CN107841549A - 一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本发明还公开了一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度的测定方法。本发明所述的丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒采用荧光定量PCR技术，具有实时监测，特异性强，精确定量的优势，确保诊断结果的精确性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及测定方法。
背景技术
脑卒中(cerebral stroke)是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。脑卒中具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点，临床表现为严重头痛、昏厥、失去意识等，这也成为了中国成年人残疾的首要原因。脑卒中患者需要长期服用降压药，定期进行常规检查，控制颅内压，可见脑卒中患者给社会和家庭带来了极大的经济负担。脑卒中是一种由遗传和环境因素共同作用引起的复杂性疾病，对脑卒中发病机制的探索进而寻找出适合诊断治疗药物已然成为了现今研究的一个热点。而在脑卒中的发病机制尚未清晰阐明的情况下，对脑卒中的预防以及早期检测更是刻不容缓。
丝氨酸羟甲基转移酶基因(srinehydroxymethyltranseferase，SHMT1)是一种蛋白编码基因，它能够编码形成丝氨酸羟甲基转移酶，该酶可以催化四氢叶酸逆向转化为5，10-亚甲基四氢叶酸。该蛋白的缺乏会导致同型半胱氨酸水平升高，进而提高脑卒中的患病风险。丝氨酸羟甲基转移酶是由位于第17号染色体的丝氨酸羟甲基转移酶基因(srinehydroxymethyltranseferase，SHMT1)(Chr17：18266824-18266911)编码而成的。现在国内外的研究已经确定同型半胱氨酸水平与脑卒中的发生有着较大的关联，但是对同型半胱氨酸水平的影响因素与其调控机制的研究较少。
目前关于丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒和测定方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，对指定基因启动子区域DNA甲基化水平的进行测定，是一种检测方便、普适度高、准确率高的检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，该方法检测方便、普适度高、准确率高。
为实现本发明的第一个目的本发明所采用的技术方案如下：
一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物：
Primer F：5’-CGAGTTTAGGAAGGTGTATT-3’(SEQ ID NO.1)和
Primer R：5’-CCATACTTAACTACGCTCTC-3’(SEQ ID NO.2)。
作为进一步的方案，本发明所述的检测试剂盒还包括洗涤液和洗脱液。
作为进一步的方案，本发明所述的荧光定量PCR反应液还包括10×PCR buffer、MgCl2、d NTPs、热启动Taq DNA酶、DNA模板、无菌双蒸水以及荧光染料。
作为进一步的方案，本发明所述的荧光染料为2×SYBR Green I。
作为进一步的方案，本发明所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/LMgCl21.5μL、2.5mmol/L d NTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM Primer R0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL。
作为进一步的方案，本发明所述的阳性对照为正常人样本的基因组完全甲基化后所得到的完全DNA甲基化样本；所述阴性对照为无菌双蒸水。
为实现本发明的第二个目的本发明所采用的技术方案如下：
一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，其包括
DNA提取步骤：提取全血基因组DNA并检测DNA的浓度；
用甲基化试剂盒对全血基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化步骤：用EZ DNAMethylation-Gold试剂盒将上述提取额全血基因组DNA与亚硫酸氢盐反应会使单链中未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后经过上样、洗涤、洗脱等步骤得到转化后的DNA；
DNA甲基化水平测定步骤：上述转化后的DNA作为样本DNA加入含荧光定量PCR反应液进行PCR扩增反应，使基因序列进行倍数扩增，每一个样本DNA对应一个的扩增曲线；曲线与既设阈值相交的横坐标点即为CT值，并通过下述计算式计算出甲基化率：
ΔΔCt＝DNA样本(CT靶基因-CTACTB)-阳性对照(CT靶基因-CTACTB)；
其中，ΔΔCt是指甲基化率，CT靶基因是指目标基因的PCR循环数即丝氨酸羟甲基转移酶基因的Ct值，CTACTB是指一种常用的内参基因即ACTB的PCR循环数。
作为进一步的方案，上述测定方法中所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl21.5μL、2.5mmol/L d NTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM Primer R0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL。
作为进一步的方案，上述测定方法中所述的甲基化水平测定步骤具体如下： 首先将转化后的DNA样本加入到热启动Taq DNA酶中，然后加入一对丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物Primer F和Primer R；最后依次加入DNA模板、10×PCRbuffer、Mg Cl2、d NTPs、2×SYBR Green I以及无菌双蒸水。
作为进一步的方案，上述测定方法中所述的PCR扩增反应条件如下：预变性95℃，10min；95℃，20s，退火温度，20s，72℃，single，30s，45个循环；溶解曲线95℃，15s，60℃，60s，95℃，continuous；保温40℃，10min。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明所述的丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒采用荧光定量PCR技术，具有实时监测，特异性强，精确定量的优势，确保诊断结果的精确性；
