JP6890546B2 - Ｔｎｆｒｓｆ１４／ｈｖｅｍタンパク質およびその使用の方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それらの内容がそれらの全体として参照により組み込まれる、２０１５年４月２日に出願した米国仮特許出願第６２／１４２，４５０号および２０１６年３月４日に出願した米国仮特許出願第６２／３０３，９８０号の優先権の利益を主張するものである。

配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体として参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１６年４月１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＭＳＫＣＣ＿００８＿ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズが３３６２１バイトである。

政府支援の陳述
本発明は、国立衛生研究所により授与された補助金第ＲＯ１ＣＡ１８３８７６−０１号および第１Ｒ０１ＣＡ１９０３８−０１号のもとに政府の支援によりなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。

著作権
本特許文書の開示の一部は、著作権保護の対象である資料を含む。著作権所有者は、米国特許商標局特許ファイルまたは記録に出現するので特許文書または特許開示のファクシミリ複写に対する誰からの異議も有さないが、何であっても著作権をすべて保有するものである。

参照による組込み
参照による組込みを許容する国については、本開示において引用した参考文献のすべては、それらの全体として参照により組み込まれる。さらに、本明細書で引用または言及したあらゆる製品に関する任意の製造業者の取扱説明書またはカタログは、参照により組み込まれる。本文に参照により組み込まれた文書、またはその中におけるあらゆる教示は、本発明の実施に際して用いることができる。

濾胞性リンパ腫（ＦＬ）は、第２の最も一般的な種類のリンパ腫であり、現在の治療選択肢により不治であると一般的にみなされている。ＦＬは、抗原との遭遇により爆発的な増殖の能力がある免疫細胞の高度に分化した集団である、胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞から生じる。ＦＬが腫瘍微小環境における他の細胞からの相互作用に高度に依存することは、公知である。しかし、これらの複数の相互作用のどれが疾患の発生および持続に重要であるかは、現在のところ明らかでない。最近のゲノム研究で、最も一般的なＦＬの変異が分類され、これは、Ｂ細胞性悪性腫瘍を引き起こす機序への新しい洞察を与えるものであるが、ＦＬが腫瘍微小環境とどのように相互作用するのかをより十分に理解すること、およびこれらの理解を濾胞性リンパ腫ならびに他の種類のがんの治療の新規かつ改善された方法に転換することの必要性が当技術分野で依然として存在する。

ヘルペスウイルス侵入媒介因子または「ＨＶＥＭ」とも呼ばれている、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）は、リンパ腫における多機能性腫瘍抑制因子である。それは、造血系において、具体的にはＢ細胞およびＴ細胞上に発現する細胞表面受容体である。ＨＶＥＭは、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）およびびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）などのリンパ腫において高頻度で突然変異するかまたは欠失する。ＨＶＥＭは、ＦＬ患者の約４４％において突然変異する。さらに、ＨＶＥＭの突然変異状態は、ＦＬ患者の生存と相関する。

本発明の主な態様の一部を以下に要約する。さらなる態様は、本発明の詳細な説明、実施例、図面および本開示の特許請求の範囲の項に記載する。本特許開示の各項における説明は、見出しまたは小見出し表題にかかわらず、すべての他の項と共に読むことを意図している。さらに、本開示の各項に記載する様々な実施形態は、様々な異なる方法で組み合わせることができ、すべてのそのような組合せは、本発明の範囲内に入るものとする。

本発明は、本特許出願の「実施例」の項でより詳細に述べる特定の発見に一部基づいている。例えば、ＴＮＦＲＳＦ１４／ＨＶＥＭの細胞表面発現の喪失がインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）マウスモデルにおける濾胞性リンパ腫（ＦＬ）の発生を著しく加速させることが今や発見された。さらに「可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド」による処置がＢ細胞性リンパ腫細胞株の増殖をインビトロで阻害し、Ｂ細胞性リンパ腫の腫瘍成長をインビボでＢＴＬＡ依存的に阻害しうることが今や示された。これらの発見に基づいて、本発明は、Ｂ細胞性リンパ腫の処置のための様々な組成物および方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｂ）可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドなどの、ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。他の実施形態において、本発明は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｂ）抗ＨＶＥＭ抗体または抗ＢＴＬＡ抗体である抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。いくつかのそのような実施形態において、ＣＡＲは、Ｂ細胞性リンパ腫細胞の表面上に存在する細胞表面抗原に結合する。いくつかのそのような実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＩｇＫおよびＲＯＲ１からなる群から選択される細胞表面抗原に結合する。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態において、本発明は、そのような核酸分子のいずれかを含む、発現ベクターおよびクローニングベクターなどのベクターを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、そのような核酸分子のいずれか、またはそのようなベクターのいずれかを含む細胞、すなわち、遺伝子改変細胞を提供する。いくつかのそのような実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。

いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｂ）可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドなどの、ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供する。他の実施形態において、本発明は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｂ）抗ＨＶＥＭ抗体または抗ＢＴＬＡ抗体のどちらかである抗体をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変Ｔ細胞を提供する。そのような遺伝子改変Ｔ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞の一種である。いくつかのそのような実施形態において、ＣＡＲは、Ｂ細胞性リンパ腫細胞の表面上に存在する細胞表面抗原に結合する。いくつかのそのような実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＩｇＫおよびＲＯＲ１からなる群から選択される細胞表面抗原に結合する。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する。いくつかのそのような実施形態において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列と、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド、抗ＨＶＥＭ抗体または抗ＢＴＬＡ抗体をコードするヌクレオチド配列は、同じ核酸分子内にある。逆に、他の実施形態において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列と、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド、抗ＨＶＥＭ抗体または抗ＢＴＬＡ抗体をコードするヌクレオチド配列は、同じ核酸分子内にない（すなわち、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列と、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド、抗ＨＶＥＭ抗体または抗ＢＴＬＡ抗体をコードするヌクレオチド配列は、異なる核酸分子で、例えば、異なるベクターで提供することができる）。

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｂ細胞性リンパ腫細胞へのＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド（可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドなど）、抗ＨＶＥＭ抗体または抗ＢＴＬＡ抗体（すなわち「活性物質」）の標的送達に有用でありうる特定の非ＣＡＲベースの組成物を提供する。例えば、一実施形態において、本発明は、（ｉ）活性物質、および（ｂ）Ｂ細胞性リンパ腫細胞上の細胞表面抗原に結合する「ターゲティング抗体」（この用語は、抗原結合抗体断片を含む）を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。いくつかのそのような実施形態において、活性物質およびターゲティング抗体は共有結合している。一方、他の実施形態において、活性物質およびターゲティング抗体は共有結合していない。いくつかの実施形態において、活性物質および／またはターゲティング抗体は、ナノ粒子、リポソーム、ポリマーミセル、リポタンパク質ベースの薬物担体および／またはデンドリマーなどの、送達粒子に備えられている。いくつかのそのような実施形態において、ターゲティング抗体は、Ｂ細胞性リンパ腫細胞の表面上のＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＩｇＫまたはＲＯＲ１に結合する。いくつかの好ましい実施形態において、ターゲティング抗体は、ＣＤ１９に結合する。他の好ましい実施形態において、ターゲティング抗体は、ＣＤ２０に結合する。いくつかのそのような実施形態において、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブまたはその抗原結合断片が使用される。

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｂ細胞性リンパ腫の処置の様々な方法を提供する。いくつかの実施形態において、そのような方法は、それを必要とする対象に、有効量の、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドなどのＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドを投与することを含む。いくつかの実施形態において、そのような方法は、それを必要とする対象に、有効量の抗ＨＶＥＭ抗体または抗ＢＴＬＡ抗体を投与することを含む。特定の実施形態において、対象は、ヒト、非ヒト霊長類またはマウスなどの哺乳動物である。好ましい実施形態において、対象は、ヒトである。

そのような処置方法の一部は、ＣＡＲ Ｔ細胞を使用して、ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド（例えば、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド）、抗ＨＶＥＭまたは抗ＢＴＬＡ抗体（すなわち「活性物質」）を対象の腫瘍細胞にターゲティングすることを含む。例えば、そのような処置方法の一部は、それを必要とする対象に、上文または本特許開示における他所で記述する遺伝子改変Ｔ細胞のいずれかを投与することを含む。一方で、そのような処置方法の一部は、活性物質を対象における腫瘍細胞にターゲティングするための他の手段（すなわち、非ＣＡＲ Ｔ細胞ベースの方法）を使用することを含む。いくつかのそのような方法において、Ｂ細胞性リンパ腫／リンパ腫細胞の表面上の抗原に結合する「ターゲティング抗体」（この用語は、抗原結合抗体断片を含む）を使用して活性物質をＢ細胞性リンパ腫／リンパ腫細胞にターゲティングする。いくつかのそのような実施形態において、ターゲティング抗体は、Ｂ細胞性リンパ腫細胞上のＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＩｇＫまたはＲＯＲ１に結合する。いくつかの好ましい実施形態において、ターゲティング抗体は、ＣＤ１９に結合する。他の好ましい実施形態において、ターゲティング抗体は、ＣＤ２０に結合する。いくつかのそのような実施形態において、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブまたはその抗原結合断片が使用される。いくつかのそのような実施形態において、活性物質は、ターゲティング抗体に共有結合している。いくつかの実施形態において、活性物質およびターゲティング抗体は、単一融合タンパク質に存在する。いくつかの実施形態において、活性物質をターゲティング抗体に共有結合していなくてもよい。いくつかの実施形態において、活性物質および／またはターゲティング抗体は、ナノ粒子、リポソーム、ポリマーミセル、リポタンパク質ベースの薬物担体および／またはデンドリマーなどの、送達粒子に備えられていてもよい。

上文および本特許開示における他所で記述する処置方法のいずれかをＢ細胞性リンパ腫療法に有用な１つまたは複数の他の処置方法と併用することができる。そのような他の処置方法は、抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ、イブルチニブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよび／もしくはイデラリシブによる処置、ならびに／または化学療法、放射線療法、免疫療法もしくは手術による処置を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｂ細胞性リンパ腫を処置するのに使用するための組成物であって、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドなどのＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｂ細胞性リンパ腫を処置するのに使用するための組成物であって、抗ＨＶＥＭ抗体または抗ＢＴＬＡ抗体を含む組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、Ｂ細胞性リンパ腫を処置するのに使用するための組成物であって、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドなどのＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。同様に、いくつかの実施形態において、本発明は、Ｂ細胞性リンパ腫を処置するのに使用するための組成物であって、抗ＨＶＥＭ抗体または抗ＢＴＬＡ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。

可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドなどの、ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドを含む、上文または本特許開示における他所で記述する実施形態において、そのような実施形態の一部では該ポリペプチドは、ＨＶＥＭ ＣＲＤ１ドメインを含む、からなる、またはから本質的になる。いくつかのそのような実施形態において、ポリペプチドは、ＨＶＥＭ ＣＲＤ１ドメインおよびＨＶＥＭ ＣＤＲ２ドメインを含む。いくつかのそのような実施形態において、該ポリペプチドは、ＨＶＥＭ ＣＲＤ１ドメイン、ＨＶＥＭ ＣＤＲ２ドメインおよびＨＶＥＭ ＣＤＲ３ドメインを含む。いくつかのそのような実施形態において、ポリペプチドは、ＨＶＥＭ ＣＤＲ３ドメインを含まない。いくつかのそのような実施形態において、ポリペプチドは、ＨＶＥＭ ＣＲＤ２ドメインを含まない。いくつかのそのような実施形態において、ポリペプチドは、ＨＶＥＭ ＣＲＤ２を含まず、ＨＶＥＭ ＣＤＲ３を含まない。いくつかのそのような実施形態において、ポリペプチドは、ＨＶＥＭ ＣＤＲ１およびＨＶＥＭ ＣＤＲ２ドメインを含むが、ＨＶＥＭ ＣＤＲ３ドメインを含まない。いくつかのそのような実施形態において、ポリペプチドは、ＢＴＬＡ結合、ＢＴＬＡ活性化、ＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫細胞の増殖の阻害、ＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫の増殖の阻害、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の刺激、Ｂ細胞性リンパ腫細胞におけるＢ細胞受容体の活性化の阻害、濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞によるＩＬ−２１の分泌の阻害、Ｂ細胞性リンパ腫細胞によるＩＬ−２１の分泌の阻害、ＢＣＲ経路活性化の阻害、ならびにＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫細胞におけるＢＴＫ、ＳＹＫおよび／またはＥＲＫ活性化の阻害からなる群から選択される１つまたは複数の活性を有する。いくつかのそのような実施形態において、ポリペプチドは、配列番号４、６または８を含む。いくつかのそのような実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３、５または７を含むヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかのそのような実施形態において、ポリペプチドは、例えば、本明細書で配列番号９として提供される核酸分子などの、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もコードする核酸分子によりコードされる。

抗ＨＶＥＭ抗体または抗ＢＴＬＡ抗体を含む、上文または本特許開示における他所で記述する実施形態において、そのような実施形態の一部では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。いくつかのそのような実施形態において、抗体は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはナノボディ抗体断片などの、抗体断片である。さらに、いくつかのそのような実施形態において、抗体は、ＨＶＥＭ活性化、ＢＴＬＡ活性化、ＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫細胞の増殖の阻害、ＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫の増殖の阻害、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の刺激、Ｂ細胞性リンパ腫細胞におけるＢ細胞受容体の活性化の阻害、濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞によるＩＬ−２１の分泌の阻害、Ｂ細胞性リンパ腫細胞によるＩＬ−２１の分泌の阻害、ＢＣＲ経路活性化の阻害、ならびにＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫細胞におけるＢＴＫ、ＳＹＫおよび／またはＥＲＫ活性化の阻害からなる群から選択される１つまたは複数の活性を有する。

Ｂリンパ腫またはＢ細胞性リンパ腫細胞を含む、上文または本特許開示における他所で記述する実施形態において、そのような実施形態の一部では、Ｂ細胞性リンパ腫／リンパ腫細胞は、胚中心（「ＧＣ」）Ｂ細胞性リンパ腫／リンパ腫細胞である。そのような実施形態の一部において、Ｂ細胞性リンパ腫／リンパ腫細胞は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）またはＦＬ細胞である。そのような実施形態の一部において、Ｂ細胞性リンパ腫／リンパ腫細胞は、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）又はＤＬＢＣＬ細胞である。いくつかのそのような実施形態において、Ｂ細胞性リンパ腫／リンパ腫細胞は、ＢＴＬＡ^＋である。いくつかのそのような実施形態において、Ｂ細胞性リンパ腫／リンパ腫細胞は、ＢＴＬＡ^ｈｉである。いくつかのそのような実施形態において、Ｂ細胞性リンパ腫／リンパ腫細胞は、ＨＶＥＭ⁻である。いくつかのそのような実施形態において、Ｂ細胞性リンパ腫／リンパ腫細胞は、ＨＶＥＭ突然変異を含む。

本発明の主な実施形態の一部を上文に要約する。さらなる態様は、本特許出願の図面の簡単な説明、発明の詳細な説明、実施例、特許請求の範囲および図面の項において規定し、記述する。さらに、本明細書で記述する実施形態のそれぞれの変形形態および組合せが予期され、それらが本発明の範囲内にあるものとすることを理解すべきである。

