牺牲后分离的代表性的肿瘤。图28D：对肿瘤大小进行量化。
具体实施方式
以下提供的或者本专利公开通篇提供的副标题不是旨在表示对本发明的各种方面或实施方案进行限制，而应当作为整体参考说明书来理解所述的方面或实施方案。例如，本具体实施方式旨在结合本申请的发明内容部分所提供的描述来阅读，并对发明内容部分中所提供的描述进行扩展。
1.定义和缩写
如说明书和随附的权利要求所用，除非上下文另有明确的说明，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代。表达方式(terms)“一(a)”(或“一(an)”)以及表达方式“一种或多种”和“至少一种”可以互相交换使用。
进一步地，“和/或”被认为是具体公开了两种指定的特征或组分中的每一种，可伴有或不伴有另一种。因此，诸如“A和/或B”的短语中用到的表达方式“和/或”旨在包括A和B、A或B、(单独)A和(单独)B。同样，诸如“A、B和/或C”的短语中用到的表达方式“和/或”旨在包括：A、B和C；A、B或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；(单独)A；(单独)B；和(单独)C。
用国际单位系统(SI)中可接受的形式来表示单位、前缀和标志。本文所提供的数字范围包括限定范围的数字。在数字表达方式之前有“约”的情况下，该表达方式包括所阐明的数字及所阐明的数字±10％的值。
“活性剂”是一种如本文所述或所要求保护的剂(agent)(例如，分子或细胞)，该剂是或包括可溶性HVEM胞外域多肽、抗HVEM抗体或抗BTLA抗体，或者编码任何这样的剂的核苷酸序列。活性剂包括但不限于细胞(诸如T细胞)、多肽/蛋白和核酸分子。
术语“抑制”“阻滞”“减少”和“阻碍”可相互交换使用，并且这些术语表示任何统计学上显著降低的生物活性，其包括但不限于对活性完全地阻滞。
“TNFRSF14”表示“肿瘤坏死因子受体超家族成员14”。
“HVEM”表示“疱疹病毒侵入介质”。
TNFRSF14和HVEM是同一种且相同的东西。因此，术语TNFRSF14和HVEM在本专利公开通篇中可交相互换使用。在一些情况下，本文中可以以“TNFRSF14/HVEM”来表示这些蛋白。
“BTLA”表示“B和T淋巴细胞衰减子”。
术语“BTLA阳性”和“BTLA+”在本文中可相互交换使用，来表示表达(或表达可检测水平的)BTLA的肿瘤或细胞。
术语“BTLA阴性”和“BTLA-”在本文中也可相互交换使用，并且表示不表达(或不表达可检测水平的)BTLA的肿瘤或细胞。
术语“BTLAhi”表示表达高水平BTLA的肿瘤或细胞。
术语“BTLAlo”表示表达低水平BTLA的肿瘤或细胞。
术语BTLA+、BTLA-、BTLAhi和BTLAlo被全部用来表示相对意义上的BTLA的表达水平。例如，可以相对于BTLA-将细胞或肿瘤归类为BTLA+。类似地，可以相对于BTLAlo将细胞或肿瘤归类为BTLAhi。使用这样的相对的术语来表示表达水平(例如用“+”对“-”，以及用“hi”对“lo”术语)在本领域中是规范的，并且这样的术语的含义对于本领域普通技术人员是清晰的。例如，本领域技术人员将会理解，细胞或肿瘤可以基于对BTLA表达水平的确定(与合适的阳性(即，表达BTLA的)对照组和/或阴性(即，不表达BTLA的)对照组比较)而被称作BTLA+。类似地，本领域技术人员将会理解，细胞或肿瘤可以基于对BTLA表达水平的确定(与合适的高表达的对照组和/或弱表达的对照组比较)而被称作BTLAhi。实施例1中提供了合适的试验以作出这些比较性的测定，并且包括但不限于免疫组织化学测验和流式细胞术或基于FACS的试验。类似地，实施例1提供了合适的对照组细胞类型以作出这些比较性的测定。
“CAR”表示“嵌合抗原受体”。
“CAR T细胞”表示已被改造(engineered)为表达CAR的基因修饰T细胞。
本专利公开中的其他地方对各种其他术语(当使用时)进行了定义。进一步地，没有在本文被具体定义的术语可以在使用该术语的上下文中和/或通过参考整个说明书来更加充分地理解。在没有提供明确的定义的情况下，本文使用的所有技术术语和科学术语具有由本发明所适用的领域的普通技术人员通常所理解的含义。
2.TNFRSF14/HVEM多肽
TNFRSF14原先被认定为是1型单纯疱疹病毒侵入人类或小鼠细胞的中介物(Montgomery,Warner等人.1996)。TNFRSF14受体是TNF受体超家族内目前已知的29种受体之一。在人类中，TNFRSF14受体基因位于染色体1p36——一个由于其在多种癌症中频繁地缺失而已被频繁地报道称藏有肿瘤抑制子的位点(Bagchi和Mills 2008)。TNFRSF14在遍及主要的人类组织中都有被表达，但是在造血系统的细胞中呈现出其最高表达水平。TNFRSF14是不溶性的跨膜蛋白，包括：细胞内结构域、跨膜结构域，以及细胞外结构域或“胞外域”。TNFRSF14的细胞外结构域包括3个富含半胱氨酸的结构域或“CRD”——被称作CRD1、CRD2，并且TNFRSF14可以与多种不同的配体相互作用；这些配体通过TNFRSF14的CRD结构域与TNFRSF14相结合。一些这样的配体递送共刺激信号：诸如配体“lymphotoxin-like,inducible expression,competes with herpes simplex virus glycoprotein D forHVEM,a receptor expressed by T lymphocytes”(或“LIGHT”)和LTα。其他配体递送共抑制信号：诸如CD160、糖蛋白D(gD)和“B和T淋巴细胞衰减子”或“BTLA”(Murphy和Murphy2010)。
图29和SEQ ID NO.2中提供了全长的人类TNFRS14/HVEM蛋白序列。图29和SEQ IDNO.1中提供了编码SEQ ID NO.2的蛋白(即，全长人类TNFRS14/HVEM蛋白)的核苷酸序列。编码全长人类TNFRS14/HVEM蛋白的另一核苷酸序列被提供为SEQ ID NO.10(NCBI参考序列：NM 003820.3)。编码全长小鼠TNFRS14/HVEM蛋白的核苷酸序列被提供为SEQ ID NO.11(NCBI参考序列：NM 178931.2)。编码全长大鼠TNFRS14/HVEM蛋白的核苷酸序列被提供为SEQ ID NO.12(NCBI参考序列：NM 001015034.1)。编码全长猴TNFRS14/HVEM蛋白的核苷酸序列被提供为SEQ ID NO.13(NCBI参考序列：NM 001043357.1)。本领域中，其他全长TNFRS14/HVEM蛋白序列以及编码这样的蛋白序列的核苷酸序列也是已知的。本发明的一些实施方案涉及这些全长HVEM序列。
但是，本发明的大多数实施方案涉及全长不溶性HVEM蛋白的非自然产生的可溶性片段，在本文中被称为“可溶性HVEM胞外域多肽”。如本专利申请的实施例部分所讨论，现已证明，可溶性HVEM胞外域多肽抑制B细胞肿瘤生长，并且该活性涉及结合BTLA。已知，在HVEM胞外域内，CRD1结构域是针对BTLA的必要结合位点，并且CRD1结构域的缺失阻滞了HVEM的抑制活性，并且也有证据表明HVEM的CRD2结构域为诸如BTLA的CRD1结合配体提供了结构支持(见M.L.del Rio,2010、Gonzales 2004、和Bjordahl 2013，通过引用将其每一者均合并至本文)。因此，本发明的“可溶性HVEM胞外域多肽”包括至少CRD1结构域(并且可以可选地包括CRD2和/或CRD3和/或其他HVEM胞外域区域)，并且不包括HVEM跨膜结构域或HVEM细胞内结构域。进一步地，本发明的“可溶性HVEM胞外域多肽”呈现出一种或多种以下功能性性质：在BTLA+/hiB细胞淋巴瘤中的肿瘤抑制活性(如，在BTLA+/hiB细胞淋巴瘤中，体外抑制B细胞淋巴瘤细胞生长的能力和/或体内抑制肿瘤生长的能力)、增加/刺激CD8+T细胞活性的能力、抑制/减少淋巴瘤细胞中B细胞受体活性的能力、抑制/减少由滤泡辅助性T(TFH)细胞或由淋巴瘤B细胞分泌IL-21的能力、以BTLA依赖的方式抑制BCR通路激活的能力、以及抑制BTLA+/hi的淋巴瘤细胞中(如，DOHH2细胞)的BTK、SYK和/或ERK激活的能力。本专利申请的实施例部分中提供了用于评估这样的功能性性质的合适的试验。
本文提供了几个示例性的可溶性HVEM胞外域多肽的序列——如下面表1所总结的。本文描述的所有可溶性HVEM胞外域多肽的氨基酸的编号是基于SEQ ID NO.2(即，SEQID NO.4是SEQ ID NO.2的氨基酸29-202；SEQ ID NO.6是SEQ ID NO.2的氨基酸37-202；以及SEQ ID NO.8是SEQ ID NO.2的氨基酸39-202，等等)。SEQ ID NO.2的氨基酸残基Cys42-Cys75形成了HVEM的CRD1结构域。SEQ ID NO.2的氨基酸残基Cys78-Cys119形成了HVEM的CRD2结构域。SEQ ID NO.2的氨基酸残基Cys121-Cys162形成了HVEM的CRD3结构域。本专利申请的实施例部分描述了用这样的示例性的可溶性HVEM胞外域多肽中的一些进行的实验。
表1：示例性的可溶性HVEM胞外域多肽的序列
可溶性HVEM胞外域多肽 核苷酸序列 氨基酸序列
Gln29-Val202 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.4
Pro37-Val202 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.6
Leu39-Val202 SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.8
在一些实施方案中，本发明的可溶性HVEM胞外域多肽包括以下，或由以下组成，或主要由以下组成：HVEM蛋白的CRD1结构域(例如，SEQ ID NO.2的氨基酸残基Cys42-Cys75；或与之相当(corresponde，相应)的氨基酸残基)。
在一些实施方案中，本发明的可溶性HVEM胞外域多肽包括以下，或由以下组成，或主要由以下组成：HVEM蛋白的CRD1结构域和CRD2结构域(如，SEQ ID NO.2的氨基酸残基Cys42-Cys75和SEQ ID NO.2的氨基酸残基Cys78-Cys119；或与之相当的氨基酸残基)。
在一些实施方案中，本发明的可溶性HVEM胞外域多肽包括以下，或由以下组成，或主要由以下组成：HVEM蛋白的CRD1结构域、CRD2结构域和CRD3结构域(例如，SEQ ID NO.2的氨基酸残基Cys42-Cys75和SEQ ID NO.2的氨基酸残基Cys78-Cys119和SEQ ID NO.2的氨基酸残基Cys121-Cys162；或与之相当的氨基酸残基)。
在一些实施方案中，本发明的可溶性HVEM胞外域多肽不包括CRD2结构域。
在一些实施方案中，本发明的可溶性HVEM胞外域多肽不包括CRD3结构域。
在一些实施方案中，本发明的可溶性HVEM胞外域多肽不包括CRD2或CRD3结构域。
在一些实施方案中，本发明的可溶性HVEM胞外域多肽包括以下，或由以下组成，或主要由以下组成：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8的氨基酸序列，或与之相应的氨基酸残基。
在一些实施方案中，本发明的可溶性HVEM胞外域多肽包括以下，或由以下组成，或主要由以下组成：从SEQ ID NO.2的氨基酸位置19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42处开始的氨基酸序列；或与之相当的氨基酸残基。
在一些实施方案中，本发明的可溶性HVEM胞外域多肽包括以下，或由以下组成，或主要由以下组成：从SEQ ID NO.2的氨基酸位置19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42处开始，并于SEQ ID NO.2的氨基酸75、76或77处结束的氨基酸序列；或与之相当的氨基酸残基(即，包括CDR1结构域)。
在一些实施方案中，本发明的可溶性HVEM胞外域多肽包括以下，或由以下组成，或主要由以下组成：从SEQ ID NO.2的氨基酸位置19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42处开始，并于SEQ ID NO.2的氨基酸119或120处结束的氨基酸序列；或与之相当的氨基酸残基(即，包括CDR1结构域和CRD2结构域)。
在一些实施方案中，本发明的可溶性HVEM胞外域多肽包括以下，或由以下组成，或主要由以下组成：从SEQ ID NO.2的氨基酸位置19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42处开始，并于SEQ ID NO.2的氨基酸162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208或209处结束的氨基酸序列；或与之相当的氨基酸残基(即，包括CDR、CRD2和CRD3结构域)。
应当注意，无论那些其他序列的排列是否使用不同的编号方案或是否存在于不同的HVEM序列中(诸如来自不同的物种的HVEM序列中)，本领域技术人员都能够例如通过与SEQ ID NO.2进行序列比对而容易地确定和/或鉴定其他序列中与本文所限定的任何特定氨基酸残基“相当”的氨基酸位置。还应当注意，对于本文提供的所有被编号的序列或被编号的氨基酸残基而言，与这样的序列/残基“相当”的序列和氨基酸残基也被考虑并包括在本文中。
在本专利公开中上文及其他地方所提供的任何特定的可溶性HVEM胞外域多肽序列的变体也被考虑到了，并且这些变体意在落入本发明的范围内。例如，在一些实施方案中，可以使用来自其他物种(直系同源物(ortholog))的本文所公开特定序列的变体。类似地，在另外的实施方案中，可以使用包括任何本文所公开的特定序列的片段的变体。同样，在一些实施方案中，可以使用包括一个或多个氨基酸替换、添加、缺失或其他突变的本文所公开的特定序列的变体。在一些实施方案中，变体氨基酸序列与本文描述的特定的可溶性HVEM胞外域多肽具有至少约40％或50％或60％或65％或70％或75％或80％或85％或90％或95％或98％或99％的同源性(identity)。在所有这些案例中，所有的变体可溶性HVEM胞外域多肽应当包括CRD1结构域，或包括足以结合BTLA的一部分CRD1结构域，并且这些变体应当呈现以下功能性性质中的一种或多种：HVEM激活、BTLA激活、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞增生、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤生长、刺激CD8+T细胞活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK激活。本发明的实施例部分中提供了用于评估这样的功能性性质的合适的试验。
应当注意，在一些实施方案中，本专利公开中所考虑到的或描述的所有可溶性HVEM胞外域多肽可以包括分泌信号序列，或者可以通过包括分泌信号序列的前体形式而被表达。在一些实施方案中，使用了IgG Kappa分泌信号。在另外的实施方案中，使用了白细胞介素2(IL2)分泌信号。但是，任何本领域已知的合适的分泌信号序列都可以使用。
除了提供氨基酸序列以外，本发明还提供了核酸序列。例如，在一些实施方案中，本发明提供了编码可溶性HVEM胞外域多肽的核酸序列，包括但不限于，包括以下，或由以下组成，或主要由以下组成的那些核酸序列：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7。本发明考虑并提供了编码本文描述的所有可溶性HVEM胞外域多肽的核苷酸序列——包括针对公开的特定序列以及本文描述的这些序列的各种变体的那些核苷酸序列。本发明还提供了包括任何本文描述的核酸分子和/或核苷酸序列的DNA构建体(如，载体和质粒)，或编码任何本文描述的可溶性HVEM胞外域多肽的DNA构建体。
本发明还提供了包括任何本文描述的核酸分子和/或核苷酸序列的基因修饰细胞，或编码任何本文描述的可溶性HVEM胞外域多肽的基因修饰细胞。
应当注意，尽管本发明主要涉及使用可溶性HVEM胞外域多肽，但在一些情况中，可能可以使用包括存在于这样的可溶性HVEM胞外域多肽中的序列的不溶性(即，膜结合)蛋白。例如，在涉及表达(和分泌)可溶性HVEM胞外域多肽的CAR T细胞的那些实施方案中，在一些情况下，可能可以使用表达HVEM胞外域多肽的不溶性(即，膜结合)版本的CAR T细胞；其中，HVEM胞外域多肽序列是膜相结合的，并且存在于T细胞的表面，而不是由T细胞分泌。这样的实施方案意在落入本发明的范围内。因此，除非另有说明，本发明的所有那些涉及可溶性HVEM胞外域多肽的实施方案可以用这样的多肽的可溶性变体来实施——这样的多肽包括呈现可溶性HVEM胞外域多肽的序列，以及引起这些序列存在于细胞膜中的其他序列(如，在细胞表面上)。
3.抗体(包括抗HVEM和抗BTLA抗体)
本发明的几个实施方案涉及抗体。如本文所用的，术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv、以及单链Fv(scFv)片段、单域抗体(sdAb或纳米抗体))、包括抗体的抗原决定部分(portion，区)的融合蛋白、从至少两个完整抗体产生的双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体以及包括抗原识别位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子——只要该抗体包括抗原识别位点并呈现符合期望的生物活性。
各种不同类型的抗体片段以及制作和使用这样的抗体片段的方法在本领域中是已知的。对于产生纳米抗体库多特异性抗体(nanobody repertoires multi-specificantibodies)的描述，请参见，例如，Fridy等人,Nature Methods.2014Dec；11(12):1253-60(通过引用将其内容合并至本文)。基于其分别以α、δ、ε、γ和μ表示的重链恒定域的同源性，抗体可以属于以下五大类免疫球蛋白中的任一类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同类的免疫球蛋白具有不同且公知的亚基结构和三维构象。抗体可以为裸的，或者可以与其他分子(诸如毒素、放射性同位素或本文所述的任何其他特定分子)缀合。
在一些实施方案中，本发明涉及抗BTLA抗体和/或抗HVEM抗体。在一些实施方案中，这样的抗体可以是任何合适类型的抗BTLA抗体或抗HVEM抗体。在某些优选的实施方案中，使用结合BTLA或HVEM的抗体片段。例如，在某些实施方案中，使用了Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或sdAb(纳米抗体)片段。在某些优选的实施方案中，抗体片段是scFv片段。在其他优选的实施方案中，抗体片段是纳米抗体。在某些实施方案中，这样的抗体(包括抗体片段)以高亲和力和/或高特异性结合其各自靶标抗原(即BTLA或HVEM)。在某些优选的实施方案中，这样的抗体(包括抗体片段)均结合并激活B细胞表面上的其各自的靶标抗原(即BTLA或HVEM)——即，这样的抗体充当针对其各自靶标抗原的激动剂。例如，这样的激活性/激动性抗体可以模仿其各自靶标抗原(即，BTLA或HVEM)的一个或多个天然配体的生物活性。WO2010106051A1中描述了对BTLA有特异性的抗体的示例，并且Park等人,CancerImmunol.Immunother.2012Feb；61(2):203-14中描述了对HVEM有特异性的抗体的示例。但是，任何其他合适的抗体(包括抗体片段)均可以使用。
术语“人源化抗体”表示已经被改造为含有最小化非人类(如，鼠类)序列的、衍生自非人类(如，鼠类)免疫球蛋白的抗体。典型地，人源化抗体是人类免疫球蛋白，其中，来自互补决定区(CDR)的残基被具有期望的特异性、亲和力和性能的来自非人类物种(如，小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的CDR的残基所替代(Jones等人,1986,Nature,321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等人,1988,Science,239:1534-1536)。在一些情况中，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FW)残基被具有期望的特异性、亲和力和性能的来自非人类物种的抗体中的相应残基所替代。
人源化的抗体可以通过在Fv框架区内和/或替代的非人类残基之内被其他残基的替换而被进一步修饰，以改善并优化抗体特异性、亲和力和/或性能。总的来讲，人源化的抗体将包括大致上所有的至少一个、典型地两个或三个可变域，该可变域含有所有的或大致上所有的相应于非人类免疫球蛋白的CDR区域，而所有的或大致上所有的FR区域是那些人类免疫球蛋白的一致性序列(consensus sequence)。人源化抗体还可以包括免疫球蛋白的恒定区或恒定域(Fc)(典型地，人类免疫球蛋白的恒定区或恒定域)的至少一部分。美国专利No.5,225,539或No.5,639,641中描述了用于生成人源化抗体的方法的示例。
术语“人类抗体”的含义是人类产生的抗体，或用本领域已知的技术制得的具有对应于人类产生的抗体的氨基酸序列的抗体。人类抗体的该定义包括完整或全长的抗体、其片段和/或包括至少一个人类重链多肽和/或轻链多肽的抗体，诸如例如包括鼠类轻链多肽和人类重链多肽的抗体。
术语“嵌合抗体”表示这样的抗体——其中，免疫球蛋白分子的氨基酸序列衍生自两个或多个不同的来源(典型地，两个或多个不同的物种)。典型地，轻链和重链二者的可变区对应与衍生自一种哺乳动物物种(如，小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区，该可变区具有期望的特异性、亲和力和性能，同时恒定区与衍生自另一物种(通常是人类)的抗体中的序列同源，以避免在该另一物种里引发免疫反应。
“单克隆抗体”(mAb)表示单个抗原决定簇(或表位)的高度特异性识别和结合中所涉及的同源抗体群体。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的“多克隆抗体”相反。
此外，“单克隆抗体”表示以多种方式制作的这样的抗体，该方式包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达和转基因动物。
特别地，可以用杂交瘤方法(诸如那些由Kohler and Milstein(1975)Nature256:495描述的)来制备单克隆抗体。使用杂交瘤方法时，将小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物进行免疫，如上所述，以引发淋巴细胞产生将特异性结合免疫抗原的抗体。也可以在体外对淋巴细胞进行免疫。免疫之后，分离淋巴细胞，并用例如聚乙二醇使淋巴细胞与合适的骨髓瘤细胞系融合，以形成随后可以从未融合的淋巴瘤和骨髓瘤细胞中选离的杂交瘤细胞。然后可以将生产单克隆抗体的杂交瘤用标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986)在体外培养中进行增殖或者在体内作为在动物腹水瘤来进行增殖；上述单克隆抗体是如通过免疫沉淀、免疫印迹或通过体外结合试验(例如，放射性免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELIZA))而确定的特异性针对选定抗原的。然后，可以从培养基或腹水液中纯化单克隆抗体。
