CN107727842A - 一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备及应用 - Google Patents

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CN107727842A CN201711113617.4A CN201711113617A CN107727842A CN 107727842 A CN107727842 A CN 107727842A CN 201711113617 A CN201711113617 A CN 201711113617A CN 107727842 A CN107727842 A CN 107727842A
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刘庆
孙宁
王增友
钟晶晶
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Abstract

本发明涉及一种检测瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备及其应用。具体是利用金银溶胶标记抗体快速、同时检测瘦肉精全部1~16种组分残留试纸卡，该试纸卡包括圆盘状的塑料支撑物和试纸芯，塑料支撑物由设有安装试纸芯固定槽的底座以及设有加样孔和结果显示窗的面板构成，试纸芯由样品垫、标记物结合垫、层析膜和吸水垫依次粘贴到衬板上制成。本发明实现了瘦肉精全组分残留的同时检测，用同一试纸卡一次加样，即可同时检测多组分或全组分瘦肉精残留物，既实现了高通量检测、大大节省了检测时间，又降低了检测成本。

Description

一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备及应用
技术领域
本发明涉及一种瘦肉精快速检测试纸卡的制备及应用，具体是一种纳米功能材料与生物免疫方法结合试纸卡的制备及应用于瘦肉精全组分残留同时检测。属于新型纳米功能材料和生物免疫技术领域。
背景技术
瘦肉精是一类叫做β－兴奋剂（β-agonist）的药物，而不是某一种特定的药物。这类药物具有实现促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的功能，所以统称为“瘦肉精”。根据国务院食品安全委员会办公室《“瘦肉精”专项整治方案》（食安办〔2011〕14号）规定的“瘦肉精”全组分为16种，包括：莱克多巴胺（Ractopamine）；克伦特罗（Clenbuterol）；沙丁胺醇（Salbutamol）；硫酸沙丁胺醇（Salbutamol Sulfate）；盐酸多巴胺（DopamineHydrochloride）；西马特罗（Cimaterol）；硫酸特布他林（Terbutaline Sulfate）；苯乙醇胺A（Phenylethanolamine A）；班布特罗（Bambuterol）；盐酸齐帕特罗（ZilpaterolHydrochloride）；盐酸氯丙那林（Clorprenaline Hydrochloride）；马布特罗（Mabuterol）；西布特罗（Cimbuterol）；溴布特罗（Brombuterol）；酒石酸阿福特罗（ArformoterolTartrate）；富马酸福莫特罗（Formoterol Fumatrate）。瘦肉精可以提高猪的瘦肉率，带来更多经济价值，但它有很危险的副作用，当摄入量较大时，会造成心血管系统的损坏，并可能出现严重的神经症状。
检测瘦肉精的方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱－质谱法（GC-MS）和酶联免疫法（ELISA）。这些方法，优点是专属性好、选择性强、检测精确度较高，但缺点是仪器设备复杂、操作过程繁琐，对检验人员的操作技能要求很高，且不适于现场和快速检测，从而限制了这些方法在实际应用中的推广。
免疫试纸法具有定性和半定量能力，可以提供待测物的初步信息，并且灵敏度高、检测快速、操作简单，非常适合用于瘦肉精的筛查。比如中国专利号CN 200620019375.3公开的“盐酸克伦特罗胶体金法检测试纸” 和CN200610010727.3公开的“盐酸克伦特罗胶体金法检测试纸及制备方法”可以实现对盐酸克伦特罗的半定量快速检测；中国专利号CN201110433726.0公开的“用双指示线免疫层析半定量诊断莱克多巴胺的方法” 可以实现对莱克多巴胺的半定量快速检测；中国专利号CN 201120070997.X公开的“一种瘦肉精分型检测试纸”可以实现对莱克多巴胺和盐酸克伦特罗的同时分组分检测；中国专利号CN201120205560.2公开的“瘦肉精多残留联检试纸卡” 和CN 201110163903.8公开的“瘦肉精多残留联检试纸卡及其制备方法”可以实现对莱克多巴胺、盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、特步特林和西马特罗中的两种到五种瘦肉精组分的的同时检测。
