CN107881127A - 一种解淀粉芽孢杆菌Lxz‑41及利用该菌株可控制备纳米硒的方法 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌Lxz‑41及利用该菌株可控制备纳米硒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌Lxz‑41及利用该菌株可控制备纳米硒的方法。该解淀粉芽孢杆菌Lxz‑41的保藏编号为：CCTCC M2016578，保藏在中国典型培养物保藏中心，该菌株具有可控生产纳米硒的能力。本发明以解淀粉芽孢杆菌Lxz‑41作为发酵菌株，流加硒酸盐，控制菌株培养时间、转速、表面活性剂浓度来可控制备纳米硒，收集发酵液沉淀，纯化后得到纳米硒颗粒。本发明菌株耐高浓度的亚硒酸盐，通过制备过程条件的控制能够使产生的大部分的纳米硒颗粒粒径在200nm以下。本发明的可控纳米硒制备方法能够减轻硒酸盐对菌体生长的抑制作用，增加纳米硒的转化率，有效控制纳米硒颗粒的结团现象，且所需的培养基和培养条件简单、成本低、易操作适合于大规模的发酵罐生产。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌Lxz-41及利用该菌株可控制备纳米硒的 方法
技术领域
本发明属于微生物应用技术及纳米硒制备领域，具体是涉及一种解淀粉芽孢杆菌Lxz-41及利用该菌株可控制备纳米硒的方法。
背景技术
硒是生态系统中非常重要的营养元素，有着“生命元素”之称。早在1957年Schwarz研究确定硒是人和动物必需的营养元素。1973年，Rotruek等人发现硒是高等动物生物代谢不可缺少的谷胱甘肽过氧化物酶的活性组分。同年，硒被世界卫生组织认定是人体必需的微量元素。此后大量的研究表明，硒的营养范围十分狭窄。人体食物中硒含量少于0.05mg/kg就会造成缺硒，大于5mg/kg又会产生中毒。硒在地球上分布不均匀，出现了部分高硒地区和严重缺硒地带。中国72％地区处于缺硒、低硒带，膳食中硒摄入量的不足严重影响着几亿人口的身体健康。根据中国营养学会调查报告，成人每日的硒摄入量仅为26.63ug,距中国营养学会和国际硒学会推荐日摄入量50ug相差甚远。缺硒会引起人类的克山病、大骨节病、癌症、糖尿病、心脑血管病、不育症等疾病，而适当的补硒可以防癌、抗肿瘤、抗爱滋病和抗衰老。缺硒已严重威胁着人们的身体健康并造成潜在危害。近年来，随着人们越来越注重保健和养生，各种富硒产品应运而生，但是产品质量参差不齐，硒的含量没有一个统一的标准。并且由于土壤中硒含量的不均，富硒产品在种植过程中都采用喷洒无机硒(硒酸钠、亚硒酸钠)来提高产品中硒的含量。但是无机硒(硒酸钠、亚硒酸钠)毒性大，被列为第六类剧毒物质，无机硒的使用严重危害了环境和人类健康。因此，现在首要研究任务是开发一种高性能低毒性的硒源，这将是硒营养保健研究的重点
开始研究制备高活性低毒性的含硒化合物，目前这方面的研究进展比较缓慢。传统意义上包括两种形式的硒：一是兼有活性和毒性的硒化合物，二是毒性低的零价硒。其中零价硒主要存在灰色、红色和黑色三种形态，对于这三种形态的元素硒来说，我们所熟知的灰色和黑色硒粒径大，且没有生物活性，而纳米级红色硒具有生物活性，根据急性毒性(LD50)数据显示，无机硒LD50＝15mg/kg，有机硒LD50＝30-40mg/kg，纳米硒LD50＝113mg/kg。迄今，纳米硒是已发现毒性最低的。目前纳米硒的生产方法主要有化学合成法和生物合成法，生物的纳米硒比化学合成的纳米硒更均匀，形态更规则，且生物合成的纳米硒耐高温，更稳定，不易转化成黑色或褐色纳米硒。生物合成纳米硒主要利用微生物还原亚硒酸盐产生，随着研究的不断深入，能够合成纳米硒的微生物涵盖的种属极其丰富，超过30个属，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、荚膜红细菌(Rhodobacter Imhoff)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。但是由于大多数微生物不易发酵生产、不易保存的特性，不能实现工业化生产。芽孢杆菌由于能产生抗逆性比较强的芽孢，能耐生产加工过程中的不良环境和条件，加上易于保存，是工业化生产纳米硒的良好微生物菌种。但是由于各种因素，导致产生的微生物纳米硒颗粒粒径较大，且大小不一。
发明内容
本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌Lxz-41，该解淀粉芽孢杆菌具有可控制备纳米硒的能力。
