CN110470707A - 一种空心金银纳米球的早期脑卒中电化学定量检测试纸条 - Google Patents

Abstract

一种空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条,包括支持垫和试纸片,支持垫上表面一端固定有第一电极,另一端固定有与试纸片侧壁相连接的硝酸纤维素膜,试纸片和硝酸纤维素膜的端面上沿侧边均设有阻流板,试纸片位于阻流板内部的上表面和斜面上分别设有样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜位于阻流板内部的上表面设有检测线、吸水垫和质控线，硝酸纤维素膜位于阻流板外部的侧边上设有第二电极。本发明电化学信号发生明显变化，实现电化学强度检测的方法来进行浓度的评价，从而提高检测的准确性。具有成本低、快速、简便、敏感且可重复性好等优点。

Description

一种空心金银纳米球的早期脑卒中电化学定量检测试纸条

技术领域

本发明属于免疫传感器技术领域，涉及一种空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条。

背景技术

脑卒中（stroke）是一种器质性脑损伤导致的脑血管疾病，以突然发病、迅速出现局限性或弥散性脑功能缺损为共同临床特征，包括缺血性脑卒中（ischemic stroke）和出血性脑卒中（hemorrhagic stroke）。前者又称脑梗死(cerebral infarction, CI)，是卒中最常见类型，约占70-80 %；后者包括脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)及蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)。脑卒中是世界范围内第二大常见死亡原因，也是成人致残的第一位原因，2008年卫生部公布的全国第三次死因回顾抽样调查报告显示，脑卒中（136.64/10万）已超过恶性肿瘤（135.88/10万）成为中国第一致死病因。我国脑卒中发病率已居世界第一，且患者的数量逐年上升，每年因脑卒中致死人数逾200万，增长速率达8.7 %。其中，缺血性脑卒中占脑卒中比例的60-80 %，出血性脑卒中患者数量低于缺血性脑卒中患者，具有较高的致残率和较差的预后效果。脑卒中也是单病种致残率最高的疾病。同时，脑卒中患者年轻化趋势明显，具有高致死率、高致残率和高复发率的特点，严重危害人类健康和生命安全，给患者及家庭带来了沉重的负担和痛苦。脑卒中主要是在诸多危险因素长期、共同作用中发生的，这些主要危险因素包括脑卒中家族史、高血压病、糖尿病、血脂异常、房颤、吸烟、肥胖和缺乏运动。对体检人群、脑卒中高危人群进行普遍筛查，可以强化高危人群健康意识，降低我国脑血管病的发病率与死亡率，对预防脑卒中的发生具有重要的意义，有助于减轻个人、家庭及社会的经济负担。

随着神经影像诊断技术的发展、早期溶栓、血管内介入、卒中一级、二级预防等临床技术和理念的进步，促使脑卒中的诊疗有较大改进，较大程度改善了患者预后。但脑卒中的巨大危害仍提示脑卒中临床诊疗技术有巨大的发展空间。脑卒中的早期无明显症状，相应病程进展的生物学机制尚未完全明确，常规的手段难以诊断，是制约脑卒中预防和治疗的一个重要因素。因此，寻求稳定易测、特异性和敏感性均较高且能反映脑组织损伤及修复情况的血液生物标志物，使之应用于体检人群、脑卒中高危人群筛查、预警及对脑卒中患者的早期诊断、病情监测和疗效评估，对于脑卒中的防治将具有重要意义。

发明内容

本发明针对传统脑卒中检测中存在的问题提出一种新型的空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

一种空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条,包括支持垫和试纸片,所述支持垫上表面一端固定有第一电极,另一端固定有与试纸片侧壁相连接的硝酸纤维素膜, 所述试纸片和硝酸纤维素膜的端面上沿侧边均设有阻流板, 试纸片位于阻流板内部的上表面和斜面上分别设有样品垫和结合垫，所述硝酸纤维素膜位于阻流板内部的上表面设有检测线、吸水垫和质控线，硝酸纤维素膜位于阻流板外部的侧边上设有第二电极。试纸条包括支持垫以及试纸片、结合垫、硝酸纤维素膜，所述结合垫装载有免疫空心金银纳米球，所述免疫空心金银纳米球以金纳米颗粒为标记物，所述空心金银纳米球分别与信号分子和抗体偶联形成抗待测物的免疫空心金银纳米球；所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和一条质控线，所述检测线包被有待测的生物标志物，质控线包被有兔抗鼠IgG抗体。试纸条还包括吸水纸，试纸片、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在支持垫上，两两之间相互交错重叠2mm。