2.本发明所述的丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒是基于血浆、唾液、尿液等体液检查的试剂盒，随时随地进行检测，并且能在较短时间内取得检测结果；
3.本发明所述的丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒检测费用低、易于为大众所接受。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为丝氨酸羟甲基转移酶基因的染色体定位图。
图2为丝氨酸羟甲基转移酶基因的测序图。
图3为丝氨酸羟甲基转移酶基因的电泳图。
具体实施方式
本发明所述的丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒， 该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物：
Primer F：5’-CGAGTTTAGGAAGGTGTATT-3’(SEQ ID NO.1)和
Primer R：5’-CCATACTTAACTACGCTCTC-3’(SEQ ID NO.2)。
作为进一步的方案，本发明所述的检测试剂盒还包括洗涤液和洗脱液。
作为进一步的方案，本发明所述的荧光定量PCR反应液还包括10×PCRbuffer、MgCl2、d NTPs、热启动Taq DNA酶、DNA模板、无菌双蒸水以及荧光染料。
作为进一步的方案，本发明所述的荧光染料为2×SYBR Green I。
作为进一步的方案，本发明所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/LMgCl21.5μL、2.5mmol/L d NTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM Primer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL。
作为进一步的方案，本发明所述的阳性对照为正常人样本的基因组完全甲基化后所得到的完全DNA甲基化样本；所述阴性对照为无菌双蒸水。
本发明所述的丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，其包括
DNA提取步骤：提取全血基因组DNA并检测DNA的浓度；
利用甲基化试剂盒对全血基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化步骤：用EZ DNAMethylation-Gold试剂盒将上述提取额全血基因组DNA与亚硫酸氢盐反应会使单链中未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后经过上样、洗涤、洗脱等步骤得到转化后的DNA；
DNA甲基化水平测定步骤：上述转化后的DNA作为样本DNA加入含荧光定量PCR反应液进行PCR扩增反应，使基因序列进行倍数扩增，每一个样本DNA对应一个的扩增曲线；曲线与既设阈值相交的横坐标点即为CT值，并通过下述计算式计算出甲基化率：
ΔΔCt＝DNA样本(CT靶基因-CTACTB)-阳性对照(CT靶基因-CTACTB)；
其中，ΔΔCt是指甲基化率，CT靶基因是指目标基因的PCR循环数即丝氨酸羟甲基转移酶基因的Ct值，CTACTB是指一种常用的内参基因即ACTB的PCR循环数。
作为进一步的方案，上述方法中所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl21.5μL、2.5mmol/L d NTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM Primer R0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL。
作为进一步的方案，上述方法中所述的甲基化水平测定步骤具体如下：首先将转化后的DNA样本加入到热启动Taq DNA酶中，然后加入一对丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物Primer F和Primer R；最后依次加入DNA模板、10×PCR buffer、Mg Cl2、d NTPs2×SYBR Green I以及无菌双蒸水。
作为进一步的方案，上述方法中所述的PCR扩增反应条件如下：预变性95℃，10min；95℃，20s，退火温度，20s，72℃，single，30s，45个循环；溶解曲线95℃，15s，60℃，60s，95℃，continuous；保温40℃，10min。
由于丝氨酸羟甲基转移酶(srinehydroxymethyltranseferase，SHMT1)是一种蛋白编码基因，它能催化四氢叶酸逆向转化为5，10-亚甲基四氢叶酸。丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区域的高甲基化水平会导致该基因的低表达甚至表 达沉默，导致血叶酸水平下降引起同型半胱氨酸水平升高，可能成为脑卒中的一个风险因素。因此，通过检测丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化水平作为非诊断性检测脑卒中的一种方法，为辅助诊断脑卒中提供依据。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中，除在本发明有特殊限定外，所采用的试剂、原料和设备均可以通过购买获得。
实施例1
一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl21.5μL、2.5mmol/L d NTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM Primer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL；其中Primer F和Primer R核苷酸序列如下：
Primer F：5’-CGAGTTTAGGAAGGTGTATT-3’(SEQ ID NO.1)和
Primer R：5’-CCATACTTAACTACGCTCTC-3’(SEQ ID NO.2)；
所述的阳性对照为正常人样本的基因组完全甲基化后所得到的完全DNA甲基化样本；所述阴性对照为无菌双蒸水。
实施例2
一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，其包括
