CN107801632A - 抗寒月季组织培养繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗寒月季组织培养繁育方法，解决此品种繁殖速度较慢，增殖系数低的生产问题，该方法包括以下的步骤：1)筛选外植体；2)外植体消毒；3)初代培养；4)增殖培养；5)壮苗培养；6)生根培养；7)移栽驯化。本发明以植株新长出的顶芽或侧芽为外植体，以MS为基本培养基，利用萘乙酸(NAA)、6‑苄胺基嘌呤(6BA)，吲哆丁酸(IBA)激素调节，建立抗寒月季再生体系的方法。该发明一个增殖继代周期为4‑5周，增殖倍数控制在6‑8倍，且不受季节的影响，可极大提高种苗繁殖系数，为该品种栽培、应用提供科学、有效的繁殖方法，满足生产需求并进行产业化生产，亦可为其它抗寒月季品种繁殖提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗寒月季的组织培养繁育方法。
背景技术
本发明涉及抗寒月季为蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa L.)多年生木本花卉，为有刺灌木。叶互生，奇数羽状复叶。花单生或成圆锥花序，花瓣多数，花色丰富艳丽，花期长，除做切花之外，也是做花坛、花境、基础种植及花篱的重要材料，常见在草坪、庭院、公园绿地等处栽植，在园林绿化中应用非常广泛。
但由于东北地区冬季寒冷漫长，夏季生长季短，城市绿化可利用的植物种类少，且绿化成本较高，尤其是黑龙江省，能够露地越冬的品种极少，因此大量繁育能够在我省露地越冬的新品种，对丰富高寒地区园林绿化植物种类具有重要意义，由于此品种月季种子繁殖率低，种子繁殖后代性状易发生变化；分株繁殖速度较慢，增殖系数极低，每年仅能增殖2-4倍，在组培繁殖初期诱导不定芽分化阶段表现出不分化或褐化现象，因此影响了此品种的大批量生产及广泛应用，在园林彩化、绿化大面积应用过程中产业化生产受到限制，此发明方法针对抗寒月季品种组培繁殖过程中诱导不定芽难的问题提出了具体方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗寒月季组织培养繁育方法，以解决种子繁殖率低、变异大，扦插、分株繁殖速度慢，组培初期不定芽有诱导难、褐化等不能满足工厂化育苗需求的问题。本发明的技术方案为：一种抗寒月季组织培养繁育方法，包括以下步骤：
1、一种抗寒月季组织培养繁育方法，包括以下几个步骤：
1)外植体筛选：春季，选择健康植株萌发出来的嫩芽，用枝剪将带新芽的枝条剪下，作为外植体；
2)外植体消毒：带嫩芽的枝条切成小段，每段带有1-3个芽，置于200mL烧杯中，杯口套上纱网后，采用自来水洗净后，加适量洗洁精在自来水处保持冲洗状态30-40分钟，用滤纸吸干水分；在烧杯中加入质量百分比浓度1‰氯化汞溶液，使外植体材料完全浸泡其中，加入2滴吐温20制成消毒液，轻轻摇晃，6-8分钟后倒掉烧杯中所有消毒液，向烧杯中倒入无菌水冲洗外植体材料4次，无菌水使用遵循先少后多原则，清洗至烧杯表面没有泡沫后，倒掉烧杯中无菌水，连带烧杯放置于超净工作台上；
3)初代培养：将消毒好的外植体材料用已消毒滤纸吸干，切去外植体材料木质化部分及嫩芽展出叶片，插于基本培养基MS上，培养约30天，培养室内温度为22-25℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内黑暗时间10小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)，Lux为：照度的国际单位；
4)增殖培养：将初代培养的外植体材料，转接于第一培养基上，所述培养基构成为：基本培养基MS附加0.01mg/L萘乙酸(NAA)和1mg/L 6-苄胺基嘌呤(6-BA)；蔗糖25g/L；琼脂粉5g/L；pH5.8-6.2；培养室内适宜温度为22-25℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内保持黑暗10小时，光照强度为2000勒克斯(Lux)，培养5-6周，有少量不定芽萌发，切下不定芽接种于第二培养基上，所述培养基构成为：基本培养基MS附加0.05mg/L萘乙酸(NAA)和2mg/L6-苄胺基嘌呤(6-BA)；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH5.8-6.2；培养室内温度为22-24℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内黑暗时间10小时，光照强度为2000勒克斯(Lux)；培养4-5周，外植体材料分化不定芽数量增多，每个外植体萌发出6-8个小侧芽；若需大量繁殖种苗，可进行重复培养；
5)壮苗培养：将长到1-2cm长的丛生芽剪切后移入壮苗培的基本培养基MS中，培养3-4周，丛生芽长成无菌苗，无菌苗长到2-4cm高度即可转入生根培养基中，增殖培养中较大的无菌苗可直接转入生根培养基中，培养室内22-25℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内保持黑暗10小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)；