作为优选，所述吸水垫的底部开设有与内部相接呈矩阵的通孔，通孔与硝酸纤维素膜下方支持垫开设的槽孔相通，支持垫的槽孔内部固定的集液柱，所述纸基电极的两端通过控制线穿过阻流板与检测线电性连接。

作为优选，所述第一电极和第二电极为通过丝网印刷方法制备得到的纸基电极。第一电极和第二电极均包括一个工作电极、一个参比电极和一个对电极，或者包括个工作电极和一个组合式参比电极、对电极。

作为优选，所述硝酸纤维素膜和结合垫上分别修饰有空心金银纳米球探针溶液，检测线上分布有对应的抗体。

上述的空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条在制备脑卒中疾病检测装置中的应用。待测脑卒中标志物可以是蛋白标志物或者炎症因子，DNA，RNA等。生物结合反应是抗原-抗体的免疫反应，DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA杂交反应和配体-受体反应。电化学方法是安培法，计时安培法，电量法，计时电量法，线性伏安法，循环伏安法；此外，检测线可以设置一条或者多条，可根据实际要求自由设定。

制备上述可定量检测血液中脑卒中标志物的免疫层析试纸条的方法，包括如下步骤：

（1）将空心金银纳米球经过预处理后，分别与信号分子检测抗体偶联，制备得到抗体免疫空心金银纳米球；

（2）将试纸片用试纸片处理液浸泡，将结合垫用结合垫处理液浸泡，烘干；

（3）将步骤（1）得到的抗体免疫空心金银纳米球喷涂在步骤（2）处理过的结合垫上，烘干；

（4）在硝酸纤维素膜上包被一条检测线和一条质控线，其中检测线包被检测抗体，质控线包被有兔抗鼠IgG抗体；

（5）将步骤（2）所述的试纸片、步骤（3）所述的结合垫和步骤（4）所述的硝酸纤维素膜以及吸水纸部分重叠，组装。

（6）将纸基电极劲贴在相应位置。

所述步骤（1）中的空心金银纳米球；步骤（1）具体操作步骤为：使用信号分子与空心金银双金属偶联，加入EDC和NHS活化，EDC、NHS与空心金银双金属的摩尔比为2:2:1-5:5:1，室温活化30 min；活化结束后，使用含PBS的溶液洗涤空心金银纳米球，加入检测抗体，室温反应1 h，然后用1 wt% BSA、pH=7.4的PBS溶液37 ℃封闭30 min；封闭结束后，用PBS溶液重新分散空心金银纳米球，4 ℃保存备用。所述步骤（2）中试纸片处理液为0.005 M且pH 为7.4-9.0的硼酸-硼砂缓冲液：2 wt% 氯化钠、2 wt% 曲拉通X-100、0.5 wt%牛血清白蛋白及0.5 wt%聚乙烯吡咯烷酮。所述步骤（2）中结合垫处理液为0.005 M 且pH为7.4- 9.0的硼酸-硼砂缓冲液：5 wt%-10 wt% 蔗糖、2 wt% 海藻糖、0.05 wt%曲拉通X-100。所述步骤（3）的喷涂方法为将制备好的抗体免疫空心金银纳米球使用定量喷膜装置或微量移液器以30μL/cm的量均匀涂于结合垫上，然后置于25-37 ℃烘箱中干燥后加入干燥剂封存备用。所述步骤（4）具体操作如下：使用抗体稀释液分别将抗体和兔抗鼠多克隆IgG抗体的浓度调整至0.5-2 mg/mL，然后将两者用划膜仪以1 μL/cm的量将上述抗体和IgG抗体以0.5 cm的间隔均匀一致地喷印于硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质控线，晾干后加入干燥剂封存备用。所述抗体稀释液为含有1 wt%-2 wt%蔗糖的0.01 M，pH为7.2- 7.6的磷酸盐缓冲液；所述步骤（4）具体操作为：将抗体分别稀释为1.5 mg/mL，将IgG抗体稀释为0.5 mg/mL，使用划膜仪以1 μL/cm的量将四者以0.5 cm的间隔均匀一致地喷印于硝酸纤维素膜上，室温晾干，加入干燥剂封存，4 ℃保存备用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

（1）本发明电化学信号发生明显变化，实现电化学强度检测的方法来进行浓度的评价，从而提高检测的准确性。

（2）本发明有效利用了纳米材料的特性，利用电化学进行检测，极大地降低了检测成本，本发明具有成本低、快速、简便、敏感且可重复性好等优点。基于表面修饰纳米探针，产生电化学信号变化，可实现对不同抗原浓度的评价。