図１Ａ〜Ｉは、ＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ相互作用がヒトＦＬｓの大部分において阻害されていることを示す。図１Ａは、１４１のＦＬ標本におけるＨＶＥＭ突然変異の要約を示す。図１Ｂは、ＨＶＥＭ ＣＮ変化を有する４１例の患者におけるコピー数（ＣＮ）状態の分布を示す。図１Ｃは、ＦＬ患者において見出された各種の突然変異の百分率を示す。図１Ｄは、Ｃｈｒ．１ｐ３６欠失がＨＶＥＭ遺伝子座に影響を及ぼすことを示す（ＭＳＫＣＣコホート、ｎ＝６４）。図１Ｅは、ＧＩＳＴＩＣ解析による高頻度の同型接合ＨＶＥＭ欠失を示す。図１Ｆは、緩慢性ＦＬにおける接合性別の欠失の頻度を示す。図１Ｇは、ＨＶＥＭおよびＢＴＬＡについて染色されたＴＭＡｓ上に示された陽性および陰性例の定量を示す。図１Ｈおよび図１Ｉは、免疫組織化学染色を示す。第１のパネル（図１Ｈ）において、抗ＨＶＥＭ抗体による強い染色が悪性細胞集団において認められたのに対して、ＢＴＬＡは、大部分は陰性のままであった。第２のパネル（図１Ｉ）は、ＨＶＥＭについて陰性であるが、すべての腫瘍細胞においてＢＴＬＡについて強い陽性を示している。元の倍率は、ｘ４００である。スケールバーは、５０μｍに等しい。 図２Ａ〜Ｇは、ＨＶＥＭがＦＬのマウスモデルにおける腫瘍抑制因子として作用することを示す。図２Ａは、ｖａｖＰＢｃｌ２モザイクマウスモデルの概略図を示す。図２Ｂは、無病生存率のカプラン・マイヤー分析（ベクター、ｎ＝１１、ＨＶＥＭに対するｓｈＲＮＡ、ｎ＝１９）を示す。図２Ｃは、正常脾臓、対照リンパ腫（ｖａｖＰＢｃｌ２−ベクター）およびＨＶＥＭに対するｓｈＲＮＡを発現する２つの独立したリンパ腫（ｖａｖＰＢｃｌ２−ｓｈＨＶＥＭ）から単離されたＢリンパ球における表面ＨＶＥＭのＦＡＣＳ解析を示す。図２Ｄは、ＨＶＥＭ ＦＡＣＳ測定の定量化（各遺伝子型についてｎ＝５、^＊ｐ＜０．０１）を示す。図２Ｅは、種々のマウス細胞集団ＨＳＣｓ（マウスへの注射前）、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｂ２２０＋（マウスを屠殺した（ｓａｃｋｉｎｇ）後）（ｎ＝５）におけるｓｈＨＶＥＭのＧＦＰ発現を示す。図２Ｆは、対照リンパ腫（ｖａｖＰＢｃｌ２ベクター）をＨＶＥＭ欠損リンパ腫（ｖａｖＰＢｃｌ２−ＨＶＥＭ）と比較したマウスリンパ腫における表示したマーカーの病理および免疫組織化学を示す。スケールバー＝１００μｍ。図２Ｇは、示したように探査した対照リンパ腫（ベクター）およびＨＶＥＭ欠損リンパ腫（ＨＶＥＭ）における免疫ブロットを示す。 図３Ａ〜Ｆは、ＢＴＬＡの欠損がインビボでのリンパ腫の発生に対するＨＶＥＭの喪失の影響を再現することを示す。図３Ａは、無病生存率のカプラン・マイヤー分析（ベクター、ｎ＝１１、ＨＶＥＭに対するｓｈＲＮＡ、ｎ＝１６、ｐ＜０．０１）を示す。図３Ｂは、対照（ベクター）およびＢＴＬＡ（ｓｈＢＴＬＡ）リンパ腫におけるＢＴＬＡ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。図３Ｃは、Ｈ＆Ｅ、Ｋｉ６７、ＰＮＡおよびＢＣＬ６を含む代表的な切片の染色されたｓｈＢＴＬＡ腫瘍の病理学的分析を示す。スケールバー＝１００μｍ。図３Ｄは、ｓｈＢＴＬＡ腫瘍におけるＫｉ６７染色の定量化を示す（ｎ＝６、ｐ＜０．０１）。図３Ｅは、ｖａｖＰＢｃｌ２−ベクターおよびｖａｖＰＢｃｌ２−ｓｈＢＴＬＡ腫瘍の表面分析を示す。図３Ｆは、示したように探査した代表的な腫瘍における免疫ブロットを示す。 図４Ａ〜Ｅは、ＨＶＥＭが細胞におけるＢＣＲシグナル伝達を自生的およびＢＴＬＡ依存的に阻止することを示す。図４Ａおよび図４Ｂは、ＢＴＬＡのノックダウン（ｓｈＢＴＬＡ）を伴わない（図４Ａ）または伴う（図４Ｂ）ｓｏｌＨＶＥＭ（１０μｇ／ｍｌ）またはイブルチニブ（１０ｎＭ）の存在下での抗ＩｇＭによる刺激の後のＢＣＬ１細胞におけるリン酸化ＢＴＫ（ｐＢＴＫ）発現のＦＡＣＳ解析の定量化を示す。図４Ｃは、精製初代ヒトＦＬ Ｂ細胞におけるＢＴＬＡ発現のＦＡＣＳ解析が高（ＢＴＬＡ^ｈｉ）および低（ＢＴＬＡｌｏ）表面ＢＴＬＡ発現を識別することを示す。図４Ｄは、可溶性ＨＶＥＭエクトドメイン（ｓｏｌＨＶＥＭ；１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下におけるＢＴＬＡ^ｈｉまたはＢＴＬＡｌｏであり、抗ヒトＩｇＧ（３分；１０μｇ／ｍｌおよびＨ２０２ １ｍＭ）により刺激したヒト初代ＦＬ Ｂ細胞における表示シグナル伝達分子のＤＦＡＣＳ解析を示す（右）。図４Ｅは、ｐＳｙｋの阻害の百分率をｐＳｙｋ＋／−ｓｏｌＨＶＥＭのＭＦＩの比を比較することによって計算し、ＭＦＩのＢＴＬＡ比と相関させたことを示す（ｒ＝０．６９７、ｐ＝０．０３、精製 ＦＬ Ｂ細胞、ｎ＝１０、グレード１およびグレード２）。 図５Ａ〜Ｉは、Ｂ細胞性リンパ腫におけるリンパ基質の異常な活性化を示す。図５Ａは、対照リンパ腫（ベクター）およびＨＶＥＭノックダウンリンパ腫（ｓｈＨＶＥＭ）におけるＦＤＣマーカーＣＤ２１／３５およびＦＲＣマーカーコラーゲン１を染色する免疫組織蛍光を示す（それぞれについてｎ＝３、スケールバー＝１００μｍ）。図５Ｂおよび図５Ｃは、マウス当たりＴ細胞域における１２部位およびＢ細胞域における３０部位（３匹のマウスについての累積数）に基づく対照（ベクター）およびＨＶＥＭ欠損（ｓｈＨＶＥＭ）リンパ腫におけるそれぞれＣＤ２１／３５（左）およびコラーゲンＩ（右）染色の系統的定量化を示す。パラメトリックｔ検定により^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；図５Ｄおよび図５Ｅは、対照（ベクター）およびＨＶＥＭノックダウン（ｓｈＨＶＥＭ）リンパ腫におけるｑＲＴ−ＰＣＲによるＣＸＣＬ１３（図５Ｄ）およびＣＣＬ１９（図５Ｅ）発現を示す（４回の反復実験の平均、エラーバーは標準偏差を示す、^＊ｐ＜０．０１）。図５Ｆは、ベクターおよびｓｈＨＶＥＭマウス（ｎ＝３）の脾臓から単離したＢ細胞におけるＬＴａ、ＬＴｂおよびＴＮＦａ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ測定を示す。図５Ｇ〜Ｉは、ｓｏｌＨＶＥＭ（１０μｇ／ｍｌ）による処置の２４時間後のＢ細胞株ＢＣＬ１におけるＴＮＦａ（図５Ｇ）、ＬＴａ（図５Ｈ）およびＬＴｂ（図５Ｉ）のｑＲＴ−ＰＣＲ測定を示す。 図６Ａ〜Ｉは、ＨＶＥＭ欠損リンパ腫Ｂ細胞へのＴＦＨ細胞動員支援の増大を示す。図６Ａは、ＣＤ３ｐｏｓ、ＣＤ４ｐｏｓ、ＣＤ２５ｎｅｇ、ＰＤ１ｈｉ、ＣＸＣＲ５ｈｉマーカーに基づくヒトＧＣ由来ＴＦＨ細胞のＦＡＣＳ同定および選別を示す。左：アイソタイプ対照；右：抗ＢＴＬＡ抗体による染色；図６Ｂおよび図６Ｃは、対照およびＨＶＥＭ欠損マウスリンパ腫における腫瘍内ＴＦＨ細胞のＦＡＣＳ測定（図６Ｂ）および定量化（図６Ｃ）を示す。図６Ｄおよび図６Ｅは、選別腫瘍内Ｔ細胞（Ｎ＝？）におけるＩＬ２１（図６Ｄ）およびＩＬ４（図６Ｅ）のｑＲＴ−ＰＣＲ測定を示す。図６Ｆは、ベクターおよびｓｈＨＶＥＭマウスの脾臓から単離したＴ細胞におけるＬＴａ、ＬＴｂおよびＴＮＦａ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ測定を示す。^＊ｐ＜ ？；図Ｇ〜Ｉは、可溶性ＨＶＥＭ（ｓｏｌＨＶＥＭ、１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｍａｂｓとともに培養した細胞選別ＴＦＨ（ｎ＝４）におけるＴＮＦａ（図６Ｇ）、ＬＴａ（図６Ｈ）およびＬＴｂ（図６Ｉ）のｑＲＴ−ＰＣＲ測定を示す。各記号は、独立したＴＦＨ試料を表す。 図７Ａ〜Ｈは、ｓｏｌＨＶＥＭ（Ｌｅｕ３９〜Ｖａｌ２０２またはＰｒｏ３７〜Ｖａｌ２０２）タンパク質がＨＶＥＭの腫瘍抑制作用を回復させることを示す。図７Ａおよび図７Ｂは、Ｐｒｏ３７〜Ｖａｌ２０２ ｓｏｌＨＶＥＭ（５μｇ／ｍｌ）またはＢＴＫ阻害剤イブルチニブ（１０ｎＭ）の存在下または非存在下で抗ＩｇＧにより刺激したＤＯＨＨ２リンパ腫細胞におけるリン酸化ＢＴＫ（ｐＢＴＫ）のＦＡＣＳ測定を示す。（Ｂ）において定量化（＊はｐ＜０．０１を示す）；図７Ｃは、示したように探査したＬｅｕ３９〜Ｖａｌ２０２ ｓｏｌＨＶＥＭ（５μｇ／ｍｌ）による処理の後のｍｙｃ／ｂｃｌ２細胞における免疫ブロットを示す。図７Ｄは、Ｌｅｕ３９〜Ｖａｌ２０２ ｓｏｌＨＶＥＭ（５μｇ／ｍｌ）により処理したＢＴＬＡ^ｈｉおよびＢＴＬＡｌｏリンパ腫細胞株のパネルにわたる細胞増殖の解析を示す。図７Ｅは、移植ｍｙｃ−ｂｃｌ２マウスリンパ腫のインビボでの処置の代表的な写真を示す。図７Ｆは、２０μｇのＬｅｕ３９〜Ｖａｌ２０２ ｓｏｌＨＶＥＭを３日ごとに腫瘍内注射した（矢印により示す）場合の十分に触知可能な腫瘍７５ｍｍ^３の形成後のビヒクルまたはＬｅｕ３９〜Ｖａｌ２０２ ＨＶＥＭエクトドメインによる移植ｍｙｃ−ｂｃｌ２マウスリンパ腫のインビボでの処置を示す。図７Ｇは、示したように探査したＬｅｕ３９〜Ｖａｌ２０２処理および非処理リンパ腫の溶解物における免疫ブロットを示す。図７Ｈは、示したように染色したＬｅｕ３９〜Ｖａｌ２０２処理および非処理リンパ腫における顕微鏡病理検査を示す。スケールバー＝１００μｍ。 図８Ａ〜Ｇは、ヒトリンパ腫におけるＨＶＥＭ突然変異および欠失を示す。図８Ａは、第２のシリーズのＦＬ（ＵＮＭＣ、ｎ＝１９８）におけるＣｈｒ．１ｐ３６欠失を示し、差し込み図は、ＤＮＡコピー数のＧＩＳＴＩＣ解析による高頻度の同型接合喪失を示す。図８Ｂは、形質転換ＦＬｓにおける接合性別の欠失の頻度を示す。図８Ｃは、ＴＭＡ上に配置したＦＬ組織試料におけるＨＶＥＭ陽性腫瘍細胞の百分率の分布を示す。色は、染色強度を表す。図８Ｄは、ＨＶＥＭ ｗｔ（左）およびＨＶＥＭ突然変異または欠失試料（右）におけるヒトＦＬｓ試料におけるＨＶＥＭの発現を示す。図８Ｅは、濾胞性リンパ腫細胞におけるＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）のそれぞれの染色強度を示す症例の数を示す。図８Ｆは、ＨＶＥＭ＋またはＨＶＥＭ−である症例におけるヒトＦＬｓにおけるＢＴＬＡ染色強度を示す。図８Ｇは、個々のＴＭＡ切片をどのように評価したかの内訳を示す。 図９Ａ〜Ｅは、ＨＶＥＭノックダウンがＦＬのインビボでの発生を促進することを示す。図９Ａは、空ベクターと比較したＨＶＥＭに対する第２のｓｈＲＮＡ（ｓｈＨＶＥＭ−２）を用いた腫瘍の発症のカプラン・マイヤー分析を示す（ベクター、ｎ＝１１；ｓｈＨＶＥＭ−２、ｎ＝１２；ｐ＜０．０１）。図９Ｂは、対照（ベクター）およびＨＶＥＭ（ｓｈＨＶＥＭ）リンパ腫におけるＨＶＥＭ ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。図９Ｃは、ＨＶＥＭ欠損リンパ腫（ｓｈＨＶＥＭ）における表示した表面マーカーのＦＡＣＳ解析を示す。図９Ｄは、ｖａｖＰＢｃｌ２−ベクターおよびｖａｖＰＢｃｌ２−ＨＶＥＭ腫瘍におけるＫｉ６７の定量を示す（ｎ＝６；平均値±ｓ．ｄ；ｔ検定：^＊ｐ＜０．０１）。図９Ｅは、ＨＶＥＭ欠損リンパ腫（ｓｈＨＶＥＭ）における表示した表面マーカーのＦＡＣＳ解析を示す。 図１０Ａ〜Ｃは、マウス腫瘍のＶＤＪ領域における変異型（variants）の解析を示す。図１０Ａは、クローン性を評価し、試料内のクロノタイプをモニターするためのｓｈＨＶＥＭマウスの３つの試料からのμ重鎖転写物の解析を示す。表は、１％以上増幅されたクローンを示す（対照試料は、０．６６％以上を有さない）。同じＶＤＪ接合部ならびにＶおよびＪＨセグメント内の最小限の差を有するクローンを変異型として最後の縦列に示す。図１０Ｂにおける進化樹は、ｓｈＨＶＥＭ試料＃２における（ＶＨ８．１２／Ｄ２．４／ＪＨ１）を含むＣＤＲ３領域に認められた変異体を接続することによる優性クローンの持続的なクローン進化を示す。図１０Ｃにおける円グラフは、各試料におけるＢ細胞レパートリーを包括的に解析した３つの試料（および対照）のＶＨファミリーの使用量を示す。試料２および３における多くのクローン増殖は、結果的に明らかなレパートリーバイアスを示している。 図１１は、マウスおよびヒトＦＬ Ｂ細胞に対するＨＶＥＭの影響を示す。精製ヒトＦＬ Ｂ細胞上のＢＴＬＡ発現のＦＡＣＳ解析により、高（ＢＴＬＡ^ｈｉ）および低（ＢＴＬＡｌｏ）表面ＢＴＬＡ発現を有する試料が識別される（上）。ＢＴＬＡ^ｈｉまたはＢＴＬＡｌｏであり、可溶性ＨＶＥＭエクトドメイン（ｓｏｌＨＶＥＭ；１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で抗ヒトＩｇＧ（３分および１０分；１０μｇ／ｍｌならびにＨ_２Ｏ_２ １ｍＭ）で刺激したヒト初代ＦＬ Ｂ細胞における表示したシグナル伝達分子のＦＡＣＳ解析を示す。 図１２Ａ〜Ｆは、Ｂ細胞性リンパ腫におけるリンパ基質の解析を示す。図１２Ａは、反応性リンパ節および２つの別個のヒト濾胞性リンパ腫組織試料におけるＣＤ２０陽性Ｂ細胞、トランスグルタミナーゼ陽性ＦＲＣｓおよびＣＤ２１Ｌ陽性ＦＤＣｓの免疫組織蛍光染色を示す。図１２Ｂは、ＦＲＣ密度（コラーゲンＩ）を得るための画像処理のフローチャートを示す。手短に述べると、画像を閾値処理し、二値画像に変換し、次いでウォーターシェッドアルゴリズムを適用し、ＩｍａｇｅＪソフトウエアにより多角形の数を評価し、解析する。図１２Ｃにおける多角形の数は、対照リンパ腫（ベクター）およびＨＶＥＭノックダウンリンパ腫におけるＦＲＣ密度を示すが、ＦＲＣ寄与の差は示されなかった。マウス当たりＴ細胞域における４０部位を選択し、解析した（各群当たりｎ＝３）。図１２Ｄ〜Ｆは、マウスＢ細胞株ＥｕＭｙｃ−Ｂｃｌ２におけるＴＮＦａ（図１２Ｄ）、ＬＴａ（図１２Ｅ）およびＬＴｂ（図１２Ｆ）のｑＲＴ−ＰＣＲ測定を示す。 図１３Ａ〜Ｅは、ＨＶＥＭ欠損リンパ腫におけるＴＦＨ細胞機能の解析を示す。図１３Ａおよび図１３Ｂは、精製リンパ腫Ｂ細胞におけるＩＬ２１（ＩＬ−２１ｒａ；Ａ）およびＩＬ４（ＩＬ４ｒａ；Ｂ）に対する受容体のｑＲＴ−ＰＣＲ測定を示す。図１３Ｄは、可溶性ＨＶＥＭエクトドメイン（ｓｏｌＨＶＥＭ：１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８による刺激（ＵＮ）を用いてまたは用いずに３日間培養した精製マウスＴＦＨ細胞（試料：ｎ＝４）の生存率を示す。図１３Ｅおよび図１３Ｆは、ｓｏｌＨＶＥＭの存在下または非存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｍａｂｓとともに培養した細胞選定ＧＣ−ＴＦＨ、ＥＬＩＳＡにより評価したＣＸＣＬ１３（図１３Ｅ）およびＩＬ−２１（図１３Ｆ）の産生を示す。 図１４Ａ〜Ｅは、マウスおよびヒトＦＬ Ｂ細胞に対するｓｏｌＨＶＥＭ（Ｌｅｕ３９〜Ｖａｌ２０２またはＰｒｏ３７〜Ｖａｌ２０２）の影響を示す。図１４Ａおよび図１４Ｂは、Ｐｒｏ３７〜Ｖａｌ２０２ ｓｏｌＨＶＥＭ（５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で抗ＩｇＧにより刺激したＤＯＨＨ２リンパ腫細胞におけるｐＳＹＫレベルの定量（^＊はｐ＜０．０１を示す）；代表的なＦＡＣＳ測定（図１４Ｂ）を示す。図１４Ｃは、マウスｍｙｃ／ｂｃｌ２ リンパ腫およびヒト系（ＤＯＨＨ２、Ｓｕ−ＤＨＬ６、Ｇｒａｎｔａ、Ｌｙ１０）を含むリンパ腫系のパネルにおけるＢＴＬＡ発現のＦＡＣＳ解析を示す。図１４Ｄは、マウスの腫瘍の代表的な写真を示す。図１４Ｅは、マウス腫瘍の腫瘍重量（ｎ＝３、ｐ＜０．０１）を示す。 図１５Ａ〜Ｂは、ｓＴＮＦＲＳＦ１４がＰ−ＢＴＫを低下させることによってリンパ腫Ｂ細胞においてシグナル伝達するＢ細胞受容体と拮抗することを示す。Ｂ細胞性リンパ腫細胞株（ＤＯＨＨ２）をＴＮＦＲＳＦ１４の可溶性エクトドメイン（ｓＴＮＦＲＳＦ１４）Ｐｒｏ３７〜Ｖａｌ２０２（５ｕｇ／ｍｌ）またはＢＴＫ阻害剤イブルチニブ（１０ｎｍＭ）により１時間前処理し、次いで抗ＩｇＧ分子によって３７℃で５分間刺激した。その後細胞を固定し、透過処理し、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｆｌｏｗ抗体を用いてｐＢＴＫ発現について探査し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａで解析した。図１５Ａは、代表的なＦＡＣＳプロットを示す。図１５Ｂは、ビヒクルまたは薬物による処理の後のホスホ−ＢＴＫの平均蛍光強度の定量を示す。 図１６Ａ〜Ｂは、ｓＴＮＦＲＳＦ１４がＰ−ＳＹＫを低下させることによってリンパ腫Ｂ細胞においてシグナル伝達するＢ細胞受容体と拮抗することを示す。Ｂ細胞性リンパ腫細胞株（ＤＯＨＨ２）をＴＮＦＲＳＦ１４の可溶性エクトドメイン（ｓＴＮＦＲＳＦ１４）Ｐｒｏ３７〜Ｖａｌ２０２（５ｕｇ／ｍｌ）またはＢＴＫ阻害剤イブルチニブ（１０ｎｍＭ）により１時間前処理し、次いで抗ＩｇＧ分子によって３７℃で５分間刺激した。その後細胞を固定し、透過処理し、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｆｌｏｗ抗体を用いてｐＳＹＫ発現について探査し、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａで解析した。図１６Ａは、代表的なＦＡＣＳプロットを示す。図１６Ｂは、ビヒクルまたは薬物による処理の後のホスホ−ＳＹＫの平均蛍光強度の定量を示す。 図１７は、ｓＴＮＦＲＳＦ１４がリンパ腫細胞株のインビトロでの増殖を阻害することを示す。３種のリンパ腫細胞株（Ｍｙｃ−Ｂｃｌ２、ＬＹ−１０、Ｇｒａｎｔａ）を１ｘ１０^５細胞／ｍｌで平板培養し、ｓＴＮＦＲＳＦ１４（５ｕｇ／ｍｌ）またはビヒクルで毎日７２時間処理した。７２時間後に細胞を血球計を用いて計数した。各バーは、３回の独立した実験の平均値を表す。 図１８は、ｓＴＮＦＲＳＦ１４がインビトロでの細胞生存率を低下させることを示す。ｍｙｃ−Ｂｃｌ２リンパ腫細胞株の細胞を１ｘ１０^５細胞／ｍｌの密度で平板培養し、それらをｓＴＮＦＲＳＦ１４（５ｕｇ／ｍｌ）またはビヒクルで処理した。２４時間の処理の後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ試薬を用いて細胞生存率を評価した。 図１９は、ｓＴＮＦＲＳＦ１４のインビトロでの効果を示す。５ｕｇ／ｍｌのｓＴＮＦＲＳＦ１４で処理した細胞株の免疫ブロットを示す。ブロットを示したように探査した。 図２０は、ｓＴＮＦＲＳＦ１４がインビボでの腫瘍増殖を阻害することを示す。異種移植片ｍｙｃ−ｂｃｌ２リンパ腫をマウスの側腹部において増殖させた。腫瘍が約０．５ｃｍ^３の容積に達したとき、ＰＢＳで希釈した２０ｕｇ／ｍｌのｓＴＮＦＲＳＦ１４の側腹部における腫瘍内注射によってマウスを１日おきに処置した。対照（ビヒクル）動物は、ＰＢＳを投与した。週２回腫瘍を秤量し、容積を測定した。 図２１は、ｓＴＮＦＲＳＦ１４が異種移植片モデルにおけるリンパ腫増殖を低減させることを示す。５００万個のｍｙｃ−Ｂｃｌ２細胞をＭａｔｒｉｇｅｌと混合し、Ｊ：Ｎｕ Ｎｕｄｅ（Ｆｏｘｎ１ ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ ｎｕ）マウスの側腹部に皮下注射した。動物をＩＵＣＡＣプロトコールに従って屠殺した。屠殺時に腫瘍を秤量し、測定した。 図２２は、ｓＴＮＦＲＳＦ１４の外因性投与がマウスリンパ腫異種移植片を抑制することを示す。動物を１１日目に屠殺し、異種移植腫瘍をマウスの側腹部から切除した。処置（ｓＴＮＦＲＳＦ１４）および非処置（ビヒクル）の各側腹部の腫瘍を秤量した。バーは、ｎ＝４マウスの平均値を表す。 図２３は、ｓＴＮＦＲＳＦ１４による処置後のインビボ腫瘍の分子的特徴付けを示す。 図２４は、異種移植腫瘍の免疫組織化学解析を示す。ｓＴＮＦＲＳＦ１４処理およびビヒクル処理マウスリンパ腫の病理学的解析を示す。腫瘍を動物の側腹部から切除し、４％パラホルムアルデヒドで一夜固定した。腫瘍を薄片に切断し、特定の腫瘍マーカーについてＩＨＣにより染色した。ＨＥ、タネルおよびＫｉ６７の代表的な染色を示す。 図２５Ａは、可溶性ＨＶＥＭを構成的に分泌するように改変されたＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞を用いたリンパ腫細胞への可溶性ＨＶＥＭポリペプチドの送達の概念図を示す。図２５Ｂは、可溶性ＨＶＥＭ配列（ＨＶＥＭ Ｐ３７〜Ｖ２０２）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子の概念図を示す。 図２６Ａ〜Ｂは、ｓｏｌＨＶＥＭがＴ細胞の生存または活性化に対する影響を有さないことを示す。図２６Ａは、可溶性ＨＶＥＭエクトドメイン（ｓｏｌＨＶＥＭ：１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８による刺激を用いてまたは用いずに２４時間培養した精製マウスＯＴ１細胞（ｎ＝２）の生存率を示す。図２６Ｂは、ＦＡＣＳにより同定された活性化マウスＯＴ１細胞の百分率を示す。ＯＴ１細胞は、図２６Ａにおけるのと同様に培養した。 図２７Ａ〜Ｂは、１９−２８−ＨＶＥＭ改変Ｔ細胞が、１９−２８−Ｔ細胞と比較してＨＶＥＭ産生および分泌の増加を示し（図２７Ａ）、ＦＡＣＳ選別ＣＡＲ−Ｔ上、およびＨＶＥＭについての探査されたＷＢ（図２７Ｂ）ＨＶＥＭに関するＥＬＩＳＡアッセイは、ＨＶＥＭレベルの増加を示している（ｐ＜０．１）。 図２８Ａは、１９−２８−ＨＶＥＭ改変Ｔ細胞が、対照１９−２８−Ｔ細胞と比較して、高いＢＴＬＡ発現を有するＢ細胞に対するインビトロでの細胞傷害性の増大を示すことを示す。ＤＯＨＨ２またはＲａｊｉ細胞を所定のＴ（標的）対Ｅ（エフェクターＴ細胞）の比でＧＦＰ標識ＣＡＲ−Ｔ細胞とともにインキュベートした。表示した時間に細胞をアネキシンＶおよびＤＡＰＩで標識し、ＧＦＰ−生存細胞の百分率をＦＡＣＳにより評価した。図２８Ｂは、Ｂ細胞株上のＢＴＬＡ発現のＦＡＣＳ解析が高および低表面ＢＴＬＡ発現を有する試料を識別することを示す。図２８Ｃ〜Ｄは、１９−２８−ＨＶＥＭ改変Ｔ細胞が、対照１９−２８−Ｔ細胞と比較して、ＤＯＨＨ２腫瘍に対するインビボでの細胞傷害性の増大を示すことを示す。異種移植片は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）と混合した５Ｍｉｏ ＤｏＨＨ２ヒトリンパ腫細胞のＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ）マウスの側腹部へのｓ．ｃ．注射により作製した。可視腫瘍形成（２０ｍｍ^３）時に、マウスにＨＶＥＭ分泌を伴うまたは伴わない１ Ｍｉｏ ａｎｔｉ−ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を単回投与した。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）ｓｃＦｖを含むＴ細胞を対照ＣＡＲとして用いた。図２８Ｃは、マウス屠殺時に単離した代表的な腫瘍を示す。図２８Ｄは、腫瘍サイズの定量を示す。

