CN107674845A - 一种新型蜡样芽孢杆菌by1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus strain）BY1，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC M 2017321，本发明的BY1菌株在固体培养基上对甲醛的抗性可达到10mM，在甲醛胁迫较短时期内，通过核酮糖单磷酸途径将甲醛同化为葡萄糖6‑磷酸和果糖,在甲醛胁迫较长时期内通过丝氨酸途径同化甲醛为丝氨酸、甘氨酸、苹果酸、乙醛酸、磷酸烯醇式丙酮酸及3磷酸甘油酸。随后这些代谢产物进入其他代谢途径被转化谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、丙氨酸及乙酸和乙醇。在含有5mM甲醇的固体培养基中对乙醛、乙醇、异丙醇、二甲苯、苯、甲苯的抗性为20mM，在含有高浓度苯系物的培养液中生长较好，能以乙酸钠或苹果酸钠或柠檬酸钠为碳源生长时去除添加的苯系物，去除率达到100%。

Description

一种新型蜡样芽孢杆菌BY1及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体的说，涉及一种具有两种甲醛同化途径且可以净化甲醛和苯系物污染的蜡样芽孢杆菌。

背景技术

随着生活质量的不断提高装修已成为现代人生活的一部分, 甲醛是很多装修材料中广泛使用的胶黏剂，用甲醛作胶黏剂的材料中或多或少都含有一些未交联的游离甲醛，游离甲醛会持续地（时间可长达5-10年）从这些材料中释放出来，造成严重的室内空气甲醛污染，这已经成为我国和发展中国家的一个严重的环境问题。人和动物暴露于污染甲醛的空气中后会引起皮肤炎症；甲醛进入呼吸系统导致呼吸道刺激和过敏；通过血液系统到达全身导致肺功能异常、肝功能异常、免疫功能异常等。长期饮用被甲醛污染的水源会对人类和动物产生急性或慢性的危害，引发头昏、贫血以及各种神经系统疾病。

苯系物为苯及衍生物的总称，是一类芳香族有机化合物，环境污染的苯系物来源包括工业生产、汽车尾气、装修装饰材料（如油漆、板材、装饰材料等）、办公设备（如复印机、打印机、传真机、电脑等）、人为活动（如吸烟、烹饪、燃香等）等。苯，甲苯、乙苯、二甲苯四类为环境污染苯系物的代表性物质。这些苯系物具有神经毒性，因此对人类健康能够产生直接危害，引起神经衰弱、头痛、失眠、眩晕、下肢疲惫等症状，长期接触可以导致人体患上贫血症和白血病。此外，苯系物能破坏DNA，因此也具有遗传毒性。

在生命出现之前的时代，甲醛(HCHO)是自然界最丰富的有机化合物之一。在生命演变过程中，能适应当时的环境条件并能很好地生存的生物体内都有一定的甲醛解毒机制。在进化过程中，微生物体内形成多种甲醛解毒机制，尤其是在甲基营养菌中形成了更为复杂有效的甲醛代谢系统。甲基营养菌是一类能利用CO₂的各种还原态一碳（C1）化合物如甲烷、甲醇、甲胺作为碳源和能源生长的微生物。C1化合物在甲基营养菌体内代谢过程中首先被氧化成甲醛，甲醛随后有两种代谢命运：一是甲醛经过各种异化途径最终氧化生成CO₂，同时提供能量供微生物生长；二是通过同化途径把甲醛转变为细胞的组成成分。已知有三个途径包括丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径（RuMP）和木酮糖单磷酸途径（Xu5P）可用甲醛作为前体合成C2或者C3化合物的骨架。丝氨酸途径和RuMP主要出现在原核生物中，Xu5P主要在甲基营养型酵母中起作用。很多能以甲醇为碳源生长的甲基营养型细菌都拥有同化甲醛的丝氨酸途径，RuMP途径作为高效捕捉游离甲醛的一个系统，在甲醛浓度极低的情况下还能发挥作用，它存在于很多甲基营养菌和非甲基营养菌中。

土壤和活性污泥中有丰富的微生物，有些微生物因为具有甲醛代谢途径，因此盆栽植物的土壤和河道中的活性污泥可吸收并降解甲醛，说明土壤和活性污泥在消除甲醛方面具有潜在的应用价值。有些研究用活性污泥（污水沟泥）、蛭石粉及陶瓷颗粒做成生物反应器，研究结果证实这类生物反应器能有效去除并降解空气中污染的甲醛及多种有机物，但是活性污泥中的微生物种类很多，组成不明确，可能含有一些致病菌。此外，由于活性污泥的成分复杂，在高温和高湿度条件下其所含的有机物可能会导致霉菌的繁殖和生长。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的在于提供一种有甲醛同化途径且可以去除苯系物污染的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus strain），为净化甲醛和苯系物污染提供新的微生物资源。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一株新型蜡样芽孢杆菌BY1 （Bacillus cereus strain BY1），该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO ：M 2017321，地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学，保藏日期：2017年6月9日，该菌株的16S rRNA基因序列如 SEQ ID NO.1 所示。