（3）该免疫传感器可以在验血时达到准确测定的目的。该传感器制备方法简单、成本低、灵敏度高、稳定性好。

（4）检测只需要一步即可，检测步骤简单方便，不容易出错。

利用本发明的试纸条对血液中脑卒中标志物进行检测，在检测物双阳性的基础上，进一步判断脑卒中发生率及预后监测，以提高对脑卒中的发生早期确诊率及预后监测。在该检测试纸条中，将抗体分别共价偶联于纳米颗粒上，将与抗体的各自配对抗体分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测线，将兔抗鼠IgG抗体包被于硝酸纤维素膜上作为质控线，按照常规免疫层析法的方法进行标本的检测，再利用拉曼信号检测仪进行检测。本方法结合了电化学和免疫层析法的现有优点，既能实现标本中的显色反应，及微量待检物的检测，又大大缩短检测时间；即可实现单人份的检测，也可以进行批量标本检测；既能定性分析，又能利用电化学信号检测仪的检测即时得到定量结果。该试纸条制备工艺简单，操作性强，省时省力，方便实用。

附图说明

图1为本发明应用在电化学免疫传感器中同时检测两种脑卒中标志物结果；

图2为免疫传感器检测两种不同浓度抗原结果图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1

在本实施例中，所采用NSE和S100-β配对抗体均为单克隆抗体技术制备的单抗。利用双抗体夹心检测NSE和S100-β抗原的原理检测标本，当待测标本中含有NSE和S100-β抗原时，抗原分别会先和结合垫上的偶联NSE和S100-β抗体的空心金银双金属结合，随着层析的进行，结合物向前移动到达NSE和S100-β抗体检测线处，NSE和S100-β抗原会再次和包被抗体结合形成双抗体夹心复合物而聚集在检测线处，另外，未结合的偶联NSE和S100-β抗体的空心金银双金属会继续前行，到达质控线C处时，会和兔抗鼠IgG抗体结合，故在C处同样会出现空心金银双金属聚集。整个反应在5分钟内可进行完全，一般反应10分钟后即可置于拉曼信号检测仪中检测，检测线及质控线都会有相应的拉曼信号值。然后，将检测值带入拟合曲线中计算可得出定量结果。

可定量检测血液中NSE和S100-β的免疫层析试纸条的制备方法本实施例的试纸条的制备方法包括以下步骤：

1、免疫空心金银纳米球的制备：

1）将99 mL双蒸水煮沸加入300 μL的质量分数为1%的氯金酸溶液，搅拌5分钟，使其充分混匀，再加入900 μL质量分数为1%的柠檬酸三钠，继续搅拌加热，至溶液变为酒红色后停止加热，搅拌冷却，然后在4℃下保存备用。

2） 硼酸-硼砂（BS）封闭缓冲液的配制：用0.05 M硼砂和0.2 M硼酸以4:1（v:v）比例配制0.2 M pH=9.0的BS缓冲液，用超纯水稀释至0.005 M，加入BSA、吐温20，终浓度为1wt%、0.05 wt%，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后置4 ℃保存备用，有效期为一周。

3） 硼酸-硼砂（BS）保存缓冲液的配制：用0.05 M硼砂和0.2 M硼酸以4:1（v:v）比例配制0.2 M pH=9.0的BS缓冲液，用超纯水稀释至0.005 M，加入BSA、吐温20、NaN3，终浓度为1 wt%、0.05 wt%、0.05 wt%，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后置4 ℃保存备用，有效期为一周。

4）抗NSE和S100-β免疫空心金银纳米球的制备：使用PBS缓冲液洗涤空心金银双金属，EDC和NHS的加入量均为空心金银双金属羧基化程度摩尔量的2倍，室温反应30 min，使用PBS缓冲液洗涤空心金银双金属充分洗涤后，以20-40 μg anti-NSE和S100-β-mAb/mg空心金银双金属的量加入适量anti-NSE和S100-β-mAb，室温反应1-2小时，使用含1 wt% BSA的pH=7.4的PBS缓冲液洗涤空心金银双金属充分洗涤后，37 ℃封闭30分钟，最后，使用含0.05 wt% 吐温20、1 wt% BSA、0.05 % NaN3的0.005 M pH=9.0的BS缓冲液重悬空心金银双金属，4 ℃保存备用。

2、 硝酸纤维素膜包被抗体的制备：

1）抗体稀释液的配制：0.01 M，pH=7 .4的磷酸盐（PBS）缓冲液为包被缓冲液，加入蔗糖，终浓度为1 wt%，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后置4 ℃保存备用，有效期为一周。

