CN107691116A - 一种液体菌种的母种培养方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种液体菌种的母种培养方法及其应用，该方法通过在配制培养液体菌种母种的自来水中，用微孔增氧技术通入空气，提高水中的溶解氧含量，然后与液体培养基混合加入摇瓶中进行灭菌处理；再将PDA斜面活化后的金针菇平板菌种采用匀浆机处理后，接入三角摇瓶中进行发酵，即可得到用作接入发酵罐生产液体菌种的液体菌种母种。本发明将匀浆机和微孔增氧技术同时结合起来应用于金针菇液体菌种的母种的生产中，显著提高液体菌种的母种质量及发酵速度。通过该方法，可实现快速高效地制备优质的金针菇液体菌种，减少液体菌种生产时间，降低生产成本，提高金针菇液体菌种的生产效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种液体菌种的母种培养方法及其应用。
背景技术
食用菌液体菌种是用液体培养基在生物发酵罐中，通过深层培养技术生产的液体形态的菌种。液体是指培养基物理状态，液体深层培养就是发酵工程技术在液体菌种的生产过程包括液体菌种母种制备与液体菌种生产，运用发酵罐生产液体菌种时，必须要通入无菌氧气，以维持液体菌种的生长需要，然而在液体菌种母种制备阶段，却未应用此方法。
金针菇学名毛柄金钱菌，金针菇子实体中氨基酸含量丰富，具有很高的营养价值。随着生产技术的不断进步，金针菇的生产已进入工厂化、周年化生产的阶段。金针菇的菌种对于金针菇高产栽培具有重要的影响。传统的金针菇固体菌种，对生产技术要求不高，但存在生产周期长，生产成本高，发菌速度慢，出菇整齐度较差等缺点，已不适用于现代化的金针菇工厂化生产。金针菇液体菌种与传统的固体菌种相比，具有诸多优点，如生产周期短、劳动强度低、成本较低、操作简便；菌种活力强，菌丝萌发快，抗菌能力强，污染率低；萌发点多，菌龄一致、出菇整齐；便于机械化生产等。因而，液体菌种已成为金针菇现代化、工厂化生产的重要研究方向，是金针菇菌种发展的趋势。
金针菇液体菌种的母种一般将PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，Potato DextroseAgar(Medium))斜面菌种活化后，接入三角摇瓶，培养5～8天，作为发酵罐生产液体菌种的母种,用这种方式生产的菌丝球大小及生长状况均一度都不理想。
液体菌种发酵过程中，菌丝体生长代谢需要充足的氧气。在使用发酵罐进行液体菌种生产的深层发酵阶段，一般安装有曝氧装置，以保证发酵罐中的氧气量足够菌丝生长需要。然而，在使用三角摇瓶生产液体菌种母种的阶段，菌丝体的生长主要依靠培养液的自来水中所含的氧气，无法满足液体菌种的母种生长需求。
发明内容
解决的技术问题：针对上述现有技术中存在生产周期长、生产成本高、发菌速度慢以及出菇整齐度较差等技术问题，本发明提供一种液体菌种的母种培养方法及其应用，该方法能够有效改善菌丝球形态及生长的均一度，缩短液体菌种母种的培养时间，获得高度均一的金针菇液体菌种母种。
技术方案：一种液体菌种的母种培养方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一.将金针菇PDA斜面菌种活化后接入PDA平板培养基中培养成金针菇PDA平板母种；
步骤二.将自来水预冷至0～10℃，把曝氧仪器放入预冷后的自来水中进行曝氧处理，曝氧仪器运行时间为30～60min；
步骤三.将以步骤二中曝氧后的自来水配制成的PDA液体培养基装入摇瓶，再将摇瓶放入灭菌锅中110～121℃灭菌20～40min，灭菌处理后取出冷却至室温备用；
步骤四.将步骤一中制备的金针菇PDA平板母种加入已灭菌的匀浆机进行匀浆处理；
步骤五.取步骤四匀浆处理后的匀浆液放入步骤三灭菌处理后冷却至室温的摇瓶中于18～20℃温度下恒温震荡培养4～7天，即可得到用作接入发酵罐中生产液体菌种的液体菌种母种，接入的匀浆液的接种量为5～8％。