本发明还公开了新型蜡样芽孢杆菌BY1的两种甲醛同化途径：RuMP途径和丝氨酸途径。

本发明还公开了新型蜡样芽孢杆菌BY1在净化甲醛污染中作为生物资源的应用。

本发明还公开了新型蜡样芽孢杆菌BY1在降解苯系物中作为生物资源的应用。

本发明的新型蜡样芽孢杆菌BY1的获得步骤为：首先用海藻酸盐和海绵包埋人工湿地收集的活性污泥，利用试剂内污染高浓度甲醛和苯系物的空气处理驯化海绵包埋的活性污泥中的微生物，然后利用筛选培养基富集驯化的微生物，分离生长快且对甲醛及苯系物抗性强吸收快的菌种

本发明的有益效果：

1、本发明的蜡样芽孢杆菌是以试剂内污染高浓度甲醛和苯系物的空气驯化海藻酸钠包埋活性污泥为材料，用甲基菌的无机盐培养基分离而得的一种芽孢杆菌，其具有两种甲醛同化途径且可以降解苯系物。

2、本发明的蜡样芽孢杆菌在含有2mM甲醛的固体培养基上生长很快，在固体培养基上对甲醛的抗性可达到10mM，对培养基中低浓度甲醛的去除率较高。甲醛胁迫较短时期内BY1菌株通过核酮糖单磷酸途径将甲醛同化为葡萄糖6-磷酸和果糖。在甲醛胁迫较长时期内BY1主要通过丝氨酸途径同化甲醛为丝氨酸、甘氨酸、苹果酸、乙醛酸、磷酸烯醇式丙酮酸及3磷酸甘油酸。随后这些代谢产物进入其他代谢途径被转化谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、丙氨酸及乙酸和乙醇。在含有5mM甲醇的固体培养基中对乙醛、乙醇、异丙醇、二甲苯、苯、甲苯的抗性可达到20mM。BY1在含有高浓度苯系物的培养液中生长较好，在液体培养基中能以乙酸钠或苹果酸钠或柠檬酸钠为碳源生长时去除添加的苯系物，去除率达到100%。

附图说明

图1：BY1菌株与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ATCC 14579 AE16877）同源性分析；

图2：BY1对不同浓度甲醛的去除率与吸收曲线；

图3：BY1代谢甲醛的途径分析。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1菌株的筛选、鉴定及检测

本发明首先用海藻酸盐和海绵包埋人工湿地中收集的活性污泥，利用试剂内污染高浓度甲醛和苯系物的空气处理驯化海绵包埋活性污泥中的微生物，然后利用筛选培养基富集驯化的微生物，分离生长快且对甲醛及苯系物抗性强的菌种，其具体筛选步骤为：

一、活性污泥的包埋及微生物的驯化

采集人工湿地的活性污泥与水混合，用纱布过滤去除碎石等大颗粒杂物，与2%的海藻酸钠1：1混合，浸泡海绵并移除多余液体混合物，随后放入有4%的CaCl₂溶液中进行固化包埋。将包埋污泥的海绵，卷成柱状放入塑料收纳箱中进行驯化处理，收纳箱底部安装一个小型离心风扇，将收纳箱放于含有醛类、烷烃类及苯系物等化学污染物的药品试剂室（甲醛浓度约为2.1-2.5mg/m³，VOC浓度约为5-6.5 mg/m³），通过离心风扇把试剂室的污染空体吹入海绵中，在整个驯化期间，海绵基质中的含水量保持在25-40%连续处理15天。

二、驯化微生物的分离

处理箱中不同高度和位置的污泥包埋海绵取出，剪5cm左右的一段，剪碎后置于装有200ml液体无机培养基（1升含有KH₂PO₄ 5g，K₂HPO₄ 1g，(NH₄) ₂SO₄ 2.6g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂ 0.01g，FeSO₄·7H₂O 0.001g，酵母膏 1.6g（0.16%），固体培养基加1.5%琼脂，使用5mM甲醇作为碳源）中，28℃下摇床振荡培养7天，经过7天培养的菌体离心去掉上清，然后用500μl水悬浮。将药品试剂室污染空气吹入水中，用这种富集污染物的水制备固体培养基，培养基中添加2mM甲醛，然后将水悬浮的菌体涂在固体培养基上，于28℃的培养箱内培养，挑选单菌落做后续的鉴定。