2）硝酸纤维素膜包被抗体的制备：使用含1 wt%蔗糖的0 .01 M pH=7 .4的PBS缓冲液将NSE和S100-β抗体稀释为1.5 mg/mL，将兔抗鼠IgG抗体稀释为0.5 mg/mL，使用划膜仪以1 μL/cm的量将两者以0.4 cm的间隔均匀一致地喷印于2.5 cm宽硝酸纤维素膜上，室温晾干，加入干燥剂封存，4 ℃保存备用。

3、 试纸片的处理：

将15 mm长试纸片放于试纸片处理液中浸透2小时，之后于25 ℃-37 ℃烘箱中烘干12h。

试纸片处理液是含2 wt% NaCl、2 wt% TritonX-100、0.5 wt% BSA及0.5 wt% PVP的0.005 M pH=9.0的BS缓冲液。

4、 结合垫的处理

将10 mm长试纸片放于试纸片处理液中浸透2小时，之后于30 ℃烘箱中烘干12 h。

结合垫处理液是含5 wt%蔗糖、2 wt%海藻糖、0.05 wt% TritonX-100的0.005 MpH=9.0的BS缓冲液。

5、 结合垫的制备

将制备好的抗NSE和S100-β免疫空心金银纳米球以1:1的比例，1.5 mg/mL，12 μL的量使用微量移液器分别以30 μL/cm的量均匀涂于处理好的结合垫上，然后置于30 ℃烘箱中干燥后加入干燥剂封存备用。

6、试纸条的组装及切割

将硝酸纤维素膜（长25 mm）、结合垫（长10 mm）、试纸片（长15 mm）和吸水纸（长25 mm）依次粘贴上在背衬板上，并且相邻垫子间互相交错重叠2 mm，电极包括一个工作电极、一个参比电极和一个对电极，组装好后用自动切割机切割成宽3 mm的成品试纸条，装入检测卡槽，装入铝箔袋加入干燥剂密封保存，备用。

实施例2

免疫空心金银纳米球的制备步骤中：EDC和NHS的加入量均为空心金银双金属羧基化程度摩尔量的5倍，其它步骤同实施例 1。

实施例3

结合垫制备步骤中，所用结合垫处理液中蔗糖的含量为10 wt%，其它步骤同实施例1。

本发明的检测卡的使用方法如下。

1.加样

从包装盒中取出单人份的检测卡，撕开铝箔包装袋，将其置于平整桌面，用微量移液器吸取70 μL血清标本加入检测卡的加样孔内，等待反应进行20分钟。

2.检测

将检测卡放到拉曼光谱分析仪中，运行仪器，仪器会自动读取检测卡的条形码信息，进行检测并即时显示测量结果。

从图1和图2可以看出，本发明对于脑卒中病人血液中标志物NSE和S100-β的检测具有非常高的灵敏度。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条,包括支持垫和试纸片,其特征在于,所述支持垫上表面一端固定有第一电极,另一端固定有与试纸片侧壁相连接的硝酸纤维素膜, 所述试纸片和硝酸纤维素膜的端面上沿侧边均设有阻流板, 试纸片位于阻流板内部的上表面和斜面上分别设有样品垫和结合垫，所述硝酸纤维素膜位于阻流板内部的上表面设有检测线、吸水垫和质控线，硝酸纤维素膜位于阻流板外部的侧边上设有第二电极。

2.根据权利要求1所述的空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条,其特征在于，所述吸水垫的底部开设有与内部相接呈矩阵的通孔，通孔与硝酸纤维素膜下方支持垫开设的槽孔相通，支持垫的槽孔内部固定的集液柱，所述纸基电极的两端通过控制线穿过阻流板与检测线电性连接。

3.根据权利要求1所述的空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条,其特征在于，所述硝酸纤维素膜和结合垫上分别修饰有空心金银纳米球探针溶液，检测线上分布有对应的抗体。

4.根据权利要求2所述的空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条,其特征在于，所述第一电极和第二电极为纸基电极。

5.根据权利要求4所述的空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条,其特征在于， 所述第一电极和第二电极均包括一个工作电极、一个参比电极和一个对电极。

6.根据权利要求4所述的空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条,其特征在于，所述第一电极和第二电极均包括个工作电极和一个组合式参比电极、对电极。

7.根据权利要求5或6所述的空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条, 其特征在于，所述第一电极和第二电极通过丝网印刷方法制备得到。

8.根据权利要求2所述的空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条,其特征在于，所述检测线为一条或多条。

9.权利要求1-6、8任意一项所述的空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条在制备脑卒中疾病检测装置中的应用。

10.权利要求7所述的空心金银纳米球的电化学定量检测试纸条在制备脑卒中疾病检测装置中的应用。