CN107782892A - 一种β‑胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种β‑胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种β‑胶原特殊序列化学发光检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括：偶联有β‑胶原特殊序列捕获抗体的磁微粒、吖啶酯标记的β‑胶原特殊序列检测抗体、β‑胶原特殊序列校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B。本发明试剂盒以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术。本发明试剂盒操作简单方便，反应条件温和，发光值稳定，受外界条件影响少；与现有技术相比，具有灵敏度高、检测快速方便、准确性高、重复性好、特异性强等优点。

Description

一种β-胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术领域，具体涉及一种β-胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
I 型胶原是人体最丰富的胶原蛋白形式，是骨中唯一的胶原成分，占骨基质的90%以上。在骨组织骨基质的不断重建中，I型胶原被降解，小片段释放入血，部分出现于尿液中。 测定血、尿中这些小片段的含量和变化可评价骨吸收状态，既有助于代谢性骨病的诊断，也能监测和评价抗骨吸收药物的疗效。
β-胶原特殊序列（β-crosslaps），又称为I型胶原C末端肽 ( C-terminaltelopeptides of type I collagen，CTX )。β-Crosslaps存在于成熟的骨胶原中，是成熟Ⅰ型胶原蛋白的羧基端降解代谢产物，同时也被分解成降解产物释放入血，是敏感性相对较好的一个指标，也是骨再吸收的重要标志物，通过检测β-Crosslaps可用于监测骨质疏松症的抗吸收治疗以及了解骨转换的程度。当人体骨吸收速度加快时，I型胶原蛋白的降解速度也随之加快，分解的β-crosslaps在血液中的含量相应增加。因β-crosslaps能在一定程度上反映骨转化的情况，临床上常将β-crosslaps作为一项重要的骨吸收标志物。
目前用于检测β-胶原特殊序列的方法主要有放射免疫法、酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等。放射免疫法操作步骤较多，需要特殊的检测设备，且会对操作人员的健康产生极大的危害；酶联免疫分析法一种非均相免疫测定方法，即抗原、抗体反应在固液相间进行，反应平衡后需要进行两相分离，操作过程难以实现全自动化，且存在灵敏度低、检测时间长等的缺点。CN 106248970 A（2016.12）公开了一种测定I型胶原C末端肽含量的试剂盒及其检测方法，该试剂盒采用碱性磷酸酶标记I型胶原C末端肽抗体，采用碱性磷酸酶进行标记的缺点是酶促受环境影响大：如消毒液、酸碱度、离子都会对其造成影响，稳定性较弱，从而影响测定结果。因此，建立一种有效、快速、简单、灵敏、抗干扰性高的检测β-胶原特殊序列的方法具有十分重要的意义。
本发明以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术进行检测。
吖啶取代物作为化学发光标记物用于免疫分析具有许多优越性，主要有：①化学反应简单、快速、无需催化剂，在有H2O2的稀碱性溶液中即能发光；②背景发光低，信噪比高，发光反应干扰因素少；③发光类型为闪光型发光，光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；④吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，可提高系统整体灵敏度；⑤易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；⑥标记物稳定，不受环境氧化剂的影响，在2-8℃下可保存数月之久。因此吖啶取代物是一类非常有效的化学发光标记物。
磁分离免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体而建立的一种新型免疫检测方法，该方法可使抗原、抗体的结合反应在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简便、灵敏度更高、反应快速、稳定、准确地定量测定β-胶原特殊序列的磁微粒化学发光测定试剂盒及制备方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
一种β-胶原特殊序列的化学发光试剂盒及其制备方法，本发明所提供的甲状腺球蛋白的化学发光试剂盒，采用磁微粒偶联β-胶原特殊序列捕获抗体、吖啶酯标记的β-胶原特殊序列检测抗体。试剂盒还包括β-胶原特殊序列校准品溶液、化学发光预激发液A以及化学发光激发液B以及清洗液。
作为本发明进一步的方案，所述磁微粒的内核为四氧化三铁或三氧化二铁，磁微粒的表面修饰基团为一种或多种活性功能基团，包括但不限于羧基、氨基、对甲苯磺酰基或链霉亲和素-生物素。
作为本发明进一步的方案，所述的磁微粒可直接与β-胶原特殊序列捕获抗体偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记β-胶原特殊序列捕获抗体。
作为本发明进一步的方案，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯标记的是β-胶原特殊序列检测抗体。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯与吖啶酯标记的β-胶原特殊序列检测抗体的摩尔比为5-100:1。
作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯标记β-胶原特殊序列检测抗体的缓冲液是pH 8.0-11.0、浓度为0.01-0.20 mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
作为本发明进一步的方案，所述的捕获抗体和检测抗体均为单克隆抗体。
作为本发明进一步的方案，所述的校准品是用含有0.5-5.0% BSA的Tris或PBS或HEPES缓冲液为基质，加入β-胶原特殊序列纯品配置而成，校准品形态为液态。
作为本发明进一步的方案，所述的β-胶原特殊序列校准品溶液浓度分别为0 ng/mL、0.02 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、2.5 ng/mL、6 ng/mL。
作为本发明进一步的方案，所述的化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成。其中，H2O2的质量分数为0.01-5.0%，HNO3浓度为0.01-1.0 mol/L；化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100的质量分数为0.01-2.0 %，NaOH浓度为0.05-1.0 mol/L。