三、形态学观察和分子生物学鉴定

在含有2mM甲醛的固体培养基上分离的菌株生长很快，菌落为灰白色，不透明，菌落较大，培养时间稍长后菌落变微红色。用接种环挑取少量菌块涂于载玻片的水珠上，使用结晶紫和番红染色，在显微镜下观察，结果发现分离到的菌株是细菌，将纯化好的菌落进行16srRNA测序，获得的测试数据如SEQ ID NO.1 所示。

16s rRNA测序数据分析显示分离菌株与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ATCC14579 AE16877）同源性达到 99%，如图1所示，因此该菌株名称定为蜡样芽孢杆菌BY1。

实施例2 蜡样芽孢杆菌BY1对甲醛抗性、吸收能力和代谢途径分析

1、BY1对甲醛的抗性分析

在添加和没有添加酵母膏的固体培养基分别加入4 mM、8 mM、12 mM和20 mM的甲醛，将BY1菌液（1%，v/v）接种于含有5mM甲醇和酵母膏的液体无机盐培养基中，28℃摇床培养，待OD600达到0.5时各取1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl菌液点于含有不同浓度甲醛的固体培养基上，28℃温箱中培养48小时后观察其生长状况。结果说明菌株BY1在含有酵母膏和没有酵母膏的无机培养基中都能生长，且生长状况几乎一致，说明菌株BY1的生长不依赖酵母膏。随着甲醛浓度的升高，菌株BY1的生长受抑制程度增加，BY1对甲醛的耐受性为10mM。

2、 BY1去除甲醛的效果分析

在不含酵母膏的液体培养基中分别添加4 mM、8 mM、10 mM、15mM和20 mM的甲醛和5mM甲醇，然后接种OD600为0.5的菌液1%（v/v），28℃摇床培养，在8h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取1毫升菌液，离心后取上清，使用Nash法测定处理液中剩余甲醛的浓度（图2A），用不加菌液但含有相同浓度的甲醛溶液检测处理系统甲醛的挥发量，甲醛去除率按照公式：100%（处理液起始甲醛）-处理液剩余甲醛%-挥发甲醛%计算。如图2B所示，结果说明菌株BY1在72h内对4 mM甲醛的去除率能达到90%以上，对8mM甲醛的去除率接近80%以上，对10mM甲醛的去除率约为50%以上，对15mM高浓度甲醛的去除率较低（＜20%）。

3、BY1代谢转化甲醛的途径分析

在含有5mM甲醇的无机盐培养基中培养BY1，用离心的方法收集菌体细胞2g，在无机盐培养基中加入4mM H¹³CHO（4mM甲醛）溶液(100ml)处理2 h和24 h，以不处理样品作为对照（CK）检测BY1菌体细胞的背景¹³C信号水平。处理结束后离心收集菌体细胞，加入3mL 10mM磷酸钾缓冲液（KPB，pH7.4），超声破碎抽提可溶性代谢产物，沸水浴加热处理3min使酶失活，12000rpm 4℃离心30min，去除沉淀细胞碎片。上清液经真空冷冻干燥后，用0.6mL KPB溶解，12000rpm离心3min取0.mL上清装入核磁管，加入10 mM去离子甲酰胺作为核磁共振分析的内参，在布鲁克核磁共振仪（DRX 500-MHz）上进行核磁共振分析收集数据。H¹³CHO标记样品中化学位移参照去离子甲酰胺（内参）的共振峰（166.85ppm），¹³C-NMR谱共振峰通过与已知化合物的¹³C-NMR 谱进行比较鉴定其归属。在BY1的H¹³CHO代谢谱(图3)中可以观察到4mMH¹³CHO处理2 h代谢产物中有G6P(葡萄糖6-磷酸)和Fruc(果糖)的信号峰，说明在0-2h处理期间甲醛被代谢转化为糖类物质，BY1菌株可能存在RuMP甲醛同化途径。

2h的甲醛胁迫使一些内源性的氨基酸和有机酸信号峰降低，说明甲醛胁迫会消耗这些内源性的代谢产物，4mM H¹³CHO处理24h 这些内源性的代谢产物信号峰强度恢复到接近处理前的水平，说明H¹³CHO处理24h后，BY1菌株中甲醛代谢产生这些内源性代谢产物。对代谢产物信号峰进行归属，结果说明H¹³CHO代谢谱中有丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、苹果酸（Mal）、乙醛酸（Ox）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、3磷酸甘油酸（3PGA）、谷氨酰胺（Gln）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）及乙酸（Ac）和乙醇（Et）。Ser、Gly、Mal、Ox、 PEP、3PGA是丝氨酸途径的代谢产物，这说明BY1菌株在H¹³CHO处理24h后主要通过丝氨酸途径同化H¹³CHO，将甲醛代谢转化为无毒性的有机酸和氨基酸，随后这些代谢产物进入其他代谢途径被转化为Gln、Asn、Glu、Ala及Ac和Et，RuMP途径和丝氨酸途径在BY1的甲醛代谢和脱毒中发挥重要作用。

