CN107739719A

CN107739719A - 一种野生食用菌的快速分离方法

Info

Publication number: CN107739719A
Application number: CN201710976729.6A
Authority: CN
Inventors: 刘韫滔; 曾思琪; 唐婷婷; 张兰; 刘奕希; 李�诚; 胡欣洁; 刘爱平; 胡滨
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2017-10-19
Filing date: 2017-10-19
Publication date: 2018-02-27

Abstract

本发明公开了一种野生食用菌的快速分离方法，其选用的原料（红平菇，茶树菇，猴头菇，蟹味菇，灵芝）在中国广泛种植，采集方便，同时属于不同的种属，代表性较强；本发明选用的原料的食药用价值极高，同时，在已有的研究中也具有较高的活性，因此具备进一步被开发利用的潜质；本发明建立了一种高效的野生菌组织分离方法，传统的组织分离法极易染菌，费时耗力；PCR测序结果以及形态学鉴定：分别在发酵第一天和第二天加入等量的，浓度分别为1 mg/L的粉锈宁和40 mg/L的庆大霉素，可以获得高产量的而且纯度最高的食用真菌。

Description

一种野生食用菌的快速分离方法

技术领域

本发明涉及一种野生食用菌的快速分离方法，属于野生食用菌分离技术领域。

背景技术

我国西南地区由于其独特的地貌和环境特征，蕴含了大量的珍惜植物、动物和食用真菌。如今，食用菌的食药用价值已经得到世界各地的广泛认可，特别是在中国、印度、日本和韩国，这些食用菌已成为重要的中药成分，至少有270种食用菌被研究并确认具有生物活性。同时，食用菌是能量和脂肪含量低，但富含蛋白质、碳水化合物和膳食纤维的营养物质，由于真菌细胞中富含非淀粉类多糖，其中β-葡萄糖是最具有功能价值的部分，蘑菇可以作为膳食纤维的潜在来源，此外，食用菌还具有抗癌、抗菌、抗病毒，降血压血脂，降血糖，免疫调节等作用。

本发明选用以下五种食用菌，因其属于不同的种属，代表性较强，便于实验的普遍推广。

红平菇属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、侧耳属的真菌，是原产于热带和亚热带地区的一种木材腐朽菌，是一种具有食、药用并兼有观赏价值的珍稀菌种。茶树菇的学名是茶薪菇，属于担子菌纲、伞菌目、粪绣伞科，含有人体所需的18种氨基酸，特别是含有人体所不能合成的8种氨基酸、蛋白质、碳水化合物等营养成分，还有丰富的维生素和多种矿物质元素，如铁、钾、锌、硒等元素，是一种高蛋白，低脂肪，无污染，无药害，集营养、保健、理疗于一身的纯天然食用菌。猴头菇属担子菌纲、多孔菌目、齿菌科、猴头属，是一种珍贵的食药用菌,富含多种营养成分，具有性平、味甘、有利五脏、助消化、滋补身体等功效。蟹味菇属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、玉蕈属，是一种大型木质腐生真菌。研究表明，蟹味菇子实体含有粗蛋白、粗脂肪、多糖、总糖、灰分等营养成分，除脂肪含量较低外其他成分均较高，而且营养种类齐全，具有货架期长、质韧、肉厚、口感极佳等特点，是一种营养全面、低热量、低脂肪的健康食品，深受人们的青睐，被视为食用菌中的珍品。灵芝是担子菌门、担子菌纲、多孔菌科、灵芝属药用真菌，传统中医视灵芝为名贵滋补类药材，有扶正固本、延年益寿之功效，临床上主要用于治疗慢性支气管炎、消化不良、神经衰弱、冠心病、肝炎、高血脂、高血压、白细胞减少症等疾病，具有极高的免疫调节作用。

现如今，为了提高食用菌的产量及其效用，使其更好的应用于现代工业化市场，越来越多的研究倾向于野生菌的分离培养，但是，在食用菌液体发酵中，常常会遭细菌和霉菌等杂菌污染，常见的霉菌类杂菌主要有毛霉、根霉、青霉、木霉、曲霉等，其中以青霉的污染最为严重。细菌和霉菌污染将直接影响食用菌的产量以及纯度，造成较为严重的经济损失和研究失误，因此，筛选出高效、低毒、选择性强的杀菌剂，从而有效地防治霉菌污染，是食用菌生产中急待解决的问题之一。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种野生食用菌的快速分离方法，其特征在于，其包括以下步骤：