作为优选，所述步骤二中曝氧仪器为曝气气泡直径100nm～50μm的微孔曝氧仪器，与一般使用的普通增氧设备比，效率更高，水中的氧气分子也更加稳定，有利于菌丝生长。
作为优选，所述步骤二中将自来水预冷至5℃。
作为优选，所述步骤二中进行曝氧处理后的水中的溶解氧含量为10～15mg/L。
作为优选，所述步骤二中进行曝氧处理后的水中的溶解氧含量为11.8mg/L。
作为优选，所述步骤二中曝氧仪器运行时间为30min。
作为优选，所述步骤三中将150mL以步骤二中曝氧后的自来水配制成的琼脂液体培养基装入250mL摇瓶。
作为优选，所述步骤三中再将摇瓶放入灭菌锅中121℃灭菌30min。
作为优选，所述步骤五中于18℃温度下震荡培养6天。
本发明的另一个技术方案为基于所述的方法在培养金针菇D163、金针菇V113、金针菇H27、金针菇W11中的应用。
有益效果：
本发明提供的一种液体菌种的母种培养方法及其应用，该方法对母种菌丝组织块进行匀浆处理，将平板菌种打碎成高度均一的菌丝体，将处理后的金针菇菌丝体组织，再接入三角摇瓶中进行发酵培养，可获得优质的高度均一的液体菌种母种。然后对母种的培养液进行预曝氧处理，采用微孔增氧技术，通过高分子微孔管向水体中通入小分子的空气，使其均匀分布于水体中，从而提高水中的溶解氧含量。同时，溶解氧浓度较高的富氧水体，还能使水中的有机物等分解有益于生物生长的营养盐等物质，排出水体中的硫化氢等有害物质，改善自来水的水质，从而提高产量。
相比现有技术，本发明将匀浆机和微孔增氧技术同时结合起来应用于金针菇液体菌种的母种的生产中，不仅在提高金针菇液体菌种母种质量，并且缩短母种制备周期。本发明所述方法在对于提高金针菇工业化液体菌种母种的生产效率和经济效益，节约液体菌种培养资源，提高金针菇菌种生产企业的经济效益等方面上，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明所述液体菌种的母种培养方法工艺流程图；
图2为本发明实施例1所述母种培养液预曝氧结合匀浆技术对金针菇D163液体菌种母种(培养第6天)菌丝球形态的影响示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
金针菇D163液体菌种的母种培养。
如图1所示，将金针菇PDA斜面菌种活化后接入平板培养基中6天培养成金针菇PDA平板母种。将准备用于配制摇瓶培养液的自来水预冷至5℃，放入微孔曝氧仪器运行30min，该微孔曝氧仪器采用曝气气泡直径为100nm～50μm的高分子纳米微孔管，通过泵的作用使空气快速通过高分子纳米微孔管，从而使水中富含微纳米级的氧气分子。测定水中的溶解氧含量为11.8mg/L。用曝氧后的水，配制PDA液体培养基。每个摇瓶中分装150mL液体培养基，摇瓶容量为250mL，121℃灭菌30min，灭菌处理后取出冷却至室温备用。将新鲜的金针菇(D163)PDA平板母种倒入内胆已经灭菌干燥的匀浆机中，运行5min后，使PDA平板母种中的菌丝块变为高度均匀一致的匀浆。每个摇瓶中接入金针菇菌种的菌丝匀浆液7.5mL，在18℃下恒温振荡进行培养，该处理设3个摇瓶作为重复。以普通自来水配制的培养基作为对照，其余试验步骤同上。观测培养期间金针菇液体菌种母种的菌丝球形态，摇瓶培养6天后，金针菇液体菌种母种的菌丝球形态示意图见图2，图中左侧锥形瓶中为通过本发明所述方法处理后的金针菇液体菌种母种菌丝球形态，右侧锥形瓶中为对照组培养的金针菇液体菌种母种菌丝球形态，测定培养液的pH值、电导率，并过滤出摇瓶中的菌丝球，洗涤数次，然后放入干燥箱105℃烘干2h，冷却后称重，测定金针菇菌丝球的生物量。
测定结果参照表1。从表中数据可以看出，在金针菇液体菌种D163的母种培养过程中，运用培养液预曝氧与PDA平板母种匀浆相结合的技术处理后大幅提高了培养液中的菌丝生物量。这表明本发明中的预曝氧与匀浆技术可极显著地提高金针菇菌种D163的菌丝体生物量，提高了菌丝球的生长速率，显著缩短金针菇液体菌种D163的母种发酵周期。