作为本发明进一步的方案，所述的清洗液是pH 7.0-9.0、浓度为5-50 mmol/L的Tris或HEPES或其它溶液，其中含质量分数为0.01-0.25%的Tween-20。
本发明检测试剂盒采用的原理是双抗体夹心法，具体是通过磁微粒偶联的单克隆抗体与样本中的抗原特异性结合，再与吖啶酯标记的单克隆抗体结合形成复合物，最后利用吖啶酯反应产生的光子以检测产物浓度。
本发明的优点在于以磁分离化学发光技术为检测手段，同时采用吖啶酯标记技术进行检测以建立一种检测β-胶原特殊序列的直接化学发光试剂盒。以磁性微粒为固相分离载体可使抗原、抗体的结合反应在近似液相的条件下进行，反应快速、彻底；吖啶酯具有背景发光低、信噪比高、发光效率高、标记稳定、可提高系统整体灵敏度的明显优势；本发明操作简单方便，具有发光值稳定、灵敏度高、检测快速方便、准确性高、重复性好、特异性强等优点。
具体实施方式
本发明提供一种β-胶原特殊序列的化学发光试剂盒及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加明确、清楚，以下对本发明进一步详细说明。
本发明提供一种β-胶原特殊序列的化学发光试剂盒，以磁分离化学发光技术作为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术进行检测。该试剂盒包括：磁微粒偶联的β-胶原特殊序列捕获抗体、吖啶酯标记的β-胶原特殊序列检测抗体、β-胶原特殊序列校准品溶液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。
具体地，本发明所述的磁微粒可直接与β-胶原特殊序列捕获抗体偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记β-胶原特殊序列捕获抗体。
具体地，本发明在制备磁微粒混悬液时，所述偶联抗体缓冲液为pH 5.0-6.0，浓度为20-200 mmol/L 的MES缓冲液。
具体地，本发明在制备磁微粒混悬液时，所述封闭缓冲液为含1%BSA的缓冲液。
具体地，本发明所述的吖啶酯标记的是β-胶原特殊序列单克隆抗体，其中，吖啶酯与标记的β-胶原特殊序列单克隆抗体的摩尔比为5-100:1。
具体地，本发明所述的吖啶酯标记缓冲液是pH 8.0-11.0、浓度为0.01-0.20 mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
具体地，本发明所述的校准品缓冲液是含有0.5-5.0% BSA的Tris或PBS或HEPES缓冲液为基质，加入β-胶原特殊序列纯品配置而成，校准品形态为液态。
具体地，本发明所述的化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成。其中，H2O2的质量分数为0.01-5.0%，HNO3浓度为0.01-1.0 mol/L；化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100的质量分数为0.01-2.0%，NaOH浓度为0.05-1.0mol/L。
具体地，本发明所述的清洗液是pH 7.0-9.0、浓度为5.0-50.0 mmol/L的Tris或HEPES或其它溶液，其中含有质量分数为0.01-0.25%的Tween-20。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：所述的一种检测β-胶原特殊序列化学发光试剂盒的组建及制备方法，包括以下步骤：
1. 试剂盒组建
组建一种β-胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分：
羧基磁珠偶联的β-胶原特殊序列单克隆抗体；
吖啶酯标记的β-胶原特殊序列单克隆抗体；
β-胶原特殊序列系列校准品溶液；
化学发光预激发液A和化学发光激发液B；
清洗液。
2. 偶联有β-胶原特殊序列单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备
（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入200 μL的0.1 mol/L MES（pH 5.0）缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入200 μL的MES缓冲液（pH 6.0），涡旋。
（2）加入15 μg的β-胶原特殊序列单克隆抗体，使羧基与抗体摩尔比为150:1，于旋转反应器上涡旋，室温孵育30 min。
（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺），于旋转反应器上涡旋，室温孵育2 h。
（4）取200 μL含1% BSA的甘氨酸缓冲液（浓度为50 mmol/L）进行封闭，时间为1 h。
（5）去上清，加入200 μL清洗缓冲液（TBS+0.05% Tween-20），洗涤3次。
（6）将上述制备好的磁微粒混悬液置于500 μL保存液（300 mmol/L甘氨酸、2%甘油、5%蔗糖）中，2-8℃保存。
3. 吖啶酯标记的β-胶原特殊序列单克隆抗体的制备
（1）将100 μg的β-胶原特殊序列单克隆抗体置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1 L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液更换5次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH 9.8、浓度为50 mmol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
（2）称取1.7 mg的吖啶酯，选用化学发光标记物为NSP-DMAE-NHS，溶于447 μL无水二甲基甲酰胺（DMF）中，配成浓度为6.5 mmol/L的吖啶酯溶液。
（3）将经透析后的β-胶原特殊序列单克隆抗体置于500 μL离心管中，加入200 μL标记缓冲液，加入759 μL的6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液（避光反应），使吖啶酯与抗体的摩尔比为7.4:1，震荡混匀，室温下反应1 h。加入100 μL 浓度为10 g/L的赖氨酸，静置15 min，使标记反应终止。
（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ab与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液0.1 mol/L的PBS（pH 6.3）平衡并淋洗层析柱。分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280 nm吸光度值。收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1% BSA后分装冰冻保存。