下文および本特許開示を通して示す小見出しは、本発明の様々な態様または実施形態の制限を意味するものでなく、本明細書を全体として参照することによって理解するものとする。例えば、この詳細な説明は、本出願の発明の概要の項と併せて読むものとし、またそれについてさらに詳細に説明するものとする。

１． 定義および略語
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、複数のものを含む。「ａ」（または「ａｎ」）という用語ならびに「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」という用語は、同義で用いることができる。

さらに、「および／または」は、他のものを含むかまたは含まない２つの指定の特徴または成分のそれぞれの個別の開示と解釈すべきである。したがって、「Ａおよび／またはＢ」のような語句に用いられる「および／または」という用語は、ＡおよびＢ、ＡまたはＢ、Ａ（単独）ならびにＢ（単独）を含むものとする。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」のような語句に用いられる「および／または」という用語は、Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）、Ｂ（単独）ならびにＣ（単独）を含むものとする。

単位、接頭辞および記号は、国際単位系（ＳＩ）で受け入れられた形で表される。本明細書で示される数値範囲は、範囲を規定する数を含む。数値用語に「約」が先行する場合、該用語は、表示された数および表示された数の±１０％値を含む。

「活性物質」は、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド、抗ＨＶＥＭ抗体もしくは抗ＢＴＬＡ抗体である、またはそれを含む本明細書で述べ、かつ／または請求する物質（例えば、分子もしくは細胞）、あるいはそのような物質のいずれかをコードするヌクレオチド配列である。活性物質は、細胞（Ｔ細胞など）、ポリペプチド／タンパク質および核酸分子を含むが、これらに限定されない。

「阻害する」、「阻止する」、「低下させる」および「抑制する」という用語は、同義で用い、活性の完全な阻止を含むが、これに限定されない、生物学的活性の統計的に有意な低下を意味する。

「ＴＮＦＲＳＦ１４」は、「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４」を意味する。

「ＨＶＥＭ」は、「ヘルペスウイルス侵入媒介因子」を意味する。

ＴＮＦＲＳＦ１４およびＨＶＥＭは、まったく同一である。したがって、ＴＮＦＲＳＦ１４およびＨＶＥＭは、本特許開示を通して同義で用いる。場合によっては、これらのタンパク質は、本明細書で「ＴＮＦＲＳＦ１４／ＨＶＥＭ」と呼ぶことができる。

「ＢＴＬＡ」は、「ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター」を意味する。

「ＢＴＬＡ陽性」および「ＢＴＬＡ^＋」という用語は、本明細書で同義で用い、ＢＴＬＡを発現する（または検出可能なレベルのＢＴＬＡを発現する）腫瘍または細胞を指す。

「ＢＴＬＡ陰性」および「ＢＴＬＡ⁻」という用語も、本明細書で同義で用い、ＢＴＬＡを発現しない（または検出可能なレベルのＢＴＬＡを発現しない）腫瘍または細胞を指す。

「ＢＴＬＡ^ｈｉ」という用語は、高レベルのＢＴＬＡを発現する腫瘍または細胞を指す。

「ＢＴＬＡ^ｌｏ」という用語は、低レベルのＢＴＬＡを発現する腫瘍または細胞を指す。

ＢＴＬＡ^＋、ＢＴＬＡ⁻、ＢＴＬＡ^ｈｉおよびＢＴＬＡ^ｌｏという用語はすべて、ＢＴＬＡの発現レベルを相対的用語で表すために用いられる。例えば、細胞または腫瘍は、ＢＴＬＡ⁻に対立するものとしてＢＴＬＡ^＋と分類することができる。同様に、細胞または腫瘍は、ＢＴＬＡ^ｌｏに対立するものとしてＢＴＬＡ^ｈｉと分類することができる。例えば、「＋」対「−」および「ｈｉ」対「ｌｏ」という用語を用いる、発現レベルを表すためのそのような相対的用語の使用は、当技術分野における標準であり、そのような用語の意味は当業者には明らかである。例えば、当業者は、適切な陽性（すなわち、ＢＴＬＡ発現）および／または陰性（非ＢＴＬＡ発現）対照と比較してＢＴＬＡ発現レベルを決定することに基づいて細胞または腫瘍をＢＴＬＡ^＋と表すことができることを理解する。同様に、当業者は、適切な高度に発現し、かつ／または弱く発現する対照と比較してＢＴＬＡ発現レベルを決定することに基づいて細胞または腫瘍をＢＴＬＡ^ｈｉと表すことができることを理解する。そのような比較による決定を下すための適切なアッセイは、実施例１に示されており、免疫組織化学およびフローサイトメトリーまたはＦＡＣＳベースのアッセイを含むが、これらに限定されない。同様に、そのような比較による決定を下すための適切な対照細胞型は、実施例１に示す。

「ＣＡＲ」は、「キメラ抗原受容体」を意味する。

「ＣＡＲ Ｔ細胞」は、ＣＡＲを発現するように操作された遺伝子改変Ｔ細胞を意味する。

様々な他の用語は、用いられる場合、本特許開示における他所で定義される。さらに、本明細書で具体的に定義されていない用語は、該用語が用いられている文脈において、かつ／または本明細書をその全体として参照することによって、より十分に理解することができる。明確な定義が示されていない場合、本明細書で用いられているすべての技術および科学用語は、本発明が関連する分野における技術者によって一般的に理解されている意味を有する。

２． ＴＮＦＲＳＦ１４／ＨＶＥＭポリペプチド
ＴＮＦＲＳＦ１４は、ヒトおよびマウス細胞への単純ヘルペスウイルス１の侵入の媒介因子として最初に同定された（Montgomery, Warner et al. 1996）。ＴＮＦＲＳＦ１４受容体は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー内の２９種の現在公知の受容体の１つである。ＴＮＦＲＳＦ１４受容体遺伝子は、複数のがんにおいてその高頻度の欠失のために腫瘍抑制因子を含むと頻繁に報告された部位である（Bagchi and Mills 2008）、ヒトにおける染色体１ｐ３６に位置する。ＴＮＦＲＳ１４は、主要なヒト組織全体にわたって発現するが、造血系の細胞において最高レベルの発現を示す。ＴＮＦＲＳＦ１４は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインまたは「エクトドメイン」を含む不溶性膜貫通タンパク質である。ＴＮＦＲＳＦ１４の細胞外ドメインは、３つのシステインリッチドメインまたはＣＲＤ１、ＣＲＤ２と呼ばれる、「ＣＲＤｓ」を含み、ＴＮＦＲＳＦ１４は、そのＣＲＤドメインを介してＴＮＦＲＳＦ１４に結合する複数の異なるリガンドと相互作用しうる。いくつかのそのようなリガンドは、リガンド「リンホトキシン様（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ）、誘導発現（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ）とＨＶＥＭについて競合する、Ｔリンパ球により発現する受容体」（または「ＬＩＧＨＴ」）およびＬＴαなどの共刺激シグナルを伝達する。他のリガンドは、ＣＤ１６０、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）ならびに「ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター」または「ＢＴＬＡ」などの共阻害シグナルを伝達する(Murphy and Murphy 2010)。

全長ヒトＴＮＦＲＳ１４／ＨＶＥＭタンパク質配列は、図２９および配列番号２に示す。配列番号２のタンパク質（すなわち、全長ヒトＴＮＦＲＳ１４／ＨＶＥＭタンパク質）をコードするヌクレオチド配列は、図２９および配列番号１に示す。全長ヒトＴＮＦＲＳ１４／ＨＶＥＭタンパク質をコードするさらなるヌクレオチド配列は、配列番号１０（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ００３８２０．３）として示す。全長マウスＴＮＦＲＳ１４／ＨＶＥＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ１７８９３１．２）として示す。全長ラットＴＮＦＲＳ１４／ＨＶＥＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ００１０１５０３４．１）として示す。全長サルＴＮＦＲＳ１４／ＨＶＥＭタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３（ＮＣＢＩ参照配列：００１０４３３５７．１）として示す。他の全長ＴＮＦＲＳ１４／ＨＶＥＭタンパク質配列およびそのようなタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列も当技術分野で公知である。本発明のいくつかの実施形態は、これらの全長ＨＶＥＭ配列を含む。

しかし、本発明の実施形態の大部分は、本明細書で「可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド」と呼ぶ全長不溶性ＨＶＥＭタンパク質の非天然型可溶性断片を含む。本特許出願の実施例の項で考察するように、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドがＢ細胞性腫瘍の増殖を阻害し、この活性がＢＴＬＡへの結合を必要とすることが今や示された。ＨＶＥＭエクトドメイン内で、ＣＲＤ１ドメインがＢＴＬＡに対する必須の結合部位であり、ＣＲＤ１ドメインの欠失がＨＶＥＭの阻害活性を阻止することが既に公知であり、ＨＶＥＭのＣＲＤ２ドメインがＢＴＬＡなどのＣＲＤ１結合リガンドの構造的支えとなるという証拠も存在する（それぞれの内容が参照により本明細書に組み込まれる、M.L.del Rio, 2010, Gonzales 2004およびBjordahl 2013を参照）。したがって、本発明の「可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド」は、少なくともＣＲＤ１ドメインを含み（かつＣＲＤ２および／またはＣＲＤ３および／または他のＨＶＥＭエクトドメイン領域を含んでいてもよく）、ＨＶＥＭ膜貫通または細胞内ドメインを含まない。さらに、本発明の「可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド」は、１つまたは複数の以下の機能特性を示す：ＢＴＬＡ^＋／ｈｉ Ｂ細胞性リンパ腫における腫瘍抑制活性（例えば、ＢＴＬＡ^＋／ｈｉ Ｂ細胞性リンパ腫におけるインビトロでのＢ細胞性リンパ腫細胞増殖および／またはインビボでの腫瘍増殖を阻害する能力）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を増大／刺激する能力、リンパ腫細胞におけるＢ細胞受容体の活性化を阻害する／低下させる能力、濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞またはリンパ腫Ｂ細胞によるＩＬ−２１の分泌を阻害する／減少させる能力、ＢＣＲ経路の活性化をＢＴＬＡ依存的に阻害する能力、ならびにＢＴＬＡ^＋／ｈｉリンパ腫細胞（例えば、ＤＯＨＨ２細胞）におけるＢＴＫ、ＳＹＫおよび／またはＥＲＫ活性化を阻害する能力。そのような機能特性を評価するための適切なアッセイは、本特許出願の実施例の項に示す。

いくつかの例示的な可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドの配列を以下の表１に要約する通りに、本明細書に示す。本明細書で述べる可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドのすべてのアミノ酸番号付けは、配列番号２に基づいている（すなわち、配列番号４は、配列番号２のアミノ酸２９〜２０２であり、配列番号６は、配列番号２のアミノ酸３７〜２０２であり、配列番号８は、配列番号２のアミノ酸３９〜２０２である等）。配列番号２のアミノ酸残基Ｃｙｓ４２〜Ｃｙｓ７５は、ＨＶＥＭのＣＲＤ１ドメインを形成する。配列番号２のアミノ酸残基Ｃｙｓ７８〜Ｃｙｓ１１９は、ＨＶＥＭのＣＲＤ２ドメインを形成する。配列番号２のアミノ酸残基Ｃｙｓ１２１〜Ｃｙｓ１６２は、ＨＶＥＭのＣＲＤ３ドメインを形成する。本特許出願の実施例の項は、そのような例示的な可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドの一部を用いて実施した実験について述べる。

いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、ＨＶＥＭタンパク質のＣＲＤ１ドメイン（例えば、配列番号２のアミノ酸残基Ｃｙｓ４２〜Ｃｙｓ７５またはそれに対応するアミノ酸残基）を含むかまたはからなるまたはから本質的になる。

いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、ＨＶＥＭタンパク質のＣＲＤ１ドメインおよびＣＲＤ２ドメイン（例えば、配列番号２のアミノ酸残基Ｃｙｓ４２〜Ｃｙｓ７５および配列番号２のアミノ酸残基Ｃｙｓ７８〜Ｃｙｓ１１９またはそれに対応するアミノ酸残基）を含むかまたはからなるまたはから本質的になる。

いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、ＨＶＥＭタンパク質のＣＲＤ１ドメイン、ＣＲＤ２ドメインおよびＣＤＲ３ドメイン（例えば、配列番号２のアミノ酸残基Ｃｙｓ４２〜Ｃｙｓ７５および配列番号２のアミノ酸残基Ｃｙｓ７８〜Ｃｙｓ１１９および配列番号２のアミノ酸残基Ｃｙｓ１２１〜Ｃｙｓ１６２またはそれに対応するアミノ酸残基）を含むかまたはからなるまたはから本質的になる。

いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、ＣＲＤ２ドメインを含まない。

いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、ＣＲＤ３ドメインを含まない。

いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、ＣＲＤ２またはＣＲＤ３ドメインを含まない。

いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、配列番号４、配列番号６または配列番号８のアミノ酸配列またはそれに対応するアミノ酸配列を含むかまたはからなるまたはから本質的になる。

いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１もしくは４２から始まるアミノ酸配列またはそれに対応するアミノ酸残基を含むかまたはからなるまたはから本質的になる。

いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１もしくは４２から始まり、配列番号２のアミノ酸７５、７６もしくは７７で終わるアミノ酸配列またはそれに対応するアミノ酸残基（すなわち、ＣＤＲ１ドメインを含む）を含むかまたはからなるまたはから本質的になる。

いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１もしくは４２から始まり、配列番号２のアミノ酸１１９もしくは１２０で終わるアミノ酸配列またはそれに対応するアミノ酸残基（すなわち、ＣＲＤ１およびＣＲＤ２ドメインを含む）を含むかまたはからなるまたはから本質的になる。

いくつかの実施形態において、本発明の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１もしくは４２から始まり、配列番号２のアミノ酸１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８もしくは２０９で終わるアミノ酸配列またはそれに対応するアミノ酸残基（すなわち、ＣＲＤ、ＣＲＤ２およびＣＲＤ３ドメインを含む）を含むかまたはからなるまたはから本質的になる。

当業者は、他の配列が異なる番号付けスキームを利用するかまたは異なるＨＶＥＭ配列に存在する（異なる種に由来するＨＶＥＭ配列におけるような）かどうかにかかわらず、例えば、配列番号２の配列との配列アライメントを実施することによって、本明細書で規定した特定のアミノ酸残基のいずれかに「対応する」他の配列におけるアミノ酸位置を容易に決定し、かつ／または同定することができることを留意すべきである。本明細書で示した番号付けされた配列または番号付けされたアミノ酸残基のすべてについて、そのような配列／残基に「対応する」配列およびアミノ酸残基も予測され、本明細書に含まれることも留意すべきである。

上文および本特許開示における他所に示す特定の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド配列のいずれかの変異体も予測され、本発明の範囲内にあるものとする。例えば、いくつかの実施形態において、他の種に由来する本明細書で開示する特定の配列の変異体（オルソログ）を用いることができる。同様に、他の実施形態において、本明細書で開示する特定の配列のいずれかの断片を含む変異体を用いることができる。同様に、いくつかの実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸置換、付加、欠失または他の突然変異を含む本明細書で開示する特定の配列の変異体を用いることができる。いくつかの実施形態において、変異型アミノ酸配列は、本明細書で述べた特定の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドとの少なくとも約４０％または５０％または６０％または６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％の同一性を有する。すべてのそのような場合において、すべての変異型可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、ＣＲＤ１ドメイン、またはＢＴＬＡに結合するのに十分であるその一部を含むべきであり、それらは、以下の機能特性：ＨＶＥＭ活性化、ＢＴＬＡ活性化、ＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫細胞の増殖の阻害、ＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫の増殖の阻害、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の刺激、Ｂ細胞性リンパ腫細胞におけるＢ細胞受容体の活性化の阻害、濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞によるＩＬ−２１の分泌の阻害、Ｂ細胞性リンパ腫細胞によるＩＬ−２１の分泌の阻害、ＢＣＲ経路の活性化の阻害、ならびにＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫細胞におけるＢＴＫ、ＳＹＫおよび／またはＥＲＫの活性化の阻害のうちの１つまたは複数を示すべきである。そのような機能特性を評価するための適切なアッセイは、本特許出願の実施例の項に示す。

本特許開示により予測されるまたは述べた可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドのすべてが、いくつかの実施形態において、分泌シグナル配列を含みうる、あるいは分泌シグナル配列を含む前駆体型により発現されうることを留意すべきである。いくつかの実施形態において、ＩｇＧカッパ分泌シグナルを用いる。他の実施形態において、インターロイキン２（ＩＬ２）分泌シグナルを用いる。しかし、当技術分野で公知の任意の適切な分泌シグナル配列を用いることができる。

アミノ酸配列を提供することに加えて、本発明は、核酸配列も提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３、配列番号５または配列番号７のヌクレオチド配列を含む、またはからなる、またはから本質的になるものを含むが、これらに限定されない、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。本発明は、特定の配列が開示され、そのような配列の様々な変異体が本明細書に記載されているものを含む、本明細書で述べた可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドのすべてをコードするヌクレオチド配列を予測し、提供する。本発明はまた、本明細書で述べた、あるいは本明細書で述べた可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドのいずれかをコードする、核酸分子および／またはヌクレオチド配列のいずれかを含むＤＮＡコンストラクト（例えば、ベクターおよびプラスミド）を提供する。

本発明はまた、本明細書で述べた、あるいは本明細書で述べた可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドのいずれかをコードする、核酸分子および／またはヌクレオチド配列のいずれかを含む遺伝子改変細胞を提供する。

