CN107815479A - 一种提高多杀霉素产量的发酵方法 - Google Patents

一种提高多杀霉素产量的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种提高多杀霉素产量的发酵方法，包括使用添加淀粉酶的发酵培养基。具体地，所述发酵培养基中淀粉酶的浓度为0.1‑1g/L；所述淀粉酶包括α‑耐高温淀粉酶。本发明通过在发酵培养基中添加淀粉酶可以显著提高多杀霉素产量。本发明方法简便易行，发酵培养基中将添加适量淀粉酶，多杀霉素发酵水平的提高可达约30％。

Description

一种提高多杀霉素产量的发酵方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种提高多杀霉素产量的发酵方法。
背景技术
多杀霉素，又名多杀菌素(Spinosad)或刺糖菌素、赤糖菌素，是刺糖多孢菌有氧发酵产生的次级代谢产物，属于大环内酯类化合物。多杀霉素具有很好的杀虫活性，对鳞翅目和缨翅目害虫有较广的杀虫谱，对双翅目、鞘翅目和膜翅目中某些大量吞食叶片的害虫种类有很好的防治作用。多杀霉素具有见效快、无副作用、选择性高、对天敌安全、半衰期短、易降解、不易产生药物抗性等优点，是理想的高效低毒绿色农药，是治理抗性害虫的首选替代农药新品种。
发明内容
本发明目的是提供一种提高多杀霉素产量的发酵方法，以解决现有技术发酵生产多杀霉素产量不高的技术问题。
为实现上述目的，本发明一种提高多杀霉素产量的发酵方法，包括使用添加淀粉酶的发酵培养基。
若无特殊指明，本发明所述发酵均为液体发酵。
优选地，所述发酵培养基中淀粉酶的浓度为0.01-1g/L，进一步优选为0.5g/L。
优选地，所述淀粉酶包括α-淀粉酶。进一步优选地，所述淀粉酶为α-耐高温淀粉酶。
本发明所述α-耐高温淀粉酶最适作用温度为90-110℃。
优选地，所述α-淀粉酶或α-耐高温淀粉酶的活为10000u/g-15000u/g，进一步优选为12000u/g。
本发明所述酶活与本领域常规定义相同。例如，α-耐高温淀粉酶的酶活力定义：1mL酶液在70℃，pH6.0条件下，1分钟液化可溶性淀粉的毫克数。
本发明所述淀粉酶可通过市售购得，例如α-耐高温淀粉酶购自江苏锐阳生物科技有限公司。
本发明方法可用刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)进行发酵。所述刺糖多孢菌可用本领域市售可得的常规菌种。
优选地，所述刺糖多孢菌为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)Z68，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日期2009年11月25日，保藏编号CGMCCNo.3460。该菌种已在中国专利CN102337219A中公开。
优选地，所述发酵培养基包括如下组分：可溶性淀粉30-60g/L、葡萄糖20-35g/L、黄豆饼粉5-20g/L、棉籽饼粉5-20g/L、酵母浸粉1-10g/L、玉米浆15-25g/L、碳酸钙2-10g/L、豆油2-10g/L、淀粉酶0.01-1g/L；灭菌前pH为6.9-7.2；
进一步优选地，所述发酵培养基包括如下组分：可溶性淀粉40g/L、葡萄糖30g/L、黄豆饼粉10g/L、棉籽饼粉10g/L、酵母浸粉5g/L、玉米浆20g/L、碳酸钙5g/L、豆油5g/L、淀粉酶0.5g/L；灭菌前发酵培养基pH为7.0。
优选地，所述发酵温度为27-30℃，进一步优选为28℃。
优选地，所述发酵过程转速为200-220rpm，进一步优选为200rpm。
优选地，所述发酵过程环境湿度为40％-60％，优选为55％。
优选地，所述发酵时间为192-216h，进一步优选为200h。
具体地，所述发酵方法包括：将种子培养液按10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，在28℃，环境湿度为55％，转速200rpm，旋转半径50mm的条件下，发酵培养200h，得到发酵液。
具体地，本发明提高多杀霉素产量的发酵方法包括以下步骤：
1)斜面培养
将刺糖多孢菌在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，于28℃培养10-12天；
2)种子培养
将步骤1)制得的斜面菌种无菌条件下转接入灭菌的种子培养基中，在28℃，环境相对湿度为55％，转速200rpm，旋转半径50mm的条件下，振荡培养50-60h，得到种子培养液；
3)发酵培养
将步骤2)制得的种子培养液按10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，在28℃，环境的湿度为55％，转速200rpm，旋转半径50mm的条件下，发酵培养200h，得到发酵液。
优选地，所用种子培养基包括如下组分：糊精15-25g/L、葡萄糖8-15g/L、玉米浆5-10g/L、豆粕粉1-5g/L、硫酸镁1-5g/L；灭菌前pH值为6.8-7.2；
进一步优选地，所述种子培养基包括如下组分：糊精20g/L、葡萄糖10g/L、玉米浆6g/L、豆粕粉3g/L、硫酸镁2g/L；灭菌前种子培养基的pH值为7.0。