6)生根培养：将无菌苗转接至生根培养基；所述培养基构成为：基本培养基MS培养基中大量元素含量减半，所述减半大量元素，由质量百分比浓度，950mg/L的硝酸钾(KNO3)，220mg/L的氯化钙(CaCl2·2H2O)，185mg/L的硫酸镁(MgSO4·7H2O)，825mg/L的硝酸铵(NH4NO3)，85mg/L的磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)组成；附加1mg/L萘乙酸(NAA)；1mg/L吲哆丁酸(IBA)和活性炭3000mg/L；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH5.8-6.2；培养室温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内保持黑暗10小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)，培养10天，无菌苗长出乳白色根须，根长度为0.8-1.5cm为宜；
7)移栽驯化：待无菌苗根长大部分为0.8-1.5cm时，将其移置过渡培养间，瓶膜不完全揭开，敞开约1/3，以保持瓶内与过渡间环境一致，放置2天后，去掉瓶膜后再放置1天；采用水温20-22℃的水轻轻洗去无菌苗根部附着的培养基，将其移栽到装有珍珠岩和蛭石体积比为2：1的苗盘中，在半遮阴条件下放置5-7天后，在温室驯化培养，30天后，计算成活率，即完成组织培养繁育。
基本培养基(MS)中所述大量元素，由质量百分比浓度，1900mg/L的硝酸钾(KNO3)，440mg/L的氯化钙(CaCl2·2H2O)，370mg/L的硫酸镁(MgSO4·7H2O)，1650mg/L的硝酸铵(NH4NO3)，170mg/L的磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)组成，配制大量元素母液1L，10倍量，分别取19000mgKNO3、4400mgCaCl2·2H2O、3700mgMgSO4·7H2O、16500mgNH4NO3、1700mg KH2PO4·H2O，分别溶解后混合定容至1L，每配置1L培养基取大量元素母液100ml；微量元素由体积百分比浓度为22.3mg/L的硫酸锰(MnSO4·4H2O)，6.2mg/L的硼酸(H3BO3)，8.6mg/L的硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，0.25mg/L的钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)，0.025mg/L的硫酸铜(CuSO4·5H2O)，0.025mg/L的氯化钴(CoCl2·6H2O)，0.83mg/L的碘化钾(KI)组成，配置微量元素母液1L，100倍量，分别取2230mgMnSO4·4H2O、620mgH3BO3，860mgZnSO4·7H2O，25mgNa2MoO4·2H2O，2.5mgCuSO4·5H2O，2.5mgCoCl2·6H2O，83mgKI，分别溶解后混合定容至1L，每配置1L培养基取微量元母液10ml；铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和质量百分比浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA·2H2O)螯合后的溶液(EDTA-Fe)组成，配置铁盐母液1L，分别取2780mgFeSO4·7H2O、3730mgNa2·EDTA·2H2O，分别加热溶解，混合后再煮沸约20分钟，冷却后定容至1L，每配置1L培养基取铁盐溶液10ml；有机物由质量百分比浓度为0.5mg/L的烟酸，0.5mg/L的盐酸吡哆醇，0.4mg/L的盐酸硫胺素，2mg/L的甘氨酸，100mg/L的肌醇组成，配置有机物母液1L，分别取50mg的烟酸，50mg的盐酸吡哆醇，40mg的盐酸硫胺素，200mg的甘氨酸，10000mg的肌醇，分别溶解，混合后定容至1L，每配置1L培养基取有机物母液10ml；棉砂糖15-20g/L，琼脂粉5g/L，pH值5.8～6。
所述再生体系建立方法是通过植株顶芽或侧芽为外植体，诱导分化出不定芽，经增殖、壮苗、生根、移栽驯化等方法培育出完整小植株，本发明采用组织培养繁殖技术，建立一种抗寒月季新品种的高效再生体系，能够保持原品种优良遗传性状，扩大繁殖系数，提高繁殖速度，满足产业化需求。本发明从筛选外植体、消毒方法、初代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养及驯化移栽方法等方面，建立了一套完整的抗寒月季植株再生体系，确定了组培繁殖培养基配方，诱导不定芽分化，生根率达到90.12％，移栽成活率达95％以上。本发明是以健康植株顶芽或侧芽为外植体，以MS为基本培养基，利用萘乙酸(NAA)、6-苄胺基嘌呤(6BA)，吲哆丁酸(IBA)激素调节，建立抗寒月季再生体系的方法。该发明一个增殖继代周期为4-5周，增殖倍数为6-8倍，且不受季节的影响，可极大提高种苗繁殖系数，为该品种的开发和利用提供科学、有效的繁殖方法，可进行产业化生产以满足市场需求。