DNA提取步骤：利用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA并利用NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度；
用甲基化试剂盒对全血基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化步骤：用EZ DNAMethylation-Gold试剂盒将上述提取额全血基因组DNA与亚硫酸氢盐反应会使 单链中未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后经过上样、洗涤、洗脱等步骤得到转化后的DNA；
DNA甲基化水平测定步骤：上述转化后的DNA作为样本DNA加入含荧光定量PCR反应液进行PCR扩增反应，使基因序列进行倍数扩增，每一个样本DNA对应一个的扩增曲线，曲线与既设阈值相交的横坐标点即为CT值，并通过下述计算式计算出甲基化率：
ΔΔCt＝DNA样本(CT靶基因-CTACTB)-阳性对照(CT靶基因-CTAcTB)；
其中，ΔΔCt是指甲基化率，CT靶基因是指目标基因的PCR循环数即丝氨酸羟甲基转移酶基因的Ct值，CTACTB是指一种常用的内参基因即ACTB的PCR循环数；
所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl21.5μL、2.5mmol/L dNTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM Primer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL；
所述的PCR扩增反应条件如表1：
表1
由图1可知被检测序列所在区域具体位置为Chr17：18266824-18266911，据此进行后续甲基化分析；由图2的DNA序列分析结果表明，模板DNA的亚硫酸氢盐转化成功；图3显示毛细管电泳证实扩增片段长度为88bp。
应用实施例1
选择样本：对深圳地区脑卒中病人172例作为病例组(66.23±9.07岁)和年龄匹配且无脑卒中家族史的305名正常者作为对照组(65.14±9.26岁)；所有研究对象在知情同意的前提下，抽血检测尿酸水平、甘油三酯等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml作为样本入EDTA抗凝管中，-80℃低温储存，备用；
DNA提取步骤：利用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪(中国厦门，致善生物科技)提取样本中的全血基因组DNA并利用NanoDrop2000超微量分光光度计(美国，Thermo FisherScientific)检测DNA的浓度；
用甲基化试剂盒对全血基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化步骤：用EZ DNAMethylation-Gold试剂盒将上述提取额全血基因组DNA与亚硫酸氢盐反应会使单链中未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后经过上样、洗涤、洗脱等步骤得到转化后的DNA；
DNA甲基化水平测定步骤：上述转化后的DNA作为样本DNA加入含荧光定量PCR反应液进行PCR扩增反应，使基因序列进行倍数扩增，每一个样本DNA对应一个的扩增曲线，曲线与既设阈值相交的横坐标点即为CT值，并通过下述计算式计算出甲基化率：
ΔΔCt＝DNA样本(CT靶基因-CTACTB)-阳性对照(CT靶基因-CTACTB)；
其中，ΔΔCt是指甲基化率，CT靶基因是指目标基因的PCR循环数即丝氨酸羟甲基转移酶基因的Ct值，CTACTB是指一种常用的内参基因即ACTB的PCR循环数。
所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl21.5μL、2.5mmol/L dNTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM Primer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL；
所述的PCR扩增反应条件与实施例2的表1中相同；
采用SPSS 16.0对数据进行整理分析。从统计学角度考量，p值小于0.05具有统计学意义，甲基化率的计算结果参见表2：
表2：深圳地区病例组与对照组间的比较(n＝850)
注：n表示样本个数，p值是两个数组之间进行对照的结果，若其小于0.05，则表示这两个数组间具有较大的统计学差异，表述为阳性结果，用字符加粗来强调。Pa是脑卒中患者与高血压患者进行对比的结果；Pb是脑卒中患者与正常人进行对比的结果；Pc是高血压患者与正常人进行对比的结果。不符合正态分布的数据，用中位数(四分位数)来表示，其计算所得p值后加#；符合正态分布的数据，用平均数±方差来表示，其计算所得p值后加*，具有其合理性。以下下表格同。
应用实施例2
选择样本：收集宁波地区脑卒中病人56例作为病例组(62.98±11.70岁)和年龄匹配且无脑卒中家族史的137名正常者作为对照组(63.57±10.24岁)；对所有研究对象在知情同意的前提下，抽血检测尿酸水平、甘油三酯等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml作为样本入EDTA抗凝管中，-80℃低温储存，备 用；
按照上述应用实施例1的步骤进行检测、计算甲基化率并将结果与应用实施例中深圳组的结果进行对比，结果参见表3-5：
表3：宁波地区病例组与对照组间的比较(n＝193)
| 分组 | 脑卒中患者 | 正常人 | P值 |
| 甲基化率 | 50.22(43.29，59.30) | 49.70±37.61 | 0.302# |
| 性别(男/女) | 35/21 | 81/56 | 0.664 |
| 年龄 | 62.98±11.70 | 63.57±10.24 | 0.627* |
| UA(μmol/L) | 289.79±95.61 | 281.95±113.28 | 0.104* |
| TG(mmol/L) | 1.33(0.85，1.77) | 1.10(0.79，1.57) | 0.147# |
| TC(mmol/L) | 4.29±1.36 | 4.57±1.26 | 0.760* |
| LDL(mmol/L) | 2.55±0.98 | 2.85±0.90 | 0.638* |
表4：深圳与宁波地区病例组间的比较(n＝228)
| 分组 | 深圳脑卒中患者 | 宁波脑卒中患者 | P值 |
| 甲基化率 | 28.76(20.39，48.05) | 50.22(43.29，59.30) | 2.89E-09# |