如无特殊说明，本发明所述发酵培养基、种子培养基均以水配制。
本发明所述发酵培养基、种子培养基一般可于121℃，灭菌30min。
其中，种子培养方法包括：挖取斜面菌苔约1cm2，将其转接入盛有30mL灭菌的种子培养基的种子瓶中，在28℃，环境相对湿度为55％，转速200rpm，旋转半径50mm的条件下，振荡培养60h，得到种子培养液。
其中，发酵培养过程种子培养液的接种量为5-20％(v/v)，优选为10％(v/v)。
为更好地提高多杀霉素的产量，可以在步骤2)种子培养基中添加适量的淀粉酶；所述种子培养基中淀粉酶的浓度为0.01-1g/L，进一步优选为0.5g/L。所述淀粉酶的含义与上述发酵培养基中淀粉酶含义相同。
本发明所述发酵培养基、种子培养基中的淀粉酶均可在所述培养基灭菌后添加，添加时培养基的温度不超过使所述淀粉酶失活的温度。可以将淀粉酶或淀粉酶溶液无菌处理(非高热灭菌)后添加到所述发酵培养基、种子培养基中。所述无菌处理包括本领域常规方法，例如过滤除菌、辐照灭菌等。
本发明所述淀粉酶也可在培养基配制过程中与其他成分一同添加，再进行灭菌处理
本发明研究发现，通过在发酵培养基中添加淀粉酶可以显著提高多杀霉素产量。本发明方法简便易行，发酵培养基中将添加适量淀粉酶，多杀霉素发酵水平的提高可达约30％。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
以下所用α-耐高温淀粉酶，酶活为12000u/g，最适作用温度为90-110℃，由江苏锐阳生物科技有限公司提供。
所用蛋白酶的酶活为50000u/g，由河南金诚生物科技有限公司提供。
所用纤维素酶的酶活为50000u/g，由河南金诚生物科技有限公司提供。
以下所用刺糖多孢菌为(Saccharopolyspora spinosa)Z68，保藏编号CGMCCNo.3460。
以下发酵液中多杀霉素含量的检测方法包括如下步骤：
1)取发酵液1ml，加入9ml甲醇溶液，摇匀；
2)超声波震荡20min，静止10min，使固液分层；
3)取上层有机相，以0.45um孔径有机滤膜进行过滤；
4)过滤后有机相作为供试液通过高效液相色谱仪进行效价检测；
5)高效液相色谱条件：150×4.6mm(id)，5μm，不锈钢C18反相色谱柱；柱温35℃，流速1.0mL/min，以甲醇∶乙腈∶水(体积比为45∶50∶5)为流动相进行分离，进样量20μL，利用紫外检测器在246nm波长下进行检测。
实施例1
一种提高多杀霉素产量的发酵方法，包括以下步骤：
1)斜面培养
将刺糖多孢菌在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，于28℃培养10-12天。
其中，所述固体斜面培养基包括如下组分：玉米淀粉25g/L、玉米浆20g/L、酵母膏10g/L、琼脂20g/L，pH值7.0，以水配制；115℃，灭菌20分钟。
2)种子培养
挖取步骤1)制得的斜面菌苔约1cm2，无菌条件下将其转接入盛有30mL灭菌的种子培养基的种子瓶中，在28℃，环境相对湿度为55％，转速200rpm，旋转半径50mm的条件下，振荡培养50-60h，得到种子培养液。
其中，所述种子培养基包括如下组分：糊精20g/L、葡萄糖10g/L、玉米浆6g/L、豆粕粉3g/L、硫酸镁2g/L；灭菌前种子培养基的pH值为7.0。于121℃，灭菌30min。
3)发酵培养
将步骤2)制得的种子培养液按10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，在28℃，环境湿度为55％，转速200rpm，旋转半径50mm的条件下，发酵培养200h，得到发酵液。
其中，所述发酵培养基包括如下组分：可溶性淀粉40g/L、葡萄糖30g/L、黄豆饼粉10g/L、棉籽饼粉10g/L、酵母浸粉5g/L、玉米浆20g/L、碳酸钙5g/L、豆油5g/L、0.5g/L的α-耐高温淀粉酶；灭菌前发酵培养基pH为7.0。于121℃，灭菌30min。
经检测，发酵液中多杀霉素含量达到18000ug/mL。
实施例2
一种提高多杀霉素产量的发酵方法，与实施例1的区别仅在于步骤3)所用发酵培养基不同，本实施例发酵培养基包括如下组分：可溶性淀粉30g/L、葡萄糖20g/L、黄豆饼粉5g/L、棉籽饼粉5g/L、酵母浸粉1g/L、玉米浆15g/L、碳酸钙2g/L、豆油2g/L、α-耐高温淀粉酶0.01g/L；灭菌前pH为6.9。
经检测，发酵液中多杀霉素含量达到14905ug/mL。
实施例3
一种提高多杀霉素产量的发酵方法，与实施例1的区别仅在于步骤3)所用发酵培养基不同，本实施例发酵培养基包括如下组分：可溶性淀粉60g/L、葡萄糖35g/L、黄豆饼粉20g/L、棉籽饼粉20g/L、酵母浸粉10g/L、玉米浆25g/L、碳酸钙10g/L、豆油10g/L、α-耐高温淀粉酶1g/L；灭菌前pH为7.2。
经检测，发酵液中多杀霉素含量达到13880ug/mL。
实施例4
一种提高多杀霉素产量的发酵方法，与实施例1的区别仅在于步骤3)发酵培养包括将步骤2)制得的种子培养液按10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，在27℃，环境湿度为60％，转速220rpm，旋转半径50mm的条件下，发酵培养216h，得到发酵液。