本発明は、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドの使用を主として対象とするが、場合によっては、そのような可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドに存在する配列を含む不溶性（すなわち、膜結合）タンパク質を使用することが可能でありうることを留意すべきである。可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドを発現する（かつ分泌する）ＣＡＲ Ｔ細胞を含む実施形態において、ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドがＴ細胞によって分泌されるのでなく、膜結合性であり、Ｔ細胞の表面上に提示されるという、不溶（すなわち、膜結合）型のＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドを発現するＣＡＲ Ｔ細胞を使用することが、場合によって可能でありうる。そのような実施形態は、本発明の範囲内にあるものとする。したがって、特に述べない限り、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドを含む本発明のそれらの実施形態のすべては、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドに存在する配列ならびに細胞膜（例えば細胞の表面上）におけるそのような配列の提示をもたらす他の配列を含むそのようなポリペプチドの不溶性変異体を用いて実施することができる。

３． 抗体（抗ＨＶＥＭおよび抗ＢＴＬＡ抗体を含む）
本発明のいくつかの実施形態は、抗体を含む。本明細書で用いているように、「抗体」という用語は、抗体が抗原認識部位を含み、所望の生物学的活性を示す限り、完全ポリクローナル抗体、完全モノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ、ならびに単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂまたはナノボディ）など）、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、少なくとも２つの完全抗体から作製された二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体および抗原認識部位を含む他の改変免疫グロブリン分子（複数可）を含む。様々な異なる種類の抗体断片ならびにそのような抗体断片を製造し、使用する方法は、当技術分野で公知である。ナノボディレパートリー多重特異性抗体の製造の説明については、例えば、Fridy et al., Nature Methods. 2014 Dec;11(12):1253-60（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づく、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭという５種の主要なクラスの免疫グロブリンまたはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれかでありうる。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる、周知のサブユニット構造および三次元配置を有する。抗体は、裸でありうるかまたは毒素、放射性同位体などの他の分子、もしくは本明細書で列挙した他の特定の分子のいずれかにコンジュゲートさせうる。

いくつかの実施形態において、本発明は、ＢＴＬＡに対する抗体および／またはＨＶＥＭに対する抗体を含む。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、適切な種類の抗ＢＴＬＡ抗体または抗ＨＶＥＭ抗体でありうる。特定の好ましい実施形態において、ＢＴＬＡまたはＨＶＥＭに結合する抗体断片を用いる。例えば、特定の実施形態において、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ（ナノボディ）断片を用いる。特定の好ましい実施形態において、抗体断片は、ｓｃＦｖ断片である。他の好ましい実施形態において、抗体断片は、ナノボディである。特定の実施形態において、そのような抗体（抗体断片を含む）は、それらのそれぞれの標的抗原（すなわち、ＢＴＬＡまたはＨＶＥＭ）に高い親和性および／または高い特異性で結合する。特定の好ましい実施形態において、そのような抗体（抗体断片を含む）は、Ｂ細胞の表面上のそれらのそれぞれの標的抗原（すなわち、ＢＴＬＡまたはＨＶＥＭ）に結合し、かつ活性化する。すなわち、それらは、それらのそれぞれの標的抗原に対するアゴニストとして作用する。例えば、そのような活性化／アゴニスト抗体は、それらのそれぞれの標的抗原（すなわち、ＢＴＬＡまたはＨＶＥＭ）の１つまたは複数の天然リガンドの生物学的活性を模倣しうる。ＢＴＬＡに対して特異的である抗体（抗体断片を含む）の例は、国際公開第２０１０１０６０５１号に記載されており、ＨＶＥＭに対して特異的であるものは、Park et al., Cancer Immunol. Immunother. 2012 Feb;61(2):203-14に記載されている。しかし、任意の他の適切な抗体（抗体断片を含む）を用いることができる。

「ヒト化抗体」という用語は、最小限の非ヒト（例えば、マウス）配列を含むように操作された、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する抗体を意味する。一般的に、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が所望の特異性、親和性および機能を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはハムスター）のＣＤＲの残基により置換されているヒト免疫グロブリンである（Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536）。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＷ）残基が所望の特異性、親和性および機能を有する非ヒト種に由来する抗体における対応する残基で置換されている。

ヒト化抗体は、抗体の特異性、親和性および／または機能を精密化および最適化するためにＦｖフレームワーク領域および／または置換された非ヒト残基内におけるさらなる残基の置換によりさらに改変することができる。一般的に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべての非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域を含む実質的にすべての少なくとも１つ、一般的に２つまたは３つの可変ドメインを含むが、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的にヒト免疫グロブリンのそれも含みうる。ヒト化抗体を作製するために用いられる方法の例は、米国特許第５，２２５，５３９号または第５，６３９，６４１号に記載されている。

「ヒト抗体」という用語は、ヒトにより産生された抗体または当技術分野で公知の任意の技術を用いて作製されたヒトにより産生された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、完全もしくは全長抗体、その断片、ならびに／または、例えば、マウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドなどの少なくとも１つのヒト重鎖および／もしくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。

「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つまたはそれ以上の異なる源、一般的に２つまたはそれ以上の異なる種に由来する抗体を意味する。一般的に、軽および重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性および機能を有する哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）の１つの種に由来する抗体の可変領域に対応するが、定常領域は、当該種における免疫応答を惹起することを避けるために他（通常ヒト）に由来する抗体における配列と相同である。

「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、高度に特異的な認識および単一抗原決定基またはエピトープの結合に関与する同種抗体集団を意味する。これは、一般的に異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含む「ポリクローナル抗体」と対照的である。

さらに、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現およびトランスジェニック動物による方法を含むが、これらに限定されないあらゆる方法で作製されるそのような抗体を意味する。

とりわけ、モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495により記載されているハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物に上述のように免疫処置を施して、免疫抗原に特異的に結合する抗体のリンパ球による産生を誘発する。リンパ球は、インビトロでも免疫化することができる。免疫化の後、リンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを用いて適切な骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成し、次いでこれを非融合リンパ球および骨髄腫細胞から分離して選択することができる。免疫沈降、免疫ブロッティングにより、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））により判定される選択される抗原に対して特異的に誘導されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、次に標準的方法（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986）を用いたインビトロでの培養においてまたは動物における腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。次いでモノクローナル抗体は、培養培地または腹水から精製することができる。

あるいは、モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている、組換えＤＮＡ法を用いて作製することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲなどにより、成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から単離し、それらの配列を通常の手順を用いて決定する。次いで重および軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドを適切な発現ベクターにクローニングし、ベクターを、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトし、モノクローナル抗体を宿主細胞により産生させる。また、所望の種の組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、記載されたように所望の種のＣＤＲｓを発現するファージディスプレイライブラリーから単離することができる（McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597）。

ポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の様々な手順により産生させることができる。例えば、ウサギ、マウス、ラット等のような宿主動物を抗原の注射により免疫処置して、抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導することができる。抗原は、天然、合成もしくは発現タンパク質またはそれらの誘導体（例えば、断片）を含みうる。免疫応答を増強させるために、宿主種に応じて、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、多価アニオン、ぺプチド、油乳剤、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノールならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルヴムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない、様々なアジュバントを用いることができる。そのようなアジュバントも当技術分野で周知である。抗体は、宿主の血清から精製することができる。

４． ＣＡＲ Ｔ細胞を含む組成物および方法
がん免疫療法は、患者の腫瘍を認識し、攻撃するように患者自身の免疫細胞を操作することを含み、これは、養子細胞移植（ＡＣＴ）としばしば呼ばれるアプローチである。そのような方法は、リンパ腫の処置のためのものを含む、現在までの臨床試験において有望な結果をもたらした。ＡＣＴにおいて、患者自身の血液から採取したＴ細胞を遺伝子操作して、キメラ抗原受容体または「ＣＡＲｓ」と呼ばれるそれらの表面上の組換え受容体を生成させる。ＣＡＲｓは、患者の腫瘍細胞上の特定の細胞表面抗原を認識し、それに結合するように設計された抗原結合ドメインを含む。操作されたＣＡＲ Ｔ細胞をインビトロで増殖させ、次いで患者に注入する。注入後、Ｔ細胞は、患者の体内で増殖し、該細胞表面抗原を発現する患者におけるがん細胞を認識し、殺滅することができる。リンパ腫に関する数件を含む、進行中の数件のＣＡＲ Ｔ細胞臨床試験が存在する。数件のリンパ腫試験は、ＣＤ１９がリンパ腫細胞の表面上に高頻度で発現することから、ＣＤ１９抗原に結合するように設計されたＣＡＲ（すなわち、ＣＤ１９特異的ＣＡＲｓ）を発現するＣＡＲ Ｔ細胞の使用を含む。ＣＤ２０特異的、ＣＤ２２特異的またはＣＤ３０特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を利用する進行中のリンパ腫試験も存在する。リンパ腫のＣＤ１９−ＣＡＲ Ｔ細胞療法を含む、ＣＡＲ Ｔ細胞療法および臨床試験に関するさらなる説明についてはBrentjens, Riviere et al. 2011、Brentjens, Davila et al. 2013、Sadelain 2015、Jackson, Rafiq et al. 2016、Ramos, Heslop et al. 2016を参照のこと。これらの参考文献のそれぞれの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明のいくつかの実施形態は、ＣＡＲｓ、ＣＡＲ Ｔ細胞およびＣＡＲ Ｔ細胞療法／リンパ腫の処置のためのＡＣＴを含む。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列および可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含むベクターおよびヌクレオチド配列を提供する。同様に、他の実施形態において、本発明は、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列およびＨＶＥＭまたはＢＴＬＡに結合する抗体（抗体断片など）をコードするヌクレオチド配列の両方を含むベクターおよびヌクレオチド配列を提供する。そのようなベクターによるＴ細胞の形質導入は、所望のキメラ抗原受容体を発現し、本明細書で述べた所望の活性物質（例えば、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド、ＨＶＥＭ抗体またはＢＴＬＡ抗体）も発現し、分泌するＣＡＲ Ｔ細胞の産生をもたらす。いくつかの実施形態において、本発明は、同じ核酸分子内のＣＡＲおよびＨＶＥＭ配列を含む本明細書で述べた特定の改変ベクターの１つによる形質導入後か、または別個のＣＡＲコードおよび可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドコード核酸分子／ベクターによる形質導入後かにかかわらず、ＣＡＲおよび可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドの両方を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を提供する。同様に、いくつかの実施形態において、本発明は、同じ核酸分子内のＣＡＲおよび抗体配列を含む本明細書で述べた特定の改変ベクターの１つによる形質導入後か、または別個のＣＡＲコードおよび抗体コード核酸分子／ベクターによる形質導入後かにかかわらず、ＣＡＲおよびＨＶＥＭ抗体もしくはＢＴＬＡ抗体の両方を発現するＣＡＲ Ｔ細胞を提供する。本発明は、そのようなＣＡＲ Ｔ細胞を利用する処置の方法も提供する。そのような実施形態において、ＣＡＲは、目的の細胞、すなわち、ＢＴＬＡ^＋／ｈｉ Ｂ細胞性リンパ腫細胞を含む、Ｂ細胞性リンパ腫細胞の表面上に発現する任意の適切な細胞表面受容体に結合するものでありうる。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ、ＣＤ２０特異的ＣＡＲ、ＣＤ２２特異的ＣＡＲ、ＣＤ３０特異的ＣＡＲ、Ｉｇｋ特異的、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲまたは任意の他の適切な細胞表面受容体に結合するＣＡＲでありうる。

ＣＡＲｓおよびＣＡＲ Ｔ細胞を作製し、使用する方法は、当技術分野で公知であり、本発明の組成物および方法は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞をどのように作製し、使用するかを教示する文献を含む、ＣＡＲ Ｔ細胞の作製および使用に関する既存の文献を参照することによって作製し、使用することができる。例えば、本明細書では、参照によりその全体の内容が本明細書に組み込まれる、以下の参考文献を参照する：（Brentjens, Santos et al. 2007、Pegram, Purdon et al. 2015）。本発明は、公知のＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞スキームを含む、現在のＣＡＲ Ｔ細胞スキームの特定の改変を提供する。例えば、本発明の組成物および方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞により分泌される可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドによるＢ細胞性リンパ腫の標的処置を可能にするために用いることができる。このアプローチの概念図は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲｓを例として示す、図２５に示す。同様に、本発明の組成物および方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞により分泌される抗ＨＶＥＭまたは抗ＢＴＬＡ抗体によるＢ細胞性リンパ腫の標的処置を可能にするために用いることができる。これは、例えば、図２５の概略図に示す可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド配列を抗ＨＶＥＭまたは抗ＢＴＬＡ抗体をコードする配列により置換することによって実現されうる。

一実施形態において、本発明は、ＣＡＲ Ｔ細胞の作製のための特定の新規ベクターを提供する。一実施形態において、本発明は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列および（ｂ）可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。他の実施形態において、本発明は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列および（ｂ）抗ＨＶＥＭ抗体または抗ＢＴＬＡ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。いくつかのそのような実施形態において、核酸分子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの、レポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である所望の特異性のＣＡＲをコードする任意の適切な配列でありうる。例えば、一実施形態において、該配列は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲをコードするＳＦＧ−１９２８ｚベクターのそれでありうる。そのようなＳＦＧ−１９２８ｚベクターは、当技術分野で公知である。例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４１３４１６５号を参照のこと。しかし、他のＣＤ１９特異的ＣＡＲｓの配列および異なる特異性を有するＣＡＲｓは、当技術分野で公知であり、本明細書で用いることができる。可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本明細書で述べ、定義したような、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列でありうる。抗ＨＶＥＭまたは抗ＢＴＬＡ抗体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、本明細書でさらに述べ、定義したような、任意の適切なヌクレオチド配列でありうる。好ましい実施形態において、分泌シグナルは、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または抗体をコードするヌクレオチド配列の上流に含まれる。核酸分子／ベクターにおける可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド（または抗ＨＶＥＭもしくは抗ＢＴＬＡ抗体）をコードするヌクレオチド配列に対するＣＡＲをコードするヌクレオチド配列の配置は、変化させることができる。図２５に可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドの発現のための１つの例示的配置を示す。しかし、例えば、内部リポソーム侵入部位、タンパク質分解切断部位または他の適切な手段を用いて、同じベクターからのＣＡＲ分子および可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド（または抗ＨＶＥＭもしくは抗ＢＴＬＡ抗体）の両方の発現を可能にする他の配置を用いることができる。図２５に示すそれを含む、いくつかの実施形態において、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをＧＦＰ融合体として最初に発現させ、次いで、例えば、Ｐ２Ａタンパク質分解切断／認識配列を含めることの結果として、ＧＦＰおよびＨＶＥＭ成分をタンパク質分解により開裂させる。これにより、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドの発現をモニターするための代用としてＧＦＰ発現を用いることが可能になる。いくつかの実施形態において、種々の発現レポーター／マーカーをＧＦＰの代わりに用いることができる。あるいは、他の実施形態において、発現レポーターを用いる必要がない。

５． 標的送達のための非ＣＡＲ Ｔ細胞ベースの組成物および方法
いくつかの実施形態において、本発明は、リンパ腫細胞への本明細書で述べた活性物質（可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドおよび抗ＨＶＥＭまたは抗ＢＴＬＡ抗体）の標的送達に有用なある特定の非ＣＡＲベースの組成物および方法を提供する。そのような組成物および方法は、例えば、対象の腫瘍における、リンパ腫細胞上にまたはその近傍に発現する分子に結合しうる適切な「ターゲティング剤」を用いることを含む。いくつかのそのような実施形態において、ターゲティング剤は、抗体または抗体の抗原結合ドメインでありうる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド（または抗ＨＶＥＭもしくは抗ＢＴＬＡ抗体）および（ｂ）Ｂ細胞性リンパ腫細胞（例えば、ＢＴＬＡ^＋リンパ腫細胞）上の細胞表面抗原に対して特異的である抗体または抗体の抗原結合ドメインの両方を含む組成物を提供する。いくつかのそのような実施形態において、組成物は、融合タンパク質であるかまたは含むものであって、該融合タンパク質は、（ａ）可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド（または抗ＨＶＥＭもしくは抗ＢＴＬＡ抗体）および（ｂ）Ｂ細胞性リンパ腫細胞（例えば、ＢＴＬＡ^＋リンパ腫細胞）上の細胞表面抗原に対して特異的である抗体または抗体の抗原結合ドメインの両方を含む。しかし、他の実施形態において、当組成物は、所望のリンパ腫細胞に活性物質を特異的に送達するために組成物の抗体成分を用いることができるナノ粒子、リポソーム、ポリマーミセル、リポタンパク質ベースの薬物担体、デンドリマー中、または他の適切なビヒクル中などに、両成分を個別に含みうる。いくつかの実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＢＴＬＡ、ＩｇｋおよびＲＯＲ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ターゲティング剤は、リツキシマブ（ＣＤ２０特異抗体）またはその抗原結合ドメインでありうる。

６． 処置の方法
本発明の実施形態のいくつかは、処置の方法を含む。本明細書で用いているように、「処置する」、「処置すること」および「処置」という用語は、対象におけるＢ細胞性リンパ腫の１つまたは複数の臨床指標または症状の検出可能な改善をもたらす処置的手段を意味する。例えば、そのような用語は、少なくとも１つの臨床指標または症状を一時的にまたは永続的に改善すること、緩和すること、減弱させること、回復させること、軽減すること、低下させること、阻害すること、予防すること、もしくは遅くすること、さらなる臨床指標または症状を予防すること、１つもしくは複数の臨床指標または症状の進行を低減または緩徐化すること、１つもしくは複数の臨床指標または症状の後退をもたらすこと等を含む。例えば、本発明によりＢ細胞性リンパ腫を「処置すること」は、Ｂ細胞性リンパ腫（またはＢ細胞性リンパ腫細胞）の増殖の速度を低下させること、Ｂ細胞性リンパ腫（またはＢ細胞性リンパ腫細胞の）の増殖を停止させること、Ｂ細胞性リンパ腫（またはＢ細胞性リンパ腫細胞の）の退縮をもたらすこと、Ｂ細胞性リンパ腫の腫瘍のサイズ（例えば、腫瘍容積または腫瘍質量について測定した）を低下させること、Ｂ細胞性リンパ腫の腫瘍の悪性度を低下させること、Ｂ細胞性リンパ腫腫瘍（またはＢ細胞性リンパ腫腫瘍細胞）を除去すること、Ｂ細胞性リンパ腫の腫瘍の再発（逆戻り）を予防すること、遅らせることまたは遅くすること、Ｂ細胞性リンパ腫に随伴する症状を改善すること、Ｂ細胞性リンパ腫患者の限られた生存期間（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅｄ）を改善すること、Ｂ細胞性リンパ腫の広がり（例えば、転移）を阻害するもしくは低下させること等を含むが、これらに限定されない。同様に、Ｂ細胞性リンパ腫を「処置すること」は、患者の腫瘍における、Ｂ細胞受容体の活性化を低下させること、ＩＬ−２１分泌濾胞性ヘルパーＴ細胞の活性を低下させること、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を増大させることを含みうるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本明細書で述べる処置の方法は、他の薬剤（ＤＮＡ損傷剤、抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ、イブルチニブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびイデラリシブを含むが、これらに限定されない）、外科的方法（例えば、腫瘍切除のための）、放射線処置法、化学療法剤による処置、放射線療法、免疫療法、養子細胞移植（ＡＣＴ）、ＥｐｈＡ７腫瘍抑制タンパク質の標的送達、他の適切な方法による処置を含むが、これらに限定されない、Ｂ細胞性リンパ腫の処置に有用な他の処置の方法と併用して実施することができる。同様に、特定の実施形態において、本明細書で示した処置の方法は、生検法および診断法（例えば、ＭＲＩ法または他の撮像法）などの、疾患の状態／進行をモニターするために用いられる手法と一緒に用いることができる。

６．１ 対象
本明細書で同義で用いる、「対象」、「個体」および「患者」という用語は、診断、予後診断または処置が望ましい、あらゆる対象、好ましくは哺乳類対象、最も好ましくはヒト対象を意味するものとする。哺乳類対象は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモットなどを含む、ヒト、家畜、飼育動物、スポーツ動物および動物園の動物を含む。

本発明の実施形態の大部分において、対象は、Ｂ細胞性リンパ腫を有するかまたは有すると疑われている。いくつかのそのような実施形態において、Ｂ細胞性リンパ腫は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）である。他の実施形態において、Ｂ細胞性リンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。