本发明以优化再生体系为目的，以保持遗传稳定性为核心，提供一种抗寒月季组织培养繁育方法，以解决种子繁殖率低、变异大，扦插、分株繁殖速度慢，组培初期不定芽有诱导难、褐化等不能满足工厂化育苗需求的问题。本发明方法无菌苗分化率高，不定芽增殖速度快，生根率高，驯化移栽成活率高，可为保持原有遗传特性及规模化生产提供可靠的技术支持。
附图说明
图1初代培养示意图
图2增殖培养示意图
图3壮苗培养示意图
图4生根苗驯化示意图
图5无菌苗清洗示意图
图6移栽驯化示意图
具体实施方式
本发明是一种抗寒月季组织培养繁育方法，包括以下几个步骤
1)外植体筛选：春季，选择健康植株萌发出来的嫩芽，用枝剪将带新芽的枝条剪下，作为外植体；
2)外植体消毒：将步骤1)带嫩芽的枝条切成小段，每段带有1-3个芽，置于200mL烧杯中，杯口套上纱网后，采用自来水洗净后，加适量洗洁精在自来水处保持冲洗状态30-40分钟，用滤纸吸干水分；在烧杯中加入质量百分比浓度1‰氯化汞溶液，使外植体材料完全浸泡其中，加入2滴吐温20(Tween20)制成消毒液，轻轻摇晃，6-8分钟后倒掉烧杯中所有消毒液，向烧杯中倒入无菌水冲洗外植体材料4次，无菌水使用遵循先少后多原则，清洗至烧杯表面没有泡沫后，倒掉烧杯中无菌水，连带烧杯放置于超净工作台上；
3)初代培养：将步骤2)消毒好的外植体材料用已消毒滤纸吸干，切去外植体材料木质化部分及嫩芽展出叶片，插于基本培养基(MS)上，培养约30天，培养室内温度为22-25℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内黑暗时间10小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)，Lux为：照度的国际单位，如图1所示；
4)增殖培养：将步骤3)初代培养的外植体材料，转接于第一培养基上，所述培养基构成为：基本培养基MS附加0.01mg/L萘乙酸(NAA)和1mg/L 6-苄胺基嘌呤(6-BA)；蔗糖25g/L；琼脂粉5g/L；pH5.8-6.2；培养室内适宜温度为22-25℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内保持黑暗10小时，光照强度为2000勒克斯(Lux)，培养5-6周，有少量不定芽萌发，切下不定芽接种于第二培养基上，所述培养基构成为：基本培养基(MS)附加0.05mg/L萘乙酸(NAA)和2mg/L6-苄胺基嘌呤(6-BA)；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH5.8-6.2；如图2所示，培养室内温度为22-24℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内黑暗时间10小时，光照强度为2000勒克斯(Lux)；培养4-5周，外植体材料分化不定芽数量增多，每个外植体萌发出6-8个小侧芽；若需大量繁殖种苗，可进行重复培养；
5)壮苗培养：将步骤4)第二培养基中的长到1-2cm长的丛生芽剪切后移入壮苗的基本培养基MS中，如图3所示，培养3-4周，丛生芽长成无菌苗，无菌苗长到2-4cm高度即可转入生根培养基中，增殖培养中较大的无菌苗可直接转入生根培养基中，培养室内22-25℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内保持黑暗10小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)；
6)生根培养：将步骤5)无菌苗转接至生根培养基；所述培养基构成为：基本培养基MS培养基中大量元素含量减半，所述减半大量元素，由质量百分比浓度，950mg/L的硝酸钾(KNO3)，220mg/L的氯化钙(CaCl2·2H2O)，185mg/L的硫酸镁(MgSO4·7H2O)，825mg/L的硝酸铵(NH4NO3)，85mg/L的磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)组成；附加1mg/L萘乙酸(NAA)；1mg/L吲哆丁酸(IBA)和活性炭3000mg/L；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH5.8-6.2；培养室温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内保持黑暗10小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)，培养10天，如图4所示，无菌苗长出乳白色根须，根长度为0.8-1.5cm为宜；