经检测，发酵液中多杀霉素含量达到16004ug/mL。
对比例1
与实施例1的区别仅在于步骤3)发酵培养基中不含淀粉酶。
经检测，发酵液中多杀霉素含量为11158ug/mL。
对比例2
与实施例2的区别仅在于步骤3)发酵培养基中不含淀粉酶。
经检测，发酵液中多杀霉素含量为10852ug/mL。
对比例3
与实施例3的区别仅在于步骤3)发酵培养基中不含淀粉酶。
经检测，发酵液中多杀霉素含量为8520ug/mL。
对比例4
与实施例4的区别仅在于步骤3)发酵培养基中不含淀粉酶。
经检测，发酵液中多杀霉素含量为8010ug/mL。
对比例5
与实施例1的区别仅在于步骤3)将发酵培养基中淀粉酶替换为蛋白酶。
该蛋白酶在发酵培养基中的添加量为0.5g/L，配制该发酵培养基时，先将除蛋白酶之外的成分按配比配成培养基，灭菌后降至室温，再将辐照灭菌处理的蛋白酶按配比添加到培养基中。
经检测，发酵液中多杀霉素含量为10378ug/mL。
对比例6
一种提高多杀霉素产量的发酵方法，与实施例1的区别仅在于将步骤3)发酵培养基中的α-耐高温淀粉酶替换为纤维素酶。
该纤维素酶在发酵培养基中的添加量为0.5g/L，配制该发酵培养基时，先将除纤维素酶之外的成分按配比配成培养基，灭菌后降至室温，再将辐照灭菌处理的纤维素酶按配比添加到培养基中。
经检测，发酵液中多杀霉素含量达到11045ug/mL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种提高多杀霉素产量的发酵方法，其特征在于，包括使用添加淀粉酶的发酵培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中淀粉酶的浓度为0.01-1g/L，进一步优选为0.5g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述淀粉酶包括α-淀粉酶；优选地，所述淀粉酶为α-耐高温淀粉酶；进一步优选地，所述α-耐高温淀粉酶最适作用温度为90-110℃。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述淀粉酶酶活为10000u/g-15000u/g，优选为12000u/g。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，用于发酵生产多杀霉素的菌种为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)，优选为刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)Z68，保藏编号CGMCC No.3460。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下组分：可溶性淀粉30-60g/L、葡萄糖20-35g/L、黄豆饼粉5-20g/L、棉籽饼粉5-20g/L、酵母浸粉1-10g/L、玉米浆15-25g/L、碳酸钙2-10g/L、豆油2-10g/L、淀粉酶0.01-1g/L；灭菌前pH为6.9-7.2；
优选地，所述发酵培养基包括如下组分：可溶性淀粉40g/L、葡萄糖30g/L、黄豆饼粉10g/L、棉籽饼粉10g/L、酵母浸粉5g/L、玉米浆20g/L、碳酸钙5g/L、豆油5g/L、淀粉酶0.5g/L；灭菌前pH为7.0。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵温度为27-30℃，优选为28℃；和/或，所述发酵时间为192-216h，优选为200h。
8.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵过程转速为200-220rpm，优选为200rpm。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)斜面培养
将刺糖多孢菌在无菌条件下接种于固体斜面培养基上，于28℃培养10-12天；
2)种子培养
将步骤1)制得的斜面菌种无菌条件下转接入灭菌的种子培养基中，在28℃，环境相对湿度为55％，转速200rpm，旋转半径50mm的条件下，振荡培养50-60h，得到种子培养液；
3)发酵培养
将步骤2)制得的种子培养液按10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，在28℃，环境湿度为55％，转速200rpm，旋转半径50mm的条件下，发酵培养200h，得到发酵液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括如下组分：糊精15-25g/L、葡萄糖8-15g/L、玉米浆5-10g/L、豆粕粉1-5g/L、硫酸镁1-5g/L；灭菌前pH值为6.8-7.2；
优选地，所述种子培养基包括如下组分：糊精20g/L、葡萄糖10g/L、玉米浆6g/L、豆粕粉3g/L、硫酸镁2g/L；灭菌前pH值为7.0。
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