可替代地，可以用如美国专利No.4,816,567中描述的重组DNA方法来制造单克隆抗体。诸如通过使用对编码抗体重链和轻链的基因特异性扩增的寡核苷酸引物来进行的RT-PCR，从成熟的B细胞或杂交瘤中分离编码单克隆抗体的多核苷酸，并且该多核苷酸的序列使用常规方法来确定。然后将经分离的编码重链和轻链的多核苷酸克隆到合适的表达载体内；当将该表达载体转染入宿主细胞(诸如E.coli细胞、猿类COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)时，由宿主细胞产生单克隆抗体。而且，可以如描述从表达所期望的物种的CDR的噬菌体展示文库中分离所期望的物种的重组单克隆抗体或其抗原结合片段(McCafferty等人,1990,Nature,348:552-554；Clackson等人,1991,Nature,352:624-628；以及Marks等人,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)。
可以通过各种本领域已知的方法来生产多克隆抗体。例如，可以通过对诸如兔、小鼠、大鼠等的宿主动物注射抗原来进行免疫，以诱导含有特异性针对抗原的多克隆抗体的血清的生产。抗原可以包括天然的、合成的或表达的蛋白，或其衍生物(例如，片段)。取决于宿主物种，各种佐剂均可以被用于增加免疫反应；该佐剂包括但不限于弗氏(Freund’s)(完全和不完全)佐剂、矿物凝胶(诸如氢氧化铝)、表面活性物质(诸如溶血卵磷脂)、普朗尼克多元醇(pluronic polyols，聚醚多元醇)、聚阴离子、肽、油乳状液(oil emulsion)、钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanins)、二硝基苯酚以及潜在有用的人类佐剂(诸如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌)。这样的佐剂也是本领域众所周知的。可以从宿主的血清中来纯化抗体。
4.涉及CAR T细胞的组合物和方法
癌症免疫疗法涉及对患者的自身免疫细胞进行改造以识别并攻击患者的肿瘤——这是一种常被称作过继细胞转移(adoptive cell transfer，ACT)的方法。这样的方法至今已在临床试验中产生了有前景的结果，包括用于治疗淋巴瘤的那些结果。在ACT中，从患者自身的血液中收集的T细胞被基因改造为在其表面上产生被称作“嵌合抗原受体”或“CAR”的重组受体。CAR含有抗原结合域，该抗原结合域被设计为识别并结合患者的肿瘤细胞上的特异性细胞表面抗原。被改造的CAR T细胞在体外被扩增，并且然后被注入患者内。注入之后，T细胞在患者的身体里倍增，并且可以识别并杀死患者中表达细胞表面抗原的癌症细胞。存在若干正在进行中的CAR T细胞的临床试验，包括针对淋巴瘤的若干临床试验。若干淋巴瘤试验涉及使用表达被设计为结合抗原CD19的CAR(即，CD19特异性的CAR)的CART细胞——因为CD19常被表达在淋巴瘤细胞的表面上。另外还有利用CD20特异性的CAR T细胞、CD22特异性的CAR T细胞或CD30特异性的CAR T细胞的正在进行中的淋巴瘤试验。对于其他关于CAR T细胞疗法和临床试验(包括针对淋巴瘤的CD19-CAR T细胞疗法)的描述，见Brentjens,Riviere等人.2011,Brentjens,Davila等人.2013,Sadelain 2015,Jackson,Rafiq等人.2016,Ramos,Heslop等人.2016。这些参考文献中每一个的内容在此都通过引用其全部而被并入本文中。
本发明的若干实施方案涉及用于淋巴瘤治疗的CAR、CAR T细胞和CAR T细胞疗法/ACT。例如，在一些实施方案中，本发明提供了包括编码CAR的核苷酸序列和编码可溶性HVEM胞外域多肽的核苷酸序列二者的载体和核苷酸序列。类似地，在另外的实施方案中，本发明提供了编码CAR的核苷酸序列和编码结合HVEM或BTLA的抗体(诸如抗体片段)二者的载体和核苷酸序列。用这样的载体对T细胞进行转导会导致产生表达所期望的嵌合抗原受体并且还表达(并分泌)如本文描述的期望的活性剂(如，可溶性HVEM胞外域多肽、HVEM抗体或BTLA抗体)的CAR T细胞。在一些实施方案中，本发明提供表达CAR和可溶性HVEM胞外域多肽二者的CAR T细胞，无论该CAR T细胞是通过用本文描述的在同一个核酸分子内含有CAR序列和HVEM序列的经特定修饰的载体之一来进行转导的，还是通过用分开的编码CAR的核酸分子/载体和编码可溶性HVEM胞外域多肽的核酸分子/载体来进行转导的。类似地，在一些实施方案中，本发明提供表达CAR和HVEM抗体或BTLA抗体的CAR T细胞，无论该CAR T细胞是通过用本文描述的在同一个核酸分子内含有CAR序列和抗体序列特定修饰的载体之一来进行转导的，还是通过用分开的编码CAR的核酸分子/载体和编码抗体的核酸分子/载体来进行转导的。本发明还提供了一种利用这样的CAR T细胞的治疗方法。在这样的实施方案中，CAR可以是结合被表达在感兴趣的细胞(即，B细胞淋巴瘤细胞，包括BTLA+/hi B细胞淋巴瘤细胞)表面上的任何合适的细胞表面受体之一。例如，在一些实施方案中，CAR可以是CD19特异性的CAR、CD20特异性的CAR、CD22特异性的CAR、CD30特异性的CAR、Igk特异性的CAR、ROR1特异性的CAR，或者是结合任何其他合适的细胞表面受体的CAR。
制造和使用CAR和CAR T细胞的方法是本领域已知的，并且本发明的组合物和方法可以参考现有的关于CAR T细胞生成和使用的文献(包括那些教授如何生成和使用CD19特异性的CAR T细胞的文献)来制造和使用。例如，本文参考了以下的参考文献——这些参考文献的全部内容通过引用而被并入本文：(Brentjens,Santos等人.2007,Pegram,Purdon等人.2015)。本发明为目前的CAR T细胞方案(包括已知的CD19特异性的CAR T细胞方案)提供了某些改进。例如，本发明的组合物和方法可以被用来使得能够用从CAR T细胞分泌的可溶性HVEM胞外域多肽来进行B细胞淋巴瘤靶向治疗。图25提供了这一方法的示意图——其中示出了CD19特异性的CAR作为示例。类似地，本发明的组合物和方法可以被用以使得能够用从CAR T细胞分泌的抗HVEM抗体或抗BTLA抗体来进行B细胞淋巴瘤靶向治疗。这可以例如可以通过用编码抗HVEM抗体或抗BTLA抗体的序列替代图25示意性示出的可溶性HVEM胞外域多肽序列来实现。
在一种实施方案中，本发明提供了用于CAR T细胞生成的某些新颖的载体。在一种实施方案中，本发明提供了核酸分子，该核酸分子包括：(a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，和(b)编码可溶性HVEM胞外域多肽的核苷酸序列。在另一实施方案中，本发明提供了核酸分子，该核酸分子包括：(a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，和(b)编码抗HVEM抗体或抗BTLA抗体的核苷酸序列。在一些这样的实施方案中，核酸分子还可选地包括报告蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)。编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列可以是本领域已知的编码所需特异性CAR的任何合适序列。例如，在一种实施方案中，序列可以是来自编码CD19特异性的CAR的SFG-1928z的序列。这样的SFG-1928z载体是本领域已知的。参见，例如，WO2014134165的公开内容，其内容通过引用而被并入本文。但是，其他CD19特异性CAR的序列和具有不同特异性的CAR是本领域已知的，并且可以在本文中使用。编码可溶性HVEM胞外域多肽的核苷酸序列可以是编码可溶性HVEM胞外域多肽的任何核苷酸序列——如本文描述和限定的。编码抗HVEM抗体或抗BTLA抗体的核苷酸序列可以是任何合适的核苷酸序列——例如如本文进一步描述和限定的。在优选的实施方案中，分泌信号被包括在编码可溶性HVEM胞外域多肽的核苷酸序列或编码抗体的核苷酸序列的上游。可以改变编码CAR的核苷酸序列在核酸分子/载体中相对于编码可溶性HVEM胞外域多肽(或者抗HVEM抗体或抗BTLA抗体)的核苷酸序列的布置。图25提供了一种示例性的用于表达可溶性HVEM胞外域多肽的布置。但是，可以采用能够从同一个载体表达出CAR分子和可溶性HVEM胞外域多肽(或者抗HVEM抗体或抗BTLA抗体)二者的其他排列方式——例如用内部核糖体进入位点、蛋白酶切位点(proteolytic cleavage sites)或任何其他合适的手段。在一些实施方案中，如包括图25示出的，可溶性HVEM胞外域多肽最初被表达为GFP融合；并且GFP成分和HVEM成分然后被蛋白酶切——例如由包含一个P2A蛋白酶切/识别序列所导致。这使得GFP的表达能够被用作对可溶性HVEM胞外域多肽的表达进行监测的代理(surrogate)。在一些实施方案中，可以使用不同的表达报告物(reporter)/标记物(marker)来替代GFP。替代地，在另外的实施方案中，不需要使用表达报告物。
5.用于靶向递送的非基于CAR T细胞的组合物和方法
在一些实施方案中，本发明提供了某些用于将本文描述的活性剂(诸如可溶性HVEM胞外域多肽和抗HVEM抗体或抗BTLA抗体)靶向递送至淋巴瘤细胞的非基于CAR的组合物和方法。这样的组合物和方法涉及使用可以结合被表达在(如，受试者的肿瘤中的)淋巴瘤细胞上或附近的分子的适合的“靶向剂”。在一些这样的实施方案中，靶向剂可以是抗体，或者是抗体的抗原结合域。例如，在一些实施方案中，本发明提供了组合物，其包括(a)可溶性HVEM胞外域多肽(或抗HVEM抗体或抗BTLA抗体)和(b)特异性针对B细胞淋巴瘤细胞(例如，BTLA+淋巴瘤细胞)上的细胞表面抗原的抗体或其抗原结合域。在一些这样的实施方案中，组合物是融合蛋白，或者包括融合蛋白，其中该融合蛋白包括(a)可溶性HVEM胞外域多肽(或抗HVEM抗体或抗BTLA抗体)和(b)特异性针对B细胞淋巴瘤细胞(例如，BTLA+淋巴瘤细胞)上的细胞表面抗原的抗体或其抗原结合域。但是，在另外的实施方案中，组合物可以在诸如纳米颗粒中、脂质体中、聚合胶束中、基于脂蛋白的药物载体中、树形分子中或在任何合适的媒介物(vehicle)(通过该媒介物，组合物中的抗体成分可以被用于将活性剂特异性递送至期望的淋巴瘤细胞)中，分开地包括两种成分。在一些实施方案中，细胞表面抗原可以选自由CD19、CD20、CD22、CD30、BTLA、Igk和ROR1组成的组。在一些实施方案中，靶向剂可以是利妥昔单抗(CD20特异性抗体)或其抗原结合域。
6.治疗方法
本发明的若干实施方案涉及治疗方法。如本文所用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”表示受试者中B细胞淋巴瘤的一个或多个临床指标或症状得到可检测的改善的治疗措施。例如，这样的术语涵盖暂时性或永久性地改善、减轻、削减、改良、缓解、减少、抑制、预防或减缓至少一个临床指标或症状，防止其他临床指标或症状，减少或减缓一个或多个临床指标或症状的发展，引起一个或多个临床指标或症状的消退，等等。例如，根据本发明，“治疗”B细胞淋巴瘤包括但不限于以下：降低B细胞淋巴瘤(或B细胞淋巴瘤细胞)的生长速率；使B细胞淋巴瘤(或B细胞淋巴瘤细胞)生长停止；引起B细胞淋巴瘤(或B细胞淋巴瘤细胞)的消退；减小B细胞淋巴瘤(例如根据肿瘤体积或肿瘤重量来测量)的大小；降低B细胞淋巴瘤的级别；消除B细胞淋巴瘤(或B细胞淋巴瘤肿瘤细胞)；防止、延迟或减缓B细胞淋巴瘤肿瘤的复发(回弹)；改善与B细胞淋巴瘤有关的症状；改善B细胞淋巴瘤患者的生存时间；抑制或减少B细胞淋巴瘤的扩散(如，转移)；等等。类似地，“治疗”B细胞淋巴瘤可以包括但不限于：在患者的肿瘤中，减少B细胞受体的激活、降低分泌IL-21的滤泡辅助性T细胞的活性，和/或增加CD8+T细胞的活性。
在一些实施方案中，本文描述的治疗方法可以与用于治疗B细胞淋巴瘤的其他治疗方法组合进行，该用于治疗B细胞淋巴瘤的其他治疗方法包括但不限于：施用其他剂(包括但不限于DNA破坏剂、抗CD20抗体、利妥昔单抗、依鲁替尼、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和艾代拉利司)、外科手术方法(如，肿瘤切除)、放射治法、用化学治疗剂治疗、放射疗法、免疫疗法、过继细胞转移(ACT)、EphA7肿瘤抑制蛋白的靶向递送、用任何其他合适的方法进行治疗。类似地，在某些实施方案中，本文所提供的治疗方法可以与用以监测疾病状况/发展的方法(诸如活检方法、诊断方法(如，MRI方法或其他成像方法))一起采用。
6.1受试者
术语“受试者”、“个人”和“患者”——其可以在本文交换使用——意在表示对其而言诊断、预后或治疗是所需的任何受试者——优选地，哺乳动物受试者，并且甚至更优选地，人类受试者。哺乳动物受试者包括人类、家畜、农畜、体育动物(sports animals)和动物园动物，包括：如人类、非人类灵长类动物、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠等等。
在本发明的大多数实施方案中，受试者具有或被怀疑具有B细胞淋巴瘤。在一些这样的实施方案中，B细胞淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤(FL)。在其他实施方案中，B细胞淋巴瘤是弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
在一些实施方案中，受试者具有BTLA+(即，表达出可检测水平的BTLA)或BTLAhi(即，表达出高水平的BTLA)B细胞淋巴瘤，或者具有包括BTLA+或BTLAhi淋巴瘤细胞的B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，受试者具有非BTLA-的B细胞淋巴瘤，或者具有包括非BTLA-(即，不能表达出可检测水平的BTLA)的淋巴瘤细胞的B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，受试者具有HVEM-(即，不能表达出可检测水平的HVEM)或HVEMlo(即，表达出低水平的HVEM)或包括一个或多个HVEM突变(诸如抑制或防止HVEM的正常肿瘤抑制功能的突变、或与B细胞淋巴瘤患者中的结果不佳有关的突变)的B细胞淋巴瘤，或者受试者具有包括HVEM-或HVEMlo或包括一个或多个HVEM突变的淋巴瘤细胞的B细胞淋巴瘤。许多这样的HVEM突变是本领域已知的。
6.2施用途径
可以经由任何合适的途径(包括通过全身施用或通过局部施用)来给受试者施用本文所提供的各种不同的“活性剂”。“全身施用”的意思是施用活性剂以使其进入循环系统，例如，通过肠内途径、肠胃外途径、吸入途径或经皮途径。施用的肠内途径涉及胃肠道，并且包括但不限于口服递送、舌下递送和口腔含化递送。肠胃外施用途径涉及除胃肠道之外的途径，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、腹腔内、鞘内和皮下。优选地，使用肠胃外施用。甚至更优选地，使用静脉内的肠胃外施用。“局部施用”的意思是直接将药物组合物施用在期望其作用的地方(如，B细胞淋巴瘤的位置处或附近)；例如通过直接的肿瘤内注射。考虑到待用的特定活性剂的属性以及待治疗的特定B细胞淋巴瘤的属性来选择适当的施用途径是在本领域普通技术人员的技术之内。
6.3有效量
任何本文公开的活性剂、组合物或药物组合物的“有效量”是足以实现或有助于实现上文中“治疗”定义中所描述的一种或多种结果的量。任何个例中适当的“有效”量可以用本领域已知的标准技术(诸如剂量递增研究)来确定，并且可以考虑到这样的因素——诸如活性剂的属性、期望的施用途径、期望的给药频率、正在治疗的特定B细胞淋巴瘤、受试者、年龄、性别和/或体重等——来确定。进一步地，可以在将使用任何其他治疗的情况下，确定“有效量”。例如，在本文描述的活性剂将与其他治疗方法或其他剂一起施用或使用的情况下，那么其有效量可以小于没有使用这样的额外的治疗方法的情况下的有效量。
7.确定受试者是否是治疗候选者的方法
在一些实施方案中，本发明提供用于确定受试者是否是用任何本文所提供的组合物或方法进行治疗的候选者的方法。在一些实施方案中，这样的方法涉及确定或测量或检测受试者的B细胞淋巴瘤中或B细胞淋巴瘤细胞中HVEM表达或活性的减少或缺乏，或HVEM突变的存在；凭此，如果受试者的B细胞淋巴瘤或B细胞淋巴瘤细胞显示的HVEM表达或活性减少或缺乏，或存在HVEM突变，那么该受试者可以是治疗的候选者。类似地，在其他实施方案中，这样的方法涉及确定或测量或检测受试者的B细胞淋巴瘤或B细胞淋巴瘤细胞中BTLA的表达或BTLA的高水平表达；凭此，如果受试者的B细胞淋巴瘤或B细胞淋巴瘤细胞表达可检测水平的BTLA(即，BTLA+)、或表达出高水平的BTLA(即，BTLAhi)，那么受试者可以是治疗的候选者。进一步地，在另外的实施方案中，这样的方法涉及这两种方法的组合——即，确定或测量或检测受试者的B细胞淋巴瘤或B细胞淋巴瘤细胞中的(a)HVEM表达或活性的减少或缺乏或HVEM突变的存在，和(b)BTLA的表达或BTLA的高水平表达。
8.组合物
本发明的若干实施方案涉及组合物，例如药物组合物。术语“组合物”表示包括至少一种本文描述的“活性剂”和一种或多种额外组分(诸如稀释剂、缓冲剂、盐水(诸如磷酸盐缓冲盐水)、细胞培养基等等)的组合物。在这样的“组合物”为“药物组合物”的情况下，该一种或多种额外组分必须是适合递送至活体受试者的组分，诸如稀释剂、缓冲剂、盐水(诸如磷酸盐缓冲盐水)、载体、稳定剂、分散剂、悬浮剂等等。
术语“药物组合物”表示这样的制剂——该制剂处于允许活性成分的生物活性发挥作用的形式，并且该制剂不含有对将被施用组合物的受试者有不可接受的毒性的额外组分。药物组合物可以存在于很多剂型，例如片剂、胶囊、液体、溶液、软胶囊(soft-gel)、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂、酊剂、膜、粉末、水凝胶、软膏、糊剂、乳霜、洗液、凝胶、慕斯、泡沫、喷雾定型剂(lacquer，漆)、喷剂、气雾剂、吸入剂(inhaler)、喷雾剂(nebulizer)、眼用滴剂、贴剂(patch)、栓剂和/或灌肠剂。
药物组合物典型地包括药物学上可接受的载体，并且可以包括一种或多种缓冲剂(如，醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(如，聚山梨醇酯)、稳定剂(如，人类白蛋白)、防腐剂(如，苄醇)、渗透增强剂、增强吸生物利用度的吸收促进剂和/或其他常规的增溶剂或分散剂。剂型和辅料的选择取决于待递送的活性剂以及待治疗或预防的疾病或疾患，并且对于本领域普通技术人员来说是常规的。
实施例
将进一步在以下非限制性实施例中描述本发明。这些实施例中括号里的数字表示在该实施例部分后面的参考文献列表中被编号的参考文献。
实施例1
B细胞淋巴瘤中HVEM失活的作用，以及用可溶性HVEM多肽在体外和在体内治疗的 作用
该实施例表现的结果证明了HVEM-BTLA的相互作用在B细胞淋巴瘤中具有肿瘤抑制功能，并且，重要地是，证明了施用可溶性HVEM胞外域蛋白逆转这些作用，并且在体外阻滞了淋巴瘤的生长。
除非另有特别的说明，对实施例1或图1-14中对“solHVEM”的任何引用均表示SEQID NO.8的Leu39-Val202可溶性HVEM胞外域多肽(被SEQ ID NO.7的核苷酸序列所编码)。
B细胞淋巴瘤的发病机制牵涉了生发中心(GC)微环境。但是，尚不确定将淋巴瘤的基因发病机制与微环境相联系的确切机理。HVEM(TNFRSF14)受体基因是GC淋巴瘤中最频繁突变的其中之一。丢失HVEM导致增生信号的细胞自主激活，并且在体内驱动GC淋巴瘤的发展。此外，HVEM不足的淋巴瘤B细胞体现出一种肿瘤纵容微环境，其标志为恶化淋巴瘤基质激活和T滤泡辅助性(TFH)细胞的募集增加。大多数这样的变化是由HVEM和BTLA(B和T淋巴细胞衰减子)受体之间的抑制性细胞间(cell-cell，细胞-细胞)相互作用被破坏而引起的。重要地，现在已发现，外源性施用HVEM胞外域蛋白片段(solHVEM L39-V202或P37-V202)会在体内损坏增生信号、使细胞因子的生产正常化并且阻滞淋巴瘤的生长。因此，丢失HVEM通过对直接响应于外源性干预的B细胞及其微环境的双重作用来促进淋巴瘤的发展。
实施例1的介绍和背景
大多数淋巴瘤源自生发中心(GC)B细胞。这些细胞包括持续构成重大健康挑战的弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡性淋巴瘤(FL)。最近的基因组研究对淋巴瘤的发病机制获悉了重要的洞见，并且已经记载了复发的基因组损伤(Challa-Malladi等人,2011；Cheung等人,2010；Lohr等人,2012；Morin等人,2011；Okosun等人,2014；Oricchio等人,2011；Pasqualucci等人,2014)。此外，生发中心(GC)微环境被探讨为是淋巴瘤发展的关键因素(Ame-Thomas等人,2007；Amin等人,2015；Mourcin等人,2012；Pangault等人,2010)。但是，将GC微环境与GC淋巴瘤的出现相联系的确切机理是未知的。
GC微环境对B细胞功能的大多数方面都至关重要，并且有可能促进淋巴瘤发展和维持。GC是由多种造血和基质细胞类型组成的动态结构(Chang和Turley,2015；De Silva和Klein,2015)。例如，主要的淋巴基质细胞亚型——纤维母细胞性网状细胞(fibroblasticreticular cells)(FRC)和滤泡性树突状细胞(follicular dendritic cells)(FDC)——促进B细胞的募集、存活和分化(Aguzzi等人.,2014；Fletcher等人.,2015)。反过来，激活的B细胞生产刺激FRC和FDC的TNF家族细胞因子TNFα和LTa1b2(Roozendaal and Mebius,2011)。衍生于这些基质细胞的CXCL13是TFH细胞的主要的引诱剂(attractant)，其反过来通过CD40L和细胞因子IL-4和IL-21的分泌来支持B细胞(Crotty,2014)。值得注意地，滤泡性淋巴瘤(FL)B细胞保留了对GC微环境强烈的依赖性，这被认为是形成了淋巴瘤生成(lymphomagenesis)的纵容性小生境——该小生境是由于与恶性B细胞串扰(crosstalk)造成的(Ame-Thomas和Tarte,2014；Mourcin等人,2012；Rehm等人,2011)。
癌症特异性基因的改变可以为潜在的肿瘤生物学带来光明。例如，HVEM(疱疹病毒侵入介质；TNFRSF14)受体基因中的体细胞突变是GC淋巴瘤中最频繁的基因损伤之一，并且与预后不定性地相关(Cheung等人,2010；Launay等人,2012；Lohr等人,2012)。HVEM突变是如何确切地导致GC淋巴瘤生物学是未知的。
对T淋巴细胞中HVEM受体的研究告知了我们目前所知晓的受体功能。在T淋巴细胞中，HVEM致力于通过结合LIGHT或CD160受体而刺激细胞间相互作用，而HVEM与BTLA受体(B和T淋巴细胞衰减子)的结合引起抑制信号(Bjordahl等人,2013；Cai和Freeman,2009；Pasero等人,2012；Steinberg等人,2011)。HVEM及其伙伴受体(partner receptor)的表达受谱系限制。例如，正常的B细胞取决于其分化和激活阶段而不定性地表达HVEM和BTLA，但其缺少LIGHT和CD160；而滤泡辅助性T(TFH)细胞是以其高BTLA表达为特征的(M'Hidi等人,2009；Murphy等人,2006)。
