CN107831226A - 一种中风回春丸的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中风回春丸的质量检测方法，包括以下步骤：采用高效液相色谱法同时对中风回春丸中的丹参、桃仁和川牛膝进行鉴别，其中，丹参以丹参素钠为对照，桃仁以苦杏仁苷为对照，川牛膝以杯苋甾酮为对照。本发明在中风回春丸原质量标准的基础上，增加方中桃仁、川牛膝两味药材的检测方法，能更好地控制产品质量；本发明的检测方法能在同一色谱条件下对丹参、桃仁和川牛膝3味药材同时进行HPLC定性鉴别的方法，其操作简便、可操作性强、专属性好，符合中药质量标准研究的技术要求。

Description

一种中风回春丸的质量检测方法

技术领域

本发明涉及药物质量检测方法技术领域，尤其是一种中风回春丸的质量检测方法。

背景技术

中风是急性脑血管病的统称。根据各种急性脑血管疾病发生的病因、病理及不同表现，一般把中风分为两大类：一类为出血性中风，也称出血性脑血管病，包括脑出血及蛛网膜下腔出血；另一类为缺血性中风，也称缺血性脑血管病，包括短暂性脑缺血发作(也叫一过性脑缺血发作)、脑血栓、脑栓塞及腔隙脑梗塞等。祖国医学认为，中风是指患者真阴素亏，正气不足，或五志过极，或膏粱厚味，或尺牍思劳太过，以致心肝火炽，内风旋动，气逆血菀于上，痰浊蒙蔽脑神，表现以猝然昏仆，不省人事，口眼歪斜，半身不遂，言语謇涩或失语，舌红苔厚腻，脉弦滑数或细涩为主要症状的一种脑病。发病率较高，一般常见于中老年人。罹病之后，极易死亡或致残。中风回春丸是用于中风病恢复期及后遗症期治疗的纯中药制剂，选用优质纯正中草药，科学配方，熔古今工艺于一体精制而成。

中风回春丸收载于《中国药典》(2015年版)一部，其处方为：酒当归30g、酒川芎30g、红花10g、桃仁30g、丹参100g、鸡血藤100g、忍冬藤100g、络石藤60g、地龙(炒)90g、土鳖虫(炒)30g、伸筋草60g、川牛膝100g、蜈蚣5g、炒茺蔚子30g、全蝎10g、威灵仙(酒制)30g、炒僵蚕30g、木瓜50g、金钱白花蛇6g，制法为：以上十九味，酒当归、酒川芎、地龙、土鳖虫、蜈蚣、金钱白花蛇、全蝎、炒僵蚕以及丹参50g粉碎成细粉，其余红花等十味和丹参的剩余部分加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并煎液，滤过，静置24小时，倾取上清液，浓缩至适量，与上述药材细粉混匀，制丸，包衣，干燥，即得。本品活血化瘀，舒筋通络。用于痰淤阻络所致的中风，症见半身不遂、肢体麻木、言语謇涩、口舌歪斜。

目前《中国药典》(2015年版)一部收载的中风回春丸质量标准仅对处方中忍冬藤、当归、川芎和丹参四味药材进行了检测，对于由十九味药材组成的中药复方制剂来说，在产品质量可控性方面还有待提高。此外，通过相关文献检索，虽也有报道中风回春丸处方中相关单味药材的检测方法，但这些方法也均不适用于中风回春丸及其相关中风治疗药物的质量检测。

在另一篇现有技术^【1】中只测定了单个药材成分的含量。

在现有技术3：《中国药典》(2015年版)一部中，记载了桃仁中苦杏仁苷的含量测定，只能测定单个药材成分的含量。

中风回春丸作为十九味药材组合而成的中药复方制剂，其效用的发挥是多个药味之间相辅相成、共同作用的结果，而非单个药味的简单加合。现有《中国药典》(2015年版)一部收载的中风回春丸质量标准仅对处方中忍冬藤、当归、川芎和丹参四味药材进行了检测，仍有多味药材未进行检测，缺乏全面性，不能很好反映药品内在质量。