以上专利均具有快速、简单的优点，但是对于瘦肉精全组分的检测却无法实现。其中201120205560.2和201110163903.8专利虽实现了五种瘦肉精组分的同时检测，但由于检测线对样品的的非特异性吸附，必会造成后续检测线的检测误差，因此，也使得以上专利无法实现瘦肉精更多组分的同时检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种可用于现场操作的、简单、快速、灵敏检测的一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备方法。
本发明的目的之二是将该试纸卡应用于瘦肉精全组分残留的联检。
本发明采用的技术方案如下：
本发明所述的瘦肉精全组分残留联检试纸卡，试纸卡呈圆盘状，圆盘状试纸卡由塑料支撑装置和试纸芯组成，塑料支撑装置包括底座和面板，其中底座上设有安装试纸芯的固定槽，面板上设有加样孔和结果显示窗，面板与固定槽之间设有不吸水硬质塑胶条材质的衬板，衬板上粘结有试纸芯，试纸芯由样品垫、标记物结合垫、层析膜和吸水垫依次粘贴到衬板上制成，层析膜上设有检测线和对照线，检测线和对照线沿层析膜呈同心圆形状的圆弧形排列。
所述标记物结合垫为吸附有1-16种混合金银溶胶标抗体的玻璃纤维棉，所述金银溶胶标抗体由金银溶胶标记的抗瘦肉精的抗体制成，所述金银溶胶为胶体金、胶体银或胶体金银合金。
所述检测线由1-16条瘦肉精－载体蛋白结合抗原包被在硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或梭化纤维素膜上制成，所述瘦肉精－载体蛋白结合抗原与标记物结合垫上所吸附的瘦肉精抗体相对应，分为十六组：第一组：金银溶胶标记莱克多巴胺（RAC）抗体，检测线为RAC－载体蛋白结合抗原；第二组：金银溶胶标记克伦特罗（CL）抗体，检测线为CL－载体蛋白结合抗原；第三组：金银溶胶标记沙丁胺醇（SAL）抗体，检测线为SAL－载体蛋白结合抗原；第四组：金银溶胶标记硫酸沙丁胺醇（SALS）抗体，检测线为SALS－载体蛋白结合抗原；第五组：金银溶胶标记盐酸多巴胺（DOPH）抗体，检测线为DOPH－载体蛋白结合抗原；第六组：金银溶胶标记西马特罗（CIM）抗体，检测线为CIM－载体蛋白结合抗原；第七组：金银溶胶标记硫酸特布他林（TERS）抗体，检测线为TERS－载体蛋白结合抗原；第八组：金银溶胶标记苯乙醇胺A（PHEA）抗体，检测线为PHEA－载体蛋白结合抗原；第九组：金银溶胶标记班布特罗BAM抗体，检测线为BAM－载体蛋白结合抗原；第十组：金银溶胶标记盐酸齐帕特罗（ZILH）抗体，检测线为ZILH－载体蛋白结合抗原；第十一组：金银溶胶标记盐酸氯丙那林（CLOH）抗体，检测线为CLOH－载体蛋白结合抗原；第十二组：金银溶胶标记马布特罗MAB抗体，检测线为MAB－载体蛋白结合抗原；第十三组：金银溶胶标记西布特罗CIM抗体，检测线为CIM－载体蛋白结合抗原；第十四组：金银溶胶标记溴布特罗（BRO）抗体，检测线为BRO－载体蛋白结合抗原；第十五组：金银溶胶标记酒石酸阿福特罗（ARF）抗体，检测线为ARF－载体蛋白结合抗原；第十六组：金银溶胶标记富马酸福莫特罗（FOR）抗体，检测线为FOR－载体蛋白结合抗原；采用其中的任意一组、二组、三组、四组、五组、六组、七组、八组、九组、十组、十一组、十二组、十三组、十四组、十五组或十六组，分别组成单组分残留检测试纸卡、双组分残留联检试纸卡、三组分残留联检试纸卡、四组分残留联检试纸卡、五组分残留联检试纸卡、六组分残留联检试纸卡、七组分残留联检试纸卡、八组分残留联检试纸卡、九组分残留联检试纸卡、十组分残留联检试纸卡、十一组分残留联检试纸卡、十二组分残留联检试纸卡、十三组分残留联检试纸卡、十四组分残留联检试纸卡、十五组分残留联检试纸卡或全组分残留联检试纸卡。
所述对照线由羊抗或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG或兔抗载体蛋白IgG抗体包被在硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或梭化纤维素膜上制成。
所述吸水垫由吸水滤纸、海绵或无纺布制成；所述样品垫由玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；所述层析膜采用尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜制成；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或人血清白蛋白。
所述的瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备及其应用，采用以下步骤：
（1）标记物结合垫的制备；
（2）检测线的制备；
（3）对照线的制备；
（4）瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备；
（5）该试纸卡应用于瘦肉精全组分残留的联检。
根据（1）标记物结合垫的制备，方法为：