本文所展现的研究用基因上和病理学上精确的小鼠模型调查了GC淋巴瘤生成中的HVEM的功能。进一步地，本文所展现的研究还证明HVEM受体的可溶性形式(solHVEMLeu39-Val202)可以对淋巴瘤中HVEM丢失的作用进行修复。
结果
除非另有特别的说明，对实施例1中对“solHVEM”的任何引用表示SEQ ID NO.8的Leu39-Val202可溶性HVEM胞外域多肽(被SEQ ID NO.7的核苷酸序列所编码)。
在多数人类FL中，HVEM和BTLA受体之间的相互作用缺失
在大量(n＝141)人类FL中，发现28％(n＝40)的样本中存在HVEM突变，并且这些样本中的三分之一(35％)是纯合突变(图1A-C)(Cheung等人,2010；Launay等人,2012；Lohr等人,2012；Ross等人,2007)。HVEM突变靶向受体的胞外域，并且包括错义突变(65％)、无义突变(32.5％)和移码突变(2.5％)。而且，HVEM位于染色体1p36缺失的最小化的共同区域——其是遍及于B细胞恶性肿瘤中普遍丢失的区域(Cheung等人,2010；Fitzgibbon等人,2007)。对两个独立系列——阵列CGH数据(MSKCC:n＝64(Oricchio等人,2011)；UNMC队列(cohort)：n＝198(Bouska等人,2014))——的荟萃分析(Meta-analysis)显示，34％的惰性FL样本(n＝262)和37％的转性FL(n＝67)发生了HVEM基因座(locus)丢失(图1D-F，图8A和8B)。GISTIC(癌症中显著靶标的基因组鉴定)分析表明惰性样本和转性样本中22-24％的这些损伤是纯合性丢失(图1E和图8A)。因此，基因组的证据表明在FL发展期间针对HVEM受体基因的强有力的筛选。
在本研究中，对人类FL中HVEM蛋白表达进行了调查。通过免疫组织化学，针对HVEM蛋白表达，对包括198个FL样本的组织微阵列(tissue microarry)进行了评估。当至少20％的肿瘤细胞显现出特异性染色时，样本被评分为HVEM阳性。用该评分底线(cut-off)，62个样本(31.3％)是HVEM阴性，而136个样本(68.7％)被归类为HVEM阳性(图1G，图8C)。这一比例与基因组的数据相一致，并且在HVEM突变或缺失的样本中，对于含有可用的基因组数据和蛋白数据的样本(n＝14)，确认了蛋白表达减少或没有蛋白表达(图8D)。
BTLA是已知的HVEM结合伙伴，并且是表达在B细胞上的唯一HVEM受体(Murphy等人,2006)。因此，遍及于淋巴瘤组织阵列对BTLA表达进行了评估。对于阳性BTLA评分(即，BTLA+)，需要肿瘤细胞显示出比反应性GC B细胞(反应性GC B细胞是弱阳性的，且被用作通用对照组(on-slide controls，载玻片上的对照组))更强的染色。使用针对BTLA的这一评分底线，102个样本是阴性的(51.2％)并且95个样本(48.2％)被评分为阳性(图1G，图8E)。总合来说，198个样本中的146个(74％)针对HVEM或BTLA都是阴性的。用卡方检测(chisquared test)对其关联性进行检测，并且发现存在显著的负关联性(互相排斥)——使得HVEM阳性肿瘤从几率上来讲比所预期的更有可能丢失BTLA(OR＝0.254；95％CI0.126-0.511；p<0.0001)(图1G-I，图8F和1G)。没有观察到BTLA的突变或缺失，且极有可能是被转录沉默了。在这一方面，已注意到BTLA表达是通过FL中的KMT2D(MLL2)甲基转移酶来控制的(Ortega-Molina等人,2015)。因此，在绝大多数人类FL中HVEM和BTLA受体之间的相互作用似乎被破坏了，表明这是一个潜在重要的肿瘤抑制通路。
HVEM在滤泡性淋巴瘤的小鼠模型中起到肿瘤抑制子的作用
为了阐明FL发展中HVEM失活的作用，使用了vavPBcl2模型，该模型概括了人类BCL2阳性FL的基因学和病理学的关键方面(Egle等人,2004；Oricchio等人,2011)。简言之，用表达抗HVEM的小发夹RNA(shRNAs)的逆转录病毒或空载体对照组来转导从胚胎肝脏分离的vavPBcl2造血祖细胞(HPC)。然后，这样的细胞被移植入致死辐射的小鼠中，并针对淋巴瘤发展对接受者进行监测(图2A)。与对照组(蓝色，n＝11)相比，HVEM的敲低(红色，n＝19)造成淋巴瘤发展的显著加速以及穿透性(penetrance)增加。相比于百分之九十的对照组动物在>100天保持无肿瘤，与其相比，仅10％的接收了shHVEM的动物在>100天保持无肿瘤(p<0.01)(图2B)。用第二个对抗HVEM的shRNA证实了这些结果(图9A)。也证实了HVEM mRNA的敲低，并且通过FACS观察到了HVEM表面表达减少(图2C和2D，图9B)。为了测试B细胞区室(compartment)中的敲低HVEM是否对淋巴瘤的发展负有责任，自对衍生的造血区室进行最初的HPC感染时，即对与报告GFP(GFP reporter)共表达的shHVEM的表达进行追踪。HPC的最初转导效率为～15％，并且发现仅在FAFCS分选的淋巴瘤B细胞上富集——其中超过80％表达了shHVEM和GFP(图2E)。因此，这些研究证明丢失HVEM导致B细胞的体内自主扩增和淋巴瘤发展。
对鼠类HVEM野生型和缺HVEM的淋巴瘤进行病理学分析显示出典型特征：GC衍生的FL。通过免疫组织化学检测和FACS分析发现了典型滤泡构造以及GC标记物PNA、BCL6和GL7的表达(图2F，图9C)。免疫组织化学进一步显示出缺HVEM的淋巴瘤中Ki67的染色增加，与增生的增加和潜伏期的减少相一致(图9D)。FACS分析显示出，所有的淋巴瘤都大致由小的B220+和CD19+B细胞组成，并且缺HVEM的肿瘤表现出适度减少的浸润性CD3+T细胞(图9E)。详尽深入的基于测序的B细胞受体(BCR)分析进一步揭示了寡克隆疾病和相关的库偏倚，伴随着体细胞超突变(SHM)造成的克隆内多样性(intraclonal diversity)。这可能反映了GC驱动的疾病的持续克隆进化(clonal evolution)(图10)。对信号分子进行的调研进一步表明了与B细胞受体通路(BCR)有关的信号分子激活和磷酸化，诸如与对照组淋巴瘤相比，SYK、BTK和ERK在缺HVEM的淋巴瘤中被激活(图2G)。
在人类FL样本中，注意到了HVEM和BTLA表达的相互排斥模式。T细胞的研究表明了HVEM和BTLA可以直接在同一细胞上顺式地相互作用(Cheung等人.,2009)。这些发现提出了这样的可能性：BTLA的丢失可以类似地促进淋巴瘤的发展(图1G-I)。因此，在如上文所述的同样的vavBcl2小鼠淋巴瘤模型中，测试了BTLA敲低的作用。简言之，BTLA敲低造成了淋巴瘤发展的显著地加速(载体n＝11；对于BTLA，n＝16；p<0.01)(图3A和3B)。肿瘤病理学揭示出了：滤泡性的结构、占主导地位的B220+和CD19+B细胞的组成(composition)和缺BTLA的淋巴瘤与对照组相比具有更高的Ki67，并且表达了GC标记PNA和BCL6(图3C-E)。与缺HVEM的淋巴瘤类似，通过免疫印迹观察到了促有丝分裂信号的激活(图3F)，诸如ERK磷酸化增加。因此，这些研究证明丢失HVEM或BTLA可以与Bcl2配合，并且在体内促进淋巴瘤的发展。
HVEM以细胞自主的和依赖于BTLA的方式来控制促有丝分裂信号
HVEM和BTLA的丢失引起鼠类淋巴瘤中BCR的激活(图2G和3F)。BCR信号的激活可能是与BTLA结合CD79的能力有关的直接效果，或者替代地，BCR信号可能是继发于局部细胞因子水平改变(Vendel等人,2009)。为了直接测试HVEM是否对于信号传递具有直接的、细胞自主的且依赖于BTLA的作用，用保持了HVEM结合性能的纯化可溶性HVEM胞外域蛋白片段(solHVEM：Leu39-Val202)来处理经分离的淋巴瘤B细胞(Cheung等人,2005；del Rio等人,2010)。简言之，在存在或不存在solHVEM(10μg/ml)或药物学BTK抑制剂依鲁替尼(10nM)的情况下，用IgM来刺激BCL1小鼠淋巴瘤细胞中的BCR信号传递通路，并且通过流式细胞仪对BTK的磷酸化进行了测量以作为BCR通路激活的指标。与药物学抑制剂类似，solHVEM的添加阻滞了BTK的磷酸化和激活(图4A)。solHVEM阻滞BCR信号传导的能力需要BTLA，并且BTLA的敲低防止了BCL1细胞中对BTK的抑制(图4B)。在原发性的人类FL B细胞中作出了类似的观察。通过FACS对遍及于十个纯化的人类FL B细胞样本的BTLA表达进行了分析，并且将样本分为BTLAhi组和BTLAlo组(图4C)。在存在或不存在solHVEM(10μg/ml)的情况下，用抗IgG刺激B细胞；并且在BTLAhi细胞中观察到了SYK和ERK的抑制，而solHVEM在BTLAlo细胞中几乎没有作用(图4D，图11)。对所有十个原发性人类FL B细胞进行累积分析证实了solHVEM阻滞SYK磷酸化的能力和BTLA表面表达之间显著的相关性(r＝0.697，p＝0.03)(图4E)。
缺HVEM的淋巴瘤具有肿瘤基质的过度激活
在人类FL中，恶性B细胞与那些为恶性B细胞提供支持的淋巴瘤基质是混合的(Mourcin等人,2012)。这些非造血的淋巴瘤成分尤其包括CD21L阳性(pos)滤泡性树突状细胞(FDC)和转谷氨酰胺酶阳性(transglutaminasepos)纤维母细胞性网状细胞(FRC)(图12A)。在小鼠淋巴瘤中，我们观察到，在不存在任何免疫作用的情况下的肿瘤基质的激活，并且这在缺HVEM的淋巴瘤中显著地更加明显(图5A)。对显微图像进行量化分析显示出，与对照组的肿瘤相比，在缺HVEM的肿瘤的滤泡内CD21/CD35pos FDC网络的显著(p<0.05)增加(对于每组而言，n＝3)(图5B)。类似地，在缺HVEM的淋巴瘤中，滤泡周围区域的I型胶原密度的显著(p<0.05)增加表明了在ERTR7pos FRC网络的细胞扩增不存在的情况下的FRC激活。(图5B，图12B和12C)。与这样的显微观察相一致的是，与对照组相比，在缺HVEM的肿瘤中发现了衍生于FDC和FRC的CXCL13和CCL19的表达的显著升高(n＝5,p<0.01)(Mueller andGermain,2009)(图5D和5E)。
TNF家族细胞因子TNFa和LAa和LTb是基质FRC和FDC的必需且非冗余的激活剂(Roozendaal and Mebius,2011)。因此，对鼠类淋巴瘤中这些细胞因子的表达进行了调查。与对照组淋巴瘤相比，在由缺HVEM的淋巴瘤纯化得到的B220+B细胞中，观察到了所有三种因子的产生都显著地增加(图5F，n＝5，p<0.05)。而且，用HVEM胞外域(solHVEM；10μg/ml)来治疗两种不同的小鼠淋巴瘤系(BCL1和Myc/Bcl2)都很快降低了LTa和LTb的表达，但不会减少TNFa(图5G-I，图12D-F)。因此，缺HVEM的淋巴瘤B细胞显示出诱导基质的TNF家族细胞因子的异常产生。
缺HVEM的淋巴瘤中增加的滤泡辅助性T(TFH)细胞
衍生于基质的细胞因子CXCL13对于CSCR5pos滤泡辅助性T细胞而言是主要的化学引诱剂(chemo-attractant)(Crotty,2014)。与缺HVEM的淋巴瘤中增加的CXCL13产生相一致(图5D)的是，与对照肿瘤相比，在缺HVEM的肿瘤中观察到了TFH细胞的数量(abundance)的显著增加(对于每组而言，n＝3；p<0.01)(图6A和6B)。TFH细胞数量的该增加与衍生于TFH的细胞因子的表达升高有关联。具体地，在从缺HVEM纯化的CD3+T细胞比对对照组淋巴瘤的FACS中，观察到了IL21、IL4和基质激活细胞因子TNFa、LTa和LTb的表达增加(对于每种基因型，n＝5；p<0.01)(图6C-6E)。进一步地，从缺HVEM淋巴瘤纯化的淋巴瘤B细胞的FACS上观察到，由TFH细胞产生的IL21和IL4增加，这与IL21受体和IL4受体的表达升高相符合(p<0.01)(图13A和13B)。人类TFH细胞被表征为高水平的BTLA受体表达(图13C)，于是进行了实验来测试HVEM是否直接影响这些肿瘤浸润性T细胞。为了测试HVEM在TFH细胞上的直接作用，纯化的人类TFH细胞被分离，并且像之前一样，在存在或不存在抗CD3和抗CD28刺激的情况下，用solHVEM进行治疗。solHVEM不会影响TFH细胞的数量或生存力，并且观察到了LTa和LTb的表达减少，而没有观察到TNFa、IL21或CXCL13的表达减少(图6F-H，图13D-F)。因此，缺HVEM的淋巴瘤募集TFH细胞数量增加——其导致基质激活并通过生产IL4和IL21来支持B细胞生长。
HVEM胞外域蛋白与淋巴瘤的体外和体内生长对抗
本文证明了，solHVEM蛋白可以以依赖于BTLA的方式来抑制BCR通路的激活，并且逆转淋巴瘤B细胞和TFH细胞中至少一部分异常的细胞因子生产。基于这样的发现，进行了实验以测试solHVEM是否会具有任何对抗淋巴瘤的单一的剂活性。首先，遍及于人类和小鼠淋巴瘤(大多数是DLBCL)细胞系的组(panel)，对BTLA受体进行表征。与人类FL样本和原发性FL B细胞中的发现相一致(图1和图4)，发现细胞系分为BTLAhi组(DOHH2、SU-DHL6、鼠类MYC/BCL2)和BTLAlo组(Granta、Su-DHLIO)(图14C)。solHVEM(10μg/ml)容易地阻滞DOHH2细胞中的BTK、SYK和ERK激活，其中该DOHH2细胞是BTLAhi的并且具有HVEM的纯合性缺失(未示出)(图7A-7C——用SolHVEM Pro37-Val202生成的图7A和7B的数据，即，SEQ ID NO.6)。遍及于整个组，solHVEM在所有BTLAhi淋巴瘤细胞中造成了显著的生长抑制，而BTLAlo细胞显示出整体上较高的基线生长速率并且不被solHVEM所影响(图7D)。接下来，进行了实验以测试solHVEM是否在体内对已确定的BTLAhi淋巴瘤具有任何作用。简言之，将表达BTLA(BTLAhi)的侵犯性(aggresive)MYC/BCL2双阳性鼠类淋巴瘤细胞移植入J:Nu裸小鼠的侧腹，并且用20μg的solHVEM或赋形剂(PBS)来治疗小鼠，每三天一次总共四次直到植入的肿瘤一旦达到50mm3的体积。用solHVEM蛋白进行的治疗防止了任何进一步的肿瘤生长，而用赋形剂治疗的肿瘤快速地扩增(对于赋形剂和solHVEM，n＝4；p<0.01)(图7E和7F，图14D和14E)。solHVEM的作用不仅仅是抑制细胞生长的，并且TUNEL染色显示出大量的凋亡，并且免疫印迹表明了ERK在体内被抑制(图7G和7H)。因此，solHVEM在体内针对淋巴瘤具有显著的单一剂活性。用不同的可溶性HVEM分子(由细胞外区域从氨基酸Pro37至Val202(SEQ ID NO.6)组成)在体外和在体内二者皆获得了类似的结果。实施例2中总结了这样的结果。
讨论
淋巴瘤中HVEM-BTLA肿瘤抑制子轴线的双重功能
GC是大多数人类B细胞淋巴瘤的起源，并且本文所展现的数据为其发病机制提供了新的洞见。现在已示出，HVEM-BTLA相互作用在75％的GC B细胞淋巴瘤中被破坏——表明了其对于淋巴瘤发展是关键障碍。HVEM受体基因在淋巴瘤中是最惯常的基因靶标之一；并且，体细胞突变和染色体缺失导致大部分的GC淋巴瘤(包括FL和DLBCL)完全失活。BTLA是表达于B细胞中的唯一的与HVEM相互作用的受体，并且保留了野生型HVEM的淋巴瘤可能将BTLA受体基因的表达沉默。然而，BTLA不是突变或缺失的靶标。反倒BTLA是KMT2D(MLL2)组蛋白甲基转移酶的靶标，并且淋巴瘤中的KMT2D失活可能促进BTLA表达减少(Ortega-Molina等人,2015)。
HVEM的丢失对淋巴瘤B细胞具有双重作用，并且还重塑了局部微环境。首先，HVEM的丢失以细胞自主且依赖于BTLA的方式刺激BCR信号传递和B细胞生长。抑制的BTLA受体具有两个ITIM结构域，其可以与B细胞受体信号分子(CD79，SHP1/2)相互作用(Gavrieli等人,2003；Vendel等人,2009；Watanabe等人,2003)。通过细胞表面HVEM或可溶性HVEM对BTLA的刺激引起BCR信号分子的抑制，并且阻滞了淋巴瘤细胞增生。在T细胞中，已示出这一相互作用在同一细胞上顺式发生(Cheung等人,2009)。B细胞中类似的顺式相互作用引起细胞自主的生长优势，并且很可能是驱动HVEM基因失活的关键因素。
除了HVEM在B细胞生长上的细胞自主作用之外，HVEM还是淋巴瘤小生境的关键驱动者。缺HVEM的B淋巴瘤会产生增加量的TNF家族细胞因子(TNFa、LTa、LTb)，这些细胞因子是淋巴瘤基质细胞(诸如FDC和FRC)的关键激活剂(Ame-Thomas等人,2007；Guilloton等人,2012；Roozendaal和Mebius,2011)。缺HVEM的小鼠淋巴瘤中的被激活的淋巴瘤基质与见于人类FL中的异常基质激活十分相像(Mourcin等人,2012)。人类FL细胞依赖于其基质(该基质支撑FL B细胞)，这至少部分是通过增加的CCL19和CXCL13介导的对生产IL4、IL21和CD40L的TFH细胞的募集。(Ame-Thomas等人,2015{Pangault,2010#1807；Ame-Thomas等人,2012)。HVEM缺乏足以在细胞因子的生产中和细胞组合物中引发这些确切的变化，这些变化一起在体内导致纵容淋巴瘤的小生境。
HVEM通过BTLA相互作用产生了直接作用，并且还产生了继发于细胞因子生产改变的间接作用。例如，淋巴基质细胞不表达BTLA(未示出)，并且对淋巴基质的作用大多数是继发于TNF家族细胞因子的产生增加。另一方面，BTLA在TFH细胞中以非常高的水平存在着。因此，在本研究中注意到，TFH细胞既经历了因CXCL13增加而介导的募集，又经历了TFH细胞上HVEM的直接作用。类似地，HVEM在淋巴瘤B细胞上直接地与BTLA衔结，并且此外衍生于TFH的诸如IL4和IL21的细胞因子为B细胞的生长提供了进一步的支持。HVEM可能具有额外的直接作用和继发作用。本文所展现的结果显示出，HVEM的丢失破坏了控制B细胞生长并维持GC环境平衡的至关重要的节点。
修复HVEM-BTLA相互作用以用于治疗
HVEM在FL和DLBCL中是突变最频繁基因之一。因此，为缺HVEM的淋巴瘤量身订制的治疗策略将会高度地有益。值得注意地，肿瘤抑制性HVEM和BTLA受体之间的相互作用发生在细胞表面，并因此可以直接可及(accessible)。在本研究中，可溶性HVEM胞外域能够结合BTLA，并在体内BCR信号传递、细胞因子产生和肿瘤生长上诱导显著的单一的剂作用。solHVEM的这样的治疗作用依赖于BTLA的表达，表明了可能需要替代策略来治疗缺BTLA的淋巴瘤，并提示BTLA表达可以作为solHVEM反应的预报物。本文所展现的结果为旨在(至少部分地)修复GC淋巴瘤中HVEM的肿瘤抑制性功能的治疗策略提供了概念验证(proof-of-concept)。增强的基于HVEM或BTLA的激活抗体的配体，和改善的针对肿瘤特异性的HVEM递送的赋形剂，也可以在GC淋巴瘤中产生肿瘤抑制性功能的作用。
材料和方法
统计方法
针对细胞类型之间的比较，或者小鼠基因型之间的比较的样本量均遵循Mead的推荐(Festing,2002)。根据其预先确定的类型(即，小鼠基因型)，将样本分配至其实验组，并因此没有随机性。对于实验组，不对调查者使用盲法。在实验(其数据提供在图2B和3A中)中，仅考虑了发展出淋巴瘤的小鼠；没有发展出淋巴瘤的小鼠被删除并在Kaplan-Meier曲线中用记号(tick，十字叉)表明出来。从独立的生物复制品中获取了量化的PCR数据(在对应的图解中标明了n值)。在绝大多数数据中证实了正态分布和等方差，并且因此所有样本都被假定为具有正态性和等方差。用Student t检验(双尾，非配对)来估算统计学上的显著性。用Kaplan-Meier曲线来体现小鼠实验中的存活，并且用对数秩检验(log-rank test)来估算显著性。用卡方检验(Chi-square test)来针对人类FL组织活检中HVEM和BTLA表达之间的相关性分析。
FL中HVEM的外显子测序
如先前所描述的(Li等人,2014；Yildiz等人,2015)，对案例进行了分析。简言之，用Primer 3程序(http://primer3.ut.ee/)，并用所描述的直接测序而产生的序列信息，设计了对HVEM的所有编码外显子序列和相邻的内含子序列进行扩增和测序的引物。用来自分选细胞的未扩增的衍生于淋巴瘤细胞的DNA和配对的衍生于CD3细胞的DNA作为模板，证实了突变是体细胞获得的。
HVEM的深度覆盖大规模平行再测序
用定制的多重引物面板(凯杰公司(Qiagen)的基因读板)扩增了HVEM的所有编码外显子。将PCT产物汇集，并用有条形码的适配器(barcoded adapters)来制备了测序文库。在HiSeq2000测序仪上完成了测序。用自定义的算法对序列变体进行了生物信息学命名。将Fastq文档上传至凯杰公司的GeneRead数据门户(http://ngsdataanalysis.sabiosciences.com)以从读取中对引物的区域进行修剪，并且用bowtie26来与人类基因组(build hgl9)进行了比对。从凯杰公司的门户中单独地下载了比对的bam文档，并将bam文档递交到了VarScan(2.3.6)以用默认参数进行变体调用(variantcalling)。使用了SnpEff(3.4B)，以用基因名字和对氨基酸序列预测的影响来对变体进行注释；使用了dbNSFP(2.1)，以基于标准的工具(Sift,Polyphen,Mutation Taster)来对预测的功能性影响进行了注释。将1000基因组2期中发现的变体排除在外。使用了由UMBioinformatics Core研发的自定义工具Jacquard以将所有样本VCFs按照样本组合为单个的变体矩阵。在sock T和配对的N DNA中，用Sanger测序对确证了具有VAF>15％的所有序列变体。
阵列比较基因组杂交/Gistic分析
如先前所描述，对来自新鲜冷冻的或OCT包埋的组织的DNA进行了分离和处理(Bouska等人,2014；Oricchio等人,201 1,Bouska,2014#43)。简单地说，根据安捷伦科技(Agilent Technologies)公司所实行的规程完成了标记和杂交。可以在GEO上登记号GSE40989下获得数据。如(Bouska等人,2014)所描述的，用基因芯片人类图谱250K Nsp SNP阵列(GeneChip Human Mapping 250K Nsp SNP array)(Affymetrix)来生成来自由197个滤泡性淋巴瘤患者组成的第二数据组(UNMC数据组)的拷贝数数据。用执行GISTIC运算法则的Gistic 2.0R包(Beroukhim等人,2010)来鉴定显著扩增和缺失的区域。在每个数据组生产的分段的拷贝数数据上，用来自Bioconductor的DNAcopy R包运行了GISTIC(Olshen等人,2004)。
FL的小鼠模型
使用了vavPBcl2小鼠模型，该小鼠模型适用于对逆转录病毒转导的HPC进行过继转移(见Egle等人,2004和Wendel等人,2004)。简单地说，在胚胎第14.5天(E14.5)，将vavPBcl2转基因胚胎肝脏细胞从vavPBcl2杂合性动物中分离。在特殊适用的生长基中，将HPC在体外生长了4天，并被用逆转录病毒转导了控制感兴趣的shRNAs的表达的MSCV载体。将HPC移植入致死辐射的野生型接受者，并且通过触诊(palpation)对疾病的始发进行每周一次的监测。对于统计学上的显著性，按照Kaplan-Meier方式用对数秩(Mantel-Cox)检验对数据进行了分析。