实施例3 蜡样芽孢杆菌BY1对苯系物和其他有机污染物的耐受性及苯系物去除效果分析

1、BY1对苯系物和其他有机污染物的耐受性分析

在含有5mM甲醇的固体培养基中分别添加浓度为4 mM、8 mM、12 mM和20 mM的乙醇、异丙醇、二甲苯、苯、甲苯制备固体平板。取OD600为0.5的菌液1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl点于固体平板上，28℃温箱中培养48小时后观察生长状况。结果说明添加乙醛、乙醇、异丙醇对菌株BY1的生长对没有明显影响，其对乙醛、乙醇、异丙醇的耐受性可达20mM，但在含有异丙醇的平板上生长较状况较差。在添加二甲苯、苯、甲苯的平板上能生长，对二甲苯、苯、甲苯的抗性也达到20mM，但在添加甲苯的平板上生长状况较差。

2、BY1去除苯系物的效果分析

在含有5mM甲醇的液体培养基（50ml）中分别添加0.5 mM、1 mM、2 mM和3 mM的苯、甲苯、二甲苯，接种OD600为0.5的BY1菌液100μl。 28℃振荡培养，在24、48、72小时测定其OD600值，然后12000rp离心15min取上清用高效液相色谱法测定培养液中剩余苯系物含量。结果说明菌株BY1在24h内能完全去除培养液中污染的低浓度苯系物，去除率达到100%，在含有苯系物的培养液中能生长，在含有高浓度苯系物的培养液中生长更好。此外，在液体培养基中添加5mM乙酸钠或苹果酸钠或柠檬酸钠为碳源，BY1生长更快，且都能在含有这三种碳源之一的培养基中生长时去除添加的苯系物。

本发明的蜡样芽孢杆菌是以试剂内污染高浓度甲醛和苯系物的空气驯化海藻酸钠包埋活性污泥为材料，用甲基菌的无机盐培养基分离而得的一种芽孢杆菌，其具有两种甲醛同化途径且可以净化甲醛和苯系物污染。

最终，以上实施例和附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 云南万魁生物科技有限公司

<120> 一种新型蜡样芽孢杆菌株BY1

<141> 2017-07-28

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1424

<212> DNA

<213> bacillus cereus strain

<400> 1

aacgtacgtt aagactttat cggtttcaat ttgtgatcct gggagctagc tcctgatggc 60

gagtggcgaa cgggtgagta atatatcgga acgtgcccta gagtggggga taactagtcg 120

aaagactagc taataccgca tacgatctac ggatgaaagt gggggatcgc aagacctcat 180

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tcctacggga ggcagcagtg gggaattttg gacaatgggg gcaaccctga tccagcaatg 360

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tgtctactag ttgtcgggtc ttaattgact tggtaacgca gctaacgcgt gaagtagacc 840

gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc 900

ggtggatgat gtggattaat tcgatgcaac gcgaaaaacc ttacctaccc ttgacatgga 960

tggaatcccg aagagatttg ggagtgctcg aaagagaacc atcacacagg tgctgcatgg 1020

ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt 1080

cattagttgc tacgaaaggg cactctaatg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg 1140

gggatgacgt caagtcctca tggcccttat gggtagggct tcacacgtca tacaatggta 1200

catacagagg gccgccaacc cgcgaggggg agctaatccc agaaagtgta tcgtagtccg 1260

gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag ttggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat 1320

gtcgcggtga atacgttccc gggtcttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagctggt 1380

gtacctcaag gggcagccag tcgaacagga gcctcgaggt tcga 1424

Claims (4)

1.一种新型蜡样芽孢杆菌菌株BY1，其特征在于：该菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO ：M 2017321，该菌株的16SrRNA基因序列如 SEQ ID NO.1 所示。

2.如权利要求1所述的新型蜡样芽孢杆菌菌株BY1，其特征在于：该菌株具有RuMP途径和丝氨酸途径两种甲醛同化途径。

3.如权利要求1所述的新型蜡样芽孢杆菌菌株BY1，其特征在于：该菌株在净化甲醛污染中作为生物资源的应用。

4.如权利要求1所述的新型蜡样芽孢杆菌菌株BY1，其特征在于：该菌株在降解苯系物中作为生物资源的应用。