CN107753585A - 一种附子汤的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及附子汤技术领域,更具体而言,涉及一种附子汤的提取方法;包括以下步骤:利用单因素和正交试验,确定提取附子汤各成分的方法;取附子汤中各味药材:黑顺片15g,茯苓9g,白术12g,白芍9g和人参6g,按料液比1:10加入70%乙醇加热回流提取2h,重复提取两次,得到包含附子汤各成分的提取液;并用高效液相色谱测定了提取液中附子汤各成分的含量;本发明以附子汤原方为研究对象,采用单因素结合正交试验法,获得了附子汤各成分含量都相对较高的提取方法,为附子汤的综合利用提供实验依据。
Description
技术领域
本发明涉及附子汤技术领域,更具体而言,涉及一种附子汤的提取方法。
背景技术
附子汤由附子、茯苓、人参、白术、芍药组成,首次出现于张仲景《伤寒论•辨少阴病脉证并治篇》,具有温经助阳、祛寒除湿之功效。《伤寒论》304条云:“少阴病,得之一二日,口中和,其背恶寒者,当灸之,附子汤主之”。305条又指出:“少阴病,身体痛,手足寒,骨节痛,脉沉者,附子汤主之”。方中附子益火兴元阳,温经散寒;人参大补元气,生化气血;茯苓健脾利湿,兼益心气;白术益气健脾,祛寒除湿;芍药养营和血以益肝阴。以附子为君药,人参为臣药,并以白术茯苓芍药辅佐,配伍得当,是治疗整体阳虚寒湿的经典方剂。古代医家运用附子汤多用于治疗脾肾阳虚、寒湿停聚、少阴阳虚方面。现代临床多用于心衰、心悸、风寒湿痹、腹痛、水肿等病,涉及到了心血管系统,寒湿痹证等多个方面。
现在有不少关于附子汤的提取条件和测定方法的报道,他们采用了不同的料液比、不同的提取方法和不同的提取溶剂等,但是这些提取方法各异,从而使含量测定结果有较大的差异。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明提供一种附子汤的提取方法,该方法使用单因素结合正交试验法,利用回流提取法对附子汤进行提取研究,获得一种附子汤的最佳提取方法。
为了解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案为:
一种附子汤的提取方法,包括以下步骤:
(1)取附子汤中各味药材,进行单因素试验,得出各因素对附子汤各成分提取效果的影响;
(2)进行正交试验,根据附子汤中各成分总峰面积的大小,确定提取条件;
(3)取与步骤(1)附子汤中等量的各味药材,按上述确定的提取条件加入乙醇溶液;
(4)将所得溶液加热回流提取;
(5)重复步骤(4)提取;
(6)将所得滤液合并,得到包含附子汤中各成分的提取液。
所述步骤(1)中,附子汤中各味药材为:黑顺片15g,茯苓9g,白术12g,白芍9g,人参6g。
所述步骤(1)中,单因素包括料液比、乙醇体积分数、提取时间和提取次数。
采用单因素试验,试验结果为采用1:5-1:20的料液比,体积分数为50%-90%的乙醇、提取时间为1h-3h,提取次数为1-3次时,各因素提取效果影响较大。
步骤(2)中,正交试验具体是指根据单因素试验结果,在每个因素下各选出3个水平,制定因素水平表,采用正交表L9(34)进行试验,根据各因素的极差值,确定各因素分别对附子汤中各成分的提取效果影响,得到最佳提取条件。
确定提取条件为采用1:10的料液比、体积分数为70%的乙醇溶液,回流提取时间为2h,提取2次。
步骤(1)中的单因素试验和步骤(2)中的正交试验,均使用高效液相色谱对包含附子汤各成分的提取液进行测定,从而比较各提取条件的优劣。
高效液相色谱中的高效液相色谱柱色谱通过BDS HYPERSIL C18色谱柱测得,BDSHYPERSIL C18色谱柱色谱柱长:250mm,内径:4.6mm,填料粒径:5μm;流动相A:乙腈;流动相B:PH=9的乙酸铵溶液,浓度为0.04mol/L;流速:1ml/min-1;检测波长:240nm;进样量:10μl;检测温度:30℃。
高效液相色谱测定附子汤各成分的含量包括以下步骤:
(1)将包含有附子汤各成分的提取液用纱布过滤,用旋蒸仪将滤液旋转蒸发浓缩至近干,再用0.05%盐酸-甲醇溶液溶解残渣,并定容至10ml,用微孔滤膜滤过即得供试品溶液;
(2)取供试品溶液注入高效液相色谱中进行色谱分析,总峰面积越大,附子汤中各成分的相对含量越高。
所述步骤(1)中,微孔滤膜的孔径为0.45μm。