本发明采用的技术方案是：
一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Lxz-41，保藏编号为：CCTCCM2016578，保藏在中国典型培养物保藏中心，该菌株具有可控生产纳米硒的能力。
一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Lxz-41可控生产纳米硒的方法，包含以下步骤:
S1.菌种活化：将保藏菌株接于牛肉膏蛋白胨或LB试管琼脂斜面培养基上，25-40℃静止培养活化，待菌落长满斜面；
S2.种子培养：将斜面培养菌种接种于含有硒盐的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，装液量为容器容量的20％，25-40℃、80-200r/min振荡培养12-24h，得种子液；
S3.纳米硒可控生产：将种子培养液按照1％-5％接种量接种至装有发酵培养基的发酵容器中，所述发酵培养基中包括硒盐，硒盐采用流加形式加入，发酵培养基装液量为发酵容器的40％-70％，搅拌速率50-200r/min、通气量0.5-2.0vvm，温度保持25-40℃，发酵时间24-72h；
S4.纳米硒提取纯化：发酵液下罐，4000-10000r/min4℃冷冻离心10-20min，收集得到菌体，用约1/4发酵液体积无菌生理盐水冲洗三次，用约1/20体积无菌蒸馏水进行悬浮，进行冰浴超声破壁20-40min，菌体裂解液4000-10000r/min4℃冷冻离心10-20min，沉淀用同体积去离子水清洗三次，并用约1/2体积蒸馏水悬浮，得到纳米硒悬液，加入同体积氯仿进行萃取30min，萃取2-3次，合并下层水相，用均质机均质2-5min，4000-10000r/min4℃冷冻离心10-20min，沉淀用等体积无菌生理盐水清洗3次，冷冻干燥即得微生物纳米硒。
进一步的，S2中牛肉膏蛋白胨液体培养基中的硒盐为亚硒酸盐、硒酸盐中的一种或几种，质量体积比为100-500mg/L。
对S2、S3培养基中的硒盐进行单独灭菌，然后加入到灭菌后的培养基中。
进一步的，S3中发酵培养基组分为(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨5，硫酸铵1，七水硫酸镁0.3，磷酸二氢钾0.5，磷酸氢二钾0.5，氯化钠2，硒盐0.1-4.5，表面活性剂0.5-1，pH＝7.2-7.4。
进一步的，S3中发酵培养基中的硒盐用母液分批流加形式或连续流加形式，以控制发酵液中硒盐的浓度，进而控制菌株的转化效率，所述硒盐为亚硒酸盐、硒酸盐中的一种或几种。
进一步的，发酵培养基中分批流加或连续流加亚硒酸钠，所用亚硒酸钠母液的浓度为50-500g/L。
进一步的，S4中超声破碎功率400W-1000W,频率20-40KHz，启停间隔10-15s，破碎20-40min。
进一步的，所述表面活性剂为SDS、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或几种。
本发明具备以下优点：
1.本发明所用解淀粉芽孢杆菌Lxz-41，能够耐受5000mg/L的亚硒酸钠，高于之前报道的芽孢杆菌的耐受浓度，且本发明采用分批流加亚硒酸盐形式，根据菌体的生长规律，在前期适应期加入低浓度的亚硒酸盐，随着菌体的生长，亚硒酸盐的浓度逐渐升高。这样能够解决由于亚硒酸盐的一次性加入对菌体所产生毒害的问题，而且在流加的条件下能够使亚硒酸盐的浓度一直维持在菌体最佳的转化浓度下，提高纳米硒的转化效率。
2.本发明通过控制发酵过程中的搅拌速率、表面活性剂浓度、发酵时间来控制所得纳米硒粒径的大小分布。且搅拌速率越大，粒径越小；在不影响菌体生长浓度范围内，表面活性剂浓度越大，粒径越小；在不影响菌体生长范围内，发酵时间越短，粒径越小。
3.本发明所选用的解淀粉芽孢杆菌Lxz-41能够耐高浓度亚硒酸钠，其菌种属于益生菌使用安全，解淀粉芽孢杆菌代谢产物丰富，分泌的抗生素抗菌蛋白或多肽类物质等添加到肥料中，能起到较好的生物防治和富硒效果；也可直接作为饲料添加剂添加到畜禽饲料里。解淀粉芽孢杆菌Lxz-41培养条件粗放，不易染菌，成本低，利用改菌株制备纳米硒的方法具有操作简单、成本低、制备方便、产量高等优点，适合大规模的制备。
附图说明
图1为本发明流加与一次性加入亚硒酸钠时，亚硒酸盐浓度与纳米硒转化率的对比柱状图；
图2为本发明流加与一次性加入亚硒酸钠时，亚硒酸盐浓度与菌体生长情况的对比柱状图；