いくつかの実施形態において、対象は、ＢＴＬＡ^＋（すなわち、検出可能なレベルのＢＴＬＡを発現する）もしくはＢＴＬＡ^ｈｉ（すなわち、高レベルのＢＴＬＡを発現する）である、Ｂ細胞性リンパ腫を有するかまたはリンパ腫細胞を含むＢ細胞性リンパ腫を有する。

いくつかの実施形態において、対象は、ＨＶＥＭ−（すなわち、検出可能なレベルのＨＶＥＭを発現しない）またはＨＶＥＭｌｏ（すなわち、低レベルのＨＶＥＭを発現する）であり、またはＨＶＥＭの正常な腫瘍抑制機能を阻害するもしくは妨げるまたはＢ細胞性リンパ腫患者における不良なアウトカムに関連する突然変異などの、１つもしくは複数のＨＶＥＭ突然変異を含むＢ細胞性リンパ腫を有するかあるいはリンパ腫細胞を含むＢ細胞性リンパ腫を有する。多くのそのようなＨＶＥＭ突然変異は、当技術分野で公知である。

６．２ 投与経路
本明細書で示した様々な異なる「活性物質」は、全身投与または局所投与を含む、任意の適切な経路を経て対象に投与することができる。「全身投与」は、活性物質が例えば、腸、非経口、吸入または経皮経路を経て循環系に入るように活性物質を投与することを意味する。腸投与経路は、消化管を含み、制限なく、経口、舌下、口腔内および直腸送達を含む。非経口投与経路は、消化管以外の経路を含み、制限なく、静脈内、筋肉内、腹腔内、脊髄内および皮下を含む。好ましくは非経口投与を用いる。より好ましくは、静脈内非経口投与を用いる。「局所投与」は、医薬組成物をその作用が望ましい場所（例えば、Ｂ細胞性リンパ腫の部位または近く）に、例えば、直接腫瘍内注射により、直接投与することを意味する。用いられる特定の活性物質の性質および処置される特定のＢ細胞性リンパ腫の性質を考慮に入れて、適切な投与経路を選択することは、当業者の技術の範囲内にある。

６．３ 有効量
本明細書で開示した活性物質、組成物または医薬組成物の「有効量」は、上の「処置」の定義で述べた１つもしくは複数のアウトカムを達成するのに、または達成することに寄与するのに十分な量である。個々の場合における適切な「有効」量は、用量漸増試験などの、当技術分野で公知の標準的技術を用いて決定することができ、活性物質の性質、所望の投与経路、所望の投与頻度、処置される特定のＢ細胞性リンパ腫、対象、年齢、性別および／または体重等のような因子を考慮に入れて決定することができる。さらに、「有効量」は、用いられる任意の他の処置との関連で決定することができる。例えば、本明細書で述べた活性物質を他の処置法または他の薬剤と併用して投与または使用すべきある状況においては、有効量は、そのようなさらなる処置法が用いられない場合よりも低い可能性がある。

７． 対象が処置の候補であるかどうかを判定する方法
いくつかの実施形態において、本発明は、対象が本明細書で示した組成物または方法のいずれかを用いる処置の候補であるかどうかを判定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、そのような方法は、対象のＢ細胞性リンパ腫またはＢ細胞性リンパ腫細胞における、ＨＶＥＭの発現もしくは活性の低下もしくは非存在、またはＨＶＥＭ突然変異の存在を判定すること、または測定すること、または検出することを含み、それにより、対象のＢ細胞性リンパ腫またはＢ細胞性リンパ腫細胞がＨＶＥＭの発現もしくは活性の低下もしくは非存在、またはＨＶＥＭ突然変異の存在を示す場合、対象は、処置の候補でありうる。同様に、他の実施形態において、そのような方法は、対象のＢ細胞性リンパ腫またはＢ細胞性リンパ腫細胞におけるＢＴＬＡの発現、もしくは高レベルの発現を判定すること、または測定すること、または検出することを含み、それにより、対象のＢ細胞性リンパ腫またはＢ細胞性リンパ腫細胞が検出可能なレベルのＢＴＬＡを発現する（すなわち、ＢＴＬＡ^＋である）または高レベルのＢＴＬＡを発現する（すなわち、ＢＴＬＡ^ｈｉである）場合、対象は、処置の候補でありうる。さらに、他の実施形態において、そのような方法は、これらの２つのアプローチの組合せ、すなわち、対象のＢ細胞性リンパ腫またはＢ細胞性リンパ腫細胞における（ａ）ＨＶＥＭの発現もしくは活性の低下もしくは非存在、またはＨＶＥＭ突然変異の存在、および（ｂ）ＢＴＬＡの発現、もしくは高レベルの発現の両方を判定すること、または測定すること、または検出することを含む。

８． 組成物
本発明のいくつかの実施形態は、組成物、例えば、医薬組成物を含む。「組成物」という用語は、本明細書で述べた少なくとも１つの「活性物質」、ならびに希釈剤、緩衝液、生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水など）、細胞培養培地および同類のものなどの、１つまたは複数のさらなる成分を含む組成物を意味する。そのような「組成物」が「医薬組成物」である場合、１つまたは複数のさらなる成分は、希釈剤、緩衝液、生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水など）、担体、安定化剤、分散剤、懸濁化剤および同類のものなどの、生存対象への送達に適する成分でなければならない。

「医薬組成物」という用語は、有効成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、組成物が投与される対象に対して容認でいないほどに有毒であるさらなる成分を含まない製剤を意味する。医薬組成物は、多数の剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤、水剤、軟ゲル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、チンキ剤、フィルム剤、散剤、ヒドロゲル、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、ムース剤、泡剤、ラッカー剤、噴霧剤、エアゾール剤、吸入剤、ネブライザー、点眼剤、貼付剤、坐剤および／または浣腸剤でありうる。医薬組成物は、一般的に薬学的に許容される担体を含み、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸もしくはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール）、浸透促進剤、生物学的利用能を増大させるための吸収促進剤および／または他の通常の可溶化剤もしくは分散剤の１つまたは複数のものを含みうる。剤形および賦形剤の選択は、送達すべき活性物質および処置または予防すべき疾患または障害に依存し、当業者には日常的なものである。

本発明を以下の非限定的な実施例においてさらに説明する。これらの実施例におけるカッコ内の数は、この実施例の項に続く参考文献一覧における番号付け参考文献を指す。

Ｂ細胞性リンパ腫におけるＨＶＥＭ不活性化の役割ならびに可溶性ＨＶＥＭポリペプチドによる処置のインビトロおよびインビボ効果
この実施例に提示する結果は、ＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ相互作用がＢ細胞性リンパ腫における腫瘍抑制機能を有することを示しており、また重要なことに、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインタンパク質の投与がインビボでこれらの作用を逆転させ、リンパ腫の増殖を阻止することを示している。

特に断らない限り、実施例１または図１〜１４における「ｓｏｌＨＶＥＭ」への任意の言及は、配列番号８のＬｅｕ３９〜Ｖａｌ２０２可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド（配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされる）を指す。

胚中心（ＧＣ）微小環境がＢ細胞性リンパ腫の病因に関連付けられている。しかし、リンパ腫の遺伝的病因を微小環境に関連付ける明確な機序は、明確にされていない。ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）受容体遺伝子は、ＧＣリンパ腫におけるとりわけ最も高頻度の突然変異遺伝子である。ＨＶＥＭの喪失は、増殖シグナルの細胞自己活性化をもたらし、インビボでのＧＣリンパ腫の発生を誘導する。さらに、ＨＶＥＭ欠損リンパ腫Ｂ細胞は、リンパ基質の活性化の激化および濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞の動員の増大によって特徴付けられる腫瘍許容性微小環境を形成する。これらの変化の大部分は、ＨＶＥＭとＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター）との間の阻害性の細胞間相互作用の分断に起因する。重要なことに、ＨＶＥＭエクトドメインタンパク質断片（ｓｏｌＨＶＥＭ Ｌ３９〜Ｖ２０２またはＰ３７〜Ｖ２０２）の外因性投与が、インビボでの増殖シグナルを弱め、サイトカインの産生を正常化し、リンパ腫の増殖を阻止することが今や見出された。したがって、ＨＶＥＭの喪失は、外因性介入を直接受けることができる（amendable）Ｂ細胞およびそれらの微小環境に対する二重の効果によりリンパ腫の発生を促進する。

実施例１に関する導入および背景
大部分のヒトリンパ腫は、胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞から生じる。これらは、重大な健康上の課題をもたらし続けているびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）および濾胞性リンパ腫（ＦＬ）を含む。最近のゲノム研究で、リンパ腫の病因に対する新たな重要な洞察が得られ、再発性ゲノム病変が分類された（Challa-Malladi et al., 2011; Cheung et al., 2010; Lohr et al., 2012; Morin et al., 2011; Okosun et al., 2014; Oricchio et al., 2011; Pasqualucci et al., 2014）。さらに、胚中心（ＧＣ）微小環境は、リンパ腫の発生における重要な因子として議論された（Ame-Thomas et al., 2007; Amin et al., 2015; Mourcin et al., 2012; Pangault et al., 2010）。しかし、ＧＣ微小環境をＧＣリンパ腫の発生に関連付ける明確な機序は、不明である。

ＧＣ微小環境は、Ｂ細胞機能の大部分の態様に重要であり、リンパ腫の発生および持続に寄与しうる。ＧＣｓは、複数の造血および支質細胞型から構成されている動的構造である（Chang and Turley, 2015; De Silva and Klein, 2015）。例えば、主なリンパ基質細胞サブタイプ、線維芽細胞性網状細胞（ＦＲＣｓ）および濾胞性樹状細胞（ＦＤＣｓ）は、Ｂ細胞の動員、生存および分化に寄与する（Aguzzi et al., 2014; Fletcher et al., 2015）。そして、活性化Ｂ細胞は、ＦＲＣｓおよびＦＤＣｓを刺激するＴＮＦファミリーサイトカインＴＮＦαおよびＬＴａ１ｂ２を産生する（Roozendaal and Mebius, 2011）。これらの支質細胞に由来するＣＸＣＬ１３は、次にＣＤ４０ＬならびにサイトカインＩＬ−４およびＩＬ−２１の分泌によりＢ細胞を支持するＴＦＨ細胞の主要な誘引物質である（Crotty, 2014）。特に、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）Ｂ細胞は、悪性Ｂ細胞とのクロストーク（ｃｒｏｓｓｔａｌｋ）の結果としてのリンパ腫形成のための許容性適所を形成すると考えられる（Ame-Thomas and Tarte, 2014; Mourcin et al., 2012; Rehm et al., 2011）、ＧＣ微小環境に対する強い依存性を保持している。

がん特異的遺伝子の変化は、基礎をなす腫瘍生物学を明らかにしうるものである。例えば、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入媒介因子；ＴＮＦＲＳＦ１４）受容体遺伝子における体細胞性突然変異は、ＧＣリンパ腫におけるとりわけ最も高頻度の遺伝子病変であり、予後と可変的に関連付けられた（Cheung et al., 2010; Launay et al., 2012; Lohr et al., 2012）。正確には、ＨＶＥＭ突然変異がＧＣリンパ腫の生物学にどのように寄与するのかは、公知でない。

Ｔリンパ球におけるＨＶＥＭ受容体の研究は、この受容体の機能についての我々の現在の知識を知らせている。Ｔリンパ球において、ＨＶＥＭが、ＬＩＧＨＴまたはＣＤ１６０受容体に結合することによって細胞−細胞相互作用を刺激することに従事するのに対して、ＨＶＥＭが、ＢＴＬＡ受容体（ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター）に結合することによって阻害シグナルをもたらす（Bjordahl et al., 2013; Cai and Freeman, 2009; Pasero et al., 2012; Steinberg et al., 2011）。ＨＶＥＭおよびそのパートナー受容体の発現は、系統制限的である。例えば、正常Ｂ細胞は、それらの分化および活性化段階に応じてＨＶＥＭおよびＢＴＬＡを可変的に発現するが、ＬＩＧＨＴおよびＣＤ１６０を欠いているのに対して、濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＲ）細胞は、それらの高いＢＴＬＡ発現を特徴とする（M'Hidi et al., 2009; Murphy et al., 2006）。

本明細書に示す試験では、遺伝学的および病理学的に正確なマウスモデルを用いてＧＣリンパ腫形成におけるＨＶＥＭの機能を検討する。さらに、本明細書に示す試験では、可溶型のＨＶＥＭ受容体（ｓｏｌＨＶＥＭ Ｌｅｕ３９〜Ｖａｌ２０２）がリンパ腫におけるＨＶＥＭの喪失の影響を修復しうることも示す。

結果
特に断らない限り、実施例１における「ｓｏｌＨＶＥＭ」への言及は、配列番号８のＬｅｕ３９〜Ｖａｌ２０２可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド（配列番号７のヌクレオチド配列によりコードされる）を指す。

ＨＶＥＭおよびＢＴＬＡ受容体間の相互作用は、大部分のヒトＦＬｓにおいて失われている
ヒトＦＬｓの大規模集合（ｎ＝１４１）において、ＨＶＥＭ突然変異が標本の２８％（ｎ＝４０）に存在し、これらの３分の１（３５％）が同型接合突然変異であったことが見出された（図１Ａ〜Ｃ）（Cheung et al., 2010;Launay et al., 2012; Lohr et al., 2012; Ross et al., 2007）。ＨＶＥＭ突然変異は、受容体のエクトドメインを標的とし、ミスセンス（６５％）、ノンセンス（３２．５％）およびフレームシフト突然変異（２．５％）を含む。さらに、ＨＶＥＭは、Ｂ細胞悪性腫瘍にわたって一般的に失われている領域である、染色体１ｐ３６欠失の最小共通領域に局在する（Cheung et al., 2010; Fitzgibbon et al., 2007）。２つの別個の一連のアレイＣＧＨデータ（ＭＳＫＣＣ：ｎ＝６４（Oricchio et al., 2011）；ＵＮＭＣコホート：ｎ＝１９８（Bouska et al., 2014））のメタ解析により、ＨＶＥＭ遺伝子座の喪失が緩慢性ＦＬ標本（ｎ＝２６２）の３４％および形質転換ＦＬｓ（ｎ＝６７）の３７％において起こることが示されている（図１Ｄ〜Ｆ、図８ＡおよびＢ）。ＧＩＳＴＩＣ（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）解析により、これらの病変の２２〜２４％が緩慢性および形質転換標本の両方における同型接合性喪失であることが示されている（図１Ｅおよび図８Ａ）。したがって、ゲノムにおける証拠は、ＦＬの発生時にＨＶＥＭ受容体遺伝子に対する強力な選択を示すものである。

本試験では、ヒトＦＬｓにおけるＨＶＥＭタンパク質発現を検討した。１９８個のＦＬ試料を含む組織マイクロアレイを免疫組織化学によりＨＶＥＭタンパク質発現について評価した。腫瘍細胞の少なくとも２０％が特異的染色を示す場合、試料をＨＶＥＭ陽性と採点した。このカットオフを用いて、６２個の試料（３１．３％）がＨＶＥＭ陰性、１３６個の試料（６８．７％）がＨＶＥＭ陽性と分類された（図１Ｇ、図８Ｃ）。この割合は、ゲノムデータと一致しており、タンパク質発現の低下または非存在が、利用可能なゲノムおよびタンパク質データを有する試料（ｎ＝１４）におけるＨＶＥＭ突然変異または欠失試料において確認された（図８Ｄ）。

ＢＴＬＡは、公知のＨＶＥＭ結合パートナーであり、Ｂ細胞上に発現する唯一のＨＶＥＭ受容体である（Murphy et al., 2006）。したがって、ＢＴＬＡ発現をリンパ腫組織アレイにわたって評価した。陽性ＢＴＬＡスコア（すなわち、ＢＴＬＡ＋）について、腫瘍細胞が、弱陽性で、オンスライド（ｏｎ−ｓｌｉｄｅ）対照として用いた反応性ＧＣ Ｂ細胞よりも強い染色を示すことが必要であった。ＢＴＬＡについてのこのカットオフを用いることにより、１０２個の試料が陰性であり（５１．２％）、９５個の試料（４８．２％）が陽性と採点された（図１Ｇ、図８Ｅ）。総合すると、１９８個の試料うちの１４６個（７４％）がＨＶＥＭまたはＢＴＬＡについて陰性であった。それらの関連性をカイ二乗検定を用いて検定したところ、ＨＶＥＭ陽性腫瘍が偶然によると予測されるものよりＢＴＬＡを失う可能性が高かったというような有意な陰性（相互排他的）相関が存在したことが見出された（ＯＲ＝０．２５４；９５％ＣＩ ０．１２６〜０．５１１；ｐ＜０．０００１）（図１Ｇ〜Ｉ、図８Ｆおよび１Ｇ）。ＢＴＬＡの突然変異または欠失は、観測されず、転写でサイレンシングであった可能性が最も高い。この点に関して、ＢＴＬＡ発現がＦＬにおけるＫＭＴ２Ｄ（ＭＬＬ２）メチルトランスフェラーゼによって制御されていることが指摘されている（Ortega-Molina et al., 2015）。したがって、ＨＶＥＭおよびＢＴＬＡ受容体間の相互作用がヒトＦＬｓの大部分において分断されていることから、これが潜在的に重要な腫瘍抑制因子経路であることが示唆されると思われる。

ＨＶＥＭは、濾胞性リンパ腫のマウスモデルにおいて腫瘍抑制因子として作用する
ＦＬの発生におけるＨＶＥＭ不活性化の役割を解明するために、ヒトＢＣＬ２陽性ＦＬｓの遺伝学および病理学の重要な側面を反復するｖａｖＰＢｃｌ２モデル（Egle et al., 2004; Oricchio et al., 2011）を用いた。手短に述べると、胎児肝臓から単離されたｖａｖＰＢｃｌ２造血前駆細胞（ＨＰＣｓ）にＨＶＥＭに対する短ヘアピンＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡｓ）を発現するレトロウイルスまたは空ベクター対照を導入した。次いで、これらの細胞を致死照射マウスに移植し、リンパ腫の発生についてレシピエントをモニターした（図２Ａ）。ＨＶＥＭのノックダウン（赤、ｎ＝１９）は、対照（青、ｎ＝１１）と比較してリンパ腫の発生の有意な加速および浸透度の増加をもたらした。対照動物の９０％が１００日間を超える期間にわたり腫瘍がないままであったのに対して、ｓｈＨＶＥＭの導入を受けた動物では１０％のみであった（ｐ＜０．０１）（図２Ｂ）。これらの結果は、ＨＶＥＭに対する第２のｓｈＲＮＡについて確認された。ＨＶＥＭ ｍＲＮＡのノックダウンも確認され、ＨＶＥＭ表面発現の減少がＦＡＣＳにより認められた（図２ＣおよびＤ、図９Ｂ）。Ｂ細胞コンパートメントにおけるＨＶＥＭノックダウンがリンパ腫の発生の原因であったかどうかを試験するために、ＧＦＰレポーターと共発現するｓｈＨＶＥＭの発現を、派生造血コンパートメント内への最初のＨＰＣ感染から追跡した。ＨＰＣｓの初期の導入効率は、約１５％であり、富化は、８０％以上がｓｈＨＶＥＭおよびＧＦＰを発現した、ＦＡＣＳ選別リンパ腫Ｂ細胞においてのみ認められた（図２Ｅ）。したがって、これらの試験により、ＨＶＥＭの喪失がインビボでのＢ細胞の自律拡大およびリンパ腫の発生をもたらすことが示されている。

マウスＨＶＥＭ野生型およびＨＶＥＭ欠損リンパ腫の病理学的解析により、ＧＣ由来のＦＬｓの一般的な顕著な特徴が示されている。一般的な濾胞構造ならびにＧＣマーカーであるＰＮＡ、ＢＣＬ６およびＧＬ７の発現が免疫組織化学およびＦＡＣＳ解析によって認められた（図２Ｆ、図９Ｃ）。免疫組織化学により、増殖の増大および潜伏の低下と一致したＨＶＥＭ欠損リンパ腫におけるＫｉ６７染色の増加がさらに示された（図９Ｄ）。ＦＡＣＳ解析により、すべてのリンパ腫が小さなＢ２２０＋およびＣＤ１９＋Ｂ細胞から構成され、ＨＶＥＭ欠損腫瘍が浸潤性ＣＤ３＋Ｔ細胞のわずかな低下を示したことが示された（図９Ｅ）。詳細で、大規模なシークエンシングベースのＢ細胞受容体（ＢＣＲ）解析により、クローン内多様性をもたらす体細胞超突然変異（ＳＨＭ）による、オリゴクローナル疾患および関連レパートリーバイアスがさらに明らかにされた。これは、ＧＣ駆動疾患の持続的なクローン進化を反映している可能性がある（図１０）。シグナル伝達分子の調査により、ＳＹＫ、ＢＴＫなどのＢ細胞受容体経路に関連するシグナル伝達分子の活性化およびリン酸化と、対照リンパ腫と比較してＨＶＥＭ欠損におけるＥＲＫの活性化も示された（図２Ｇ）。