免疫组织化学方法和TMA方法
将免疫组织化学检测(IHC)应用在组织微阵列(TMA)上，该TMA涵盖来自186个诊断有FL的患者的199个福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)组织试样的1.5mm的复制的核心(duplicate cores)(Kridel等人,2015)。切下4μm的切片，并且在Ventana BenchMark XT平台上(Ventana，AZ)用抗HVEM的小鼠单克隆抗体(稀释1:50；克隆体2G6-2C7；亚诺法公司，沃尔纳特市，加利福尼亚州)和抗CD272/BTLA的兔多克隆抗体(稀释1:100；Epitomics公司，产品序列号#S2379；多伦多，安大略省)进行了IHC。由两个血液病理学家对载玻片上的阳性肿瘤细胞(10％的增量)和染色强度(0＝阴性，1＝弱，2＝中，3＝强)进行了评价。用连接至Nikon Eclipse E600显微镜的Nikon DS-Fi照相机获取了代表性的图像。收集了脾以进行组织学和免疫化学分析。如先前所描述，用HE、PNA、BCL6、TUNEL、Ki67对切片进行了染色(Oricchio等人,2011)。用Metamorph软件对Ki67阳性细胞进行了量化。
FL小鼠模型上的流式细胞术
在BD LSR Fortessa(Becton Dickinson公司，富兰克林湖，新泽西州)上对机械分离后获取的细胞悬浮液进行了流式细胞分析。如描述的，对每种基因型的代表性肿瘤的肿瘤细胞悬浮液进行了染色(Wendel等人,2004)。以下用于染色的抗体是：从BD Biosciences公司获得的：CD8(克隆体RA3-6B2)、CD4(克隆体1D3)、FAS(克隆体Jo2)，T和B细胞激活抗原(GL7)、IgG(A85-1)、IgM(R6-60.2)、CD3(克隆体17A2)、CXCR5(克隆体RF8B2)；或从eBiosciencees公司获得：PD-1(克隆体JH3)、CD44(克隆体IM7)、CD62L(克隆体MEL14)；或从Biolegend公司获得：HVEM(克隆体HMHV-1B18)、BTLA(克隆体6A6)。
从FL小鼠模型中对B和T细胞进行纯化和分析
用微珠细胞分离(bead cell separation)从小鼠的脾中分离了B和T细胞。用PanT细胞分离试剂盒或B细胞分离试剂盒(Miltenyl Biotec)对全细胞溶解产物进行了分离，并且分离遵循制造商的说明指示。用凯杰公司的RNA提取试剂盒，从肿瘤中、分选的T细胞中和分选的B细胞中提取了总RNA。用M-MulV逆转录酶(New England BioLabs公司)在1μg的总RNA上进行了逆转录。在ABI Prism 7000序列检测系统中(Applied Biosystems公司)，用TaqMan通用混合液(TaqMan Universal master mix)，通过如(Mavrakis等人,2008)描述的ΔΔCt方法进行了qRT-PCR分析。对以下使用了Applied Biosystems公司的Taqman基因表达试验(Tawman Gene Expression assay)：Gusb、IL-21、IL-4、IL-21ra、IL-4ra、HVEM、BTLA、p21和CXCL13。
基质细胞上的免疫组织荧光检测
将小鼠脾和人类淋巴结急冻在OCT中(Tissue-Tek OCT化合物)。在室温下将二十微米的切片在4％的PFA中固定15分钟。用封闭液(PBS，10％的BSA、10％的驴血清、0.1％的皂素)将切片孵育1小时，然后在4℃潮湿室中与以下初级抗体培育过夜：针对小鼠脾，用CD21/CD35(大鼠IgG2b，稀释1/50，BD Biosciences公司)和I型胶原(兔多克隆抗体，稀释1/100，Abcam公司)；针对人类淋巴结，用CD21L(小鼠IgM，稀释1/100，Dako公司)、转谷氨酰胺酶-2(小鼠IgG1，稀释1/50，Abcam公司)和CD20(多克隆抗体兔，稀释1/50，Abacam公司)。洗涤之后，载玻片与对应的二级抗体(Jackson ImmunoResearch公司)一起孵育，并最终将载玻片安放在了含有SytoxBlue的Mowiol抗褪色试剂中(1/500，英杰公司(Invitrogen))，并通过SP8上的共聚焦显微镜进行了分析(Leica Microsystems公司)。用ImageJ软件进行了图像分析。
人类细胞样本
在机构审查委员会核准和知情同意的程序下招募了受试者。样本包括：从有滤泡性淋巴瘤(FL)的患者中获取的淋巴结(LN)，和从经历了常规扁桃体切除术的孩童中收集的扁桃体。将组织切成片，并用注射器和针头进行冲洗。如描述的，用FACSAria(BectonDickinson公司)将扁桃体TFH分选为CD3posCD4posCXCR5hiICOShiCD25neg细胞，其纯度高于98％(Mourcin等人,2012){Pangault,2010#2203}。用B细胞分离试剂盒II(MiltenyiBiotech公司)对原发性FL B细胞进行纯化。用于染色的抗体是：Miltenyi CD3(克隆体BW264/56)、Beckman Coulter CD4(克隆体13B8.2)、eBiosciences(克隆体J105)，和BDBiosciences CD25(克隆体M-A251)、CXCR5(RF8B2)和BTLA(克隆体J168-540)。
TFH刺激
在solHVEM(10μg/ml)存在或不存在的情况下，在含有或不含有抗CD3(0.6μg/ml)和抗CD28(0.6μg/ml，Pelicluster Sanquin公司)MAbs的IMDM 10％FCS中对经纯化的TFH进行培养。培养3天后，通过流式细胞术，用算珠(Flow Count，Beckman Coulter公司)和Topro-3染色(Invitrogen公司)对活TFH的数量进行了估测。根据制造商的说明指示，通过ELISA(R&D Systems公司)对培养上清液中的CXCL13进行了量化。
对人类FL中BCR的信号传递进行分析
在含有或不含有solHVEM(10μg/ml)的H2O2(1mM)存在下，用FITC缀合的羊抗人类IgG(英杰，10mg/mL)刺激经纯化的IgGpos FL B细胞。通过在室温下以4％的最终浓度添加PFA 15分钟，将反应停止。在用PBS-1％BSA进行洗涤和再水化之前，用80％的甲醇在-20℃黑暗中对经固定的细胞进行了20分钟的透化处理。用Alexa 647缀合的抗pSyk(克隆体17A/p-ZAP70)、抗pBLNK(克隆体j117-1278)或抗pERK1/2(克隆体20A，BD Biosciences公司)对磷蛋白激活进行了量化，并用抗IgG FITC Ab和PE缀合的抗kappa Ab(Southern Biotech公司)在表达克隆的门控(gated)重链和轻链的B细胞上对磷蛋白的激活进行了分析。
小鼠细胞中磷酸化流式细胞术
对于磷酸化BTK的染色、磷酸化Syk的染色，在37℃下用5μg/ml的sHVEM(R&DSystems)或10μg/ml的依鲁替尼(ChemieTek公司的PCI-32765)对细胞进行了60分钟的预处理。通过对细胞直接添加等体积的甲醛以将细胞固定。在室温下将细胞孵育10分钟，在PBS中洗涤2次，并且将残余的细胞在1mL的冰冷甲醇中(100％)冰上透化了30分钟。然后将细胞洗涤了两次，并用磷酸化BTK(Bd Biosciences公司，克隆体N35-88)和磷酸化Syk(BdBiosciences公司，克隆体17A/P-Zap70)进行了染色，并在BD LSRFortessa上进行了分析。
VDJ区域的测序
从潜在的肿瘤淋巴组织中制备了RNA，并从正常的小鼠脾中制备了RNA作为对照组。通过下一代方法(next generation method)，对从μ重链转录本表达的VDJ区域进行了测序。这一策略联合了5'RACE PCR、焦磷酸测序和精准的库分析(用IMGT/High-V-QuestmRNA和IMGT上可用的相关工具(the International ImMunoGeneTics informationwebsite(www.imgt.org))对最频繁的克隆型进行量化)。从逆向的引物开始进行RACE-PCR，该逆向的引物在μCH1外显子内进行杂交。
细胞培养和细胞增生试验
淋巴瘤细胞系DoHH2、Ly-10、Granta、Su-DHL-6被保持在含有10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI 1640中。小鼠淋巴瘤细胞系myc-bcl2被保持在含有10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的IMDM-DMEM(50:50)中。将细胞系以5x105/mL被接种，并用5μg/ml的sHVEM来处理。24小时后，在治疗后用血球计对细胞数量进行了总共72小时的计数。
体内生长和治疗的研究
如先前所描述的，进行了移植研究和治疗研究(Schatz等人,2011)。总的来说，将一百万个与基质胶(BD)联合的myc-bcl2小鼠淋巴瘤细胞皮下注射入裸小鼠J:Nu(Foxn1nu/Foxn1 nu)的右侧腹和左侧腹。一旦肿瘤达到75mm3，通过用稀释在PBS中的20μg sHVEM(右侧腹)或用赋形剂对照组(左侧腹)，对小鼠进行每三天一次的肿瘤内注射治疗。每三天对肿瘤大小进行了测量和记录。在动物牺牲和肿瘤切除后，对肿瘤称重。
免疫印迹
如先前描述的，用全细胞溶解产物或上清液进行了免疫印迹(Wendel等人,2004)。简言之，将30μg的蛋白/样本溶解在SDS-PAGE凝胶上，并转移至Immobilon-P膜上(Millipore公司)。抗体是针对：pSyk(Cell Signaling Technologies公司，#2712)、Syk(Cell Signaling Technologies公司，#2710)、pBTK(Cell Signaling Technologies公司，#5082)、BTK(Cell Signaling Technologies公司，#3533)、pERK(Cell SignalingTechnologies公司，#9102)、ERK(Cell Signaling Technologies公司，#4370)和微管蛋白(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))。用升高的化学发光进行了检测(ECL；GEHealthcare)。
实施例2
用额外的可溶性HVEM多肽治疗的体外作用和体内作用
以上实施例1中描述的若干实验涉及了使用L39-V202可溶性HVEM多肽(具有SEQID NO.8所提供的序列，其由全长HVEM氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的氨基酸L39-V202组成)。用其他可溶性HVEM蛋白序列也获得了具有可比性的结果。用Pro37-Val202可溶性HVEM多肽(由SEQ ID NO.5的核苷酸序列编码，并且具有SEQ ID NO.6中所提供的氨基酸序列；SEQ IDNO.6是由SEQ ID NO.2全长HVEM氨基酸序列的氨基酸Pro37-Val202组成的)获得了本实施例所展现的结果。除非另有特别的说明，实施例2或图15-24中的“solHVEM”的任何引用表示SEQ ID NO.6的Pro37-Val202可溶性HVEM胞外域多肽(由SEQ ID NO.5的核苷酸序列编码)。
一些实验是用DOHH2细胞(一种表达BTLA的细胞系)来进行的。单独地用抗免疫球蛋白G(抗IgG)刺激了人类DOHH2细胞，或联同sTNFRSF14(Pro37-Val202)一起，或联同BTK依鲁替尼一起。抗IgG的治疗造成了BTK的依鲁替尼敏感性激活(磷酸化)；在对细胞进行刺激之前，通过将DOHH2细胞与sTNFRSF14一起预培育一个小时，有效地阻滞了该BTK的激活(图15A-B)。该抑制作用也见于BTK通路中BTK的上游——在用抗IgG激活前，当用sTNFRSF14预处理时，磷酸化的SYK水平也被抑制了(图16A-B)。
进行了实验来确定信号传递在体外的该抑制是否见于其他细胞系中。将表达高量BTLA的细胞系或不表达BTLA的细胞系暴露于5μg的sTNFRSF14，并且在三天的时间段中对细胞生长进行监测。引人注目地，观察到在生长上最大作用的细胞系是那些表达最高水平的BTLA(Myc-Bcl2细胞系)的细胞系，而在不表达BTLA的细胞系中，sTNFRSF14没有抑制细胞生长(图17)。在体外的治疗造成了细胞存活率适度地减少，但在表达高水平BTLA的细胞系中，明显降低了ERK的磷酸化水平(图18，图19)。
为了研究sTNFRSF14多肽在体内的作用，将五(5)百万myc-bcl2细胞被注射进入了裸小鼠的右侧腹和左侧腹二者中。在形成可触知的肿瘤后，开始了治疗。该治疗包括在右侧腹上用20μg的sTNFRSF14对小鼠进行肿瘤内的注射或在左侧腹上用赋形剂对小鼠进行肿瘤内的注射。在用sTNFRSF14注射的肿瘤中，观察到了显著的单一剂作用伴随着几乎完全的生长延迟(图20)。当与sTNFRSF14治疗的肿瘤相比时，用赋形剂治疗的肿瘤显著地生长更快并且大小偏大(图21)。在治疗开始后11天，用sTNFRSF14治疗的肿瘤的平均重量仅0.75克，而用赋形剂治疗的重量为平均3克(图22)。与赋形剂治疗的肿瘤相比，用sTNFRSF14治疗的肿瘤呈现出减少的磷酸化ERK水平(图23)。用sTNFRSF14治疗的肿瘤还呈现出较高水平的TUNEL染色和减少的增生标记物Ki67(图24)。合起来，这些结果进一步证实了，例如在Bcl2阳性的滤泡性淋巴瘤中，可以将HVEM用作治疗靶标，以及将可溶性HVEM多肽用作治疗剂。
实施例3
用CAR T细胞将可溶性HVEM多肽靶向递送至肿瘤
最近发现，CD19+B细胞恶性肿瘤对免疫调节治疗很敏感，该免疫调节治疗包括对改造的嵌合抗原受体(CAR)T细胞进行再引入(Brentjens,Riviere等人.2011,Kalos,Levine等人.2011,Kochenderfer,Dudley等人.2012,Brentjens,Davila等人.2013)。这些T细胞表达CAR，CAR允许生成能够进行非主要组织相容性肿瘤识别和消灭的靶向肿瘤的T细胞。此外，这些T细胞可以被改造，以分泌额外的因子，诸如，以增加具有CD19+肿瘤的小鼠的存活的IL12(Pegram,Purdon等人.2015)。如本文所描述，这一方案现已被修改，以使得能够用可溶性TNFRSF14/HVEM多肽来治疗CD19+B细胞恶性肿瘤(诸如FL)。图25提供了这一方法的示意图。
首先进行了实验来确定可溶性HVEM多肽在T细胞存活率上是否具有任何作用。图26A示出，在可溶性HVEM多肽(solHVEM：10μg/ml)存在或不存在、在有或没有通过抗CD3/抗CD28的刺激的情况下，在培养24小时后纯化的鼠类OT1细胞(n＝2)的存活率。图26B示出，通过FACS鉴定的激活的鼠类OT1细胞的百分比。这些结果展示出，可溶性HVEM多肽的表达在T细胞存活率或激活上没有作用。
接下来，生成了经修饰的嵌合抗原受体(CAR)构建体，以允许从同一构建体/载体中表达CAR分子和可溶性HVEM胞外域多肽(以及GFP)。如图25B所示，对SFG-1928z载体进行了修饰，以在P2A蛋白水解裂解位点和IgG Kappa分泌信号的下游包括编码人类可溶性HVEM多肽的核苷酸序列(HVEM P37-V202)。如图25B示出，也在构建体中包括了编码绿色荧光蛋白(GFP)的核苷酸序列(1928序列的下游)，伴随着GFP和1928z序列之间的核糖体内部进入位点(IRES)。图25B示出了所生成的1928-GFP-HVEM构建体的示意性代表图。SEQ ID NO.9提供了所生成的1928-GFP-HVEM构建体的核苷酸序列。
接下来，通过密度离心从人类PBMCs中分离了人类T细胞，在存在IL2(Peprotech公司)和植物凝集素(phytohemagglutinin)(西格玛公司)的情况下，通过将该人类T细胞与CD3/CD28Dynobeads(英杰公司)一起培养，对T细胞进行了激活和扩增。在覆盖重组人类纤维蛋白(rectronectin)(Takara公司)的平板上，用1928-GFP-HVEM构建体(或对照组的构建体)对T细胞进行了转导。在T细胞转导后，对GFP+细胞进行了分选，并用CD3/CD28珠进行了进一步的扩增。
通过Western印迹分析，对含有1928-GFP对照组构建体(无HVEM)或含有1928-GFP-HVEM构建体的T细胞中HVEM的表达进行了评估(见图27A)。通过用Origene公司的人类HVEMELISA试剂盒对细胞培养上清液进行ELISA试验，证实了HVEM的分泌(见图27B)。如图27示出，与对照组1928T细胞相比，1928-GFP-HVEM修饰的T细胞呈现出增加的HVEM产生和分泌。
通过将靶标和效应细胞按照特别的细胞比例进行共培养，确定了转导的T细胞的细胞溶解能力。靶标细胞包括DOHH2和Raji细胞系，分别具有高BTLA表达和低BTLA表达。在4小时或24小时的共培养后，收获了细胞，并且用DAPI和Annexin V进行了染色，并且通过流式细胞术进行了试验，以检测残留的GFP阴性的存活细胞。图28A-B中提供了结果。
将混合有基质胶(BD公司)的5Mio DOHH2人类淋巴瘤细胞通过皮下注射(s.c.)入NOD/SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/J)小鼠的侧腹中，生成了异种移植物。在形成可见的肿瘤后(体积大概20mm3)，在含有或不含有HVEM分泌修饰中，给予小鼠单剂量的1Mio抗CD19CAR T细胞。含有前列腺特异性膜抗原(PSMA)scFv的T细胞被用作对照组CAR T细胞。每周两次地对肿瘤的体积进行了测量。如图28C和图28D中所展示，相比于用不分泌HVEM的CD19CAR T细胞或者用对照组的PSMA CAR T细胞所观察到的，分泌HVEM的CD19CAR T细胞在体内抑制肿瘤生长的程度较大。
实施例4
用抗CD20抗体对可溶性HVEM胞外域多肽进行靶向递送
可溶性HVEM胞外域多肽可以与任何合适的靶向肿瘤的剂相联系，使得那些剂特异性地靶向B细胞淋巴瘤。例如，在本实施例中，可溶性HVEM胞外域多肽共价连接于抗CD20抗体利妥昔单抗，然后施用于具有B细胞淋巴瘤的受试者。已经证明，类似的靶向方法在FL中与另外的细胞外肿瘤抑制子一起具有效果(Oricchio,Nanjangud等人.2011,Oricchio andWendel 2012)。值得注意的，这类方法比目前的疗法更有益处，包括减少脱靶效应以及潜在的在非常低的剂量下使用可溶性可溶性HVEM胞外域多肽。
尽管为了清楚和理解性，用一些细节描述了以上的发明，但是本领域技术人员通过阅读本公开将会明白，可以作出各种形式和细节的变化，而不违背本发明的真实精神和范围。还可以根据以下权利要求对本发明进行进一步的限定。
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<130> MSKCC.008.WO1
<140>
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<150> 62/142,450
<151> 2015-04-02
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 852
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
atggagcctc ctggagactg ggggcctcct ccctggagat ccacccccaa aaccgacgtc 60
ttgaggctgg tgctgtatct caccttcctg ggagccccct gctacgcccc agctctgccg 120
tcctgcaagg aggacgagta cccagtgggc tccgagtgct gccccaagtg cagtccaggt 180
tatcgtgtga aggaggcctg cggggagctg acgggcacag tgtgtgaacc ctgccctcca 240
ggcacctaca ttgcccacct caatggccta agcaagtgtc tgcagtgcca aatgtgtgac 300
ccagccatgg gcctgcgcgc gagccggaac tgctccagga cagagaacgc cgtgtgtggc 360
tgcagcccag gccacttctg catcgtccag gacggggacc actgcgccgc gtgccgcgct 420
tacgccacct ccagcccggg ccagagggtg cagaagggag gcaccgagag tcaggacacc 480
ctgtgtcaga actgcccccc ggggaccttc tctcccaatg ggaccctgga ggaatgtcag 540
caccagacca agtgcagctg gctggtgacg aaggccggag ctgggaccag cagctcccac 600
tgggtatggt ggtttctctc agggagcctc gtcatcgtca ttgtttgctc cacagttggc 660
ctaatcatat gtgtgaaaag aagaaagcca aggggtgatg tagtcaaggt gatcgtctcc 720
gtccagcgga aaagacagga ggcagaaggt gaggccacag tcattgaggc cctgcaggcc 780
cctccggacg tcaccacggt ggccgtggag gagacaatac cctcattcac ggggaggagc 840
ccaaaccact ga 852
<210> 2
<211> 283
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro
1 5 10 15
Lys Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala
20 25 30
Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro
35 40 45
Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys
50 55 60
Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro
65 70 75 80
Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys
85 90 95
Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser
100 105 110
Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile
115 120 125
Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser
130 135 140
Ser Pro Gly Gln Arg Val Gln Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Thr
145 150 155 160
Leu Cys Gln Asn Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Pro Asn Gly Thr Leu