图3为本发明不同搅拌速率下制备纳米硒的平均粒径变化的对比柱状图；
图4为本发明不同发酵时间下制备纳米硒的平均粒径变化的对比柱状图；
图5为本发明不同表面活性剂浓度下制备纳米硒的平均粒径变化的对比柱状图；
图6为本发明菌株特性图；
图7为本发明菌株对亚硒酸钠耐受浓度实验结果；
图8为本发明菌株液体摇瓶发酵产纳米硒照片；
图9为本发明方法所制备的纳米硒在分辨率为1μm下的电镜扫描照片；
图10为本发明方法所制备的纳米硒在分辨率为100nm下的电镜扫描照片。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
需要说明的是，本申请说明书中平均粒径的检测方法如下：
选取三组平行(三组相同制备条件下获得的纳米硒颗粒)进行拍摄，在每张照片中随机选择并测量Ni颗纳米硒粒子粒径，由下面公式计算平均粒径。
本发明从陕西省安康市紫阳土壤中分离得到一株可耐受较高浓度亚硒酸钠的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Lxz-41，菌株Lxz-41现保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌路珈山，邮编430072，保藏编号CCTCC M2016578，保藏日期2016年10月18日。
该解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Lxz-41的16srDNA序列如下所示：
AATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTA
本发明还提供一种利用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Lxz-41可控制备纳米硒的方法，该方法包括以下步骤：
S1.菌种活化：将保藏菌株接于牛肉膏蛋白胨或LB试管琼脂斜面培养基上，25-40℃静止培养活化，待菌落长满斜面；
S2.种子培养：将斜面培养菌种接种于含有硒盐的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，装液量为容器容量的20％，25-40℃、80-200r/min振荡培养12-24h，得种子液；
S3.纳米硒可控生产：将种子培养液按照1％-5％接种量接种至装有发酵培养基的发酵容器中，所述发酵培养基中包括硒盐，硒盐采用流加形式加入，发酵培养基装液量为发酵容器的40％-70％，搅拌速率50-200r/min、通气量0.5-2.0vvm，温度保持25-40℃，发酵时间24-72h；
S4.纳米硒提取纯化：发酵液下罐，4000-10000r/min4℃冷冻离心10-20min，收集得到菌体，用约1/4发酵液体积无菌生理盐水冲洗三次，用约1/20体积无菌蒸馏水进行悬浮，进行冰浴超声破壁20-40min，菌体裂解液4000-10000r/min4℃冷冻离心10-20min，沉淀用同体积去离子水清洗三次，并用约1/2体积蒸馏水悬浮，得到纳米硒悬液，加入同体积氯仿进行萃取30min，萃取2-3次，合并下层水相，用均质机均质2-5min，4000-10000r/min4℃冷冻离心10-20min，沉淀用等体积无菌生理盐水清洗3次，冷冻干燥即得微生物纳米硒。
S2中牛肉膏蛋白胨液体培养基中的硒盐为亚硒酸盐、硒酸盐中的一种或几种，质量体积比为100-500mg/L。
对S2、S3培养基中的硒盐进行单独灭菌，然后加入到灭菌后的培养基中。
S3中发酵培养基组分为(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨5，硫酸铵1，七水硫酸镁0.3，磷酸二氢钾0.5，磷酸氢二钾0.5，氯化钠2，硒盐0.1-4.5，表面活性剂0.5-1，pH＝7.2-7.4。
S3中发酵培养基中的硒盐用母液分批流加形式或连续流加形式，以控制发酵液中硒盐的浓度，进而控制菌株的转化效率，所述硒盐为亚硒酸盐、硒酸盐中的一种或几种。
发酵培养基中分批流加或连续流加亚硒酸钠，所用亚硒酸钠母液的浓度为50-500g/L。
S4中超声破碎功率400W-1000W,频率20-40KHz，启停间隔10-15s，破碎20-40min。
所述表面活性剂为SDS、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或几种。