4. β-胶原特殊序列校准品的制备
用含有2% BSA的Tris-NaCl缓冲液将β-胶原特殊序列纯品配制成标示浓度为0 ng/mL、0.02 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、2.5 ng/mL、6 ng/mL的一系列校准品。
5. 化学发光激发剂的制备
（1） 化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成。其中，H2O2的质量分数为1.5%，HNO3浓度为0.1 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
（2）化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100浓度为1.0%，NaOH浓度为0.4 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
6. 清洗液的制备
称量3.05 g Tris，8.775 g NaCl至1000 mL的烧杯中，加入1 mL质量分数为0.05%Tween-20，搅拌混匀，定容，将pH调至 7.6后保存备用。
实施例2：实际样本中β-胶原特殊序列的检测
本发明β-胶原特殊序列定量检测试剂盒的使用操作程序如下：
试剂盒的检测
（1）在反应杯中加入待测样本50 μL，再加入磁颗粒偶联悬浮液150 μL，振荡混匀，37℃孵育8 min。
（2）分离，清洗3次，将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（3）向反应杯中加入吖啶酯标记物150 μL，振荡混匀，37℃孵育7 min。
（4）分离，清洗3次，将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（5）加入100 μL化学发光预激发液A，1 s后加入100 μL化学发光激发液B，测量其相对发光强度，样本中β-胶原特殊序列的含量与其相对发光强度成一定比例关系。
实施例3：性能指标检测结果
（1）分析灵敏度
用试剂盒中0 ng/mL 校准品作为待测样本，重复测定20次，得出20次测量结果的 RLU值（相对发光值），计算其平均值（M）和标准差（SD），得出 M+2SD 所对应 RLU值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值。按检测方案中最低检测限检测方法，重复3次实验，最后求出本试剂盒对β-胶原特殊序列的分析灵敏度为0.01 ng/mL。
（2）精密度
用β-胶原特殊序列试剂盒测试浓度为（0.2±0.02）ng/mL及（2.0±0.2）ng/mL两个β-胶原特殊序列样本，每个浓度重复测试10次，计算试剂盒精密度，结果表明该试剂盒CV均小于5%。
（3）稳定性
取β-胶原特殊序列检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间1，3，5，7，9，11，12，13，14，15个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示β-胶原特殊序列检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为12个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为30天。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.一种β-胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于，包括：偶联有β-胶原特殊序列捕获抗体的磁微粒、吖啶酯标记的β-胶原特殊序列检测抗体、β-胶原特殊序列校准品溶液、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。
2.根据权利要求1所述的一种β-胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒的内核为四氧化三铁或三氧化二铁，磁微粒的表面修饰基团为一种或多种活性功能基团，包括但不限于羧基、氨基、对甲苯磺酰基或链霉亲和素-生物素。
3.根据权利要求1所述的一种β-胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒可直接与β-胶原特殊序列捕获抗体偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记β-胶原特殊序列捕获抗体。
4.根据权利要求1所述的一种β-胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
5.根据权利要求1所述的一种β-胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的吖啶酯标记的是β-胶原特殊序列检测抗体。
6.根据权利要求1所述的一种β-胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的检测抗体和捕获抗体均为单克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的一种β-胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的校准品是以含有BSA的缓冲液为基质，加入β-胶原特殊序列纯品配置而成的系列浓度梯度的校准品溶液。
8.根据权利要求1所述的一种β-胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光预激发液A由H2O2和HNO3的混合液组成，化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。
9.根据权利要求1所述的一种β-胶原特殊序列的化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：在反应杯中加入一定量的待测样本，再加入磁颗粒偶联悬浮液，混匀，37℃孵育，加入清洗液去掉上清；之后按照一定的比例加入吖啶酯标记物，37℃孵育，加入清洗液去掉上清，加入化学发光预激发液A和激发液B，测定相应的发光强度RLU/s。
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CN112946301A (zh) * 2021-04-15 2021-06-11 江苏优尼泰克生物科技有限公司 用于β-胶原特殊序列检测的组合物及应用和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法

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