165 170 175
Glu Glu Cys Gln His Gln Thr Lys Cys Ser Trp Leu Val Thr Lys Ala
180 185 190
Gly Ala Gly Thr Ser Ser Ser His Trp Val Trp Trp Phe Leu Ser Gly
195 200 205
Ser Leu Val Ile Val Ile Val Cys Ser Thr Val Gly Leu Ile Ile Cys
210 215 220
Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val Ser
225 230 235 240
Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile Glu
245 250 255
Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu Thr
260 265 270
Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
275 280
<210> 3
<211> 522
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
ttcctgggag ccccctgcta cgccccagct ctgccgtcct gcaaggagga cgagtaccca 60
gtgggctccg agtgctgccc caagtgcagt ccaggttatc gtgtgaagga ggcctgcggg 120
gagctgacgg gcacagtgtg tgaaccctgc cctccaggca cctacattgc ccacctcaat 180
ggcctaagca agtgtctgca gtgccaaatg tgtgacccag ccatgggcct gcgcgcgagc 240
cggaactgct ccaggacaga gaacgccgtg tgtggctgca gcccaggcca cttctgcatc 300
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<211> 174
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Phe Leu Gly Ala Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu
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Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys
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130 135 140
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<211> 498
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
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tgcagtccag gttatcgtgt gaaggaggcc tgcggggagc tgacgggcac agtgtgtgaa 120
ccctgccctc caggcaccta cattgcccac ctcaatggcc taagcaagtg tctgcagtgc 180
caaatgtgtg acccagccat gggcctgcgc gcgagccgga actgctccag gacagagaac 240
gccgtgtgtg gctgcagccc aggccacttc tgcatcgtcc aggacgggga ccactgcgcc 300
gcgtgccgcg cttacgccac ctccagcccg ggccagaggg tgcagaaggg aggcaccgag 360
agtcaggaca ccctgtgtca gaactgcccc ccggggacct tctctcccaa tgggaccctg 420
gaggaatgtc agcaccagac caagtgcagc tggctggtga cgaaggccgg agctgggacc 480
agcagctccc actgggta 498
<210> 6
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu
1 5 10 15
Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly
20 25 30
Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile
35 40 45
Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp
50 55 60
Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn
65 70 75 80
Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile Val Gln Asp Gly
85 90 95
Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser Ser Pro Gly Gln
100 105 110
Arg Val Gln Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Thr Leu Cys Gln Asn
115 120 125
Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Pro Asn Gly Thr Leu Glu Glu Cys Gln
130 135 140
His Gln Thr Lys Cys Ser Trp Leu Val Thr Lys Ala Gly Ala Gly Thr
145 150 155 160
Ser Ser Ser His Trp Val
165
<210> 7
<211> 492
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
ctgccgtcct gcaaggagga cgagtaccca gtgggctccg agtgctgccc caagtgcagt 60
ccaggttatc gtgtgaagga ggcctgcggg gagctgacgg gcacagtgtg tgaaccctgc 120
cctccaggca cctacattgc ccacctcaat ggcctaagca agtgtctgca gtgccaaatg 180
tgtgacccag ccatgggcct gcgcgcgagc cggaactgct ccaggacaga gaacgccgtg 240
tgtggctgca gcccaggcca cttctgcatc gtccaggacg gggaccactg cgccgcgtgc 300
cgcgcttacg ccacctccag cccgggccag agggtgcaga agggaggcac cgagagtcag 360
gacaccctgt gtcagaactg ccccccgggg accttctctc ccaatgggac cctggaggaa 420
tgtcagcacc agaccaagtg cagctggctg gtgacgaagg ccggagctgg gaccagcagc 480
tcccactggg ta 492
<210> 8
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys
1 5 10 15
Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu
20 25 30
Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ile Ala His
35 40 45
Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys Gln Met Cys Asp Pro Ala
50 55 60
Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser Arg Thr Glu Asn Ala Val
65 70 75 80
Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile Val Gln Asp Gly Asp His
85 90 95
Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser Ser Pro Gly Gln Arg Val
100 105 110
Gln Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Thr Leu Cys Gln Asn Cys Pro
115 120 125
Pro Gly Thr Phe Ser Pro Asn Gly Thr Leu Glu Glu Cys Gln His Gln
130 135 140
Thr Lys Cys Ser Trp Leu Val Thr Lys Ala Gly Ala Gly Thr Ser Ser
145 150 155 160
Ser His Trp Val
<210> 9
<211> 9728
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 9
ggatccggat tagtccaatt tgttaaagac aggatatcag tggtccaggc tctagttttg 60
actcaacaat atcaccagct gaagcctata gagtacgagc catagataaa ataaaagatt 120
ttatttagtc tccagaaaaa ggggggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta 180
gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaaatacat aactgagaat agagaagttc 240
agatcaaggt caggaacaga tggaacagct gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 300
agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggaa cagctgaata tgggccaaac 360
aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag 420
atgcggtcca gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag 480
gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt 540
tcgcgcgctt ctgctccccg agctcaataa aagagcccac aacccctcac tcggggcgcc 600
agtcctccga ttgactgagt cgcccgggta cccgtgtatc caataaaccc tcttgcagtt 660
gcatccgact tgtggtctcg ctgttccttg ggagggtctc ctctgagtga ttgactaccc 720
gtcagcgggg gtctttcaca catgcagcat gtatcaaaat taatttggtt ttttttctta 780
agtatttaca ttaaatggcc atagtactta aagttacatt ggcttccttg aaataaacat 840
ggagtattca gaatgtgtca taaatatttc taattttaag atagtatctc cattggcttt 900
ctactttttc ttttattttt ttttgtcctc tgtcttccat ttgttgttgt tgttgtttgt 960
ttgtttgttt gttggttggt tggttaattt ttttttaaag atcctacact atagttcaag 1020
ctagactatt agctactctg taacccaggg tgaccttgaa gtcatgggta gcctgctgtt 1080
ttagccttcc cacatctaag attacaggta tgagctatca tttttggtat attgattgat 1140
tgattgattg atgtgtgtgt gtgtgattgt gtttgtgtgt gtgactgtga aaatgtgtgt 1200
atgggtgtgt gtgaatgtgt gtatgtatgt gtgtgtgtga gtgtgtgtgt gtgtgtgtgc 1260
atgtgtgtgt gtgtgactgt gtctatgtgt atgactgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 1320
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gttgtgaaaa aatattctat ggtagtgaga gccaacgctc 1380
cggctcaggt gtcaggttgg tttttgagac agagtctttc acttagcttg gaattcactg 1440
gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 1500
gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 1560
tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt tctccttacg 1620
catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 1680
gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 1740
ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag 1800
aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg atgacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 1860
tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 1920
aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 1980
catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 2040
tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 2100
tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 2160
ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 2220
ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 2280
cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 2340
ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 2400
tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 2460
gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 2520
ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 2580
aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 2640
acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 2700
tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 2760
cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 2820
gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 2880
taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 2940
tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 3000
cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 3060
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 3120
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 3180
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 3240
cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 3300
tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 3360
taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 3420
gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga 3480
agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 3540
ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 3600
acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 3660
caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 3720
tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 3780
tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc 3840
aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag 3900
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca 3960
ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag 4020
cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc tttgctctta 4080
ggagtttcct aatacatccc aaactcaaat atataaagca tttgacttgt tctatgccct 4140
agggggcggg gggaagctaa gccagctttt tttaacattt aaaatgttaa ttccatttta 4200
aatgcacaga tgtttttatt tcataagggt ttcaatgtgc atgaatgctg caatattcct 4260
gttaccaaag ctagtataaa taaaaataga taaacgtgga aattacttag agtttctgtc 4320
attaacgttt ccttcctcag ttgacaacat aaatgcgctg ctgagcaagc cagtttgcat 4380
ctgtcaggat caatttccca ttatgccagt catattaatt actagtcaat tagttgattt 4440
ttatttttga catatacatg tgaatgaaag accccacctg taggtttggc aagctagctt 4500
aagtaacgcc attttgcaag gcatggaaaa atacataact gagaatagaa aagttcagat 4560
caaggtcagg aacagatgga acagctgaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca 4620
gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag atggaacagc tgaatatggg ccaaacagga 4680
tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc 4740
ggtccagccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc 4800
tgaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc 4860
gcgcttatgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc cctcactcgg ggcgccagtc 4920
ctccgattga ctgagtcgcc cgggtacccg tgtatccaat aaaccctctt gcagttgcat 4980
ccgacttgtg gtctcgctgt tccttgggag ggtctcctct gagtgattga ctacccgtca 5040
gcgggggtct ttcatttggg ggctcgtccg ggatcgggag acccctgccc agggaccacc 5100
gacccaccac cgggaggtaa gctggccagc aacttatctg tgtctgtccg attgtctagt 5160
gtctatgact gattttatgc gcctgcgtcg gtactagtta gctaactagc tctgtatctg 5220