（1）新鲜菌种的清洁预处理：所有样品被采摘后，均由塑料刀具去除表面污渍，不用水冲洗，用保鲜膜包裹后，迅速置于冰盒中，带回实验室备用；

（2）抗生素添加量以及添加方式的优化：选用粉锈宁作为霉菌抑制剂，抗生素头孢霉素，庆大霉素作为细菌抑制剂，化学药品双氧水作为细菌抑制剂来优化；

（3）培养基的配置：

先取 200 g 马铃薯，切成绿豆般大小后沸水煮 30 分钟，之后用纱布过滤，同时，称取20 g 葡萄糖，5 g 蛋白胨、1 g 酵母提取物、1 g磷酸二氢钾、1 g硫酸镁、2 g氯化钠，混合后配置成1 L的液体，放于4 ℃冰箱中保存，使用时按照上述抗生素及化学抑制剂的比例及添加方式加入；

（5）野生菌的组织分离：

先用浓度为75 % 的酒精浸泡5分钟，之后转移到浓度为0.5 % 的升汞内浸泡5分钟，然后用无菌水清洗干净菌种表面的升汞，再用无菌棉花将其表面擦干；随后，用无菌手术刀将子实体中间切开，从子实体伞柄交接处切取三个大小一致的块状于配置好的液体培养液中，之后将三角瓶放于摇床中，以23 ℃，120 r/min培养7天。

进一步，作为优选，所述步骤（1）中，野生食用菌为红平菇，茶树菇，猴头菇，蟹味菇，灵芝，且对各种野生食用菌进行形态学鉴定。

进一步，作为优选，所述步骤（2）中，分别在发酵第一天和第二天加入等量的，浓度分别为1 mg/L的粉锈宁和40 mg/L的庆大霉素。

进一步，作为优选，所述步骤（2）中，粉锈宁和庆大霉素按1：1比例混合加入。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）本发明选用的原料（红平菇，茶树菇，猴头菇，蟹味菇，灵芝）在中国广泛种植，采集方便，同时属于不同的种属，代表性较强；

（2）本发明选用的原料的食药用价值极高，同时，在已有的研究中也具有较高的活性，因此具备进一步被开发利用的潜质；

（3）本发明建立了一种高效的野生菌组织分离方法，传统的组织分离法极易染菌，费时耗力；

（4）PCR测序结果以及形态学鉴定：分别在发酵第一天和第二天加入等量的，最终浓度分别为2 mg/L的粉锈宁和80 mg/L的庆大霉素，可以获得高产量的而且纯度最高的食用真菌。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

分离实验方法：

1.新鲜菌种的清洁预处理：

所有样品被采摘后，均由塑料刀具去除表面污渍（不用水冲洗），用保鲜膜包裹后，迅速置于冰盒中，带回实验室备用。

2.形态学鉴定：

红平菇，茶树菇，猴头菇，蟹味菇，灵芝通过形态学对菌株进行初步的分类鉴定。

3.抗生素添加量以及添加方式的优化：

因食用真菌中，感染多为细菌和霉菌，故本实验选用粉锈宁作为霉菌抑制剂，抗生素头孢霉素，庆大霉素作为细菌抑制剂，化学药品双氧水作为细菌抑制剂来优化。

3.1 培养基中只添加一种抑菌药品：

组Ⅰ：粉锈宁:设置浓度分别为0，0.5，1，2，5 mg/L。

组Ⅱ：头孢霉素：设置浓度为0，50，100，200，300 mg/L。

组Ⅲ：庆大霉素：设置浓度为0，70，80，90，100 mg/L。

组Ⅳ：双氧水：设置浓度为0，10，15，20 ，25 mg/L。

3.2 霉菌抑制剂与细菌抑制剂相混合加入培养基中：

在以每种抑制剂的最优浓度为基础，我们将霉菌抑制剂和细菌抑制剂按照1:1的比例混合后加入培养基，再次确定最适添加量。

组Ⅴ：粉锈宁 : 头孢霉素=1 ：1

组Ⅵ：粉锈宁：庆大霉素=1 ：1

组Ⅶ：粉锈宁：双氧水=1 ：1

3.3 抗生素的添加方式：

在配置培养基时就将最优条件下的抑菌剂加入，作为第一种添加方式；将最优条件下的抑菌剂等分为两份，分别在发酵第一天，第二天加入，作为第二种添加方式；将最优条件下的抑菌剂等分为三份，分别在发酵第一天，第二天和第三天加入，作为第三种添加方式。