1）胶体金的制备：将0.1 mg氯金酸加入到3mL 0.1 mol/L的CTAB溶液中，快速加入60 μL 10 mmol·L-1冰点－硼氢酸钠溶液，搅拌1h后，稀释10倍，制得纳米Au种子；将63 mg氯金酸加入到120 mL 0.1 mol/L的CTAB溶液中，滴加0.1 mol·L-1 抗坏血酸至无色，再加入制得的Au种子5滴，静置2 h，以5000rpm速度离心15min，用去离子水洗涤，反复两次，加入40mL去离子水，制得胶体金；
2）胶体银的制备：将77.4 mg AgNO3溶于70 mL去离子水中，加入111 mg PVP，溶解后，加热至沸腾，加入5 mL 10 %（w/w）柠檬酸钠溶液，立即停止加热，溶液变为淡绿色，冷却至室温后，以5000rpm速度离心15min，用去离子水洗涤，反复两次，加入40 mL去离子水，制得胶体银；
3）胶体金银合金的制备：将63 mg氯金酸和77.4 mg AgNO3溶于140 mL去离子水中，加入222 mg PVP，溶解后，加热至沸腾，加入10 mL 10 %（w/w）柠檬酸钠溶液，立即停止加热，溶液变为亮黄色，冷却至室温后，以5000rpm速度离心15min，用去离子水洗涤，反复两次，加入40 mL去离子水，制得胶体金银合金；
4）金银溶胶标抗体的制备：将上述1）~3）中的任意一种胶体作为金银溶胶，利用磷酸盐缓冲溶液将pH值调至8.5~9.5，按照1:2000的标记比将任意一种待标记的瘦肉精抗体加入到pH值为8.5~9.5的金银溶胶中，标记8min后，加入20%的PEG10000至最终浓度为0.05%，4℃下1300~1800rpm速度离心20min，除去未标记的金银溶胶颗粒，再在4℃下12000~15000rpm速度离心20min，弃去上清液，获得的初步纯化的金银溶胶标抗体蛋白，最后用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，分别制得胶体金标抗体、胶体银标抗体或胶体金银合金标抗体的金银溶胶标抗体；
5）标记物结合垫的制备：将1:100~500稀释的金银溶胶标抗体吸附于玻璃纤维棉中，4℃下真空干燥，制得标记物结合垫。
根据（2）检测线的制备，方法为：
1）瘦肉精－载体蛋白结合抗原的制备：在4℃下，将10~30mg的任意一种瘦肉精溶于2~4mL、0.1mol/L的稀盐酸溶液中，搅拌下滴加浓度为10%的NaNO2溶液，反应2~4h，得到反应液；再称取5~15mg载体蛋白溶于1~3mL磷酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢加入到所述反应液中，调节pH8.5~9.5，0~4℃搅拌；12h后收集反应液与透析袋中，在4℃下，用磷酸盐缓冲溶液透析3~5天，每天更换透析液2~3次，最后得到所述瘦肉精－载体蛋白结合抗原；
2）检测线的制备：将1:100~500稀释的任意一种瘦肉精－载体蛋白结合抗原吸附于硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或梭化纤维素膜上，4℃下真空干燥，制得检测线。
根据（3）对照线的制备，方法为：将1:100~500稀释的羊抗或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG或兔抗载体蛋白IgG抗体吸附于硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或梭化纤维素膜上，4℃下真空干燥，制得对照线。
根据（4）瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备，方法为：将样品垫、标记物结合垫、层析膜和吸水垫依次粘贴到衬板上制成试纸芯，所述层析膜上加载同心圆形状的内圆弧检测线（隐形）和外圆弧对照线（隐形）；将制成的试纸芯安装在底座的固定槽中，最后和面板嵌合在一起，即制成试纸卡。
根据（5）该试纸卡应用于瘦肉精全组分残留的联检，方法为：将试纸卡平放，从加样孔滴加待检测样品，1 – 5 min内从显示窗对检测结果进行判定；所述判定的方法为：如果一组检测线和对照线中，只有对照线显色，表示该组检测线对应的瘦肉精组分检测结果为阳性，说明在待测样品中含有该瘦肉精组分；如果检测线和对照线均显色时，表示该组检测线对应的瘦肉精组分检测结果为阴性，说明在待测样品中不含该瘦肉精组分；如果对照线不显色，表明试纸卡已失效，说明无论检测线是否显色，检测结果均无效。
本发明的积极有益成果：
①本发明所制备的试纸卡具有特异性强，敏感性高的优点，最低检出限可达到lppb，符合我国瘦肉精的限量检测要求；
②本发明所制备的试纸卡实现了瘦肉精全组分残留的同时检测，用同一试纸卡一次加样，即可同时检测多组分或全组分瘦肉精残留物，既实现了高通量检测、大大节省了检测时间，又降低了检测成本；
③本发明所制备的试纸卡实现了瘦肉精全组分残留的快速检测，在不需要其它额外试剂和仪器的情况下，现场检测在2~5min内即可判定检测结果，简捷、快速；
④本发明所制备的试纸卡呈圆盘状，检测样品滴加后扩散均匀快速，完全克服了长条状检测试纸样品需要量大、扩散不均匀的缺点，从而极大地降低了多组分检测的误差，准确性显著提高；
⑤本发明所制备的试纸卡以红色、蓝色或黄色圆弧形线条显示检测结果，判定依据形象、直观，简单、明了，不易出现人为误判；