与现有技术相比,本发明所具有的有益效果为:
本发明以附子汤原方为研究对象,采用单因素结合正交试验法,优选出提取附子汤各成分的最佳方法:料液比为1:10时,附子汤中的化学成分完全扩散在溶剂中;乙醇体积分数为70%时,有效成分提取率最高;提取时间为2h、提取次数2次都可以使有效成分充分被提取,综合得到使附子汤各成分含量相对较高的提取方法,也为附子汤的综合利用提供实验依据。
附图说明
图1为附子汤的高效液相色谱图;
图2为料液比对总峰面积大小的影响;
图3为乙醇体积分数对总峰面积大小的影响;
图4为提取时间对总峰面积大小的影响;
图5为提取次数对总峰面积大小的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
1、材料与设备
1.1仪器
高效液相色谱仪(型号沃特世-2695,UV检测器及其配套色谱工作站,美国Waters公司),十万分之一电子天平(型号AB-135S,METTLER梅特勒集团),万分之一电子天平(型号FA/JA 1004,上海精密科学仪器有限公司),数显酸度计(型号PHS-3C,上海宇隆仪器有限公司),旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),超声波清洗器(型号KQ5200V,昆山超声仪器有限公司),SKM型数显恒温电热套(鄄城华鲁电热仪器有限公司)。
1.2试剂
无水乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,分析纯,2014-05-10),氨水(天津市科密欧化学试剂有限公司,分析纯,2013-02-06),乙酸铵(天津市科密欧化学试剂有限公司,分析纯,2013-03-10),甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,色谱纯,2013-01-05),乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司,色谱纯,2013-02-09),盐酸(天津市光复精细化工研究所,分析纯,2012-09-16),娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。
1.3药材
黑顺片为毛茛科植物乌头的子根的加工品。茯苓为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核。人参为五加科植物人参的干燥根和根茎。白术为菊科植物白术的干燥根茎。芍药为毛莨科植物芍药的干燥根。黑顺片、白术、茯苓、白芍购自河北祁一堂药业有限公司,人参购自国药集团山西有限公司。
1.4色谱条件
色谱柱:BDS HYPERSIL C18色谱柱,长:250mm,内径:4.6mm,填料粒径:5μm;流动相A:乙腈,流动相B:pH=9的乙酸铵溶液,浓度为0.04mol/L;流速:1ml/min-1;检测波长:240nm;进样量:10μl;检测温度:30℃;梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
时间/min | 流动相A/% | 流动相B/% |
0 | 10 | 90 |
24 | 34 | 66 |
50 | 54 | 46 |
60 | 64 | 34 |
1.5色谱图
高效液相色谱图如图1所示。
1.6测定法
取附子汤中各味药材:黑顺片15g,茯苓9g,白术12g,白芍9g,人参6g,按照一定条件加热回流提取60min,用纱布过滤药液,旋蒸仪浓缩至近干,用0.05%盐酸-甲醇溶液溶解残渣,并定容至10mL,用0.45μm微孔滤膜滤过即得供试品溶液。
2、确定提取附子汤各成分的最优方法
2.1单因素试验
(1)料液比的选择
取附子汤药材5份,精密称定,分别用5倍量、10倍量、20倍量、30倍量、40倍量的70%乙醇回流提取1h,过滤,旋蒸仪浓缩至近干,用0.05%盐酸-甲醇溶液将残渣溶解,并定容至10ml,摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,取一定量的提取液于液相小瓶中,置于高效液相色谱仪中进行色谱分析。
(2)乙醇体积分数的选择