表1母种培养液预曝氧及匀浆技术对金针菇(菌种D163)液体菌种母种生长的影响
实施例2
金针菇V113液体菌种的母种培养。
将金针菇PDA斜面菌种活化后接入平板培养基中培养成金针菇PDA平板母种。将准备用于配制摇瓶培养液的自来水预冷至5℃，放入微孔曝氧仪器，运行30min，测定水中的溶解氧含量为11.8mg/L，该微孔曝氧仪器采用高分子纳米微孔管，通过泵的作用使空气快速通过高分子纳米微孔管，从而使水中富含微纳米级的氧气分子。用曝氧后的水，配制PDA液体培养基。每个摇瓶中分装150mL液体培养基，121℃灭菌30min，灭菌处理后取出冷却至室温备用。将新鲜的金针菇(V113)PDA平板母种倒入内胆已经灭菌干燥的匀浆机中，运行5min后，使PDA平板母种中的菌丝块变为高度均匀一致的匀浆。每个摇瓶中接入金针菇菌种的菌丝匀浆液7.5mL，在18℃下恒温振荡进行培养，该处理设3个摇瓶作为重复。以普通自来水配制的培养基作为对照，其余试验步骤同上。观测培养期间金针菇液体菌种母种的菌丝球形态，摇瓶培养6天后，测定培养液的pH值、电导率，并过滤出摇瓶中的菌丝球，洗涤数次，然后放入干燥箱105℃烘干2h，冷却后称重，测定金针菇菌丝球的生物量。
测定结果参照表2。从表中数据可以看出，在金针菇液体菌种V113的母种培养过程中，运用培养液预曝氧与匀浆相结合的技术处理后大幅提高了培养液中的菌丝生物量。这表明本发明中的预曝氧与匀浆技术可极显著地提高金针菇菌种V113的菌丝体生物量，提高了菌丝球的生长速率。
表2母种培养液预曝氧及匀浆技术对金针菇(菌种V113)液体菌种母种生长的影响
实施例3
金针菇H27液体菌种的母种培养。
将金针菇PDA斜面菌种活化后接入平板培养基中培养成金针菇PDA平板母种。将准备用于配制摇瓶培养液的自来水预冷至5℃，放入微孔曝氧仪器，运行30min，测定水中的溶解氧含量为11.8mg/L，该微孔曝氧仪器采用高分子纳米微孔管，通过泵的作用使空气快速通过高分子纳米微孔管，从而使水中富含微纳米级的氧气分子。用曝氧后的水，配制PDA液体培养基。每个摇瓶中分装150mL液体培养基，121℃灭菌30min，灭菌处理后取出冷却至室温备用。将新鲜的金针菇(H27)PDA平板母种倒入内胆已经灭菌干燥的匀浆机中，运行5min后，使PDA平板母种中的菌丝块变为高度均匀一致的匀浆。每个摇瓶中接入金针菇菌种的菌丝匀浆液7.5mL，在18℃下恒温振荡进行培养，该处理设3个摇瓶作为重复。以普通自来水配制的培养基作为对照，其余试验步骤同上。观测培养期间金针菇液体菌种母种的菌丝球形态，摇瓶培养6天后，测定培养液的pH值、电导率，并过滤出摇瓶中的菌丝球，洗涤数次，然后放入干燥箱105℃烘干2h，冷却后称重，测定金针菇菌丝球的生物量。
测定结果参照表3。从表中数据可以看出，在金针菇液体菌种H27的母种培养过程中，运用培养液预曝氧与匀浆相结合的技术处理后，大幅提高了培养液中的金针菇菌丝生物量。这表明本发明中的预曝氧与匀浆技术可极显著地提高金针菇菌种H27的菌丝体生物量，提高了菌丝球的生长速率。
表3母种培养液预曝氧及匀浆技术对金针菇(菌种H27)液体菌种母种生长的影响
实施例4
金针菇W11液体菌种的母种培养。
将金针菇PDA斜面菌种活化后接入平板培养基中培养成金针菇PDA平板母种。将准备用于配制摇瓶培养液的自来水预冷至5℃，放入微孔曝氧仪器，运行30min，测定水中的溶解氧含量为11.8mg/L，该微孔曝氧仪器采用高分子纳米微孔管，通过泵的作用使空气快速通过高分子纳米微孔管，从而使水中富含微纳米级的氧气分子。用曝氧后的水，配制PDA液体培养基。每个摇瓶中分装150mL液体培养基，121℃灭菌30min，灭菌处理后取出冷却至室温备用。将新鲜的金针菇(W11)PDA平板母种倒入内胆已经灭菌干燥的匀浆机中，运行5min后，使PDA平板母种中的菌丝块变为高度均匀一致的匀浆。每个摇瓶中接入金针菇菌种的菌丝匀浆液7.5mL，在18℃下恒温振荡进行培养，该处理设3个摇瓶作为重复。以普通自来水配制的培养基作为对照，其余试验步骤同上。观测培养期间金针菇液体菌种母种的菌丝球形态，摇瓶培养6天后，测定培养液的pH值、电导率，并过滤出摇瓶中的菌丝球，洗涤数次，然后放入干燥箱105℃烘干2h，冷却后称重，测定金针菇菌丝球的生物量。