⑥本发明所制备的试纸卡采用金银溶胶，大大节省了检测费用，适用范围广，使用本试纸卡比用仪器分析和常规单项检测试纸条的费用大幅下降；
⑦本发明所制备的试纸卡适用范围广，可满足不同层次人员的需要，包括专业检验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、加工企业和养殖场户等，可实现对非法添加瘦肉精的有效检测，保障食品安全，便于推广应用。
附图说明
图1、试纸芯侧视剖面结构示意图；
图2、单组分残留检测试纸芯俯视结构示意图；
图3、单组分残留检测试纸卡面板俯视结构示意图；
图4、试纸卡底座结构示意图；
图5、四组分残留联检试纸芯俯视结构示意图；
图6、四组分残留联检试纸卡面板构造俯视图；
图7、八组分残留联检试纸芯俯视结构示意图；
图8、八组分残留联检试纸卡面板构造俯视图；
图9、全组分残留联检试纸芯俯视结构示意图；
图10、全组分残留联检试纸卡面板构造俯视图；
图中，1：衬板；2：吸水垫；3：层析膜；4：标记物结合垫；5：样品垫；6：对照线；7：检测线；8：加样孔；9：显示窗；10：面板；11：底座；12：固定槽。
具体实施方式
在制备瘦肉精全组分残留联检试纸卡时，需要先制备标记物结合垫、检测线和对照线，进而制备试纸芯，将制成的试纸芯安装在底座的固定槽中，最后和面板嵌合在一起，即制成试纸卡。
实施例一：标记物结合垫的制备，以吸附有胶体金标记的莱克多巴胺（RAC）抗体的标记物结合垫制备方法为例：
（1）胶体金的制备：将0.1 mg氯金酸加入到3mL 0.1 mol/L的CTAB溶液中，快速加入60μL 10 mmol·L-1冰点－硼氢酸钠溶液，搅拌1h后，稀释10倍，制得纳米Au种子；将63 mg氯金酸加入到120 mL 0.1 mol/L的CTAB溶液中，滴加0.1 mol·L-1 抗坏血酸至无色，再加入制得的Au种子5滴，静置2 h，以5000rpm速度离心15min，用去离子水洗涤，反复两次，加入40mL去离子水，制得胶体金；
（2）将上述胶体金作为金银溶胶，利用磷酸盐缓冲溶液将pH值调至8.5~9.5，按照1:2000的标记比将任意一种待标记的RAC抗体加入到pH值为8.5~9.5的金银溶胶中，标记8min后，加入20%的PEG10000至最终浓度为0.05%，4℃下1300~1800rpm速度离心20min，除去未标记的胶体金颗粒，再在4℃下12000~15000rpm速度离心20min，弃去上清液，获得的初步纯化的胶体金标抗体蛋白，最后用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，制得胶体金标记的RAC抗体；
（3）标记物结合垫的制备：将1 : 100稀释的胶体金标记的RAC抗体吸附于玻璃纤维棉中，4℃下真空干燥，制得标记物结合垫。
同法，分别用其他15种瘦肉精组分代替RAC，分别制得吸附有胶体金标记的瘦肉精各组分抗体的标记物结合垫。
实施例二：标记物结合垫的制备，以吸附有胶体银标记的克伦特罗（CL）抗体的标记物结合垫制备方法为例：
（1）胶体银的制备：将77.4 mg AgNO3溶于70 mL去离子水中，加入111 mg PVP，溶解后，加热至沸腾，加入5 mL 10 %（w/w）柠檬酸钠溶液，立即停止加热，溶液变为淡绿色，冷却至室温后，以5000rpm速度离心15min，用去离子水洗涤，反复两次，加入40 mL去离子水，制得胶体银；
（2）将上述胶体银作为金银溶胶，利用磷酸盐缓冲溶液将pH值调至8.5~9.5，按照1:2000的标记比将任意一种待标记的CL抗体加入到pH值为8.5~9.5的金银溶胶中，标记8min后，加入20%的PEG10000至最终浓度为0.05%，4℃下1300~1800rpm速度离心20min，除去未标记的胶体银颗粒，再在4℃下12000~15000rpm速度离心20min，弃去上清液，获得的初步纯化的胶体银标抗体蛋白，最后用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，制得胶体银标记的CL抗体；
（3）标记物结合垫的制备：将1 : 300稀释的胶体银标记的CL抗体吸附于玻璃纤维棉中，4℃下真空干燥，制得标记物结合垫。
同法，分别用其他15种瘦肉精组分代替CL，分别制得吸附有胶体银标记的瘦肉精各组分抗体的标记物结合垫。
实施例三：标记物结合垫的制备，以吸附有胶体金银合金标记的沙丁胺醇（SAL）抗体的标记物结合垫制备方法为例：
（1）胶体金银合金的制备：将63 mg氯金酸和77.4 mg AgNO3溶于140 mL去离子水中，加入222 mg PVP，溶解后，加热至沸腾，加入10 mL 10 %（w/w）柠檬酸钠溶液，立即停止加热，溶液变为亮黄色，冷却至室温后，以5000rpm速度离心15min，用去离子水洗涤，反复两次，加入40 mL去离子水，制得胶体金银合金；
（2）将上述胶体金银合金作为金银溶胶，利用磷酸盐缓冲溶液将pH值调至8.5~9.5，按照1:2000的标记比将任意一种待标记的SAL抗体加入到pH值为8.5~9.5的金银溶胶中，标记8min后，加入20%的PEG10000至最终浓度为0.05%，4℃下1300~1800rpm速度离心20min，除去未标记的胶体金银合金颗粒，再在4℃下12000~15000rpm速度离心20min，弃去上清液，获得的初步纯化的胶体金银合金标抗体蛋白，最后用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，制得胶体金银合金标记的SAL抗体；