图7为本发明菌株对亚硒酸钠耐受浓度实验结果，由图中可知，解淀粉芽孢杆菌能够耐受5000mg/L的亚硒酸钠，而最适合菌体生长的亚硒酸钠的浓度范围为1500mg/L-3000mg/L，菌株高亚硒酸钠的耐受能力提高了纳米硒的生产能力。
参见图1和图2，以发酵48h为例，在流加和一次性加入种子培养液时，亚硒酸盐浓度与纳米硒转化率的对比柱状图；由图中可知，采用分批流加亚硒酸盐形式，根据菌体的生长规律，在前期适应期加入低浓度的亚硒酸盐，随着菌体的生长，亚硒酸盐的浓度逐渐升高。这样能够解决由于亚硒酸盐的一次性加入对菌体所产生毒害的问题，而且在流加的条件下能够使亚硒酸盐的浓度一直维持在菌体最佳的转化浓度下，提高纳米硒的转化效率。
参见图3-图5，通过控制发酵过程中的搅拌速率、表面活性剂浓度、发酵时间来控制所得纳米硒粒径的大小分布。且搅拌速率越大，粒径越小；在不影响菌体生长浓度范围内，表面活性剂浓度越大，粒径越小；在不影响菌体生长范围内，发酵时间越短，粒径越小。
最终通过本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Lxz-41液体摇瓶发酵产纳米硒照片如图8所示，采用亚硒酸钠添加浓度为2000mg/L、3000mg/L，140r/min，28℃培养24h，溶液变成鲜红色；通过收集发酵液沉淀，纯化后得到纳米硒颗粒微观结构参见图9和图10所示，所制备的纳米硒颗粒粒径在100-200nm之间。
实施例1：解淀粉芽孢杆菌Lxz-41对不同C源的利用及化学因子的敏感性
将解淀粉芽孢杆菌Lxz-41接种于LB固体培养基中，28℃培养16h，刮取2环菌落接种于LB液体培养基中，28℃培养24h。
用排枪将培养液加入到带有不同C源和敏感因子的96孔板中，96孔板布局如下表1。
表1
28℃恒温静止培养48h，通过微生物生化分析仪读取显色反应吸光值，见附图6。
实施例2：解淀粉芽孢杆菌Lxz-41的鉴定
将解淀粉芽孢杆菌Lxz-41接种于LB固体培养基中，28℃培养16h，刮取2环菌落接种于LB液体培养基中，28℃培养24h。
取灭菌的EP管，加入解淀粉芽孢杆菌Lxz-41培养液1ml，12000r/min离心1min，然后按照天根生化科技有限公司细菌提取试剂盒进行解淀粉芽孢杆菌Lxz-41DNA的提取。
PCR反应条件：引物：27F:AGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT.反应条件见表2
表2
PCR产物进行试剂盒纯化后进行测序，测序后利用DNAMAN5.0进行片段拼接，将获得的序列,见附图并在GENbank进行16S rDNA BLAST比对，根据结果显示，菌株Lxz-41与Bacillus amyloliquefaciens Y2，序列相似性达到100％。由此确定了Lxz-41为解淀粉芽孢杆菌，定名为Bacillus amyloliquefaciens Lxz-41，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M 2016578。
实施例3：解淀粉芽孢杆菌Lxz-41对亚硒酸钠的耐受浓度
将解淀粉芽孢杆菌Lxz-41接种于LB固体培养基中，28℃培养16h，刮取2环菌落接种于LB液体培养基中，28℃培养24h。
配置含亚硒酸钠浓度分别为0、100、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000mg/L的牛肉膏蛋白胨或LB液体培养基。取灭菌的96孔板，每个浓度8个平行，每孔加入150uL培养基，接入5uL解淀粉芽孢杆菌Lxz-41，30℃，100r/min振荡培养48h。附图8结果显示，亚硒酸钠浓度4500mg/L及以下，菌体均有所生长，且溶液亚硒酸钠含量在100mg/L以上开始变红，亚硒酸钠浓度在4500mg/L及以上时，已经明显抑制菌体的生长。因此，确定了解淀粉芽孢杆菌Lxz-41对亚硒酸钠的最大耐受浓度为4500mg/L。
实施例4：纳米硒制备
菌种活化：将保藏菌株接于牛肉膏蛋白胨试管琼脂斜面培养基上，25℃静止培养活化，待菌落长满斜面。
种子培养：将斜面培养菌种接种于含有100mg/L亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，装液量为容器容量的20％，28℃、80r/min振荡培养24h，得种子液。
纳米硒可控生产：将种子培养液按照5％接种量接种至1L三角瓶发酵培养基中，装液量为400mL，发酵开始前加入500mg/L的亚硒酸钠，24h后再加入250mg/L的亚硒酸钠，25℃80r/min摇瓶培养48h。