取附子汤药材5份,精密称定,分别用10倍量10%、30%、50%、70%、90%乙醇回流提取1h,过滤,旋蒸仪浓缩至近干,用0.05%盐酸-甲醇溶液将残渣溶解,并定容至10ml,摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,取一定量的提取液于液相小瓶中,置于高效液相色谱仪中进行色谱分析。
(3)提取时间的选择
取附子汤药材5份,精密称定,分别用10倍量70%乙醇回流提取0.5h、1h、2h、3h、4h,过滤,旋蒸仪浓缩至近干,用0.05%盐酸-甲醇溶液将残渣溶解,并定容至10ml,摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,取一定量的提取液于液相小瓶中,置于高效液相色谱仪中进行色谱分析。
(4)提取次数的选择
取附子汤药材5份,精密称定,分别用10倍量70%乙醇回流提取1、2、3、4、5次,每次1h,过滤,旋蒸仪浓缩至近干,用0.05%盐酸-甲醇溶液将残渣溶解,并定容至10ml,摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,取一定量的提取液于液相小瓶中,置于高效液相色谱仪中进行色谱分析。
(5)单因素指标的选择
a、料液比对总峰面积大小的影响
试验结果见图2。通过图表可知,随着料液比的增加,总峰面积呈现先升高后趋于平缓,总峰面积随着料液比的增大而升高,这是因为提取率的高低与附子汤中化学成分向溶剂扩散的难易程度有关,料液比小,溶剂量少,导致两相界面间的浓度差小,不利于有效成分的扩散。但随着料液比的升高,总峰面积趋于平缓,此时附子汤中化学成分已完全扩散在溶剂中。综合考虑提取率和试验成本,在该因素下选择5倍量、10倍量、20倍量这三个水平进行正交试验。
b、乙醇体积分数对总峰面积大小的影响
试验结果见图3。通过图表可知,随着乙醇体积分数的增大,总峰面积总体呈上升趋势。乙醇体积分数过小时,附子汤中有效成分不能完全被提取,故乙醇体积分数的上升使得有效成分的提取率提高,然而乙醇体积分数过高时,溶解在溶剂中的水溶性成分减少。综上所述,在该因素下选择乙醇体积分数为50%、70%、90%这三个水平进行正交试验。
c、提取时间对总峰面积大小的影响
试验结果见图4。通过图表可知,总峰面积随着提取时间的增加而增长。当提取时间超过2h时,总峰面积的增长趋势变缓,可能是因为有效成分已被充分提取。根据试验结果,在该因素下选择提取时间为1h、2h、3h这三个水平进行正交试验。
d、提取次数对总峰面积大小的影响
试验结果见图5。通过图表可知,总峰面积随着提取时间的增加而增长。在提取次数为3次时,增加提取次数总峰面积增加不明显。因此,在该因素下选择提取次数为1次、2次、3次这三个水平进行正交试验。
2.2正交试验
(1)正交试验因素水平的选择
经过单因素试验并在此基础上,选择影响附子汤中总峰面积的4个因素料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取次数,进行4因素3水平的正交试验,后运用正交试验设计计算,对正交试验结果进行分析,根据结果得出附子汤提取的最优条件。因素水平表见下表2。
表2 正交试验设计因素与水平
(2)正交试验方差分析及其结果
根据单因素试验结果,用正交试验考察影响附子汤提取的四个因素:乙醇体积分数,提取时间,提取次数,料液比对附子汤中化学成分总峰面积的影响。对结果进行极差分析,以确定最佳提取方法。采用L9(34)正交因子水平表,设计L9(34)正交试验,试验结果见下表3。
表3 正交试验设计及其结果
由表3的极差显示,各因素对附子汤中化学成分的总峰面积大小的影响为A>C>B>D,即乙醇体积分数>提取次数>提取时间>料液比。
正交试验方差分析见下表4,表中可以得出因素A(乙醇体积分数)差异显著,因素B(提取时间)、因素C(提取次数)与因素D(料液比)在试验范围内对试验结果有影响,但并无显著统计学差异。综合单因素考察结果,在试验条件范围内,选择优化的提取方案为A2B2C2D2。即乙醇体积分数为70%、提取时长2h、提取2次、料液比为1:10。
表4 正交试验方差分析
F0.05(2,2)=19
3、最佳提取方法的验证
称取附子汤药材,按照最优提取方法进行回流提取,平行操作3份,总峰面积分别为345308980,338907680,318410765,见下表5,RSD值4.09%。证明该方法稳定可行。
表5 验证试验