7)移栽驯化：待步骤6)中无菌苗根长大部分为0.8-1.5cm时，将其移置过渡培养间，瓶膜不完全揭开，敞开约1/3，以保持瓶内与过渡间环境一致，放置2天后，去掉瓶膜后再放置1天；采用水温20-22℃的水轻轻洗去无菌苗根部附着的培养基，如图5所示，将其移栽到装有珍珠岩和蛭石体积比为2：1的苗盘中，在半遮阴条件下放置5-7天后，在温室驯化培养，30天后，计算成活率，即完成组织培养繁育如图6所示。
如图1所示，培养20-30天。培养室内为22-25℃，光照14小时，黑暗10小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)，初次诱导分化启动后，丛生芽分化率达100％；
如图2所示，丛生芽剪切后移入增殖培养基中，培养4-6周，培养室内22-25℃，光照14小时，黑暗10小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)，一代增殖系数为6.9；
如图3所示，丛生芽剪切后移入壮苗培养基中，培养3-4周，培养室内22-25℃，光照14小时，黑暗10小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)；
如图4所示，无菌苗转接至生根培养基1/2MS+NAA1+IBA1+活性炭，于24-26℃，光照12小时，黑暗12小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)，培养1-2周，生根率为90.12％，可将无菌苗在过渡室放至2-3天后，逐渐打开瓶膜，使瓶内外温湿度接近；
如图5所示，无菌苗出瓶时，用约20℃的水清洗根部的培养基，置于白磁盘中，准备栽于基质中；
如图6所示，清洗后的无菌苗栽于盛有珍珠岩与蛭石体积比为2：1的基质的苗盘中，在保湿保温条件下进行驯化培育，逐步降低湿度、温度，20天后，移栽成活率达95％。
如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示，本发明从选择外植体、消毒方法、初代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养及移栽驯化方法等方面，建立了一套完整的抗寒月季植株再生体系，确定了组培繁殖培养基配方，直接诱导不定芽，不定芽分化率达100％，一代增殖系数为6.9，1-2周内生根率达到90.12％，移栽成活率达95％。
Claims (2)
1.一种抗寒月季组织培养繁育方法，其特征是：包括以下几个步骤：
1)外植体筛选：春季，选择健康植株萌发出来的嫩芽，用枝剪将带新芽的枝条剪下，作为外植体；
2)外植体消毒：带嫩芽的枝条切成小段，每段带有1-3个芽，置于200mL烧杯中，杯口套上纱网后，采用自来水洗净后，加适量洗洁精在自来水处保持冲洗状态30-40分钟，用滤纸吸干水分；在烧杯中加入质量百分比浓度1‰氯化汞溶液，使外植体材料完全浸泡其中，加入2滴吐温20制成消毒液，轻轻摇晃，6-8分钟后倒掉烧杯中所有消毒液，向烧杯中倒入无菌水冲洗外植体材料4次，无菌水使用遵循先少后多原则，清洗至烧杯表面没有泡沫后，倒掉烧杯中无菌水，连带烧杯放置于超净工作台上；
3)初代培养：将消毒好的外植体材料用已消毒滤纸吸干，切去外植体材料木质化部分及嫩芽展出叶片，插于基本培养基MS上，培养约30天，培养室内温度为22-25℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内黑暗时间10小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)，Lux为：照度的国际单位；
4)增殖培养：将初代培养的外植体材料，转接于第一培养基上，所述培养基构成为：基本培养基MS附加0.01mg/L萘乙酸(NAA)和1mg/L 6-苄胺基嘌呤(6-BA)；蔗糖25g/L；琼脂粉5g/L；pH5.8-6.2；培养室内适宜温度为22-25℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内保持黑暗10小时，光照强度为2000勒克斯(Lux)，培养5-6周，有少量不定芽萌发，切下不定芽接种于第二培养基上，所述培养基构成为：基本培养基MS附加0.05mg/L萘乙酸(NAA)和2mg/L6-苄胺基嘌呤(6-BA)；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH5.8-6.2；培养室内温度为22-24℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内黑暗时间10小时，光照强度为2000勒克斯(Lux)；培养4-5周，外植体材料分化不定芽数量增多，每个外植体萌发出6-8个小侧芽；若需大量繁殖种苗，可进行重复培养；