（3）标记物结合垫的制备：将1 : 500稀释的胶体金银合金标记的SAL抗体吸附于玻璃纤维棉中，4℃下真空干燥，制得标记物结合垫；
同法，分别用其他15种瘦肉精组分代替SAL，分别制得吸附有胶体金银合金标记的瘦肉精各组分抗体的标记物结合垫。
实施例四：检测线的制备，以莱克多巴胺（RAC）－牛血清白蛋白结合抗原为例：
（1）RAC－牛血清白蛋白结合抗原的制备：在4℃下，将10 mg的RAC溶于2 mL、0.1mol/L的稀盐酸溶液中，搅拌下滴加浓度为10%的NaNO2溶液，反应2~4h，得到反应液；再称取5 mg牛血清白蛋白溶于1 mL磷酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢加入到所述反应液中，调节pH8.5~9.5，0~4℃搅拌；12h后收集反应液与透析袋中，在4℃下，用磷酸盐缓冲溶液透析3~5天，每天更换透析液2~3次，最后得到所述RAC－牛血清白蛋白结合抗原；
同法，将牛血清白蛋白换为鸡卵清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或人血清白蛋白，分别制得RAC－鸡卵清白蛋白、RAC－钥孔血蓝蛋白或RAC－人血清白蛋白；分别用其他15种瘦肉精组分代替RAC，分别制得相应的瘦肉精－载体蛋白结合抗原；
（2）检测线的制备：将1 : 100稀释的任意一种瘦肉精－载体蛋白结合抗原吸附于硝酸纤维素膜上，4℃下真空干燥，制得检测线。
实施例五：检测线的制备，以克伦特罗（CL）－鸡卵清白蛋白结合抗原为例：
（1）CL－鸡卵清白蛋白结合抗原的制备：在4℃下，将20 mg的CL溶于3 mL、0.1mol/L的稀盐酸溶液中，搅拌下滴加浓度为10%的NaNO2溶液，反应2~4h，得到反应液；再称取10 mg鸡卵清白蛋白溶于2 mL磷酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢加入到所述反应液中，调节pH8.5~9.5，0~4℃搅拌；12h后收集反应液与透析袋中，在4℃下，用磷酸盐缓冲溶液透析3~5天，每天更换透析液2~3次，最后得到所述CL－鸡卵清白蛋白结合抗原；
同法，将鸡卵清白蛋白换为牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或人血清白蛋白，分别制得CL－牛血清白蛋白、CL－钥孔血蓝蛋白或CL－人血清白蛋白；分别用其他15种瘦肉精组分代替CL，分别制得相应的瘦肉精－载体蛋白结合抗原；
（2）检测线的制备：将1 : 300稀释的任意一种瘦肉精－载体蛋白结合抗原吸附于纯纤维素膜上，4℃下真空干燥，制得检测线。
实施例六：检测线的制备，以沙丁胺醇（SAL）－人血清白蛋白结合抗原为例：
（1）SAL－人血清白蛋白结合抗原的制备：在4℃下，将30 mg的CL溶于4 mL、0.1mol/L的稀盐酸溶液中，搅拌下滴加浓度为10%的NaNO2溶液，反应2~4h，得到反应液；再称取15 mg人血清白蛋白溶于3 mL磷酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢加入到所述反应液中，调节pH8.5~9.5，0~4℃搅拌；12h后收集反应液与透析袋中，在4℃下，用磷酸盐缓冲溶液透析3~5天，每天更换透析液2~3次，最后得到所述SAL－人血清白蛋白结合抗原；
同法，将人血清白蛋白换为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白，分别制得SAL－牛血清白蛋白、SAL－鸡卵清白蛋白或SAL－钥孔血蓝蛋白；分别用其他15种瘦肉精组分代替SAL，分别制得相应的瘦肉精－载体蛋白结合抗原；
（2）检测线的制备：将1 : 500稀释的任意一种瘦肉精－载体蛋白结合抗原吸附于梭化纤维素膜上，4℃下真空干燥，制得检测线。
实施例七：对照线的制备：将1 : 100稀释的羊抗小鼠IgG抗体吸附于硝酸纤维素膜上，4℃下真空干燥，制得对照线。
实施例八：对照线的制备：将1 : 300稀释的兔抗小鼠IgG吸附于纯纤维素膜上，4℃下真空干燥，制得对照线。
实施例九：对照线的制备：将1 : 500稀释的羊抗兔IgG抗体吸附于梭化纤维素膜上，4℃下真空干燥，制得对照线。
实施例十：对照线的制备：将1 : 300稀释的兔抗载体蛋白IgG抗体吸附于硝酸纤维素膜上，4℃下真空干燥，制得对照线。
实施例十一：一种瘦肉精单组分残留检测试纸卡（以莱克多巴胺单组分残留检测试纸卡为例，如图1 - 4所示）
（1）试纸芯的制备：将样品垫5、标记物结合垫4、层析膜3和吸水垫2依次粘贴到衬板上1制成试纸芯，其各部分具体构造为：样品垫5由玻璃纤维棉制成；标记物结合垫4为吸附有胶体银标莱克多巴胺（RAC）抗体的玻璃纤维棉；层析膜3由硝酸纤维素膜制成，其上用RAC－载体蛋白结合抗原制备圆弧形检测线7（隐形），沿圆心向外用兔抗载体蛋白IgG抗体制备圆弧形对照线6（隐形），载体蛋白均为牛血清白蛋白，对照线采用硝酸纤维素膜制成；吸水垫2用吸水滤纸制成；衬板1用硬质塑胶条制成。