测定结果参照表4。从表中数据可以看出，在金针菇液体菌种W11的母种培养过程中，运用培养液预曝氧与匀浆相结合的技术处理后，大幅提高了培养液中的金针菇菌丝生物量。这表明本发明中的预曝氧与匀浆技术可极显著地提高金针菇菌种W11的菌丝体生物量，提高了菌丝球的生长速率。
表4母种培养液预曝氧及匀浆技术对金针菇(菌种W11)液体菌种母种生长的影响
根据以上实施例可以看出，在金针菇液体菌种的母种培养过程中，运用培养液预曝氧与PDA平板母种匀浆相结合的技术，可以极显著地提高不同的金针菇菌种的菌丝体生物量，对金针菇的菌丝生长具有非常明显的促进作用。不同的金针菇菌种在处理后，培养液中的pH值均高于对照，这表明相对于对照而言，预曝氧与匀浆技术处理后的金针菇菌丝体在培养6天时，这可能是由于部分菌丝球老化自溶产生氨基氮等碱性物质，表明处理后大大提高了菌丝球的生长速率，实际的液体菌种母种发酵时间要低于对照的时间，说明可以显著缩短液体菌种的母种发酵周期。与对照相比，处理后的培养液电导率与菌丝生物量均显著高于对照，但不同的金针菇菌种之间的增产效果有所差异。
Claims (10)
1.一种液体菌种的母种培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一.将金针菇PDA斜面菌种活化后接入PDA平板培养基中培养成金针菇PDA平板母种；
步骤二.将自来水预冷至0～10 ℃，把曝氧仪器放入预冷后的自来水中进行曝氧处理，曝氧仪器运行时间为30～60 min；
步骤三.将以步骤二中曝氧后的自来水配制成的PDA液体培养基装入摇瓶，再将摇瓶放入灭菌锅中110～121 ℃灭菌20～40 min，灭菌处理后取出冷却至室温备用；
步骤四.将步骤一中制备的金针菇PDA平板母种加入已灭菌的匀浆机进行匀浆处理；
步骤五.取步骤四匀浆处理后的匀浆液放入步骤三灭菌处理后冷却至室温的摇瓶中于18～20 ℃温度下恒温震荡培养4～7天，即可得到用于接入发酵罐中生产液体菌种的母种。
2.根据权利要求1所述的一种液体菌种的母种培养方法，其特征在于，所述步骤二中曝氧仪器为曝气气泡直径100nm～50μm的微孔曝氧仪器。
3.根据权利要求1所述的一种液体菌种的母种培养方法，其特征在于，所述步骤二中将自来水预冷至5 ℃。
4.根据权利要求1所述的一种液体菌种的母种培养方法，其特征在于，所述步骤二中进行曝氧处理后的水中的溶解氧含量为10～15 mg/L。
5.根据权利要求1所述的一种液体菌种的母种培养方法，其特征在于，所述步骤二中进行曝氧处理后的水中的溶解氧含量为11.8 mg/L。
6.根据权利要求1所述的一种金针菇液体菌种的母种培养方法，其特征在于，所述步骤二中曝氧仪器运行时间为30 min。
7.根据权利要求1所述的一种金针菇液体菌种的母种培养方法，其特征在于，所述步骤三中将150 mL以步骤二中曝氧后的自来水配制成的PDA液体培养基装入250 mL摇瓶。
8.根据权利要求1所述的一种液体菌种的母种培养方法，其特征在于，所述步骤三中再将摇瓶放入灭菌锅中121 ℃灭菌30 min。
9.根据权利要求1所述的一种液体菌种的母种培养方法，其特征在于，所述步骤五中于18 ℃温度下震荡培养6天。
10.基于权利要求1所述的方法在培养金针菇D163、金针菇V113、金针菇H27、金针菇W11中的应用。
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