gcggacccgt ggtggaactg acgagttcgg aacacccggc cgcaaccctg ggagacgtcc 5280
cagggacttc gggggccgtt tttgtggccc gacctgagtc ctaaaatccc gatcgtttag 5340
gactctttgg tgcacccccc ttagaggagg gatatgtggt tctggtagga gacgagaacc 5400
taaaacagtt cccgcctccg tctgaatttt tgctttcggt ttgggaccga agccgcgccg 5460
cgcgtcttgt ctgctgcagc atcgttctgt gttgtctctg tctgactgtg tttctgtatt 5520
tgtctgaaaa tatgggcccg ggctagactg ttaccactcc cttaagtttg accttaggtc 5580
actggaaaga tgtcgagcgg atcgctcaca accagtcggt agatgtcaag aagagacgtt 5640
gggttacctt ctgctctgca gaatggccaa cctttaacgt cggatggccg cgagacggca 5700
cctttaaccg agacctcatc acccaggtta agatcaaggt cttttcacct ggcccgcatg 5760
gacacccaga ccaggtcccc tacatcgtga cctgggaagc cttggctttt gacccccctc 5820
cctgggtcaa gccctttgta caccctaagc ctccgcctcc tcttcctcca tccgccccgt 5880
ctctccccct tgaacctcct cgttcgaccc cgcctcgatc ctccctttat ccagccctca 5940
ctccttctct aggcgccccc atatggccat atgagatctt atatggggca cccccgcccc 6000
ttgtaaactt ccctgaccct gacatgacaa gagttactaa cagcccctct ctccaagctc 6060
acttacaggc tctctactta gtccagcacg aagtctggag acctctggcg gcagcctacc 6120
aagaacaact ggaccgaccg gtggtacctc acccttaccg agtcggcgac acagtgtggg 6180
tccgccgaca ccagactaag aacctagaac ctcgctggaa aggaccttac acagtcctgc 6240
tgaccacccc caccgccctc aaagtagacg gcatcgcagc ttggatacac gccgcccacg 6300
tgaaggctgc cgaccccggg ggtggaccat cctctagact gccatggctc tcccagtgac 6360
tgccctactg cttcccctag cgcttctcct gcatgcagag gtgaagctgc agcagtctgg 6420
ggctgagctg gtgaggcctg ggtcctcagt gaagatttcc tgcaaggctt ctggctatgc 6480
attcagtagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct ggacagggtc ttgagtggat 6540
tggacagatt tatcctggag atggtgatac taactacaat ggaaagttca agggtcaagc 6600
cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg cagctcagcg gcctaacatc 6660
tgaggactct gcggtctatt tctgtgcaag aaagaccatt agttcggtag tagatttcta 6720
ctttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcaggtggag gtggatcagg 6780
tggaggtgga tctggtggag gtggatctga cattgagctc acccagtctc caaaattcat 6840
gtccacatca gtaggagaca gggtcagcgt cacctgcaag gccagtcaga atgtgggtac 6900
taatgtagcc tggtatcaac agaaaccagg acaatctcct aaaccactga tttactcggc 6960
aacctaccgg aacagtggag tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt 7020
cactctcacc atcactaacg tgcagtctaa agacttggca gactatttct gtcaacaata 7080
taacaggtat ccgtacacgt ccggaggggg gaccaagctg gagatcaaac gggcggccgc 7140
aattgaagtt atgtatcctc ctccttacct agacaatgag aagagcaatg gaaccattat 7200
ccatgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt 7260
ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc 7320
ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa 7380
catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg 7440
cgacttcgca gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta 7500
ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga 7560
tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa 7620
ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga 7680
gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct 7740
cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta 7800
acagccactc gagccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 7860
tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 7920
cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 7980
ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 8040
caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 8100
ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 8160
cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 8220
aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 8280
tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 8340
gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat aataccatgg tgagcaaggg cgaggagctg 8400
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 8460
agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 8520
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 8580
gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 8640
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 8700
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 8760
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 8820
cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 8880
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 8940
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 9000
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 9060
gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagggcagcg gcgccaccaa cttcagcctg 9120
ctgaagcagg ccggcgacgt ggaggagaac cccggcccca tggagacaga cacactcctg 9180
ctatgggtac tgctgctctg ggttccaggt tccactggtg acccagctct gccgtcctgc 9240
aaggaggacg agtacccagt gggctccgag tgctgcccca agtgcagtcc aggttatcgt 9300
gtgaaggagg cctgcgggga gctgacgggc acagtgtgtg aaccctgccc tccaggcacc 9360
tacattgccc acctcaatgg cctaagcaag tgtctgcagt gccaaatgtg tgacccagcc 9420
atgggcctgc gcgcgagccg gaactgctcc aggacagaga acgccgtgtg tggctgcagc 9480
ccaggccact tctgcatcgt ccaggacggg gaccactgcg ccgcgtgccg cgcttacgcc 9540
acctccagcc cgggccagag ggtgcagaag ggaggcaccg agagtcagga caccctgtgt 9600
cagaactgcc ccccggggac cttctctccc aatgggaccc tggaggaatg tcagcaccag 9660
accaagtgca gctggctggt gacgaaggcc ggagctggga ccagcagctc ccactgggta 9720
tagctcga 9728
<210> 10
<211> 3519
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
tccttcatac cggcccttcc cctcggcttt gcctggacag ctcctgcctc ccgcagggcc 60
cacctgtgtc ccccagcgcc gctccaccca gcaggcctga gcccctctct gctgccagac 120
accccctgct gcccactctc ctgctgctcg ggttctgagg cacagcttgt cacaccgagg 180
cggattctct ttctctttct ctttctcttc tggcccacag ccgcagcaat ggcgctgagt 240
tcctctgctg gagttcatcc tgctagctgg gttcccgagc tgccggtctg agcctgaggc 300
atggagcctc ctggagactg ggggcctcct ccctggagat ccacccccaa aaccgacgtc 360
ttgaggctgg tgctgtatct caccttcctg ggagccccct gctacgcccc agctctgccg 420
tcctgcaagg aggacgagta cccagtgggc tccgagtgct gccccaagtg cagtccaggt 480
tatcgtgtga aggaggcctg cggggagctg acgggcacag tgtgtgaacc ctgccctcca 540
ggcacctaca ttgcccacct caatggccta agcaagtgtc tgcagtgcca aatgtgtgac 600
ccagccatgg gcctgcgcgc gagccggaac tgctccagga cagagaacgc cgtgtgtggc 660
tgcagcccag gccacttctg catcgtccag gacggggacc actgcgccgc gtgccgcgct 720
tacgccacct ccagcccggg ccagagggtg cagaagggag gcaccgagag tcaggacacc 780
ctgtgtcaga actgcccccc ggggaccttc tctcccaatg ggaccctgga ggaatgtcag 840
caccagacca agtgcagctg gctggtgacg aaggccggag ctgggaccag cagctcccac 900
tgggtatggt ggtttctctc agggagcctc gtcatcgtca ttgtttgctc cacagttggc 960
ctaatcatat gtgtgaaaag aagaaagcca aggggtgatg tagtcaaggt gatcgtctcc 1020
gtccagcgga aaagacagga ggcagaaggt gaggccacag tcattgaggc cctgcaggcc 1080
cctccggacg tcaccacggt ggccgtggag gagacaatac cctcattcac ggggaggagc 1140
ccaaaccact gacccacaga ctctgcaccc cgacgccaga gatacctgga gcgacggctg 1200
ctgaaagagg ctgtccacct ggcggaacca ccggagcccg gaggcttggg ggctccgccc 1260
tgggctggct tccgtctcct ccagtggagg gagaggtggg gcccctgctg gggtagagct 1320
ggggacgcca cgtgccattc ccatgggcca gtgagggcct ggggcctctg ttctgctgtg 1380
gcctgagctc cccagagtcc tgaggaggag cgccagttgc ccctcgctca cagaccacac 1440
acccagccct cctgggccag cccagagggc ccttcagacc ccagctgtct gcgcgtctga 1500
ctcttgtggc ctcagcagga caggccccgg gcactgcctc acagccaagg ctggactggg 1560
ttggctgcag tgtggtgttt agtggatacc acatcggaag tgattttcta aattggattt 1620
gaattcggct cctgttttct atttgtcatg aaacagtgta tttggggaga tgctgtggga 1680
ggatgtaaat atcttgtttc tcctcaaact gtcacctccc ggtgtttctt gctgaacaag 1740
gagttccagg atggctgctg ggctgttcgg gggacccctg ccctcctccc gtcatgcctg 1800
ggggttcact ccacccagag aggagccctg gccgcccctt catatcccaa cagctgagct 1860
ctcagtgggc tcttctgacc tctgtggctc cgtccgaggc tattgctgtg gattctgatg 1920
ctcaaatggt gtcagatttg cccagtaaaa accccagatc tacatctgac ctacacttcc 1980
cagctgtgtc caccgagaaa ccccagtatc agtgacgcct gctgtgccca gccctctcca 2040
cctgctccgg gaacccgcca ggcccaggtc ccgctggcag gggcttcacc aggcctctga 2100
gccacacatt catttaatgg tcgggatgag gcccctttcc ccacatctga agttagaagc 2160
ggtgagggga atgaccctgc agccatgcca tgaggatgga ggccacatag cccctccgag 2220
catgcccgct ccaccccgcc ctaccccctc tcctttcctt gtcacctgcc tccagcagag 2280
cccccaggct gagccaccca ccccaactcc tctcctgcca ccccttgtcc tgtggaagct 2340
ttggcttagc gtcctggggt gtggagaggc ccatgcaggc caggtggagc cctgggcccc 2400
tagaaagcag cacttctggc tgccccaccc cgtgtcaccc tctccccaac tggaggcgtg 2460
gtctccaggg accacgggcc tccctgtgca tggaccggct cctgaccacc gtccagggtc 2520
attgccaggg taccttttca gaggctgacc ccatagacct ggctgccccc cagtgctaga 2580
tgggagccaa gcacagcctg cccttctgcc cacagtcccg ggggcaggtg ggagcatggg 2640
gccatggagt gagcgggcag gggtggcaga gggctccctg gtcaggggcc ccaacttccc 2700
ttcccccagg gaggccacct gacatctggg ctccaggcac agcaggaagc ccacctgccc 2760
caacctgtag ctcctcctcc tgggaggagc catggatcct ggaaaagctc tggggccacc 2820
tcccaggttt ggggggacag agctccaaga gacgacggct ggggacacga gccctcatgg 2880
ggccgctgtg tgctcacccc ttgattttct tcttttcatg catgagatta ggccaagtgt 2940
ggagaaatca atgatgttga cgatgaggct ccctgagaga aatcacaccc agcgggagct 3000
gctgctccca ggtctggcct cggtcaccag ccacctgctg catccgcggg agtggggccg 3060
aggacatggg agtggcaggt gcagcccccg gtactcactc agccccaggg agtgtccctg 3120
gctcccaggg ctctgggagg tgagggcagg tcccggggga ggctgggtta gtggcagctc 3180
cgggatgaga cctcagaggt ctgtctgact tgtccaagcc cggctatggg gaggtggggg 3240
gaaggaagga agaggagaga aataaggaga ggctgggcaa agaagacagg acggcagagg 3300
gagaggggag agaagtggga ggcagccagc agcgcagggc cctgagagta tttcagcggc 3360
accgctgtcc tgggccgccc ggtgccacat ctttgaaaac agttgtttaa tttaagcttg 3420
tccactcagt agctgttgaa tgtgggaggt tatcttgttc tattcaagtt gctataaaaa 3480
taaaaactac catagactgg gaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3519
<210> 11
<211> 893
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 11
gctcttggcc tgaagtttct tgatcaagaa aatggaacct ctcccaggat gggggtcggc 60
accctggagc caggccccta cagacaacac cttcaggctg gtgccttgtg tcttcctttt 120
gaacttgctg cagcgcatct ctgcccagcc ctcatgcaga caggaggagt tccttgtggg 180
agacgagtgc tgccccatgt gcaacccagg ttaccatgtg aagcaggtct gcagtgagca 240
tacaggcaca gtgtgtgccc cctgtccccc acagacatat accgcccatg caaatggcct 300
gagcaagtgt ctgccctgcg gagtctgtga tccagacatg ggcctgctga cctggcagga 360
gtgctccagc tggaaggaca ctgtgtgcag atgcatccca ggctacttct gtgagaacca 420
ggatgggagc cactgttcca catgcttgca gcacaccacc tgccctccag ggcagagggt 480
agagaagaga gggactcacg accaggacac tgtatgtgct gactgcctaa cagggacctt 540
ctcacttgga gggactcagg aggaatgcct gccctggacc aactgcagtg catttcaaca 600
ggaagtaaga cgtgggacca acagcacaga caccacctgc tcctcccagg tcgtctacta 660
cgttgtgtcc atccttttgc cacttgtgat agtgggagct gggatagctg gattcctcat 720