参考文献：

1、马英，车镇涛.HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量.中草药,2000,31(6):427-428。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种更全面地检测中风回春丸质量的方法，其检测结果更准确可靠。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种中风回春丸的质量检测方法，所述质量检测方法包括以下步骤：采用高效液相色谱法同时对中风回春丸中的丹参、桃仁和川牛膝进行鉴别，其中，所述丹参以丹参素钠为对照，所述桃仁以苦杏仁苷为对照，所述川牛膝以杯苋甾酮为对照。

优选地，所述质量检测方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：称取中风回春丸，粉碎，置容器中并加入醇溶液，超声提取，冷却，滤过，滤液通过挥发除去醇液，剩余水溶液加入乙酸乙酯萃取多次，合并各次的乙酸乙酯层，于水浴上浓缩，滤过，取续滤液，即得待检测的中风回春丸溶液，其中所述醇溶液与中风回春丸的体积质量比为25～35:1(ml/g)；

(2)对照品溶液的制备：取对照品丹参素钠、苦杏仁苷和杯苋甾酮适量，加入一定量的与步骤(1)相同的醇溶液制成丹参素钠、苦杏仁苷和杯苋甾酮的混合溶液，即为所需的对照品溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验：色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C₁₈柱；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为酸水溶液；检测波长为210nm～220nm；柱温为20℃～30℃；理论板数按丹参素钠峰计算应不低于3000；

(4)测定：分别定量吸取所述对照品溶液和所述待检测的中风回春丸溶液，注入液相色谱仪测得各自的色谱图，并进行分析。

应当说明的是，在系统适用性试验中，只要满足理论板数按丹参素钠峰计算应不低于3000的条件即可。

优选地，所述丹参素钠浓度为100～200μg/ml、所述苦杏仁苷浓度为50～100μg/ml、所述杯苋甾酮浓度为50～100μg/ml。

优选地，所述步骤(3)中的梯度洗脱程序为：

0～5分钟，流动相A为5％→7％，流动相B为95％→93％；

5～10分钟，流动相A为7％→15％，流动相B为93％→85％；

10～15分钟，流动相A为15％→20％，流动相B为85％→80％；

15～25分钟，流动相A为20％→30％，流动相B为80％→70％；其中，所述流动相A、B的比例均为体积百分比。优选地，所述步骤(1)中醇溶液为50～70％的甲醇溶液。应当说明的是，甲醇溶液浓度为体积百分比。

优选地，所述步骤(1)中醇溶液为60％的甲醇溶液，所述超声处理时间为60～120分钟。

优选地，所述流动相B为冰醋酸、磷酸或甲酸的水溶液。

优选地，所述流动相B的浓度为0.05～0.4％。应当说明的是，流动相B的浓度为体积百分比。

优选地，所述流动相B为磷酸水溶液，所述流动相B中磷酸的体积百分数为0.2％。

优选地，所述步骤(3)中的检测波长为215nm，柱温为25℃。

综上所述，本发明的有益效果为：

1、本发明在中风回春丸原质量标准的基础上，增加方中桃仁、川牛膝两味药材的检测方法，能更好地控制产品质量；

2、中风回春丸是中药复方制剂，其成分复杂，发明人通过大量研究得到本发明所述的在同一色谱条件下对丹参、桃仁和川牛膝3味药材同时进行HPLC定性鉴别的方法，并进行了方法学验证，实验结果表明本发明的检测方法操作简便、可操作性强、专属性好，符合中药质量标准研究的技术要求。

附图说明

图1是丹参素钠、苦杏仁苷和杯苋甾酮混合对照品HPLC色谱图；

图2是中风回春丸供试品HPLC色谱图；

图3是缺少丹参、桃仁、川牛膝的阴性样品HPLC色谱图；

图4～图8是不同比例流动相条件下中风回春丸供试品HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明旨在提供一种全面、可靠的中风回春丸的质量检测方法。中风回春丸处方共十九味药材，而质量标准中仅对忍冬藤、当归、川芎和丹参这四味药材进行质量控制，不能很好反映药品的内在质量。因此，本发明增加处方中桃仁和川牛膝这两味药材的检测方法，以更好地对中风回春丸的质量进行控制。具体为：利用高效液相色谱法对中风回春丸中的丹参(以活性成分丹参素钠为对照)、桃仁(以活性成分苦杏仁苷为对照)和川牛膝(以活性成分杯苋甾酮为对照)在同一色谱条件下进行定性鉴别。