（2）试纸卡的制备：将试纸芯安装在底座11的固定槽12中，最后和面板10嵌合在一起，即制成试纸卡，试纸卡面板上设有加样孔8和显示窗9，显示窗旁边设有T和C标识。
（3）样品的检测：选猪尿为检测样品，具体步骤如下：
1）检测样品处理：无需特殊处理，如过于浑浊，静置后离心取上清即可；
2）操作具体方法：将试纸卡平放，从加样孔滴加待检测样品，1 – 5 min内从显示窗判定检测结果；
3）检测结果判定：如果只有在C位置隐形对照线处显示蓝色圆弧线，表示RAC检测结果为阳性，说明在待测样品中含有RAC；如果在T和C位置显示两条蓝色圆弧线时，表示RAC检测结果为阴性，说明在待测样品中不含RAC；如果在C位置没有蓝色圆弧线显示，表明试纸卡已失效，说明无论在T位置是否有蓝色圆弧线，检测结果均无效。
实施例十二：一种瘦肉精四组分残留联检试纸卡（以莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇四组分残留联检试纸卡为例，如图5 - 6所示）
（1）试纸芯的制备：与实施例十一基本相同，不同之处在于：样品垫由尼龙膜制成；标记物结合垫为吸附有胶体金标记的莱克多巴胺（RAC）抗体、胶体金标记的克伦特罗（CL）抗体、胶体金标记的沙丁胺醇（SAL）抗体、胶体金标记的硫酸沙丁胺醇（SALS）抗体的玻璃纤维棉；层析膜由尼龙膜制成，其上分别用RAC－载体蛋白结合抗原、CL－载体蛋白结合抗原、SAL－载体蛋白结合抗原、SALS－载体蛋白结合抗原沿同一圆形制备四条圆弧形检测线（隐形），沿圆心向外用羊抗兔IgG抗体制备对应的圆弧形对照线（隐形），载体蛋白均为人血清白蛋白，对照线采用纯纤维素膜制成；吸水垫用无纺布制成。
（2）试纸卡的制备：与实施例十一基本相同，不同之处在于：显示窗旁边设有T1、T2、T3、T4和C1、C2、C3、C4标识。
（3）样品的检测：与实施例十一基本相同，不同之处在于检测结果判定：划分T1和C1、T2和C2、T3和C3、T4和C4四个小组，如果任一小组中只有C位置显示红色圆弧线时，表示该小组对应的瘦肉精组分检测结果为阳性，说明在待测样品中含有该组分；如果任一小组中T和C位置同时显示两条红色圆弧线时，表示该小组对应的瘦肉精组分检测结果为阴性，说明在待测样品中不含该组分；无论哪个小组如果在C位置没有红色圆弧线显示，表明该部分试纸卡已失效，该小组对应的检测结果无效。
实施例十三：一种瘦肉精八组分残留联检试纸卡（以莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、盐酸多巴胺、西马特罗、硫酸特布他林、苯乙醇胺A八组分残留联检试纸卡为例，如图7 - 8所示）
（1）试纸芯的制备：与实施例十二基本相同，不同之处在于：样品垫由聚偏二氟乙烯膜制成；标记物结合垫为吸附有胶体金银合计标记的莱克多巴胺（RAC）抗体、胶体金银合计标记的克伦特罗（CL）抗体、胶体金银合计标记的沙丁胺醇（SAL）抗体、胶体金银合计标记的硫酸沙丁胺醇（SALS）抗体、胶体金银合计标记的盐酸多巴胺（DOPH）、胶体金银合计标记的西马特罗（CIM）抗体、胶体金银合计标记的硫酸特布他林（TERS）抗体、胶体金银合计标记的苯乙醇胺A（PHEA）抗体的玻璃纤维棉；层析膜由聚偏二氟乙烯膜制成，其上分别用RAC－载体蛋白结合抗原、CL－载体蛋白结合抗原、SAL－载体蛋白结合抗原、SALS－载体蛋白结合抗原、DOPH－载体蛋白结合抗原、CIM－载体蛋白结合抗原、TERS－载体蛋白结合抗原、PHEA－载体蛋白结合抗原沿同一圆形制备八条圆弧形检测线（隐形），沿圆心向外用兔抗小鼠IgG抗体制备对应的圆弧形对照线（隐形），载体蛋白均为鸡卵清白蛋白，对照线采用梭化纤维素膜制成；吸水垫用海绵制成。
（2）试纸卡的制备：与实施例十二基本相同，不同之处在于：显示窗旁边设有T1、T2、……、T7、T8和C1、C2、……、C7、C8标识。
（3）样品的检测：与实施例十二基本相同，不同之处在于划分T1和C1、T2和C2、……、T7和C7、T8和C8八个小组，检测线和对照线显色颜色为黄色。
实施例十四：一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡（如图9 - 10所示）
（1）试纸芯的制备：与实施例十二基本相同，不同之处在于：样品垫由聚酯膜制成；标记物结合垫为吸附有胶体金分别标记的瘦肉精全部十六种组分抗体的玻璃纤维棉；层析膜由醋酸纤维素膜制成，其上分别用瘦肉精全部十六种组分－载体蛋白结合抗原沿同一圆形制备十六条圆弧形检测线（隐形），沿圆心向外用羊抗小鼠IgG抗体制备对应的圆弧形对照线（隐形），载体蛋白均为钥孔血蓝蛋白，对照线采用硝酸纤维素膜制成；吸水垫用吸水滤纸制成。
（2）试纸卡的制备：与实施例十二基本相同，不同之处在于：显示窗旁边设有T1、T2、……、T15、T16和C1、C2、……、C15、C16标识。
（3）样品的检测：与实施例十二基本相同，不同之处在于划分T1和C1、T2和C2、……、T15和C15、T16和C16十六个小组。
实施例十四：一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡，采用上述实施例所制备的试纸卡检测瘦肉精，检测的技术指标如表1所示。