ヒトＦＬ試料において、ＨＶＥＭおよびＢＴＬＡ発現の相互に排他的なパターンが認められた。Ｔ細胞における試験により、ＨＶＥＭおよびＢＴＬＡが同じ細胞上でシスで直接相互作用しうることが示された（Cheung et al., 2009）。これらの所見は、ＢＴＬＡの喪失がリンパ腫の発生を同様に促進しうるという可能性を提起するものである（図１Ｇ〜Ｉ）。したがって、ＢＴＬＡのノックダウンの効果を上述の同じｖａｖＢｃｌ２マウスリンパ腫モデルにおいて試験した。手短に述べると、ＢＴＬＡのノックダウンは、リンパ腫の発生の有意な加速をもたらした（ｎ＝１１ ベクター、ＢＴＬＡについてｎ＝１６、ｐ＜０．０１）（図３Ａおよび３Ｂ）。腫瘍の病理学により、濾胞構造、優勢なＢ２２０＋およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の組成、ならびにＢＴＬＡ欠損リンパ腫が対照より高いＫｉ６７を有し、ＧＣマーカーＰＮＡおよびＢＣＬ６を発現したことが明らかにされた（図３Ｃ〜Ｅ）。ＨＶＥＭ欠損リンパ腫と同様に、ＥＲＫリン酸化の増大などの増殖シグナルの活性化が免疫ブロットにより認められた（図３Ｆ）。したがって、これらの試験により、ＨＶＥＭまたはＢＴＬＡの喪失がＢｃｌ２と共同し、インビボでリンパ腫の発生を促進しうることが示されている。

ＨＶＥＭは、増殖シグナルを細胞自律的かつＢＴＬＡ依存的に制御する
ＨＶＥＭおよびＢＴＬＡの喪失は、マウスリンパ腫におけるＢＣＲの活性化をもたらす（図２Ｇおよび３Ｆ）。ＢＣＲシグナルの活性化は、ＣＤ７９に結合するＢＴＬＡの能力に関連する直接的な効果でありうるか、あるいは局所サイトカインレベルの変化に続発するものでありうる（Vendel et al., 2009）。ＨＶＥＭがシグナル伝達に対する直接的な、細胞自律的、かつＢＴＬＡ依存的効果を有するかどうかを直接的に試験するために、単離リンパ腫Ｂ細胞を、ＨＶＥＭの結合特性を保持している精製可溶性ＨＶＥＭエクトドメインタンパク質断片（ｓｏｌＨＶＥＭ：Ｌｅｕ３９〜Ｖａｌ２０２）で処理した（Cheung et al., 2005; del Rio et al., 2010）。手短に述べると、ＢＣＬ１マウスリンパ腫細胞におけるＢＣＲシグナル伝達経路を、ｓｏｌＨＶＥＭ（１０μｇ／ｍｌ）または薬理学的ＢＴＫ阻害剤イブルチニブ（１０ｎＭ）の存在下または非存在下でＩｇＭで刺激し、ＢＣＲ経路の活性化の指標としてのＢＴＫのリン酸化をフローサイトメトリーにより測定した。ｓｏｌＨＶＥＭの添加は、薬理学的阻害剤と同様にＢＴＫのリン酸化および活性化を阻止した（図４Ａ）。ｓｏｌＨＶＥＭがＢＣＲシグナル伝達を阻止する能力には、ＢＴＬＡを必要とし、ＢＴＬＡのノックダウンがＢＣＬ１細胞におけるＢＴＫの阻害を妨げた（図４Ｂ）。同様な観察を初代ヒトＦＬ Ｂ細胞において行った。ＢＴＬＡ発現を、精製ヒトＦＬ Ｂ細胞の１０個の試料にわたってＦＡＣＳにより解析し、試料をＢＴＬＡ^ｈｉおよびＢＴＬＡ^ｌｏ群に分けた（図４Ｃ）。ｓｏｌＨＶＥＭ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で抗ＩｇＧによりＢ細胞を刺激したところ、ＳＹＫおよびＥＲＫの阻害がＢＴＬＡ^ｈｉ細胞において認められたのに対して、ｓｏｌＨＶＥＭは、ＢＴＬＡ^ｌｏ細胞においてほとんど効果を有さなかった（図４Ｄ、図１１）。１０個すべての初代ヒトＦＬ Ｂ細胞の累積的解析により、ＳＹＫリン酸化を阻止するｓｏｌＨＶＥＭの能力とＢＴＬＡ表面発現との間の有意な相関関係が確認された（ｒ＝０．６９７、ｐ＝０．０３）（図４Ｅ）。

ＨＶＥＭ欠損リンパ腫は、腫瘍支質の過度の活性化を有する
ヒトＦＬｓにおいて、悪性Ｂ細胞は、悪性Ｂ細胞の支えとなるリンパ基質と混合している（Mourcin et al., 2012）。これらの非造血性リンパ腫成分は、特定のＣＤ２１Ｌ陽性濾胞性樹状細胞（ＦＤＣｓ）およびトランスグルタミナーゼ陽性線維芽細胞性網状細胞（ＦＲＣｓ）に含まれる（図１２Ａ）。マウスリンパ腫において、我々は、免疫処置の非存在下で腫瘍支質の活性化を認め、これは、ＨＶＥＭ欠損リンパ腫において有意により顕著であった（図５Ａ）。顕微鏡画像の定量的解析により、対照腫瘍と比較してＨＶＥＭ欠損腫瘍における濾胞内のＣＤ２１／ＣＤ３５陽性ＦＤＣネットワークの有意な（ｐ＜０．０５）増加が示された（それぞれについてｎ＝３）（図５Ｂ）。同様に、濾胞周囲部におけるＩ型コラーゲン密度は、ＨＶＥＭ欠損リンパ腫において有意に（ｐ＜０．０５）増加し、ＥＲＴＲ７陽性ＦＲＣネットワークの細胞拡大の非存在下におけるＦＲＣｓの活性化が示唆される（図５Ｂ、図１２Ｂおよび１２Ｃ）。これらの顕微鏡所見と一致して、対照と比較してＨＶＥＭ欠損腫瘍におけるＦＤＣおよびＦＲＣ由来のサイトカインＣＸＣＬ１３およびＣＣＬ１９の発現の有意な増大が見出された（ｎ＝５、ｐ＜０．０１）（Mueller and Germain, 2009）（図５Ｄおよび５Ｅ）。

ＴＮＦファミリーサイトカインＴＮＦａならびにＬＴａおよびＬＴｂは、支質ＦＲＣｓおよびＦＤＣｓの必須かつ非冗長性活性化因子である（Roozendaal and Mebius, 2011）。したがって、マウスリンパ腫におけるこれらのサイトカインの発現を検討した。３つの因子すべての産生の有意な増加が対照リンパ腫と比較してＨＶＥＭ欠損リンパ腫の精製Ｂ２２０＋Ｂ細胞において認められた（図５Ｆ、ｎ＝５、ｐ＜０．０５）。さらに、ＨＶＥＭエクトドメイン（ｓｏｌＨＶＥＭ；１０μｇ／ｍｌ）による２種のマウスリンパ腫細胞株（ＢＣＬ１およびＭｙｃ／Ｂｃｌ２）の処理により、ＬＴａおよびＬＴｂの発現が容易に低下したが、ＴＮＦａは低下しなかった（図５Ｇ〜Ｉ、図１２Ｄ〜Ｆ）。したがって、ＨＶＥＭ欠損リンパ腫Ｂ細胞は、ＴＮＦファミリーサイトカインを誘導する支質の異常な産生を示す。

ＨＶＥＭ欠損リンパ腫における濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞の増加
支質由来サイトカインＣＸＣＬ１３は、ＣＸＣＲ５陽性濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）に対する主な化学誘引物質である（Crotty, 2014）。ＨＶＥＭ欠損リンパ腫におけるＣＸＣＬ１３の産生の増加（図５Ｄ）と一致して、ＴＦＨ細胞の存在量の有意な増加が、対照腫瘍と比較してＨＶＥＭ欠損腫瘍において認められた（それぞれについてｎ＝３；ｐ＜０．０１）（図６Ａおよび６Ｂ）。ＴＦＨ細胞数のこの増加は、ＴＦＨ由来のサイトカインの発現の増加を随伴する。具体的には、ＩＬ２１、ＩＬ４、ならびに支質活性化サイトカインＴＮＦａ、ＬＴａおよびＬＴｂの発現の増大が、対照リンパ腫と比べてＨＶＥＭ欠損リンパ腫からのＦＡＣＳ精製ＣＤ３＋Ｔ細胞において認められた（各遺伝子型のｎ＝５、ｐ＜０．０１）（図６Ｃ〜６Ｅ）。さらに、ＴＦＨ細胞によるＩＬ２１およびＩＬ４の産生の増加が、ＨＶＥＭ欠損リンパ腫からのＦＡＣＳ精製リンパ腫Ｂ細胞上のＩＬ２１およびＩＬ４受容体の発現の上昇（ｐ＜０．０１）（図１３Ａおよび１３Ｂ）と一致していたことが認められた。ヒトＴＦＨ細胞は、ＢＴＬＡ受容体の高レベルの発現を特徴としており（図１３Ｃ）、ＨＶＥＭがこれらの腫瘍浸潤性Ｔ細胞に直接影響を及ぼすかどうかを試験するために実験を行った。ＴＦＨ細胞に対するＨＶＥＭの直接的な影響を試験するために、精製ヒトＴＦＨ細胞を単離し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８による刺激の存在下または非存在下で前のようにｓｏｌＨＶＥＭにより処理した。ｓｏｌＨＶＥＭは、ＴＦＨ細胞の数または生存率に影響を及ぼさず、ＬＴａおよびＬＴｂの発現の低下が認められたが、ＴＮＦａ、ＩＬ２１またはＣＸＣＬ１３については認められなかった（図６Ｆ〜Ｈ、１３Ｄ〜Ｆ）。したがって、ＨＶＥＭ欠損リンパ腫は、支質の活性化に寄与し、ＩＬ４およびＩＬ２１の産生によってＢ細胞の増殖を支持するより多数のＴＦＨ細胞を動員する。

ＨＶＥＭエクトドメインタンパク質は、リンパ腫の増殖をインビトロおよびインビボで阻止する
ｓｏｌＨＶＥＭタンパク質がＢＣＲ経路の活性化をＢＴＬＡ依存的に阻害し、リンパ腫Ｂ細胞およびＴＦＨ細胞における異常なサイトカインの産生を少なくとも一部逆転させることができることが本明細書で示された。これらの所見に基づいて、ｓｏｌＨＶＥＭがリンパ腫に対して単剤活性を有するかどうかを試験するために実験を行った。最初に、ＢＴＬＡ受容体の発現をヒトおよびマウスリンパ腫（主にＤＬＢＣＬ）細胞株のパネルにわたって特徴付けた。ヒトＦＬ試料および初代ＦＬ Ｂ細胞における所見（図１および４）と一致して、細胞株がＢＴＬＡ^ｈｉ（ＤＯＨＨ２、ＳＵ−ＤＨＬ６、マウスＭＹＣ／ＢＣＬ２）およびＢＴＬＡ^ｌｏ（Ｇｒａｎｔａ、Ｓｕ−ＤＨＬ１０）（図１４Ｃ）群に分類されることが見出された。ＳｏｌＨＶＥＭ（１０μｇ／ｍｌ）は、ＢＴＬＡ^ｈｉであり、ＨＶＥＭの同型接合性欠失を有する（示さず）ＤＯＨＨ２細胞におけるＢＴＫ、ＳＹＫおよびＥＲＫの活性化を容易に阻止した（図７Ａ〜７Ｃ−図７Ａおよび７Ｂのデータは、ＳｏｌＨＶＥＭ Ｐｒｏ３７〜Ｖａｌ２０２、すなわち、配列番号６を用いて得られた）。全パネルにわたって、ＳｏｌＨＶＥＭは、すべてのＢＴＬＡ^ｈｉリンパ腫細胞における有意な増殖阻害をもたらしたのに対して、ＢＴＬＡ^ｌｏ細胞は、全体的なより高いベースライン増殖速度を示し、ＳｏｌＨＶＥＭよる影響を受けなかった（図７Ｄ）。次に、ＳｏｌＨＶＥＭが確立されたＢＴＬＡ^ｈｉリンパ腫に対するインビボでの効果を有するかどうかを試験するために実験を行った。手短に述べると、ＢＴＬＡ（ＢＴＬＡ^ｈｉ）を発現する攻撃的なＭＹＣ／ＢＣＬ２二重陽性マウスリンパ腫細胞をＪ：Ｎｕヌードマウスの側腹部に移植し、移植した腫瘍が約５０ｍｍ^３の容積に達したならば、マウスを２０μｇのｓｏｌＨＶＥＭまたはビヒクル（ＰＢＳ）により３日ごとに処置した。ＳｏｌＨＶＥＭタンパク質による処置により、さらなる腫瘍増殖が予防されたのに対して、ビヒクル処置腫瘍は、急速に拡大した（媒ビヒクル体およびＳｏｌＨＶＥＭについてｎ＝４；ｐ＜０．０１）（図７Ｅおよび７Ｆ、図１４Ｄおよび１４Ｅ）。ＳｏｌＨＶＥＭの効果は、単に細胞増殖抑制性ではなく、タネル染色は、多大なアポトーシスを示し、免疫ブロットは、インビボでのＥＲＫ阻害を示している（図７Ｇおよび７Ｈ）。したがって、ＳｏｌＨＶＥＭは、リンパ腫に対するインビボでの有意な単剤活性を有する。同様の結果がアミノ酸Ｐｒｏ３７〜Ｖａｌ２０２（配列番号６）の細胞外領域からなる異なる可溶性ＨＶＥＭ分子によりインビトロおよびインビボの両方で得られた。これらの結果は、実施例２で要約する。

考察
リンパ腫におけるＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ腫瘍抑制因子軸の二重機能
ＧＣは、大部分のヒトＢ細胞性リンパ腫の起源であり、本明細書に提示するデータは、それらの病因についての新たな洞察を提供する。ＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ相互作用がＧＣ Ｂ細胞性リンパ腫の７５％において分断されていることが今や示され、これにより、それがリンパ腫の発生に対する重要なバリアーであることがわかる。ＨＶＥＭ受容体遺伝子は、リンパ腫におけるとりわけ最も高頻度の遺伝的標的であり、体細胞突然変異および染色体欠失は、ＦＬｓおよびＤＬＢＣＬｓを含むＧＣリンパ腫の大部分における完全な不活性化をもたらす。ＢＴＬＡは、Ｂ細胞において発現する唯一のＨＶＥＭ相互作用性受容体であり、野生型ＨＶＥＭを保持しているリンパ腫は、ＢＴＬＡ受容体遺伝子の発現をサイレンシングする可能性がある。しかし、ＢＴＬＡは、突然変異または欠失の標的ではない。それどころかＢＴＬＡは、ＫＭＴ２Ｄ（ＭＬＬ２）ヒストンメチルトランスフェラーゼの標的であり、リンパ腫におけるＫＭＴ２Ｄの不活性化は、ＢＴＬＡの発現の低下に寄与しうる（Ortega-Molina et al., 2015）。

ＨＶＥＭの喪失は、リンパ腫Ｂ細胞に対する二重の効果を有し、局所微小環境も再形成する。第一に、ＨＶＥＭの喪失は、細胞におけるＢＣＲシグナル伝達およびＢ細胞の増殖を自律的かつＢＴＬＡ依存的に刺激する。阻害性ＢＴＬＡ受容体は、Ｂ細胞受容体シグナル伝達分子（ＣＤ７９、ＳＨＰ１／２）と相互作用しうる（Gavrieli et al., 2003; Vendel et al., 2009; Watanabe et al., 2003）２つのＩＴＩＭドメインを有する。細胞表面ＨＶＥＭまたは可溶性ＨＶＥＭによるＢＴＬＡの刺激は、ＢＣＲシグナル伝達分子の阻害をもたらし、リンパ腫細胞の増殖を阻止する。Ｔ細胞においては、この相互作用は、同じ細胞上でシスで起こることが示された（Cheung et al., 2009）。Ｂ細胞における同様のシス相互作用は、細胞の自律的増殖の利点をもたらし、遺伝的ＨＶＥＭ不活性化を駆動する重要な因子である可能性がある。

Ｂ細胞の増殖に対するその細胞自律性効果に加えて、ＨＶＥＭは、リンパ腫の適所の重要な推進要因でもある。ＨＶＥＭ欠損Ｂリンパ球は、ＦＤＣｓおよびＦＲＣｓなどのリンパ基質細胞の重要な活性化因子であるＴＮＦファミリーサイトカイン（ＴＮＦａ、ＬＴａ、ＬＴｂ）の量の増加をもたらす（Ame-Thomas et al., 2007; Guilloton et al., 2012; Roozendaal and Mebius, 2011）。ＨＶＥＭ欠損マウスリンパ腫における活性化リンパ基質は、ヒトＦＬｓにおいて認められる異常な支質の活性化に極めて類似している（Mourcin et al., 2012）。ヒトＦＬ細胞は、少なくとも一部は、ＩＬ４、ＩＬ２１およびＣＤ４０Ｌ産生ＴＦＨ細胞のＣＣＬ１９およびＣＸＣＬ１３媒介性動員の増加によってＦＬ Ｂ細胞を支えるそれらの支質に依存する（Ame-Thomas et al., 2015{Pangault, 2010 #1807; Ame-Thomas et al., 2012）。ＨＶＥＭの欠損は、インビボでのリンパ腫の許容性適所に共に寄与するサイトカインの産生および細胞組成のこれらの正確な変化を誘発するのに十分である。

ＨＶＥＭは、ＢＴＬＡ相互作用による直接的な効果をもたらし、サイトカインの産生の変化に続発する間接的な効果ももたらす。例えば、リンパ基質細胞は、ＢＴＬＡを発現せず（示さず）、リンパ基質に対する効果は、ＴＮＦファミリーサイトカインの産生の増加に大部分続発するものである。他方で、ＢＴＬＡは、ＴＦＨ細胞上に非常に高いレベルで存在する。したがって、本試験において、ＴＦＨ細胞がＣＸＣＬ１３媒介性動員の増加とＴＦＨ細胞上のＨＶＥＭの直接的な影響も受けることが認められた。同様に、ＨＶＥＭは、リンパ腫Ｂ細胞上のＢＴＬＡを直接的に作動させ、さらにＩＬ４およびＩＬ２１などのＴＦＨ由来のサイトカインは、Ｂ細胞の増殖のさらなる持続をもたらす。ＨＶＥＭは、さらなる直接的および続発性の効果を有しうる。本明細書に提示する結果は、ＨＶＥＭの喪失が、Ｂ細胞の増殖を制御し、バランスのとれたＧＣ環境を維持する重要な中心点を破壊するものであることを示している。

療法のためのＨＶＥＭ−ＢＴＬＡ相互作用の回復
ＨＶＥＭは、ＦＬおよびＤＬＢＣＬにおける最も高頻度で突然変異する遺伝子の１つである。したがって、ＨＶＥＭ欠損リンパ腫に適した処置戦略は、極めて有益であることになる。特に、腫瘍抑制性のＨＶＥＭおよびＢＴＬＡ受容体間の相互作用は、細胞表面上で起こり、したがって、直接的に利用できる。本試験において、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインは、ＢＴＬＡに結合し、インビボでのＢＣＲシグナル伝達、サイトカイン産生および腫瘍増殖に対する有意な単剤効果をもたらすことができた。ｓｏｌＨＶＥＭのこれらの処置効果は、ＢＴＬＡの発現に依存するものであり、ＢＴＬＡ欠損リンパ腫を処置するためには代替戦略が必要でありうることがわかり、またＢＴＬＡの発現がｓｏｌＨＶＥＭ応答の予測因子でありうることが示唆される。本明細書に提示する結果は、ＧＣリンパ腫におけるＨＶＥＭの腫瘍抑制機能を少なくとも一部、回復させることを目的とする処置戦略の概念実証を示している。ＨＶＥＭまたはＢＴＬＡ活性化抗体に基づく増強されたリガンドおよび腫瘍特異的なＨＶＥＭの送達のための改善されたビヒクルもＧＣリンパ腫における腫瘍抑制機能効果をもたらしうる。