另外，现有技术只涉及到单味药材或单个复方制剂中单一成分的检测，而中风回春丸处方中药味多，成分复杂，影响测定的干扰因素较多，采用现有技术无法使该中药复方制剂中的活性成分(或指标成分)丹参素钠、苦杏仁苷和杯苋甾酮得到有效分离。因此，为了实现在同一色谱条件下同时对中风回春丸中的丹参、桃仁和川牛膝进行检测，本发明克服了现有技术的不足，采用高效液相色谱法，从供试品溶液制备、色谱条件和流动相系统的选择上通过大量的创造性劳动成功地实现了对这三味药材在同一色谱条件下同时进行快速的定性鉴别。该检测方法稳定可靠、专属性强、准确度高，能有效控制产品的质量。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于阐述本发明，并不限制本发明的保护范围。

实施例1

本发明的中风回春丸的质量检测方法的一种实施例，其具体包括如下步骤：

实验材料：中风回春丸及阴性对照样品均由广州白云山敬修堂药业股份有限公司提供。丹参素钠对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号110855-201603。苦杏仁苷对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号为110820-201607。杯苋甾酮对照品由中国食品药品检定研究院提供，批号为111804-201705。乙腈为色谱纯，LABSCIENCE公司生产，水为超纯水，其它试剂为分析纯。

供试品溶液的制备：取中风回春丸粉末约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇30ml，密塞，称定重量，超声处理90分钟，放冷，滤过，滤液挥去醇液，剩余水液加乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯层，于水浴上浓缩至约10ml，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取丹参素钠对照品、苦杏仁苷对照品和杯苋甾酮对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成丹参素钠浓度为150μg/ml、苦杏仁苷浓度为80μg/ml、杯苋甾酮浓度为60μg/ml的混合溶液，即得。

色谱条件与系统适用性试验：色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C₁₈柱；以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下表1所示；检测波长为215nm；柱温为25℃；理论板数按丹参素钠峰计算应不低于3000。

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得如图1和2所示的色谱图，图1为丹参素钠、苦杏仁苷和杯苋甾酮混合对照品HPLC色谱图，图2为中风回春丸供试品HPLC色谱图。

表1梯度洗脱的具体程序

实施例2

本发明的中风回春丸的质量检测方法的一种实施例，具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备过程中，以50％甲醇为提取溶剂，溶剂用量为25ml，超声处理120分钟；色谱条件与系统适用性试验中，流动相B为0.05％冰醋酸溶液，检测波长为210nm，柱温为20℃。

实施例3

本发明的中风回春丸的质量检测方法的一种实施例，具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备过程中，以70％甲醇为提取溶剂，溶剂用量为35ml，超声处理60分钟；色谱条件与系统适用性试验中，流动相B为0.4％甲酸溶液，检测波长为220nm，柱温为30℃。

实施例4

本发明的中风回春丸的质量检测方法的一种实施例，具体操作步骤同实施例1，不同的是供试品溶液的制备过程中，以65％甲醇为提取溶剂；色谱条件与系统适用性试验中，流动相B为0.1％磷酸溶液。

实施例5色谱柱的选择和专属性试验

为了验证上述方法，以下做了不同色谱柱考察和专属性试验：

不同色谱柱考察：按实施例1测定方法，分别用A柱(Agilent Eclipse Plus C₁₈柱，规格250mm×4.6mm,5μm)、B柱(Agilent ZORBAX SB-C₁₈柱，规格250mm×4.6mm,5μm)、C柱(Phenomenex Synergi 4μFusion-RP 80A柱，规格250mm×4.6mm,4μm)三种型号的色谱柱测定。结果表明用三种型号的色谱柱测定，丹参素钠、苦杏仁苷和杯苋甾酮3个成分的色谱峰均能得到很好的分离。

专属性试验：按处方称取除丹参、桃仁和川牛膝以外的药材，按制备工艺制成阴性样品。再按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按实施例1方法测定。结果在与丹参素钠、苦杏仁苷和杯苋甾酮对照品色谱相应的位置上(如图3所示)阴性对照溶液无干扰，说明该测定方法具有较好的专属性。