表1本发明所制备的试纸卡检测16种瘦肉精的技术指标
。

Claims (10)

1.一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡，其特征在于试纸卡呈圆盘状，所述圆盘状试纸卡由塑料支撑装置和试纸芯组成，所述塑料支撑装置包括底座和面板，所述底座上设有安装试纸芯的固定槽，固定槽上设置有面板，所述面板上设有加样孔和结果显示窗，所述面板与固定槽之间设有不吸水硬质塑胶条材质的衬板，所述衬板上粘结有试纸芯，所述试纸芯由样品垫、标记物结合垫、层析膜和吸水垫组成，排布方式是以样品垫为圆形中心向外周依次排列标记物结合垫、层析膜和吸水垫，所述层析膜上设有检测线和对照线，排布方式是检测线和对照线沿层析膜呈同心圆形状的圆弧形排列。
2.根据权利要求1所述的一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡，其特征是：所述标记物结合垫为吸附有1-16种混合金银溶胶标抗体的玻璃纤维棉，所述金银溶胶标抗体由金银溶胶标记的抗瘦肉精的抗体制成，所述金银溶胶为胶体金、胶体银或胶体金银合金。
3.根据权利要求1所述的一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡，其特征是：所述检测线由1-16条瘦肉精－载体蛋白结合抗原包被在硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或梭化纤维素膜上制成，所述瘦肉精－载体蛋白结合抗原与标记物结合垫上所吸附的瘦肉精抗体相对应，分为十六组：第一组：金银溶胶标记莱克多巴胺（RAC）抗体，检测线为RAC－载体蛋白结合抗原；第二组：金银溶胶标记克伦特罗（CL）抗体，检测线为CL－载体蛋白结合抗原；第三组：金银溶胶标记沙丁胺醇（SAL）抗体，检测线为SAL－载体蛋白结合抗原；第四组：金银溶胶标记硫酸沙丁胺醇（SALS）抗体，检测线为SALS－载体蛋白结合抗原；第五组：金银溶胶标记盐酸多巴胺（DOPH）抗体，检测线为DOPH－载体蛋白结合抗原；第六组：金银溶胶标记西马特罗（CIM）抗体，检测线为CIM－载体蛋白结合抗原；第七组：金银溶胶标记硫酸特布他林（TERS）抗体，检测线为TERS－载体蛋白结合抗原；第八组：金银溶胶标记苯乙醇胺A（PHEA）抗体，检测线为PHEA－载体蛋白结合抗原；第九组：金银溶胶标记班布特罗BAM抗体，检测线为BAM－载体蛋白结合抗原；第十组：金银溶胶标记盐酸齐帕特罗（ZILH）抗体，检测线为ZILH－载体蛋白结合抗原；第十一组：金银溶胶标记盐酸氯丙那林（CLOH）抗体，检测线为CLOH－载体蛋白结合抗原；第十二组：金银溶胶标记马布特罗MAB抗体，检测线为MAB－载体蛋白结合抗原；第十三组：金银溶胶标记西布特罗CIM抗体，检测线为CIM－载体蛋白结合抗原；第十四组：金银溶胶标记溴布特罗（BRO）抗体，检测线为BRO－载体蛋白结合抗原；第十五组：金银溶胶标记酒石酸阿福特罗（ARF）抗体，检测线为ARF－载体蛋白结合抗原；第十六组：金银溶胶标记富马酸福莫特罗（FOR）抗体，检测线为FOR－载体蛋白结合抗原；采用其中的任意一组、二组、三组、四组、五组、六组、七组、八组、九组、十组、十一组、十二组、十三组、十四组、十五组或十六组，分别组成单组分残留检测试纸卡、双组分残留联检试纸卡、三组分残留联检试纸卡、四组分残留联检试纸卡、五组分残留联检试纸卡、六组分残留联检试纸卡、七组分残留联检试纸卡、八组分残留联检试纸卡、九组分残留联检试纸卡、十组分残留联检试纸卡、十一组分残留联检试纸卡、十二组分残留联检试纸卡、十三组分残留联检试纸卡、十四组分残留联检试纸卡、十五组分残留联检试纸卡或全组分残留联检试纸卡。
4.根据权利要求1所述的一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡，其特征是：所述对照线由羊抗或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG或兔抗载体蛋白IgG抗体包被在硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或梭化纤维素膜上制成；所述吸水垫由吸水滤纸、海绵或无纺布制成；所述样品垫由玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；所述层析膜采用尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜制成；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、钥孔血蓝蛋白或人血清白蛋白。
5.根据权利要求1所述的一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备，其特征是采用以下步骤：
（1）标记物结合垫的制备；
（2）检测线的制备；
（3）对照线的制备；
（4）瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备。