本发明选择用总峰面积作为指标,能更加直观地比较试验结果,更加准确的反映试验差异,由于附子汤中成分较多,用总峰面积作为指标还可以使得在结果比较上更为简便。本发明采用该洗脱条件是因为在该洗脱条件下色谱峰较多,色谱峰分离度效果较好,以240nm为检测波长是因为在该波长下色谱峰较多,基线平稳,噪音小。本发明采用了回流提取的方法对附子汤化学成分进行提取,不用水煎煮法是因为水煎煮所能提取的化学成分比较少,且含量较低,故选择了回流提取法作为本试验的提取方法。
本发明从影响附子汤提取的单因素出发,运用正交试验法对附子汤的提取方法进行了研究,结合单因素考察结果,确立了附子汤的最佳提取方法:用10倍量70%乙醇回流提取2次,每次2小时。该方法简单可靠,为附子汤在现代医疗中进一步的药效研究提供依据。
上面仅对本发明的较佳实施例作了详细说明,但是本发明并不限于上述实施例,在本领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化,各种变化均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种附子汤的提取方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取附子汤中各味药材,进行单因素试验,得出各因素对附子汤各成分提取效果的影响;
(2)进行正交试验,根据附子汤中各成分总峰面积的大小,确定提取条件;
(3)取与步骤(1)附子汤中等量的各味药材,按上述确定的提取条件加入乙醇溶液;
(4)将所得溶液加热回流提取;
(5)重复步骤(4)提取;
(6)将所得滤液合并,得到包含附子汤中各成分的提取液。
2.如权利要求1所述的一种附子汤的提取方法,其特征在于:所述步骤(1)中,附子汤中各味药材为:黑顺片15g,茯苓9g,白术12g,白芍9g,人参6g。
3.如权利要求1所述的一种附子汤的提取方法,其特征在于:所述步骤(1)中,单因素包括料液比、乙醇体积分数、提取时间和提取次数。
4.如权利要求3所述的一种附子汤的提取方法,其特征在于:采用单因素试验,试验结果为采用1:5-1:20的料液比,体积分数为50%-90%的乙醇、提取时间为1h-3h,提取次数为1-3次时,各因素提取效果影响较大。
5.如权利要求1所述的一种附子汤的提取方法,其特征在于:步骤(2)中,正交试验具体是指根据单因素试验结果,在每个因素下各选出3个水平,制定因素水平表,采用正交表L9(34)进行试验,根据各因素的极差值,确定各因素分别对附子汤中各成分的提取效果影响,得到最佳提取条件。
6.如权利要求5所述的一种附子汤的提取方法,其特征在于:确定提取条件为采用1:10的料液比、体积分数为70%的乙醇溶液,回流提取时间为2h,提取2次。
7.如权利要求1所述的一种附子汤的提取方法,其特征在于:步骤(1)中的单因素试验和步骤(2)中的正交试验,均使用高效液相色谱对包含附子汤各成分的提取液进行测定,从而比较各提取条件的优劣。
8. 如权利要求7所述的一种附子汤的提取方法,其特征在于:高效液相色谱中的高效液相色谱柱色谱通过BDS HYPERSIL C18色谱柱测得,BDS HYPERSIL C18色谱柱色谱柱长:250mm,内径:4.6mm,填料粒径:5μm;流动相A:乙腈;流动相B:PH=9的乙酸铵溶液,浓度为0.04mol/L;流速:1ml/min;检测波长:240nm;进样量:10μl;检测温度:30℃。
9.如权利要求7所述的一种附子汤的提取方法,其特征在于:高效液相色谱测定附子汤各成分的含量包括以下步骤:
(1)将包含有附子汤各成分的提取液用纱布过滤,用旋蒸仪将滤液旋转蒸发浓缩至近干,再用0.05%盐酸-甲醇溶液溶解残渣,并定容至10ml,用微孔滤膜滤过即得供试品溶液;
(2)取供试品溶液注入高效液相色谱中进行色谱分析,总峰面积越大,附子汤中各成分的相对含量越高。
10.如权利要求9所述的一种附子汤的提取方法,其特征在于:所述步骤(1)中,微孔滤膜的孔径为0.45μm。
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2017
- 2017-09-22 CN CN201710866940.2A patent/CN107753585A/zh active Pending
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