实施例6不同比例流动相和梯度洗脱程序对中风回春丸供试品HPLC色谱图的影响

测试对象：与实施例1的检测方法相比，作为对照组的检测方法的区别仅在于：不同比例流动相或者不同梯度洗脱程序，其他步骤和具体参数都与实施例1相同；

与实施例1相比，对照组1的区别仅在于A:B＝15:85(对应的色谱图如图4所示)；

与实施例1相比，对照组2的区别仅在与A:B＝20:80(对应的色谱图如图5所示)；

与实施例1相比，对照组3的区别仅在与A:B＝30:70(对应的色谱图如图6所示)；

与实施例1相比，对照组4的区别仅在于：梯度洗脱程序(对应的色谱图如图7所示)：

0～5分钟，流动相A为4％→6％，流动相B为96％→94％；

5～10分钟，流动相A为6％→14％，流动相B为94％→86％；

10～15分钟，流动相A为14％→22％，流动相B为86％→78％；

15～25分钟，流动相A为22％→30％，流动相B为78％→70％；

与实施例1相比，对照组5的区别仅在于：梯度洗脱程序(对应的色谱图如图8所示)：

0～5分钟，流动相A为6％→8％，流动相B为94％→92％；

5～10分钟，流动相A为8％→16％，流动相B为92％→84％；

10～15分钟，流动相A为16％→19％，流动相B为84％→81％；

15～25分钟，流动相A为19％→30％，流动相B为81％→70％；

其中，所述流动相A和B的比例均为体积百分比。

测试方法：按照实施例1的检测方法进行测试；

测试结果：与图2相比，图4～8各对照组中相应指标成分的色谱峰分离效果均不好。因此，通过大量试验表明，实施例1的检测方法为中风回春丸的最佳的质量检测方法；本发明的测定方法操作简便、可操作性强、专属性好，适合作为质量控制方法，且在同一个HPLC方法条件下同时定性鉴别丹参、桃仁和川牛膝三味药材。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种中风回春丸的质量检测方法，其特征在于，所述质量检测方法包括以下步骤：采用高效液相色谱法同时对中风回春丸中的丹参、桃仁和川牛膝进行鉴别，其中，所述丹参以丹参素钠为对照，所述桃仁以苦杏仁苷为对照，所述川牛膝以杯苋甾酮为对照。

2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述质量检测方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：称取中风回春丸，粉碎，置容器中并加入醇溶液，超声提取，冷却，滤过，滤液通过挥发除去醇液，剩余水溶液加入乙酸乙酯萃取多次，合并各次的乙酸乙酯层，于水浴上浓缩，滤过，取续滤液，即得待检测的中风回春丸溶液，其中所述醇溶液与中风回春丸的体积质量比为25～35:1(ml/g)；

(2)对照品溶液的制备：取对照品丹参素钠、苦杏仁苷和杯苋甾酮适量，加入一定量的与步骤(1)相同的醇溶液制成丹参素钠、苦杏仁苷和杯苋甾酮的混合溶液，即为所需的对照品溶液；

(3)色谱条件与系统适用性试验：色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的C₁₈柱；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为酸水溶液；检测波长为210nm～220nm；柱温为20℃～30℃；理论板数按丹参素钠峰计算应不低于3000；

(4)测定：分别定量吸取所述对照品溶液和所述待检测的中风回春丸溶液，注入液相色谱仪测得各自的色谱图，并进行分析。

3.根据权利要求2所述的质量检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的梯度洗脱程序为：

0～5分钟，流动相A为5％→7％，流动相B为95％→93％；

5～10分钟，流动相A为7％→15％，流动相B为93％→85％；

10～15分钟，流动相A为15％→20％，流动相B为85％→80％；

15～25分钟，流动相A为20％→30％，流动相B为80％→70％；其中，所述流动相A和B的比例均为体积百分比。

4.根据权利要求2所述的质量检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中醇溶液为50～70％的甲醇溶液。

5.根据权利要求2所述的质量检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中醇溶液为60％的甲醇溶液，所述超声处理时间为60～120分钟。

6.根据权利要求2所述的质量检测方法，其特征在于，所述流动相B为冰醋酸、磷酸或甲酸的水溶液。

7.根据权利要求2所述的质量检测方法，其特征在于，所述流动相B的浓度为0.05～0.4％。

8.根据权利要求2所述的质量检测方法，其特征在于，所述流动相B为磷酸水溶液，所述流动相B中磷酸的体积百分数为0.2％。

9.根据权利要求2所述的质量检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的检测波长为215nm，柱温为25℃。