纳米硒提取纯化：将发酵液10000r/min冷冻离心10min，收集得到菌体，用100mL无菌生理盐水冲洗三次，用20mL体积无菌蒸馏水进行悬浮，进行冰浴超声破壁，30W，启停间隔15s，破碎20min，菌体裂解液10000r/min冷冻离心10min，沉淀用20mL去离子水清洗三次，并用10mL体积蒸馏水悬浮，得到纳米硒悬液，加入同体积氯仿进行萃取30min，萃取3次，合并下层水相，用均质机均质5min，10000r/min冷冻离心10min，沉淀用10mL无菌生理盐水清洗3次，冷冻干燥24h得到微生物纳米硒。
纳米硒的纯度及平均粒径的检测：硒的检测按照国家标准GB 5009.93-2017进行，在此条件下，纳米硒的转化率为88.31％，所得硒的纯度为91.2％，平均粒径为153±20nm。
实施例5：纳米硒制备
菌种活化：将保藏菌株接于牛肉膏蛋白胨试管琼脂斜面培养基上，40℃静止培养活化，待菌落长满斜面。
种子培养：将斜面培养菌种接种于含有100mg/L亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，装液量为容器容量的20％，40℃、200r/min振荡培养24h，得种子液。
纳米硒可控生产：将种子培养液按照5％接种量接种至500L发酵罐发酵培养基中，装液量为350L，采用连续流加亚硒酸钠母液(50g/L)的方式，流加速度1.5mL/min,连续流加36h，40℃200r/min发酵培养72h。
纳米硒提取纯化：将发酵罐发酵液4000r/min冷冻离心20min，收集得到菌体，用100L无菌生理盐水冲洗三次，用15L体积无菌蒸馏水进行悬浮，进行冰浴超声破壁，800W，启停间隔15s，破碎20min，菌体裂解液5000r/min冷冻离心20min，沉淀用15L去离子水清洗三次，并用5L体积蒸馏水悬浮，得到纳米硒悬液，加入同体积氯仿进行萃取30min，萃取3次，合并下层水相，用均质机均质5min，5000r/min冷冻离心10min，沉淀用5L无菌生理盐水清洗3次，冷冻干燥48h得到微生物纳米硒。
纳米硒的纯度及平均粒径的检测：硒的检测按照国家标准GB 5009.93-2017进行；在此条件下纳米硒的转化率为94.32％，所得硒的纯度为91.6％，平均粒径为116±20nm。
实施例6：纳米硒制备
菌种活化：将保藏菌株接于牛肉膏蛋白胨试管琼脂斜面培养基上，30℃静止培养活化，待菌落长满斜面。
种子培养：将斜面培养菌种接种于含有100mg/L亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，装液量为容器容量的20％，30℃、140r/min振荡培养24h，得种子液。
纳米硒可控生产：将种子培养液按照5％接种量接种至100L小型发酵罐发酵培养基中，装液量为50L，发酵开始前加入500mg/L的亚硒酸钠，24h后进行连续流加亚硒酸钠母液(50g/L),0.1mL/min，连续流加24h，30℃140r/min搅拌共培养60h。
纳米硒提取纯化：将发酵液8000r/min冷冻离心15min，收集得到菌体，用10L无菌生理盐水冲洗三次，用2L体积无菌蒸馏水进行悬浮，进行冰浴超声破壁，600W，启停间隔15s，破碎20min，菌体裂解液8000r/min冷冻离心15min，沉淀用1L去离子水清洗三次，并用1L体积蒸馏水悬浮，得到纳米硒悬液，加入同体积氯仿进行萃取30min，萃取3次，合并下层水相，用均质机均质5min，8000r/min冷冻离心15min，沉淀用1L无菌生理盐水清洗3次，冷冻干燥48h得到微生物纳米硒。
纳米硒的纯度及平均粒径的检测：硒的检测按照国家标准GB 5009.93-2017进行,在此条件下纳米硒的转化率为91.3％，所得硒的纯度为92％，平均粒径为145±20nm。
实施例7：纳米硒制备
菌种活化：将保藏菌株接于牛肉膏蛋白胨试管琼脂斜面培养基上，35℃静止培养活化，待菌落长满斜面。
种子培养：将斜面培养菌种接种于含有100mg/L亚硒酸钠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，装液量为容器容量的20％，35℃、180r/min振荡培养24h，得种子液。
纳米硒可控生产：将种子培养液按照5％接种量接种至1T发酵罐发酵培养基中，装液量为600L，采用连续流加亚硒酸钠母液(50g/L)的方式，流加速度2mL/min,连续流加48h后，流速变为1ml/min，流加12h，35℃180r/min共发酵培养72h。