| 性别(男/女) | 91/81 | 35/21 | 0.210 |
| 年龄 | 66.23±9.07 | 62.98±11.70 | 0.022* |
| UA(μmol/L) | 359.91±90.560 | 289.79±95.61 | 0.786* |
| TG(mmol/L) | 1.59(1.15，2.12) | 1.33(0.85，1.77) | 0.003# |
| TC(mmol/L) | 4.96±1.09 | 4.29±1.36 | 0.121* |
| LDL(mmol/L) | 2.88±0.84 | 2.55±0.98 | 0.296* |
表5深圳与宁波地区对照组间的比较(n＝442)
由表1可见：基因启动子区域高甲基化是导致脑卒中患者发病的一个较大危险因素(Pc＝1.92E-38)
据表3可知宁波地区和深圳地区的脑卒中患者的甲基化率存在显著差异，尤以年龄因素为一个特征性指标，而在生化指标中TG的差异具有统计学差异。由表3和4显示宁波地区和深圳地区的正常人的诸多生化指标(如UA、TG、TC等)皆有着明显的不同(P＜0.05)，据表5可知，仅深圳地区AGE，UA与脑卒中的相关性有统计学意义，可见地域因素也是脑卒中患者发病的一个不容忽视的原因。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市南山区慢性病防治院
<120> 一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及测定方法
<130> 深圳市南山区慢性病防治院
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<400> 1
CGAGTTTAGG AAGGTGTATT 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<400> 2
CCATACTTAA CTACGCTCTC 20
Claims (10)
1.一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物：
Primer F：5’-CGAGTTTAGGAAGGTGTATT-3’和
Primer R：5’-CCATACTTAACTACGCTCTC-3’。
2.根据权利要求1所述的丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒还包括洗涤液和洗脱液。
3.根据权利要求2所述的丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应液还包括10×PCR buffer、Mg Cl2、d NTPs、热启动TaqDNA酶、DNA模板、无菌双蒸水以及荧光染料。
4.根据权利要求3所述的丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为2×SYBR Green I。
5.根据权利要求4所述的丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl2 1.5μL、2.5mmol/L dNTPs 1.5μL、10μM Primer F0.25μL、10μM Primer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL。
6.根据权利要求1所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为正常人样本的基因组完全甲基化后所得到的完全DNA甲基化样本；所述阴性对照为无菌双蒸水。
7.一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，其特征在于，其包括
DNA提取步骤：提取全血基因组DNA并检测DNA的浓度；
用甲基化试剂盒对全血基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化步骤：用EZ DNA Methylation-Gold试剂盒将上述提取额全血基因组DNA与亚硫酸氢盐反应会使单链中未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后经过上样、洗涤、洗脱等步骤得到转化后的DNA；
DNA甲基化水平测定步骤：上述转化后的DNA作为样本DNA加入含荧光定量PCR反应液进行PCR扩增反应，使基因序列进行倍数扩增，每一个样本DNA对应一个的扩增曲线；曲线与既设阈值相交的横坐标点即为CT值，并通过下述计算式计算出甲基化率：
ΔΔCt＝DNA样本(CT靶基因-CTACTB)-阳性对照(CT靶基因-CTACTB)；
其中，ΔΔCt是指甲基化率，CT靶基因是指目标基因的PCR循环数即丝氨酸羟甲基转移酶基因的Ct值，CTACTB是指一种常用的内参基因即ACTB的PCR循环数。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，所述PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl2 1.5μL、2.5mmol/L d NTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μMPrimer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL。
9.根据权利要求8所述的DNA的测定方法，其特征在于，所述甲基化水平测定步骤具体如下：首先将转化后的DNA样本加入到热启动Taq DNA酶中，然后加入一对丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物Primer F和Primer R；最后依次加入DNA模板、10×PCR buffer、Mg Cl2、d NTPs、2×SYBR Green I以及无菌双蒸水。
10.根据权利要求7-9任一项所述的测定方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件如下：预变性95℃，10min；95℃，20s，退火温度，20s，72℃，single，30s，45个循环；溶解曲线95℃，15s，60℃，60s，95℃，continuous；保温40℃，10min。
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| CN113373209A (zh) * | 2020-03-09 | 2021-09-10 | 南京医科大学 | 血液骨架蛋白基因甲基化作为脑卒中早期诊断的潜在标志物 |
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