ctgcacgcga agacacctgc acaccagctc agtggccaag gagctggagc ctttccagga 780
acaacaggag aacaccatca ggtttccagt caccgaggtt gggtttgctg agaccgagga 840
ggagacagcc tccaactgaa caaattctgg gtgacaagac accgaggaga cgt 893
<210> 12
<211> 2089
<212> DNA
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 12
cacttttagt tttagctggg gctcatgaga gtgtgtgagg aggtccaaag tccatggggc 60
tcctggcctg cagtgtcttg attaagaaaa tggaacctct cccgggatgg gagtcgtcac 120
cctggagccg ggcagacaac accttcaggc tggtgccgtg tgtcttcctt ttgaacttgt 180
tgcagtgtat ctctgcccag cccttgtgca gacaggagga gttttctgtt ggggatgagt 240
gctgccccat gtgcaatcca ggttaccatg tgaagcaggt ctgcagtgag catacaggca 300
cagtgtgtgc cccctgtccc ccacagacct ataccgccca tgcgaatggc ctgagcaagt 360
gtctgccctg cggagtctgt gatccagaca tgggcctgct gacctggcag gagtgctcca 420
gctggaagga cactgtgtgc agatgcatct caggttactt ctgtgagaac caggatgggg 480
gcgcctgttc cacatgcttg cctcacgccg cctgccctcc aggacagagg gtacagaaga 540
gaggtactta cagccatgac actgtatgtg ctgactgcct gacaggaacc ttctcacttg 600
gcgggactca ggaggaatgc ctgccctgga ccaagtgcag tacctttcaa cgggaagtaa 660
aacatgggac cagcagcaca gacaccacct gctccttcca gaccttctac atcgtcgttg 720
tgatagtggg agttgcgata gtgggagctg gggtagttgt attcctcctc cgcaagcaaa 780
gacagcggca taccagcata gtggccagtg agctggaggc tttccagcag gagcaacaag 840
aggacgccat caggtttcca gtcatcgagg ttggtccttc tgtgaccgag gaggaggcag 900
ccttcaactg catgaattcg gggtgatgag acaccttgga gaccctgatg ggaagtttcc 960
atatgccaga ggggcacggc agatgccctg ggctgctacg gcatcacatg gcaggggaga 1020
tgttgccatg gcccagggtg tagcagttgc tttgtccttc ttagtgttaa atgggatcat 1080
ctgcgcccat gcaaacgatc caaagtctgt atcagtgaca gttaccacag accctatgcc 1140
ctacttccca aatcttccag acagcctgtc taaaccctag gcctttgacc gtcctggaaa 1200
tgttaaaggc tgctcatcca gagggctgct gagcacggcc ttctggggtc agggtgcttg 1260
cgatgagaca agaatatggc attggtggat tttattttga agtttctggg gctggaatct 1320
tgcccatacc aggcaagtgc tttattcctg agctacattc ccaagactct ttccgttttt 1380
tatcttgagg caaagtcaca cggaattgtc tgggccaacc atggactcct tctgtatctt 1440
gggcaagcct caaacttgac gcttctacct ctgctcttca agtaacactg tgatgacctg 1500
cgtggtcctc cagacggggc gggtcaatgc cttctatttt ctttgtgtgt gtgtgtgtgt 1560
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgcacac gcgtacctgt tacccccttt tcccaccgga 1620
cctagcccca gagagttttc tgcaggcccc agagaactaa gttttactcc ctcagacaca 1680
agtctgctga gggattgatt aatcactgac tccacacctc tcctcagtgt acctgacctg 1740
tcaaagctgg tcttcagtac ttgttcctta gtagctagcc atcttgagcc agcccgaggc 1800
tcatcaattc agctagatcg gcctaccact gagcgttggg catccccttg gctctgcctt 1860
ctcagcgctg ggtttagggc acacagcact atgccaaact tctaaagtgg attctgggga 1920
tgagcccagt ttcaagaatg caggtccttt ctcatgctgt ggaacagcac tcttagtgac 1980
caaaccattc ccttggcttc agaatgaatg tctaagttat tttctacttg tcataggaaa 2040
taaatatttt tgttacacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2089
<210> 13
<211> 846
<212> DNA
<213> 猕猴（Macaca mulatta）
<400> 13
atggagcctc ctggaggttg ggggtctcct ccccggagac ccgcccccaa agccgacttc 60
ttgacgctgg tgctgtatct caccttcctg ggatccccct gctacgcccc agctctgccc 120
tcctgcaaag aggacgagta cccagtgggc tctgagtgct gtcccaagtg cggtccaggt 180
ttccacgtga ggcaggcctg tggggagcag acgggcacgg tgtgtgaacc ctgctctccg 240
gggacctaca ttgctcactt caatggcctg agcaagtgtc tgcagtgcca aatgtgtgac 300
ccagccatgg gcctgcgcac aagccggaac tgctccacga cagcgaacgc cctgtgtggc 360
tgcagcccag gccacttctg catcatccag gacggggacc actgcgccgc gtgccgcgct 420
tacgccacct ccagcccggg ccagagggta cagaagggag gcactgagag tcaggacacc 480
ctgtgtcaga actgcccccc ggggaccttc tcttccaatg ggaccctgga ggaatgccag 540
cacgggacca agtgcagcaa atggctggtg acggaggccg gacctgggac cagcagcttc 600
cgctgggtgt ggtggtttct ctcagggacc ctcatcgtca ttgtcattgt tggcctaata 660
cttggcctaa tatgtgtgaa aagaagaaag tcaaggggcg atgtagtcaa ggtgatcgtc 720
tccgtccagc ggaagagaca ggaggcagaa ggtgaagcca tagtcactga ggccctgcag 780
gcccctccgg acatcaccac agtggccgtg gaagagacag aacctgcatt cactgggagg 840
agctga 846

Claims (195)

1.一种核酸分子，包括：(a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，和(b)编码可溶性HVEM胞外域多肽的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述CAR结合B细胞淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述CAR结合滤泡性淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述CAR结合DLBCL淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原。
5.根据权利要求2所述的核酸分子，其中，所述细胞表面抗原选自由CD19、CD20、CD22、CD30、Igk和ROR1组成的组。
6.根据权利要求2所述的核酸分子，其中，所述细胞表面抗原是CD19。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽主要由HVEM CRD1结构域组成。
8.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽由HVEM CRD1结构域组成。
9.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1结构域和HVEM CRD2结构域。
10.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1结构域、HVEM CRD2结构域和HVEM CRD3结构域。
11.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD3结构域。
12.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子，其中，可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD2结构域。
13.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子，其中，可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD2结构域，并且不包括HVEM CRD3结构域。
14.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1和HVEM CRD2结构域，但不包括HVEM CRD3结构域。
15.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽具有选自由以下所组成的组的一种或多种活性：BTLA结合、BTLA激活、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞增生、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤生长、刺激CD8+ T细胞活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK的激活。
16.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子，其中，所述编码可溶性HVEM胞外域多肽的核苷酸序列包括SEQ ID NO：3、5或7。
17.根据权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包括SEQ IDNO：9。
18.一种载体，包括权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子。
19.根据权利要求18所述的载体，其中，所述载体是表达载体。
20.根据权利要求18所述的载体，其中，所述载体是克隆载体。
21.一种细胞，包括权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子。
22.一种细胞，包括权利要求18所述的载体。
23.一种T细胞，包括权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子。
24.一种T细胞，包括权利要求18所述的载体。
25.一种基因修饰T细胞，包括：(a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，和(b)编码可溶性HVEM胞外域多肽的核苷酸序列。
26.根据权利要求25所述的基因修饰T细胞，其中，所述编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列和所述编码可溶性HVEM胞外域多肽的核苷酸序列在同一核酸分子内。
27.根据权利要求25所述的基因修饰T细胞，其中，所述编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列和所述编码可溶性HVEM胞外域多肽的核苷酸序列不在同一核酸分子内。
28.根据权利要求25所述的基因修饰T细胞，还包括编码报告蛋白的核苷酸序列。
29.根据权利要求28所述的基因修饰T细胞，其中，所述报告蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。
30.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述CAR结合B细胞淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原。
31.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述CAR结合滤泡性淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原。
32.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述CAR结合弥漫大B细胞淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原。
33.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述CAR结合选自由CD19、CD20、CD22、CD30、Igk和ROR1组成的组的细胞表面抗原。
34.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述CAR结合CD19。
35.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽主要由HVEM CRD1结构域组成。
36.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽由HVEM CRD1结构域组成。
37.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1结构域和HVEM CRD2结构域。
38.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1结构域、HVEM CRD2结构域和HVEM CRD3结构域。
39.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD3结构域。
40.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD2结构域。
41.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD2结构域，并且不包括HVEM CRD3结构域。
42.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1和HVEM CRD2结构域，但不包括HVEM CDR3结构域。
43.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽具有选自由以下所组成的组的一种或多种活性：BTLA结合、BTLA激活、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞增生、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤生长、刺激CD8+ T细胞活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK的激活。
44.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述编码可溶性HVEM胞外域多肽的核苷酸序列包括SEQ ID NO：3、5或7。
45.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述T细胞分泌包括SEQ ID NO：4、6或8的可溶性HVEM胞外域多肽。
46.根据权利要求25-29中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述T细胞包括SEQID NO：9。
47.一种为对其有需要的受试者治疗B细胞淋巴瘤的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的可溶性HVEM胞外域多肽。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述受试者患有滤泡性淋巴瘤。
49.根据权利要求47所述的方法，其中，所述受试者患有弥漫大B细胞淋巴瘤。
50.根据权利要求47所述的方法，其中，所述受试者患有包括BTLA+肿瘤细胞的B细胞淋巴瘤。
51.根据权利要求47所述的方法，其中，所述受试者患有包括BTLAhi肿瘤细胞的B细胞淋巴瘤。
52.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
53.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述受试者是人类。
54.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述受试者是非人类灵长目动物。
55.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述受试者是非人类哺乳动物。
56.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述受试者是小鼠。
57.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽主要由HVEM CRD1结构域组成。
58.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽由HVEM CRD1结构域组成。
59.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1结构域和HVEM CRD2结构域。
60.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1结构域、HVEM CRD2结构域和HVEM CRD3结构域。
61.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD3结构域。
62.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD2结构域。
63.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD2结构域，并且不包括HVEM CRD3结构域。
64.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1和HVEM CRD2结构域，但不包括HVEM CDR3结构域。
65.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽具有选自由以下所组成的组的一种或多种活性：BTLA结合、BTLA激活、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞增生、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤生长、刺激CD8+ T细胞活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK的激活。
66.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括SEQ ID NO：4、6或8。
67.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽由包括SEQ ID NO：3、5或7的核苷酸序列编码。
68.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述方法包括向所述受试者施用CAR T细胞。
69.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述方法包括向所述受试者施用CD19特异性CAR T细胞。
70.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽由CAR T细胞分泌。
71.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽由CD19特异性CAR T细胞分泌。
72.根据权利要求69所述的方法，其中，所述CD19特异性CAR T细胞包括SEQ ID NO：9。
73.根据权利要求69中任意一项所述的方法，其中，所述CD19特异性CAR T细胞包括SEQID NO：9。
74.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽被靶向至所述淋巴瘤。
75.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，用结合所述淋巴瘤细胞的靶向抗体将所述可溶性HVEM胞外域多肽靶向至所述淋巴瘤。
76.根据权利要求75所述的方法，其中，所述靶向抗体结合CD20、CD22、CD30、Igk或ROR1。
77.根据权利要求75所述的方法，其中，所述靶向抗体结合CD19。