材料および方法
統計的方法
細胞型間またはマウス遺伝子型間の比較のための標本の大きさは、ミード（Ｍｅａｄ）の勧告（Festing,2002）に準拠した。標本は、それらのあらかじめ判定した型（すなわち、マウス遺伝子型）に従ってそれらの実験群に割り当てたため、無作為化はなかった。研究者らは、実験群に対して盲検化しなかった。データを図２Ｂおよび３Ａに示す実験においては、リンパ腫を発現したマウスのみを考慮し、リンパ腫を発現しなかったマウスは、検閲し、カプラン・マイヤー曲線にチェックマークで示した。定量的ＰＣＲデータは、独立した生物学的反復実験から得られた（ｎ値は、対応する図の説明に示した）。正規分布および等分散性は、大部分のデータにおいて確認された。したがって、すべての標本について正規性および等分散性を推定した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（両側、対応のない）を用いて、統計的有意性を推定した。マウス実験における生存率は、カプラン・マイヤー曲線を用いて表示し、有意性は、対数順位検定により推定した。ヒトＦＬ組織生検におけるＨＶＥＭおよびＢＴＬＡ発現の間の関連解析については、カイ二乗検定を用いた。

ＦＬにおけるＨＶＥＭのエクソンシークエンシング
症例は、以前に記載された通りに解析した（Li et al., 2014; Yildiz et al., 2015）。手短に述べると、ＨＶＥＭの全コーディングエクソンおよび隣接イントロン配列を増幅し、シークエンスするためのプライマーは、プライマー３プログラム（http://primer3.ut.ee/）を用いて設計し、述べた直接シークエンス法を用いて配列情報を得た。突然変異は、非増幅リンパ腫細胞由来ＤＮＡおよび選別細胞からの対のＣＤ３細胞由来のＤＮＡを鋳型として用いて体細胞において獲得されたことが確認された。

ＨＶＥＭのディープカバッレジ大規模並列再シークエンシング（deep coverage massively parallel re-sequencing）
専用の多重プライマーパネル（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅａｄ Ｐａｎｅｌ）を用いて、ＨＶＥＭの全コーディングエクソンを増幅した。ＰＣＲ産物をプールし、バーコードアダプターを用いて作製したライブラリーをシークエンシングした。シークエンシングは、ＨｉＳｅｑ２０００シークエンサーを用いて行った。配列変異体のバイオインフォーマティクスノミネーションは、専用アルゴリズムを用いて実施した。ＦａｓｔｑファイルをＱｉａｇｅｎ ＧｅｎｅＲｅａｄデータポータル（http://ngsdataanalysis.sabiosciences.com）にアップロードして、読取りからのプライマー領域をトリミングし、ｂｏｗｔｉｅ２６を用いてヒトゲノム（ビルドｈｇ１９）に対してアライメントした。アライメントしたｂａｍファイルをＱｉａｇｅｎポータルから個別にダウンロードし、デフォルトパラメーターを用いて変異体を呼び出すためにＶａｒＳｃａｎ（２．３．６）に提出した。ＳｎｐＥｆｆ（３．４Ｂ）を用いて、変異体に遺伝子名により注釈を付け、アミノ酸配列に対する影響を予測し、ｄｂＮＳＦＰ（２．１）を用いて、標準ツール（Ｓｉｆｔ、Ｐｏｌｙｐｈｅｎ、ＭｕｔａｔｉｏｎＴａｓｔｅｒ）に基づく予測される機能上の影響に注釈を付けた。１０００ゲノムフェーズ２（1000 Genomes phase 2）に見出された変異体は、除外した。ＵＭ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｏｒｅにより開発された専用ツールである、Ｊａｃｑｕａｒｄを用いて、すべての試料ＶＣＦｓを試料別の変異体の単一マトリックスに集約した。ＶＡＦ＞１５％を有するすべての配列変異体をサンガーシークエンシング法を用いてストックＴおよび対Ｎ ＤＮＡにおいてバリデートした。

アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション／Ｇｉｓｔｉｃ解析
新鮮凍結またはＯＣＴ包埋組織からのＤＮＡを単離し、以前に記載された通りに処理した（Bouska et al., 2014; Oricchio et al., 2011, Bouska, 2014 #43）。手短に述べると、標識およびハイブリダイゼーションは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより実施されたプロトコールに従って行った。データは、受託番号ＧＳＥ４０９８９のもとにＧＥＯで入手可能である。１９７例の濾胞性リンパ腫患者からなる第２のデータセット（ＵＮＭＣデータセット）からのコピー数データは、（Bouska et al., 2014）に記載されているＧｅｎｅＣｈｉｐヒトマッピング２５０Ｋ Ｎｓｐ ＳＮＰアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて得られた。有意に増幅され、欠失した領域を同定するために、ＧＩＳＴＩＣアルゴリズム（Beroukhim et al., 2010）を実装したＧｉｓｔｉｃ ２．０Ｒパッケージを用いた。ＧＩＳＴＩＣは、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ製のＤＮＡｃｏｐｙ Ｒパッケージ（Olshen et al., 2004）を用いて各データセットについて得られたセグメント化コピー数データについて実行した。

ＦＬのマウスモデル
レトロウイルス導入ＨＰＣｓへの養子移植に適合した、ｖａｖＰＢｃｌ２マウスモデルを用いた（Egle et al., 2004およびWendel et al., 2004を参照）。手短に述べると、ｖａｖＰＢｃｌ２トランスジェニック胎児肝臓細胞を胎生期１４．５日目（Ｅ１４．５）にｖａｖＰＢｃｌ２異型接合動物から単離した。ＨＰＣｓを特別に適応させた増殖培地中で４日間インビトロで増殖させ、目的のｓｈＲＮＡｓの発現を導くＭＳＣＶベクターをレトロウイルスにより導入した。ＨＰＣｓを致死照射野生型レシピエントに移植し、疾患の発症を触診により週１回モニターした。データは、統計的有意性に関する対数順位（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を用いてカプラン・マイヤーフォーマットで解析した。

免疫組織化学およびＴＭＡ法
免疫組織化学（ＩＨＣ）は、ＦＬと診断された１８６例の患者からの１９９個のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織標本の１．５ｍｍ二連コアを含む組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）に適用した（Kridel et al., 2015）。４μｍ切片を切断し、ＨＶＥＭに対するマウスモノクローナル抗体（希釈度１：５０；クローン２Ｇ６−２Ｃ７；Ａｂｎｏｖａ、Ｗａｌｎｕｔ、ＣＡ）およびＣＤ２７２／ＢＴＬＡに対するウサギポリクローナル抗体（希釈度１：１００；Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、カタログ＃Ｓ２３７９；Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ）を用いてＶｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈ Ｍａｒｋ ＸＴプラットフォーム（Ｖｅｎｔａｎａ、ＡＺ）上でＩＨＣを実施した。スライドは、陽性腫瘍細胞の百分率（１０％増分で）および染色強度（０＝陰性、１＝弱、２＝中、３＝強）について２人の血液病理学者によって評価された。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００顕微鏡に接続されたＮｉｋｏｎ ＤＳ−Ｆｉ１カメラを用いて代表的な画像を取得した。組織学および免疫化学解析のために脾臓を採取した。切片を以前に記載された通りにＨＥ、ＰＮＡ、ＢＣＬ６、タネル、Ｋｉ６７で染色した（Oricchio et al., 2011）。Ｋｉ６７陽性細胞をＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウエアを用いて定量した。

ＦＬマウスモデルにおけるフローサイトメトリー
ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）で機械的解離を実施した後に細胞懸濁液のフローサイトメトリー解析を実施した。各遺伝子型の代表的な腫瘍の腫瘍細胞懸濁液を記載された通りに染色した（Wendel et al., 2004）。染色に用いた以下の抗体をBD Biosciencesから入手した：ＣＤ８（クローンＲＡ３−６Ｂ２）、ＣＤ４（クローン１Ｄ３）、ＦＡＳ（クローンＪｏ２）、ＴおよびＢ細胞活性化抗原（ＧＬ７）、ＩｇＧ（Ａ８５−１）、ＩｇＭ（Ｒ６−６０．２）、ＣＤ３（クローン１７Ａ２）、ＣＸＣＲ５（クローンＲＦ８Ｂ２）、またはｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから：ＰＤ−１（クローンＪＨ３）、ＣＤ４４（クローンＩＭ７）、ＣＤ６２Ｌ（クローンＭＥＬ１４）、またはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから：ＨＶＥＭ（クローンＨＭＨＶ−１Ｂ１８）、ＢＴＬＡ（クローン６Ａ６）。

ＦＬマウスモデルからのＢおよびＴ細胞の精製および解析
ＢおよびＴ細胞は、ビーズ細胞分離を用いてマウスの脾臓から単離した。製造業者の指示に従って、Ｐａｎ Ｔ細胞単離キットまたはＢ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて全細胞溶解物を分離にかけ、単離した。

Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ抽出キットを用いて腫瘍から全ＲＮＡを抽出し、Ｔ細胞を選別し、Ｂ細胞を選別した。Ｍ−ＭｕｌＶ逆転写酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて１μｇの全ＲＮＡについて逆転写を実施した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを用いて記載されたΔΔＣｔ法（Mavrakis et al., 2008）によりｑＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイをＧｕｓｂ、ＩＬ−２１、ＩＬ−４、ＩＬ−２１ｒａ、ＩＬ−４ｒａ、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ｐ２１およびＣＸＣＬ１３について用いた。

支質細胞における免疫組織蛍光法
マウス脾臓およびヒトリンパ節をＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で急速冷凍した。２０μｍ切片を４％ＰＦＡで室温で１５分間固定した。切片をブロッキング溶液（ＰＢＳ、１０％ＢＳＡ、１０％ロバ血清、０．１％サポニン）とともに１時間インキュベートし、次いで以下の一次抗体とともに加湿チャンバー内で４℃で一夜インキュベートした：マウス脾臓についてＣＤ２１／ＣＤ３５（ラットＩｇＧ２ｂ、希釈度１／５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびコラーゲンＩ（ウサギポリクローナル、希釈度１／１００、Ａｂｃａｍ）；ならびにヒトリンパ節についてＣＤ２１Ｌ（マウスＩｇＭ、希釈度１／１００、Ｄａｋｏ）、トランスグルタミナーゼ−２（マウスＩｇＧ１、希釈度１／５０、Ａｂｃａｍ）およびＣＤ２０（ポリクローナルウサギ、希釈度１／５０、Ａｂｃａｍ）。洗浄後、スライド標本を対応する二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートし、最後にＳｙｔｏｘＢｌｕｅを含むＭｏｗｉｏｌ退色防止用封入剤（希釈度１／５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にマウントし、ＳＰ８（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で共焦点顕微鏡法により解析した。ＩｍａｇｅＪソフトウエアを画像解析に用いた。

ヒト細胞試料
対象は、治験審査委員会承認およびインフォームドコンセントの手続きのもとに募集した。試料は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）を有する患者から得られたリンパ節（ＬＮ）および日常的扁桃摘出術を受けていた小児から採取した扁桃腺を含んでいた。組織を断片に切断し、注射器および針を用いてフラッシュした。扁桃腺ＴＦＨは、記載された（Mourcin et al., 2012）{Pangault, 2010 #2203}ように、ＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて９８％を超える純度を有するＣＤ３陽性ＣＤ４陽性ＣＸＣＲ５ｈｉＩＣＯＳｈｉＣＤ２５陰性細胞として選別した。初代ＦＬ Ｂ細胞は、Ｂ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製した。染色に用いた抗体は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ３（クローンＢＷ２６４／５６）、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣＤ４（クローン１３Ｂ８．２）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（クローンＪ１０５）およびＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣＤ２５（クローンＭ−Ａ２５１）、ＣＸＣＲ５（ＲＦ８Ｂ２）およびＢＴＬＡ（クローンＪ１６８−５４０）であった。

ＴＦＨ刺激
精製ＴＦＨを、ｓｏｌＨＶＥＭ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で抗ＣＤ３（０．６μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（０．６μｇ／ｍＬ、Ｐｅｌｉｃｌｕｓｔｅｒ Ｓａｎｑｕｉｎ）ＭＡｂｓを含むかまたは含まないＩＭＤＭ １０％ＦＣＳ中で培養した。３日間の培養後、計数ビーズ（Ｆｌｏｗ Ｃｏｕｎｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＴｏｐｒｏ−３染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてフローサイトメトリーにより生存ＴＦＨの数を評価した。ＣＸＣＬ１３は、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により培養上清において定量した。

ヒトＦＬにおけるＢＣＲシグナル伝達の解析
ｓｏｌＨＶＥＭ（１０μｇ／ｍＬ）を含むかまたは含まないＨ_２Ｏ_２（１ｍＭ）の存在下でＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０ｍｇ／ｍＬ）を用いて精製ＩｇＧ陽性ＦＬ Ｂ細胞を刺激した。４％の最終濃度のＰＦＡを室温で１５分間加えることによって反応を停止させた。洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡで再脱水する前に固定細胞を８０％メタノールで−２０℃で２０分間暗中透過処理した。Ａｌｅｘａ ６４７コンジュゲート抗ｐＳｙｋ（クローン１７Ａ／ｐ−ＺＡＰ７０）、抗ｐＢＬＮＫ（クローンｊ１１７−１２７８）または抗ｐＥＲＫ１／２（クローン２０Ａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてリンタンパク質活性化を定量し、抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ ＡｂおよびＰＥコンジュゲート抗カッパＡｂ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてコンジュゲートされたクローン重鎖および軽鎖を発現するＢ細胞について解析した。

マウス細胞におけるホスホフローサイトメトリー
ホスホ−ＢＴＫ、ホスホ−Ｓｙｋ染色のために、５μｇ／ｍＬのｓＨＶＥＭ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または１０ｎｇ／ｍＬのイブルチニブ（ＣｈｅｍｉｅＴｅｋ ＰＣＩ−３２７６５）で細胞を３７℃で６０分間前処理した。等容積のホルムアルデヒドを細胞に直接加えることによって細胞を固定した。細胞を室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、残存細胞を１ｍＬの氷冷メタノール（１００％）で氷上で３０分間透過処理した。次いで細胞を２回洗浄し、ホスホ−ＢＴＫ（Ｂｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ クローンＮ３５−８８）およびホスホ−Ｓｙｋ（Ｂｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ クローン１７ Ａ／Ｐ−Ｚａｐ７０）で染色し、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで解析した。

ＶＤＪ領域のシークエンシング
潜在的に腫瘍性リンパ組織から、また対照としての正常マウス脾臓からＲＮＡを調製した。μ重鎖転写物からの発現ＶＤＪ領域を次世代法により配列決定した。この戦略は、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ、パイロシークエンシングならびにＩＭＧＴ（ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｂｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ））で利用可能なＩＭＧＴ／Ｈｉｇｈ−Ｖ−ＱｕｅｓｔｍＲＮＡおよび関連ツールを用いる最も高頻度のクローン型の定量による正確なレパートリー解析を組み合わせたものであった。ＲＡＣＥ−ＰＣＲは、μＣＨ１エクソン内の逆プライマーハイブリダイゼーションから開始した。

細胞培養、および細胞増殖アッセイ
リンパ腫細胞株ＤｏＨＨ２、Ｌｙ−１０、Ｇｒａｎｔａ、Ｓｕ−ＤＨＬ−６を１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０中で維持した。マウスリンパ腫細胞株ｍｙｃ−ｂｃｌ２を１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ−ＤＭＥＭ（５０：５０）中で維持した。細胞株を５×１０^５／ｍＬで播種し、５μｇ／ｍｌのｓＨＶＥＭで処理した。２４時間後に細胞数を処理後合計７２時間にわたり血球計を用いて計数した。

インビボ増殖および処置試験
移植および処置試験は、以前に記載された（Schatz et al., 2011）ように創出した。要約すると、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）と混合した１００万個のｍｙｃ−ｂｃｌ２マウスリンパ腫細胞の皮下注射をＪ：Ｎｕ Ｎｕｄｅ（Ｆｏｘｎ１ ｎｕ／Ｆｏｘｎ１ ｎｕ）マウスの右および左側腹部に行った。腫瘍が７５ｍｍ^３に達したならば、ＰＢＳで希釈した２０μｇのｓＨＶＥＭ（右側腹部）またはビヒクル対照（左側腹部）の腫瘍内注射によりマウスを３日ごとに処置した。３日ごとに腫瘍サイズを測定し、記録した。動物を屠殺し、腫瘍を切除した後に腫瘍を秤量した。

免疫ブロット
免疫ブロットは、以前に記載された通りに全細胞溶解物または上清を用いて実施した（Wendel et al., 2004）。手短に述べると、３０μｇのタンパク質／試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転移させた。抗体は、ｐＳｙｋ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃２７１２）、Ｓｙｋ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃２７１０）、ｐＢＴＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ ５０８２）、ＢＴＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃ ３５３３）、ｐＥＲＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃９１０２）、ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃４３７０）およびチューブリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に対する抗体であった。増強化学発光を検出のために用いた（ＥＣＬ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。

さらなる可溶性ＨＶＥＭポリペプチドによる処置のインビトロおよびインビボ効果
上記の実施例１で述べたいくつかの実験は、（全長ＨＶＥＭアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸Ｌ３９〜Ｖ２０２からなる、配列番号８に示す配列を有する）Ｌ３９〜Ｖ２０２可溶性ＨＶＥＭポリペプチドの使用を含む。他の可溶性ＨＶＥＭタンパク質配列を用いることによっても同等の結果が得られた。この実施例に示す結果は、Ｐｒｏ３７〜Ｖａｌ２０２可溶性ＨＶＥＭポリペプチド（配列番号５のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号２の全長ＨＶＥＭアミノ酸配列のアミノ酸Ｐｒｏ３７〜Ｖａｌ２０２からなる、配列番号６に示すアミノ酸配列を有する）を用いて得られた。特に断らない限り、実施例２または図１５〜２４における「ｓｏｌＨＶＥＭ」への言及は、配列番号６のＰｒｏ３７〜Ｖａｌ２０２可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド（配列番号５のヌクレオチド配列によりコードされる）を指す。

ＢＴＬＡを発現する細胞株である、ＤＯＨＨ２細胞を用いていくつかの実験を行った。ヒトＤＯＨＨ２細胞を、抗免疫グロブリンＧ（抗ＩｇＧ）単独により、ｓＴＮＦＲＳＦ１４（Ｐｒｏ３７〜Ｖａｌ２０２）との併用により、またはＢＴＫイブルチニブにより刺激した。抗ＩｇＧ処理は、細胞を刺激する前に１時間ＤＯＨＨ２細胞をｓＴＮＦＲＳＦ１４とともにプレインキュベートすることによって効果的に阻止される、ＢＴＫのイブルチニブ感受性活性化（リン酸化）を引き起こした（図１５Ａ〜Ｂ）。この阻害効果は、ＢＣＲ経路におけるＢＴＫの上流においても認められ、抗ＩｇＧによる活性化の前にｓＴＮＦＲＳＦ１４により前処理した場合にリン酸化ＳＹＫのレベルも阻害された（図１６Ａ〜Ｂ）。

インビトロでのシグナル伝達のこの阻害が他の細胞株で認められるかどうかを判断するために実験を行った。高い量のＢＴＬＡを発現したかまたはＢＴＬＡを発現しなかった細胞株を５ｕｇのｓＴＮＦＲＳＦ１４に曝露し、細胞増殖を３日間モニターした。顕著なことに、増殖に対する大の効果が認められた細胞株は、最高レベルのＢＴＬＡを発現した細胞株（Ｍｙｃ−Ｂｃｌ２細胞株）であったのに対して、ＢＴＬＡを発現しなかった細胞株では、ｓＴＮＦＲＳＦ１４は、細胞増殖を阻害しなかった（図１７）。インビトロ処理は、細胞生存率のわずかな低下をもたらしたが、高レベルのＢＴＬＡを発現した細胞株におけるＥＲＫのリン酸化のレベルを明らかに低下させた（図１８、図１９）。