纳米硒提取纯化：将发酵液5000r/min冷冻离心20min，收集得到菌体，用150L无菌生理盐水冲洗三次，用30L无菌蒸馏水进行悬浮，进行冰浴超声破壁，1000W，启停间隔15s，破碎20min，菌体裂解液5000r/min冷冻离心20min，沉淀用15L去离子水清洗三次，并用15L体积蒸馏水悬浮，得到纳米硒悬液，加入同体积氯仿进行萃取30min，萃取3次，合并下层水相，用均质机均质5min，5000r/min冷冻离心20min，沉淀用15L无菌生理盐水清洗3次，冷冻干燥48h得到微生物纳米硒。
纳米硒的纯度及平均粒径的检测：硒的检测按照国家标准GB 5009.93-2017进行，在此条件下，纳米硒的转化率为90.8％，所得硒的纯度为93.2％，平均粒径为153±20nm。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 陕西省微生物研究所
<120> 一种解淀粉芽孢杆菌Lxz-41及利用该菌株可控制备纳米硒的方法
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1404
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌Lxz-41（Bacillus amyloliquefaciens Lxz-41）
<400> 1
aatacatgca agtcgagcgg acagatggga gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg 60
tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa 120
taccggatgc ttgtttgaac cgcatggttc agacataaaa ggtggcttcg gctaccactt 180
acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcaacgat 240
gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct 300
acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc 360
gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt 420
caaatagggc ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc 480
agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc 540
aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa 600
ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta 660
gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga 720
gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga 780
gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg 840
cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg 900
gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc 960
tgacaatcct agagatagga cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg 1020
tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct 1080
tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg 1140
tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg 1200
acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt 1260
cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc 1320
atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt 1380
gtaacacccg aagtcggtga ggta 1404

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Baci l lus amylol iquefaciens)Lxz-41，保藏编号为：CCTCC M2016578，保藏在中国典型培养物保藏中心，该菌株具有可控生产纳米硒的能力。
2.一种解淀粉芽孢杆菌(Baci l lus amylol iquefaciens)Lxz-41可控生产纳米硒的方法，其特征在于，包含以下步骤:
S1.菌种活化：将保藏菌株接于牛肉膏蛋白胨或LB试管琼脂斜面培养基上，25-40℃静止培养活化，待菌落长满斜面；
S2.种子培养：将斜面培养菌种接种于含有硒盐的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，装液量为容器容量的20％，25-40℃、80-200r/min振荡培养12-24h，得种子液；
S3.纳米硒可控生产：将种子培养液按照1％-5％接种量接种至装有发酵培养基的发酵容器中，所述发酵培养基中包括硒盐，硒盐采用流加形式加入，发酵培养基装液量为发酵容器容量的40％-70％，搅拌速率50-200r/min、通气量0.5-2.0vvm，温度保持25-40℃，发酵时间24-72h；
S4.纳米硒提取纯化：发酵液下罐，4000-10000r/min4℃冷冻离心10-20min，收集得到菌体，用约1/4发酵液体积无菌生理盐水冲洗三次，用约1/20体积无菌蒸馏水进行悬浮，进行冰浴超声破壁20-40min，菌体裂解液4000-10000r/min4℃冷冻离心10-20min，沉淀用同体积去离子水清洗三次，并用约1/2体积蒸馏水悬浮，得到纳米硒悬液，加入同体积氯仿进行萃取30min，萃取2-3次，合并下层水相，用均质机均质2-5min，4000-10000r/min4℃冷冻离心10-20min，沉淀用等体积无菌生理盐水清洗3次，冷冻干燥即得微生物纳米硒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2中牛肉膏蛋白胨液体培养基中的硒盐为亚硒酸盐、硒酸盐中的一种或几种，质量体积比为100-500mg/L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对S2、S3培养基中的硒盐进行单独灭菌，然后加入到灭菌后的培养基中。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S3中发酵培养基组分为(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨5，硫酸铵1，七水硫酸镁0.3，磷酸二氢钾0.5，磷酸氢二钾0.5，氯化钠2，硒盐0.1-4.5，表面活性剂0.5-1，pH＝7.2-7.4。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S3中发酵培养基中的硒盐用母液分批流加形式或连续流加形式，以控制发酵液中硒盐的浓度，进而控制菌株的转化效率，所述硒盐为亚硒酸盐、硒酸盐中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵培养基中分批流加或连续流加亚硒酸钠，所用亚硒酸钠母液的浓度为50-500g/L。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S4中超声破碎功率400W-1000W,频率20-40KHz，启停间隔10-15s，破碎20-40min。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂为SDS、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或几种。
10.含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌Lxz-41的复合微生物菌剂。
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