4培养基的配置：

先取 200 g 马铃薯，切成绿豆般大小后沸水煮 30 分钟，之后用纱布过滤，同时，称取20 g 葡萄糖，5 g 蛋白胨、1 g 酵母提取物、1 g磷酸二氢钾、1 g硫酸镁、2 g氯化钠，混合后配置成1 L的液体，放于4 ℃冰箱中保存，使用时按照上述抗生素及化学抑制剂的比例及添加方式加入。

5野生菌的组织分离：

6生产量以及抑制率测定：

采用干重法（将菌丝发酵液 5000 rpm 离心 5 min，弃去上清液并收集菌丝），将培养的菌丝和子实体置于60 ℃烘箱，至恒重。

生产效率 g/L= 菌丝干重 g ÷ 液体培养基的体积 L

抑制率 % = [ (对照菌丝生产量 – 抗生素处理菌丝生长量) ÷ 对照菌丝生产量]×100 %

7 抗生素效果的鉴定：

7.1 食用菌发酵结果的初步鉴定：

根据发酵过程中，对发酵液的颜色，菌丝生长状况进行初步鉴定，初步判定是否有杂菌污染。

7.2 食用菌DNA的提取：

用 70% 的酒精将样品的表面清洗干净，然后灭菌后的解剖刀挑取少量子实体内部组织（约 500 mg），转移至灭过菌的研钵中，用液氮将菌体迅速研磨成粉末，加 600 µL 2 ×CTAB 溶液，转入 1.5 mL 离心管，震荡摇匀；65 ℃ 水浴 40 min； 10000 r/min 离心 10min，取上清液，用等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:l）抽提，10000 r/min 离心 10 min，将上清液移至干净管中，再用等体积氯仿:异戊醇（24:1）抽提，取上清液移至干净管中，加 0.6倍体积异戊醇，颠倒混合，室温下静止 l h，沉淀 DNA；于 14000 r/min 离心 20 min，收集DNA 沉淀； DNA 沉淀加 500 µL 70％乙醇漂洗，自然风干，加20 µL TE 溶解 DNA， -20℃保存备用。

7.3 PCR扩增：

以抽提的DNA作为模板，分别采用ITS1-4，16S的引物进行扩增，PCR的总反应体系为25μL。

7.4 PCR 产物序列测定及序列分析：

首先由 PCR 结果确定所提的 DNA 只含有真菌，随后将初步确定的 PCR 产物纯化，将己纯化的 PCR 产物送入生物技术有限公司进行测序。将得到的碱基序列在 Genebank 等国际核酸序列数据库内进行同源序列比对，最终确定菌种类型。

结果与讨论：

1.单个抗生素对食用菌菌丝生长的影响

1.1单个抗生素对食用菌菌丝产量的影响

由表1可知，粉锈宁对五种食用菌菌丝的生长的影响不大，除了对灵芝有不同程度的抑制外，在一定浓度时均对其他四种食用菌菌丝生长有一定的促进作用，不过总体而言，在培养基中添加粉锈宁对菌丝产量不会有太大的影响。

表1:粉锈宁对五种食用菌菌丝的生长的影响

表2:头孢霉素对五种食用菌菌丝的生长的影响

由表2可知，头孢霉素对五种食用菌菌丝的生长的影响不大，除茶树菇外在一定浓度时均对食用菌菌丝生长有一定的促进作用。

表3:庆大霉素对五种食用菌菌丝的生长的影响

由表3可知，庆大霉素对五种食用菌菌丝的均有一定的促进作用不过总体而言，尤其是对红平菇和灵芝的促进作用最强。

表4:双氧水对五种食用菌菌丝的生长的影响

由表4可知，双氧水对这五种食用菌菌丝生长的影响都有一定的局限性，在双氧水浓度较小时，有利于这五种食用菌菌丝的生长，但是当双氧水浓度达到20mg/L时，尤其以茶树菇和灵芝最为敏感，菌丝生长效率下降了一点，当双氧水浓度达到25mg/L时，抑制了这五种食用菌的生长，且抑制率较高，此浓度不利于食用菌的生长。