インビボでのｓＴＮＦＲＳＦ１４ポリペプチドの効果を試験するために、５００万個のｍｙｃ−ｂｃｌ２細胞をヌードマウスの右および左側腹部に注射した。触知可能な腫瘍の形成時に、処置を開始した。処置は、右側腹部には２０ｕｇのｓＴＮＦＲＳＦ１４を、左側腹部にはビヒクルをマウスの腫瘍内に注射することを含む。顕著な単剤効果が認められ、ｓＴＮＦＲＳＦ１４注射腫瘍におけるほぼ完全な増殖遅延が示された（図２０）。ｓＴＮＦＲＳＦ１４処置腫瘍と比較した場合、ビヒクル処置腫瘍は、著しくより速く、かつより大きいサイズに増殖した（図２１）。処置を開始してから１１日後にｓＴＮＦＲＳＦ１４処置腫瘍は、平均重量が０．７５ｇのみのであったが、ビヒクル処置腫瘍は、３ｇの平均重量であった（図２２）。ｓＴＮＦＲＳＦ１４により処置した腫瘍は、ビヒクル処置腫瘍と比較してリン酸化ＥＲＫのレベルの低下を示した（図２３）。ｓＴＮＦＲＳＦ１４処置腫瘍は、より高いレベルのタネル染色および増殖マーカーＫｉ６７の低下も示した（図２４）。総合すると、これらの結果は、処置標的としてのＨＶＥＭの有用性および例えば、Ｂｃｌ２陽性濾胞性リンパ腫における処置剤としての可溶性ＨＶＥＭポリペプチドの有用性をさらに確認するものである。

ＣＡＲ Ｔ細胞を用いた腫瘍への可溶性ＨＶＥＭポリペプチドの標的送達
ＣＤ１９＋Ｂ細胞性悪性腫瘍が、操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の再導入を含む免疫調節療法に対して感受性であることが最近明らかになった（Brentjens, Riviere et al. 2011, Kalos, Levine et al. 2011, Kochenderfer, Dudley et al. 2012, Brentjens, Davila et al. 2013）。これらのＴ細胞は、非主要組織適合性腫瘍認識および根絶の能力がある腫瘍標的Ｔ細胞の発生を可能にするＣＡＲを発現する。さらに、これらのＴ細胞は、ＣＤ１９＋腫瘍を有するマウスの生存を向上させるＩＬ１２などのさらなる因子を分泌するように操作することができる（Pegram, Purdon et al. 2015）。本明細書で述べたように、このスキームは、可溶性ＴＮＦＲＳＦ１４／ＨＶＥＭポリペプチドを用いてＦＬなどのＣＤ１９＋Ｂ細胞性悪性腫瘍の処置を可能にするように今回修正した。このアプローチの概略図を図２５に示す。

可溶性ＨＶＥＭポリペプチドがＴ細胞の生存率に対する影響を有するかどうかを判断するための実験を最初に行った。図２６Ａに可溶性ＨＶＥＭポリペプチド（ｓｏｌＨＶＥＭ：１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８による刺激を用いるかまたは用いずに２４時間培養した精製マウスＯＴ１細胞（ｎ＝２）の生存率を示し、図２６ＢにＦＡＣＳにより同定された活性化マウスＯＴ１細胞の百分率を示す。これらの結果から、可溶性ＨＶＥＭポリペプチド発現がＴ細胞の生存率または活性化に対して影響を有さなかったことが示された。

次に、同じコンストラクト／ベクターからＣＡＲ分子および可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチド（ならびにＧＦＰ）の両方の発現を可能にするために改変キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コンストラクトを作製した。図２５Ｂに示すように、Ｐ２Ａタンパク質切断部位およびＩｇＧカッパ分泌シグナルの下流のヒト可溶性ＨＶＥＭポリペプチド（ＨＶＥＭ Ｐ３７〜Ｖ２０２）をコードするヌクレオチド配列を含むようにＳＦＧ−１９２８ｚベクターを改変した。図２５Ｂに示すように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするヌクレオチド配列もＧＦＰと１９２８ｚ配列の間の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、コンストラクト−１９２８ｚ配列の下流−に含めた。得られる１９２８−ＧＦＰ−ＨＶＥＭコンストラクトの概略図を図２５Ｂに示す。得られる１９２８−ＧＦＰ−ＨＶＥＭコンストラクトのヌクレオチド配列を配列番号９として示す。

次に、ヒトＴ細胞を密度遠心分離によりヒトＰＢＭＣｓから単離し、ＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）およびフィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ）の存在下でＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎｏｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに培養することによって活性化し、拡大した。１９２８−ＧＦＰ−ＨＶＥＭコンストラクト（または対照コンストラクト）によるＴ細胞の形質導入をレトロネクチン（rectronectin）（Ｔａｋａｒａ）被覆プレート上で実施した。Ｔ細胞形質導入後に、ＧＦＰ＋細胞を選別し、ＣＤ３／Ｃｄ２８ビーズを用いてさらに拡大した。

１９２８−ＧＦＰ対照コンストラクト（非ＨＶＥＭ）または１９２８−ＧＦＰ−ＨＶＥＭコンストラクトを含むＴ細胞のウエスタンブロット解析によってＨＶＥＭ発現を評価した（図２７Ａ参照）。ＨＶＥＭの分泌は、Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｈｕｍａｎ ＨＶＥＭ ＥＬＩＳＡキットを用いた細胞培養上清のＥＬＩＳＡアッセイによって確認された（図２７Ｂ参照）。図２７に示すように、１９２８−ＧＦＰ−ＨＶＥＭ改変Ｔ細胞は、対照１９２８Ｔ細胞と比較してＨＶＥＭの産生および分泌の増加を示した。

形質導入Ｔ細胞の細胞溶解能力は、標的およびエフェクター細胞を特定の細胞比で共培養することによって決定した。標的細胞は、それぞれ高および低ＢＴＬＡ発現を有する、ＤＯＨＨ２およびＲａｊｉ細胞株を含んでいた。４または２４時間の共培養の後に、細胞を収集し、ＤＡＰＩおよびアネキシンＶについて染色し、フローサイトメトリーによりアッセイして、残存ＧＦＰ陰性生存細胞を検出した。結果を図２８Ａ〜Ｂに示す。

Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）と混合した５Ｍｉｏ ＤｏＨＨ２ヒトリンパ腫細胞のＮＯＤ／ＳＣＩＤ（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ／Ｊ）マウスの側腹部への皮下注射（ｓ．ｃ．）によって異種移植片を作製した。可視腫瘍の形成（おおよその容積２０ｍｍ^３）の後に、マウスにＨＶＥＭ分泌改変を有するかまたは有さない１Ｍｉｏ抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を単回投与した。前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）ｓｃＦｖを含むＴ細胞を対照ＣＡＲ Ｔ細胞として用いた。腫瘍容積を週２回測定した。図２８Ｃおよび図２８Ｄに示すように、ＨＶＥＭ分泌ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、非ＨＶＥＭ分泌ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞または対照ＰＳＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞について認められたものよりも大きい程度にインビボでの腫瘍増殖を阻害した。

抗ＣＤ２０抗体を用いた可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドの標的送達
可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドは、Ｂ細胞性リンパ腫を特異的に標的とする薬剤のような、適切な腫瘍標的薬剤に連結させることができる。例えば、本実施例において、可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドを抗ＣＤ２０抗体リツキシマブに共有結合させ、次いでＢ細胞性リンパ腫を有する対象に投与する。同様な標的アプローチがＦＬにおける他の細胞外腫瘍抑制因子を用いて功を奏することが既に示された（Oricchio, Nanjangud et al. 2011, Oricchio and Wendel 2012）。特に、この種のアプローチは、現行の療法と比べてオフターゲット効果の低減を含む長所を有し、非常に低い用量の可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドの使用の可能性を有する。

前述の発明は、明瞭さおよび理解の目的のためにある程度詳細に説明したが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることは、本開示を読むことによって当業者に明らかになる。本発明はまた、以下の特許請求の範囲によりさらに規定しうる。

参考文献
Aguzzi et al. (2014). Follicular dendritic cells: origin, phenotype, and function in health and disease. Trends Immunol 35, 105-113.
Ame-Thomas et al. (2015). CD10 delineates a subset of human IL-4 producing follicular helper T cells involved in the survival of follicular lymphoma B cells. Blood 125, 2381-2385.
Ame-Thomas et al. (2012). Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia 26, 1053-1063.
Ame-Thomas et al. (2007). Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood 109, 693-702.
Ame-Thomas et al. (2014). The yin and the yang of follicular lymphoma cell niches: role of microenvironment heterogeneity and plasticity. Semin Cancer Biol 24, 23-32.
Amin et al. (2015). DC-SIGN-expressing macrophages trigger activation of mannosylated IgM B-cell receptor in follicular lymphoma. Blood 126, 1911-1920.
Bagchi et al. (2008). "The quest for the 1p36 tumor suppressor." Cancer Res 68(8): 2551-2556.
Beroukhim et al. (2010). The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature 463, 899-905.
Bjordahl et al. (2013). Lymphotoxin network pathways shape the tumor microenvironment. Current opinion in immunology 25, 222-229.
Bouska et al. (2014). Genome-wide copy-number analyses reveal genomic abnormalities involved in transformation of follicular lymphoma. Blood 123, 1681-1690.
Brentjens et al. (2013). "CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia." Sci Transl Med 5(177): 177ra138.
Brentjens et al. (2011). "Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias." Blood 118(18): 4817-4828.
Brentjens et al. (2007). "Genetically targeted T cells eradicate systemic acute lymphoblastic leukemia xenografts." Clin Cancer Res 13(18 Pt 1): 5426-5435.
Cai et al. (2009). The CD160, BTLA, LIGHT/HVEM pathway: a bidirectional switch regulating T-cell activation. Immunological reviews 229, 244-258.
Challa-Malladi et al. (2011). Combined Genetic Inactivation of β2-Microglobulin and CD58 Reveals Frequent Escape from Immune Recognition in Diffuse Large B Cell Lymphoma. Cancer Cell 20, 728-740.
Chang et al. (2015). Stromal infrastructure of the lymph node and coordination of immunity. Trends Immunol 36, 30-39.
Cheung et al. (2010). Acquired TNFRSF14 mutations in follicular lymphoma are associated with worse prognosis. Cancer Res 70, 9166-9174.
Cheung et al. (2005). Evolutionarily divergent herpesviruses modulate T cell activation by targeting the herpesvirus entry mediator cosignaling pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 13218-13223.
Cheung et al. (2009). T cell intrinsic heterodimeric complexes between HVEM and BTLA determine receptivity to the surrounding microenvironment. J Immunol 183, 7286-7296.
Crotty, S. (2014). T follicular helper cell differentiation, function, and roles in disease. Immunity 41, 529-542.
De Silva et al. (2015). Dynamics of B cells in germinal centres. Nature reviews Immunology 15, 137-148.
del Rio et al. (2010). HVEM/LIGHT/BTLA/CD160 cosignaling pathways as targets for immune regulation. J Leukoc Biol 87, 223-235.
Egle et al. (2004). VavP-Bcl2 transgenic mice develop follicular lymphoma preceded by germinal center hyperplasia. Blood 103, 2276-2283.
Festing, M.F. (2002). The design and statistical analysis of animal experiments. ILAR J 43, 191-193.
Fitzgibbon et al. (2007). Genome-wide detection of recurring sites of uniparental disomy in follicular and transformed follicular lymphoma. Leukemia 21, 1514-1520.
Fletcher et al. (2015). Lymph node fibroblastic reticular cells in health and disease. Nature reviews Immunology 15, 350-361.
Fridy et al. (2014). A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods 11(12):1253-60.
Gavrieli et al. (2003). Characterization of phosphotyrosine binding motifs in the cytoplasmic domain of B and T lymphocyte attenuator required for association with protein tyrosine phosphatases SHP-1 and SHP-2. Biochemical and biophysical research communications 312, 1236-1243.
Guilloton et al. (2012). Mesenchymal stromal cells orchestrate follicular lymphoma cell niche through the CCL2-dependent recruitment and polarization of monocytes. Blood 119, 2556-2567.
Jackson et al. (2016). "Driving CAR T-cells forward." Nat Rev Clin Oncol.
Kalos et al. (2011). "T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia." Sci Transl Med 3(95): 95ra73.
Kochenderfer et al. (2012). "B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells." Blood 119(12): 2709-2720.
Launay et al. (2012). High rate of TNFRSF14 gene alterations related to 1p36 region in de novo follicular lymphoma and impact on prognosis. Leukemia 26, 559-562.
Li et al. (2014). Mutations in linker histone genes HIST1H1 B, C, D, and E; OCT2 (POU2F2); IRF8; and ARID1A underlying the pathogenesis of follicular lymphoma. Blood 123, 1487-1498.
Lohr et al. (2012). Discovery and prioritization of somatic mutations in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) by whole-exome sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 3879-3884.
M'Hidi et al. (2009). High expression of the inhibitory receptor BTLA in T-follicular helper cells and in B-cell small lymphocytic lymphoma/chronic lymphocytic leukemia. American journal of clinical pathology 132, 589-596.
Mavrakis et al. (2008). Tumorigenic activity and therapeutic inhibition of Rheb GTPase. Genes Dev 22, 2178-2188.
Montgomery et al. (1996). "Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family." Cell 87(3): 427-436.
Morin et al. (2011). Frequent mutation of histone-modifying genes in non-Hodgkin lymphoma. Nature 476, 298-303.
Mourcin et al. (2012). Stromal cell contribution to human follicular lymphoma pathogenesis. Frontiers in immunology 3, 280.
Mueller et al. (2009). Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system. Nature reviews Immunology 9, 618-629.
Murphy et al. (2006). Balancing co-stimulation and inhibition with BTLA and HVEM. Nature reviews Immunology 6, 671-681.
Murphy et al. (2010). "Slow down and survive: Enigmatic immunoregulation by BTLA and HVEM." Annu Rev Immunol 28: 389-411.
Okosun et al. (2014). Integrated genomic analysis identifies recurrent mutations and evolution patterns driving the initiation and progression of follicular lymphoma. Nat Genet 46, 176-181.
Olshen et al. (2004). Circular binary segmentation for the analysis of array-based DNA copy number data. Biostatistics 5, 557-572.
Oricchio et al. (2011). The Eph-receptor A7 is a soluble tumor suppressor for follicular lymphoma. Cell 147, 554-564.
Oricchio & Wendel (2012). "Mining the cancer genome uncovers therapeutic activity of EphA7 against lymphoma." Cell Cycle 11(6): 1076-1080.
Ortega-Molina et al. (2015). The histone lysine methyltransferase KMT2D sustains a gene expression program that represses B cell lymphoma development. Nat Med 21, 1199-1208.
Pangault et al. (2010). Follicular lymphoma cell niche: identification of a preeminent IL-4-dependent T(FH)-B cell axis. Leukemia 24, 2080-2089.
Park et al. (2012). Expression of anti-HVEM single-chain antibody on tumor cells induces tumor-specific immunity with long-term memory. Cancer Immunol. Immunother. 61(2), 203-14.
Pasero et al. (2012). The HVEM network: new directions in targeting novel costimulatory/co-inhibitory molecules for cancer therapy. Current opinion in pharmacology 12, 478-485.
Pasqualucci et al. (2014). Genetics of follicular lymphoma transformation. Cell reports 6, 130-140.
Pegram et al. (2015). "IL-12-secreting CD19-targeted cord blood-derived T cells for the immunotherapy of B-cell acute lymphoblastic leukemia." Leukemia 29(2): 415-422.
Ramos et al. (2016). "CAR-T Cell Therapy for Lymphoma." Annu Rev Med 67: 165-183.
Rehm et al. (2011). Cooperative function of CCR7 and lymphotoxin in the formation of a lymphoma-permissive niche within murine secondary lymphoid organs. Blood 118, 1020-1033.
Roozendaal & Mebius (2011). Stromal cell-immune cell interactions. Annual review of immunology 29, 23-43.
Ross et al. (2007). Comprehensive analysis of copy number and allele status identifies multiple chromosome defects underlying follicular lymphoma pathogenesis. Clin Cancer Res 13, 4777-4785.
Sadelain (2015). "CAR therapy: the CD19 paradigm." J Clin Invest 125(9): 3392-3400.
Steinberg et al. (2011). The signaling networks of the herpesvirus entry mediator (TNFRSF14) in immune regulation. Immunological reviews 244, 169-187.
Vendel et al. (2009). B and T lymphocyte attenuator regulates B cell receptor signaling by targeting Syk and BLNK. J Immunol 182, 1509-1517.
Watanabe et al. (2003). BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature immunology 4, 670-679.
Wendel et al. (2004). Survival signalling by Akt and eIF4E in oncogenesis and cancer therapy. Nature 428, 332-337.
Yildiz et al. (2015). Activating STAT6 mutations in follicular lymphoma. Blood 125, 668-679

Claims (30)

1. （ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｂ）可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドがＨＶＥＭ ＣＲＤ１ドメイン、ＨＶＥＭ ＣＲＤ２ドメインおよびＨＶＥＭ ＣＲＤ３ドメインを含む、核酸分子。
2. 前記ＣＡＲが、Ｂ細胞性リンパ腫細胞上の細胞表面抗原に結合する、請求項１に記載の核酸分子。
3. 前記ＣＡＲが、濾胞性リンパ腫細胞上の細胞表面抗原に結合する、請求項１に記載の核酸分子。
4. 前記ＣＡＲが、ＤＬＢＣＬリンパ腫細胞上の細胞表面抗原に結合する、請求項１に記載の核酸分子。
5. 前記細胞表面抗原がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＩｇｋおよびＲＯＲ１からなる群から選択される、請求項２に記載の核酸分子。
6. 前記細胞表面抗原がＣＤ１９である、請求項２に記載の核酸分子。
7. 前記可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドが、ＢＴＬＡ結合、ＢＴＬＡ活性化、ＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫細胞の増殖の阻害、ＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫の増殖の阻害、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の刺激、Ｂ細胞性リンパ腫細胞におけるＢ細胞受容体の活性化の阻害、濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞によるＩＬ−２１の分泌の阻害、Ｂ細胞性リンパ腫細胞によるＩＬ−２１の分泌の阻害、ＢＣＲ経路活性化の阻害、ならびにＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫細胞におけるＢＴＫ、ＳＹＫおよび／またはＥＲＫ活性化の阻害からなる群から選択される１つまたは複数の活性を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
8. 前記可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号３、５または７で表される配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
9. 配列番号９で表される配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
10. 請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
11. 発現ベクターである、請求項１０に記載のベクター。
12. クローニングベクターである、請求項１０に記載のベクター。
13. 請求項１から６のいずれかに記載の核酸分子を含む細胞。
14. 請求項１０に記載のベクターを含む細胞。
15. 請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子を含むＴ細胞。
16. 請求項１０に記載のベクターを含むＴ細胞。
17. （ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｂ）可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変Ｔ細胞であって、前記可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドがＨＶＥＭ ＣＲＤ１ドメイン、ＨＶＥＭ ＣＲＤ２ドメインおよびＨＶＥＭ ＣＲＤ３ドメインを含む、遺伝子改変Ｔ細胞。
18. 前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする前記ヌクレオチド配列と、前記可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、同じ核酸分子内にある、請求項１７に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
19. 前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする前記ヌクレオチド配列と、前記可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、同じ核酸分子内にない、請求項１７に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
20. レポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１７に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
21. 前記レポータータンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項２０に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
22. 前記ＣＡＲが、Ｂ細胞性リンパ腫細胞上の細胞表面抗原に結合する、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
23. 前記ＣＡＲが、濾胞性リンパ腫細胞上の細胞表面抗原に結合する、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
24. 前記ＣＡＲが、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫細胞上の細胞表面抗原に結合する、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
25. 前記ＣＡＲがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＩｇｋおよびＲＯＲ１からなる群から選択される細胞表面抗原に結合する、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
26. 前記ＣＡＲがＣＤ１９に結合する、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
27. 前記可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドが、ＢＴＬＡ結合、ＢＴＬＡ活性化、ＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫細胞の増殖の阻害、ＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫の増殖の阻害、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の刺激、Ｂ細胞性リンパ腫細胞におけるＢ細胞受容体の活性化の阻害、濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞によるＩＬ−２１の分泌の阻害、Ｂ細胞性リンパ腫細胞によるＩＬ−２１の分泌の阻害、ＢＣＲ経路活性化の阻害、ならびにＢＴＬＡ^＋Ｂ細胞性リンパ腫細胞におけるＢＴＫ、ＳＹＫおよび／またはＥＲＫ活性化の阻害からなる群から選択される１つまたは複数の活性を有する、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
28. 前記可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が配列番号３、５または７で表される配列を含む、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
29. 配列番号４、６または８で表される配列を含む可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドを分泌する、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。
30. ＣＡＲおよび可溶性ＨＶＥＭエクトドメインポリペプチドの両方を発現するコンストラクトとして、配列番号９で表される配列を含む、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の遺伝子改変Ｔ細胞。

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