6.根据权利要求5所述的一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备，其特征是所述标记物结合垫的制备方法为：
（1）胶体金的制备：将0.1 mg氯金酸加入到3mL 0.1 mol/L的CTAB溶液中，快速加入60μL 10 mmol·L-1冰点－硼氢酸钠溶液，搅拌1h后，稀释10倍，制得纳米Au种子；将63 mg氯金酸加入到120 mL 0.1 mol/L的CTAB溶液中，滴加0.1 mol·L-1 抗坏血酸至无色，再加入制得的Au种子5滴，静置2 h，以5000rpm速度离心15min，用去离子水洗涤，反复两次，加入40mL去离子水，制得胶体金；
（2）胶体银的制备：将77.4 mg AgNO3溶于70 mL去离子水中，加入111 mg PVP，溶解后，加热至沸腾，加入5 mL 10 %（w/w）柠檬酸钠溶液，立即停止加热，溶液变为淡绿色，冷却至室温后，以5000rpm速度离心15min，用去离子水洗涤，反复两次，加入40 mL去离子水，制得胶体银；
（3）胶体金银合金的制备：将63 mg氯金酸和77.4 mg AgNO3溶于140 mL去离子水中，加入222 mg PVP，溶解后，加热至沸腾，加入10 mL 10 %（w/w）柠檬酸钠溶液，立即停止加热，溶液变为亮黄色，冷却至室温后，以5000rpm速度离心15min，用去离子水洗涤，反复两次，加入40 mL去离子水，制得胶体金银合金；
（4）金银溶胶标抗体的制备：将上述1）~3）中的任意一种胶体作为金银溶胶，利用磷酸盐缓冲溶液将pH值调至8.5~9.5，按照1:2000的标记比将任意一种待标记的瘦肉精抗体加入到pH值为8.5~9.5的金银溶胶中，标记8min后，加入20%的PEG10000至最终浓度为0.05%，4℃下1300~1800rpm速度离心20min，除去未标记的金银溶胶颗粒，再在4℃下12000~15000rpm速度离心20min，弃去上清液，获得的初步纯化的金银溶胶标抗体蛋白，最后用丙烯葡聚糖S-400柱层析进行分离纯化，分别制得胶体金标抗体、胶体银标抗体或胶体金银合金标抗体的金银溶胶标抗体；
（5）标记物结合垫的制备：将1:100~500稀释的金银溶胶标抗体吸附于玻璃纤维棉中，4℃下真空干燥，制得标记物结合垫。
7.根据权利要求5所述的一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备，其特征是所述检测线的制备方法为：
（1）瘦肉精－载体蛋白结合抗原的制备：在4℃下，将10~30mg的任意一种瘦肉精溶于2~4mL、0.1mol/L的稀盐酸溶液中，搅拌下滴加浓度为10%的NaNO2溶液，反应2~4h，得到反应液；再称取5~15mg载体蛋白溶于1~3mL磷酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢加入到所述反应液中，调节pH8.5~9.5，0~4℃搅拌；12h后收集反应液与透析袋中，在4℃下，用磷酸盐缓冲溶液透析3~5天，每天更换透析液2~3次，最后得到所述瘦肉精－载体蛋白结合抗原；
（2）检测线的制备：将1:100~500稀释的任意一种瘦肉精－载体蛋白结合抗原吸附于硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或梭化纤维素膜上，4℃下真空干燥，制得检测线。
8.根据权利要求5所述的一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备，其特征是所述对照线的制备方法为：将1:100~500稀释的羊抗或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG或兔抗载体蛋白IgG抗体吸附于硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或梭化纤维素膜上，4℃下真空干燥，制得对照线。
9.根据权利要求5所述的一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备，其特征是所述瘦肉精全组分残留联检试纸卡的制备方法为：将样品垫、标记物结合垫、层析膜和吸水垫依次粘贴到衬板上制成试纸芯，所述层析膜上加载同心圆形状的内圆弧检测线（隐形）和外圆弧对照线（隐形）；将制成的试纸芯安装在底座的固定槽中，最后和面板嵌合在一起，即制成试纸卡。
10.根据权利要求1所述的一种瘦肉精全组分残留联检试纸卡应用于瘦肉精全组分残留的联检，其特征是方法为：将试纸卡平放，从加样孔滴加待检测样品，1 – 5 min内从显示窗对检测结果进行判定；所述判定的方法为：如果一组检测线和对照线中，只有对照线显色，表示该组检测线对应的瘦肉精组分检测结果为阳性，说明在待测样品中含有该瘦肉精组分；如果检测线和对照线均显色时，表示该组检测线对应的瘦肉精组分检测结果为阴性，说明在待测样品中不含该瘦肉精组分；如果对照线不显色，表明试纸卡已失效，说明无论检测线是否显色，检测结果均无效。
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