78.根据权利要求75所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽共价附接于所述靶向抗体。
79.根据权利要求75所述的方法，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽和所述靶向抗体存在于单个融合蛋白中。
80.根据权利要求75所述的方法，其中，所述靶向抗体存在于递送颗粒的表面上。
81.根据权利要求80所述的方法，其中，所述递送颗粒选自由纳米颗粒、脂质体、聚合胶束、基于脂蛋白的药物载体和树形分子组成的组。
82.根据权利要求47-51中任意一项所述的方法，其中，所述受试者还用一种或多种在B细胞淋巴瘤治疗中有用的其他剂治疗。
83.根据权利要求82所述的方法，其中，所述受试者用选自由以下所组成的组的一种或多种剂治疗：抗CD20抗体、利妥昔单抗、依鲁替尼、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和艾代拉利司。
84.一种药物组合物，包括：(i)可溶性HVEM胞外域多肽，和(b)结合B细胞淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原的抗体或其抗原结合片段。
85.根据权利要求84所述的药物组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽与所述抗体或其抗原结合片段是共价连接的。
86.根据权利要求84所述的药物组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽与所述抗体或其抗原结合片段不是共价连接的。
87.根据权利要求84所述的药物组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽与所述抗体或其抗原结合片段被提供在递送颗粒中。
88.根据权利要求87所述的药物组合物，其中，所述递送颗粒选自由纳米颗粒、脂质体、聚合胶束、基于脂蛋白的药物载体和树形分子组成的组。
89.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段结合CD19、CD20、CD22、CD30、Igk和ROR1。
90.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，包括抗CD20抗体利妥昔单抗或其抗原结合片段。
91.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，包括抗CD19抗体或其抗原结合片段。
92.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，包括抗CD20抗体或其抗原结合片段。
93.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽主要由HVEM CRD1结构域组成。
94.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽由HVEM CRD1结构域组成。
95.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1结构域和HVEM CRD2结构域。
96.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1结构域、HVEM CRD2结构域和HVEM CRD3结构域。
97.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD3结构域。
98.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD2结构域。
99.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD2结构域，并且不包括HVEM CRD3结构域。
100.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1和HVEM CRD2结构域，但不包括HVEM CRD3结构域。
101.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽具有选自由以下所组成的组的一种或多种活性：BTLA结合、BTLA激活、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞增生、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤生长、刺激CD8+ T细胞活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK的激活。
102.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括SEQ ID NO：4、6或8。
103.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽由包括SEQ ID NO：3、5或7的核苷酸序列编码。
104.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，所述B细胞淋巴瘤细胞是滤泡性淋巴瘤细胞。
105.根据权利要求84-87中任意一项所述的药物组合物，其中，所述B细胞淋巴瘤细胞是弥漫大B细胞淋巴瘤细胞。
106.一种用于为对其有需要的受试者治疗B细胞淋巴瘤的组合物，所述组合物包括可溶性HVEM胞外域多肽。
107.根据权利要求106所述的组合物，其中，所述受试者患有BTLA+B细胞淋巴瘤。
108.根据权利要求106所述的组合物，其中，所述受试者患有BTLAhiB细胞淋巴瘤。
109.根据权利要求106所述的组合物，其中，所述受试者患有滤泡性淋巴瘤。
110.根据权利要求106所述的组合物，其中，所述受试者患有弥漫大B细胞淋巴瘤。
111.根据权利要求106-110中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽主要由HVEM CRD1结构域组成。
112.根据权利要求106-110中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽由HVEM CRD1结构域组成。
113.根据权利要求106-110中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1结构域和HVEM CRD2结构域。
114.根据权利要求106-110中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1结构域、HVEM CRD2结构域和HVEM CRD3结构域。
115.根据权利要求106-110中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD3结构域。
116.根据权利要求106-110中任意一项所述的组合物，其中，可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD2结构域。
117.根据权利要求106-110中任意一项所述的组合物，其中，可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD2结构域，并且不包括HVEM CRD3结构域。
118.根据权利要求106-110中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1和HVEM CRD2结构域，但不包括HVEM CRD3结构域。
119.根据权利要求106-110中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽具有选自由以下所组成的组的一种或多种活性：BTLA结合、BTLA激活、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞增生、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤生长、刺激CD8+ T细胞活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK的激活。
120.根据权利要求106-110中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括SEQ ID NO：4、6或8。
121.一种用于为对其有需要的受试者治疗B细胞淋巴瘤的组合物，所述组合物包括编码可溶性HVEM胞外域多肽的核苷酸序列。
122.根据权利要求121所述的组合物，其中，所述受试者患有BTLA+B细胞淋巴瘤。
123.根据权利要求121所述的组合物，其中，所述受试者患有BTLAhiB细胞淋巴瘤。
124.根据权利要求121所述的组合物，其中，所述受试者患有滤泡性淋巴瘤。
125.根据权利要求121所述的组合物，其中，所述受试者患有弥漫大B细胞淋巴瘤。
126.根据权利要求120-125中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽主要由HVEM CRD1结构域组成。
127.根据权利要求120-125中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽由HVEM CRD1结构域组成。
128.根据权利要求120-125中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1结构域和HVEM CRD2结构域。
129.根据权利要求120-125中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1结构域、HVEM CRD2结构域和HVEM CRD3结构域。
130.根据权利要求120-125中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD3结构域。
131.根据权利要求120-125中任意一项所述的组合物，其中，可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD2结构域。
132.根据权利要求120-125中任意一项所述的组合物，其中，可溶性HVEM胞外域多肽不包括HVEM CRD2结构域，并且不包括HVEM CRD3结构域。
133.根据权利要求120-125中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽包括HVEM CRD1和HVEM CRD2结构域，但不包括HVEM CRD3结构域。
134.根据权利要求120-125中任意一项所述的组合物，其中，所述可溶性HVEM胞外域多肽具有选自由以下所组成的组的一种或多种活性：BTLA结合、BTLA激活、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞增生、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤生长、刺激CD8+ T细胞活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK的激活。
135.根据权利要求120-125中任意一项所述的组合物，其中，所述核苷酸序列包括SEQID NO：3、5或7。
136.一种核酸分子，包括：(a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，和(b)编码抗体的核苷酸序列；其中，所述抗体或者是抗HVEM抗体，或者是抗BTLA抗体。
137.根据权利要求136所述的核酸分子，其中，所述CAR结合B细胞淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原。
138.根据权利要求136所述的核酸分子，其中，所述CAR结合滤泡性淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原。
139.根据权利要求136所述的核酸分子，其中，所述CAR结合DLBCL淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原。
140.根据权利要求137所述的核酸分子，其中，所述细胞表面抗原选自由CD19、CD20、CD22、CD30、Igk和ROR1组成的组。
141.根据权利要求137所述的核酸分子，其中，所述细胞表面抗原是CD19。
142.根据权利要求136所述的核酸分子，其中，所述抗体是人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
143.根据权利要求136所述的核酸分子，其中，所述抗体是抗体片段。
144.根据权利要求136所述的核酸分子，其中，所述抗体片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或纳米抗体抗体片段。
145.根据权利要求136-144中任意一项所述的核酸分子，其中，所述抗体具有选自由以下所组成的组的一种或多种活性：HVEM激活、BTLA激活、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞增生、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤生长、刺激CD8+ T细胞活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK的激活。
146.一种载体，包括权利要求136-144中任意一项所述的核酸分子。
147.根据权利要求146所述的载体，其中，所述载体是表达载体。
148.根据权利要求146所述的载体，其中，所述载体是克隆载体。
149.一种细胞，包括权利要求136-144中任意一项所述的核酸分子。
150.一种细胞，包括权利要求146所述的载体。
151.一种T细胞，包括权利要求136-144中任意一项所述的核酸分子。
152.一种T细胞，包括权利要求146所述的载体。
153.一种基因修饰T细胞，包括：(a)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，和(b)编码抗体的核苷酸序列；其中，所述抗体或者是抗HVEM抗体，或者是抗BTLA抗体。
154.根据权利要求153所述的基因修饰T细胞，其中，所述编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列和所述编码抗体的核苷酸序列在同一核酸分子内。
155.根据权利要求153所述的基因修饰T细胞，其中，所述编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列和所述编码抗体的核苷酸序列不在同一核酸分子内。
156.根据权利要求153-155中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述CAR结合B细胞淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原。
157.根据权利要求153-155中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述CAR结合滤泡性淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原。
158.根据权利要求153-155中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述CAR结合弥漫大B细胞淋巴瘤细胞上的细胞表面抗原。
159.根据权利要求158所述的基因修饰T细胞，其中，所述细胞表面抗原选自由CD19、CD20、CD22、CD30、Igk和ROR1组成的组。
160.根据权利要求158所述的基因修饰T细胞，其中，所述细胞表面抗原是CD19。
161.根据权利要求153-155中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述抗体是人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
162.根据权利要求153-155中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述抗体是抗体片段。
163.根据权利要求162所述的基因修饰T细胞，其中，所述抗体片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或纳米抗体抗体片段。
164.根据权利要求153-155中任意一项所述的基因修饰T细胞，其中，所述抗体具有选自由以下所组成的组的一种或多种活性：HVEM激活、BTLA激活、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞增生、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤生长、刺激CD8+ T细胞活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK的激活。
165.一种为对其有需要的受试者治疗B细胞淋巴瘤的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的抗体；其中，所述抗体或者是抗HVEM抗体，或者是抗BTLA抗体。
166.根据权利要求165所述的方法，其中，所述受试者患有滤泡性淋巴瘤。
167.根据权利要求165所述的方法，其中，所述受试者患有弥漫大B细胞淋巴瘤。
168.根据权利要求165所述的方法，其中，所述受试者患有BTLA+B细胞淋巴瘤。
169.根据权利要求165所述的方法，其中，所述受试者患有BTLAhiB细胞淋巴瘤。
170.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
171.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述受试者是人类。
172.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述受试者是非人类灵长目动物。
173.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述受试者是非人类哺乳动物。
174.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述受试者是小鼠。
175.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述抗体是人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
176.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述抗体是抗体片段。
177.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述抗体片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或纳米抗体抗体片段。
178.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述抗体具有选自由以下所组成的组的一种或多种活性：HVEM激活、BTLA激活、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞增生、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤生长、刺激CD8+ T细胞活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK的激活。
179.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述方法包括向所述受试者施用CAR T细胞。
180.根据权利要求179所述的方法，其中，所述方法包括向所述受试者施用CD19特异性CAR T细胞。
181.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述抗体由CART细胞分泌。
182.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述抗体由CD19特异性CART细胞分泌。
183.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述抗体被靶向至所述B淋巴瘤细胞。
184.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述抗体被提供在递送颗粒中。
185.根据权利要求184所述的方法，其中，所述递送颗粒选自由纳米颗粒、脂质体、聚合胶束、基于脂蛋白的药物载体和树形分子组成的组。
186.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述受试者还用一种或多种在B细胞淋巴瘤治疗中有用的其他剂治疗。
187.根据权利要求165-169中任意一项所述的方法，其中，所述受试者还用选自由以下所组成的组的一种或多种剂治疗：抗CD20抗体、利妥昔单抗、依鲁替尼、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和艾代拉利司。
188.一种用于为对其有需要的受试者治疗B细胞淋巴瘤的组合物，所述组合物包括选自由抗HVEM抗体和抗BTLA抗体组成的组的抗体。
189.根据权利要求188所述的组合物，其中，所述受试者患有BTLA+B细胞淋巴瘤。
190.根据权利要求188所述的组合物，其中，所述受试者患有滤泡性淋巴瘤。
191.根据权利要求188所述的组合物，其中，所述受试者患有弥漫大B细胞淋巴瘤。
192.根据权利要求188-191中任意一项所述的组合物，其中，所述抗体是人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
193.根据权利要求188-191中任意一项所述的组合物，其中，所述抗体是抗体片段。
194.根据权利要求188-191中任意一项所述的组合物，其中，所述抗体片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或纳米抗体抗体片段。
195.根据权利要求188-191中任意一项所述的组合物，其中，所述抗体具有选自由以下所组成的组的一种或多种活性：HVEM激活、BTLA激活、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞增生、抑制BTLA+B细胞淋巴瘤生长、刺激CD8+ T细胞活性、抑制B细胞淋巴瘤细胞中B细胞受体激活、抑制滤泡辅助性T(TFH)细胞分泌IL-21、抑制B细胞淋巴瘤细胞分泌IL-21、抑制BCR通路激活，以及抑制BTLA+B细胞淋巴瘤细胞中BTK、SYK和/或ERK的激活。
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