5)壮苗培养：将长到1-2cm长的丛生芽剪切后移入壮苗培的基本培养基MS中，培养3-4周，丛生芽长成无菌苗，无菌苗长到2-4cm高度即可转入生根培养基中，增殖培养中较大的无菌苗可直接转入生根培养基中，培养室内22-25℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内保持黑暗10小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)；
6)生根培养：将无菌苗转接至生根培养基；所述培养基构成为：基本培养基MS培养基中大量元素含量减半，所述减半大量元素，由质量百分比浓度，950mg/L的硝酸钾(KNO3)，220mg/L的氯化钙(CaCl2·2H2O)，185mg/L的硫酸镁(MgSO4·7H2O)，825mg/L的硝酸铵(NH4NO3)，85mg/L的磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)组成；附加1mg/L萘乙酸(NAA)；1mg/L吲哆丁酸(IBA)和活性炭3000mg/L；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH5.8-6.2；培养室温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为14小时，培养室内保持黑暗10小时，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)，培养10天，无菌苗长出乳白色根须，根长度为0.8-1.5cm为宜；
7)移栽驯化：待无菌苗根长大部分为0.8-1.5cm时，将其移置过渡培养间，瓶膜不完全揭开，敞开约1/3，以保持瓶内与过渡间环境一致，放置2天后，去掉瓶膜后再放置1天；采用水温20-22℃的水轻轻洗去无菌苗根部附着的培养基，将其移栽到装有珍珠岩和蛭石体积比为2：1的苗盘中，在半遮阴条件下放置5-7天后，在温室驯化培养，30天后，计算成活率，即完成组织培养繁育。
2.根据权利要求1所述的一种抗寒月季组织培养快繁方法，其特征是：
基本培养基(MS)中所述大量元素，由质量百分比浓度，1900mg/L的硝酸钾(KNO3)，440mg/L的氯化钙(CaCl2·2H2O)，370mg/L的硫酸镁(MgSO4·7H2O)，1650mg/L的硝酸铵(NH4NO3)，170mg/L的磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)组成，配制大量元素母液1L，10倍量，分别取19000mgKNO3、4400mgCaCl2·2H2O、3700mgMgSO4·7H2O、16500mgNH4NO3、1700mg KH2PO4·H2O，分别溶解后混合定容至1L，每配置1L培养基取大量元素母液100ml；微量元素由体积百分比浓度为22.3mg/L的硫酸锰(MnSO4·4H2O)，6.2mg/L的硼酸(H3BO3)，8.6mg/L的硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，0.25mg/L的钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)，0.025mg/L的硫酸铜(CuSO4·5H2O)，0.025mg/L的氯化钴(CoCl2·6H2O)，0.83mg/L的碘化钾(KI)组成，配置微量元素母液1L，100倍量，分别取2230mgMnSO4·4H2O、620mgH3BO3，860mgZnSO4·7H2O，25mgNa2MoO4·2H2O，2.5mgCuSO4·5H2O，2.5mgCoCl2·6H2O，83mgKI，分别溶解后混合定容至1L，每配置1L培养基取微量元母液10ml；铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和质量百分比浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA·2H2O)螯合后的溶液(EDTA-Fe)组成，配置铁盐母液1L，分别取2780mgFeSO4·7H2O、3730mgNa2·EDTA·2H2O，分别加热溶解，混合后再煮沸约20分钟，冷却后定容至1L，每配置1L培养基取铁盐溶液10ml；有机物由质量百分比浓度为0.5mg/L的烟酸，0.5mg/L的盐酸吡哆醇，0.4mg/L的盐酸硫胺素，2mg/L的甘氨酸，100mg/L的肌醇组成，配置有机物母液1L，分别取50mg的烟酸，50mg的盐酸吡哆醇，40mg的盐酸硫胺素，200mg的甘氨酸，10000mg的肌醇，分别溶解，混合后定容至1L，每配置1L培养基取有机物母液10ml；棉砂糖15-20g/L，琼脂粉5g/L，pH值5.8～6。
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2017
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