1.2 单个抗生素的作用效果

根据 PCR 鉴定的图谱可知，在不加抗生素的作用下，使用不同的引物均可获得条带，故证明野生菌的组织中还有不同的杂菌污染；在粉锈宁的作用下，我们也可以清楚地看到每一条条带，而且不同浓度下条带的亮度差别不大，说明细菌对粉锈宁并不敏感，这可能是由于粉锈宁是霉菌抗生素，对细菌没有太大的影响；在头孢霉素和庆大霉素的分别作用下，我们可以清楚地看到随着抗生素浓度的添加，以27F，1492R为引物的条带亮度逐渐减弱，在头孢霉素，庆大霉素浓度分别为200，80 mg/L 时，有部分条带不再显现，说明头孢霉素，庆大霉素对细菌作用较强；双氧水的作用效果与头孢霉素庆大霉素类似，只是双氧水在浓度为25 mg/L时严重抑制食用菌菌丝的生长，不利于工业化生产。

2.组合抗生素对食用菌菌丝生长的作用效果：

根据上述结果，我们可以得知粉锈宁，头孢霉素，庆大霉素，双氧水的最适浓度分别是：2，200，80，20 mg/L，我们采取各个抑菌剂的最适浓度，按照粉锈宁：头孢霉素=1 ：1；粉锈宁：庆大霉素=1 ：1；粉锈宁：双氧水=1 ：1的比例进行再次优化，目测可得，添加组合类抑菌剂对食用菌的产量影响也不大。

粉锈宁与头孢霉素按1：1和粉锈宁与双氧水按1：1比例混合后，以27F，1492R为引物的条带亮度相对于单因素作用时很暗，但是还有条带显示，粉锈宁和庆大霉素按1：1比例混合后，以27F，1492R为引物的条带不再显现，同时，我们将这三种PCR产物纯化，将其送生物技术有限公司进行测序，最后得到粉锈宁和庆大霉素按1：1比例混合后的菌种是我们筛选所需要的菌种。

3.最优抗生素的添加时间对食用菌菌丝生长的作用效果：

我们将三种抗生素的添加时间的产物做PCR鉴定，图谱显示这种菌只可能是真菌或霉菌，同时，我们将这三种PCR产物纯化，将其送往生物技术有限公司进行测序，确定这三种结果下的菌种均为我们所筛选的真菌，但是根据产量，我们可以知道分别在发酵第一天和第二天加入抗生素，对菌丝生长效率的影响最小。

综合上述结果，我们知道在发酵第一天和第二天，分别加入浓度为1 mg/L的粉锈宁和40 mg/L的庆大霉素，可以一次性筛选出所需要的纯种菌种，大大减少了分离的时间，利于工业化应用。

本发明选用的原料（红平菇，茶树菇，猴头菇，蟹味菇，灵芝）在中国广泛种植，采集方便，同时属于不同的种属，代表性较强；选用的原料的食药用价值极高，同时，在已有的研究中也具有较高的活性，因此具备进一步被开发利用的潜质；本发明建立了一种高效的野生菌组织分离方法，传统的组织分离法极易染菌，费时耗力；（4）PCR测序结果以及形态学鉴定：分别在发酵第一天和第二天加入等量的，最终浓度分别为2 mg/L的粉锈宁和80 mg/L的庆大霉素，可以获得高产量的而且纯度最高的食用真菌。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种野生食用菌的快速分离方法，其特征在于，其包括以下步骤：

（3）培养基的配置：

（5）野生菌的组织分离：

2.根据权利要求1所述的一种野生食用菌的快速分离方法，其特征在于：所述步骤（1）中，野生食用菌为红平菇，茶树菇，猴头菇，蟹味菇，灵芝，且对各种野生食用菌进行形态学鉴定。

3.根据权利要求1所述的一种野生食用菌的快速分离方法，其特征在于：所述步骤（2）中，分别在发酵第一天和第二天加入等量的，浓度分别为1 mg/L的粉锈宁和40 mg/L的庆大霉素。

4.根据权利要求1所述的一种野生食用菌的快速分离方法，其特征在于：所述步骤（2）中，粉锈宁和庆大霉素按1：1比例混合加入。