CN107666904A - 多不饱和脂肪酸的纯化组合物、其制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的长链多不饱和脂肪酸或其盐或酯的纯化组合物，其表征为基本上不含其它通常存在但结构不同的组分，如呋喃脂肪酸、植烷酸和降植烷酸、角鲨烯和一些低聚物，以及多种“持久性”环境污染物，如多氯二苯并二噁英和多氯二苯并呋喃、多氯联苯、多溴二苯醚、多环芳烃和其它通常也存在且极其有毒的物质。本发明还涉及获得所述组合物的纯化方法及其作为食品、特殊医疗用途食品、食品与膳食补充剂和药物的用途。

Description

多不饱和脂肪酸的纯化组合物、其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及新的长链多不饱和脂肪酸(PUFA)或其盐或酯的纯化组合物，其表征为基本上不含其它通常存在但结构不同的组分，如呋喃脂肪酸、植烷酸和降植烷酸、角鲨烯和一些低聚物，以及多种被定义为“持久性”的环境污染物(POP，持久性有机污染物)，如多氯二苯并二噁英和多氯二苯并呋喃、多氯联苯、多溴二苯醚、多环芳烃和其它通常也存在且极其有毒的物质。本发明还涉及产生所述组合物的纯化方法及其作为食品、特殊医疗用途食品、食品与膳食补充剂和药物的用途，还包括在动物和水产养殖中的用途。该纯化方法在于用适合用于获得所有存在的PUFA的总络合物的尿素量处理通常为高浓度的所需浓度的PUFA组合物，并且通过过滤尿素中的包合络合物连续地分离纯化出纯化的PUFA及含有其它结构不同的产物和几种“持久性”环境污染物的溶剂相。

背景技术

根据起始于末端甲基基团的第一个双键的位置，将含有2-6个双键和18个或更多个碳原子的长链多不饱和脂肪酸定义为“ω-6”(或n-6)和“ω-3”(或n-3)。

两个酸家族的典型代表分别是亚油酸(LA，C18:2n-6)和α-亚麻酸(ALA，C18:3n-3)，由于它们不在体内合成，需要通过饮食摄取，将其定义为“必需”酸。

它们两者都在体内通过称为延长酶和去饱和酶的特定酶体系进行链延长和不饱和度增加。

最熟知的ω-6酸是γ-亚麻酸(GLA，C18:3n-6)和花生四烯酸(ARA，C20:4n-6)，且ω-3酸被定义为十八碳四烯酸(或4,8,12,15-十八碳四烯酸(moroctic acid)，SDA，C18:4n-3)、二十碳四烯酸(ETA，C20:4n-3)、二十一碳五烯酸(C21:5n-3)、二十二碳五烯酸(或鰶油酸，DPA，C22:5n-3)，特别是二十碳五烯酸(或二十碳五烯酸(timnodonic acid)，EPA，C20:5n-3，全顺式)和二十二碳六烯酸(或鱼油酸，DHA，C22:6n-3，全顺式)。

在所有情况下，长链多不饱和脂肪酸之间的比例是可变的，并且还与大量的饱和及单不饱和酸如油酸(C18:1n-9)混合。

在自然界中，这些脂肪酸可以以不同的形式存在，例如，在磷脂等中，但更频繁地以油(或脂肪)的形式存在，即与甘油形成酯(甘油酯)。ω-6酸在植物油和种子中特别丰富，而ω-3酸，特别是EPA和DHA具有普遍的海洋来源，特别是源自鱼油、甚至来自水产养殖鱼、或源自磷虾油，甚至源自藻类和其它产油微生物，或源自从选定的藻类菌株或其它微生物菌株开始的“单细胞发酵”。

这些油类通常经历一些标准的初始处理，如漂白和中和，然后本技术包括从用于药物或食物用途或饮食补充剂的最感兴趣组分的这些复杂混合物(如真正为EPA和DHA)中进行浓缩或分离。

为此，在第一阶段，将天然油(甘油酯)进行温和的水解过程，例如借助于含醇的氢氧化钾，从而得到相应的钾盐，然后得到游离酸及如果需要的话-烷基酯；或者更常见地，采用酯基转移反应，例如，在过量的脂肪醇(优选C1-C3)和碱性或酸性催化剂存在下，直接得到脂肪酸的相应烷基酯，并且如果需要的话，由此可以得到相关的酸或盐。

从近几年开始，除了化学途径之外，还通过酶促途径，通过选择性脂肪酶(甚至固定化的)进行所述水解或醇解过程：这允许在甚至更温和的反应条件下操作，并且进一步地由于与饱和及单不饱和酰基相比，PUFA对酶促裂解具有更高的抗性，其也可以将仍然部分酰化的和富含PUFA的甘油的中间体组分分离出来(参见例如Kapoor R和Patil UK，IntFood Res J，18，493，2011)，以在单独的阶段进行水解或醇解。

在更普通的情况下，第一阶段之后通常进行增加所需组分浓度的处理，该组分典型为EPA或DHA，或其以预定比例的混合物，如果优选，主要作为乙酯或甚至作为酸或盐。

通常将这种处理方式重复多次且甚至与多种方法结合，该处理方式涉及多种技术，主要包括：

-在高真空下蒸馏，通常分子蒸馏或短程蒸馏更适合于限制热降解过程，明显地布置以适当分馏；

-一些色谱方法，甚至在高压(HPLC)下，但是更适合于实验室规模或分析目的；

-逆流提取

-用硝酸银水溶液提取；

-超临界流体提取(SFE)，通常用CO2，甚至与制备级的色谱方法(SFC)和适合的固定相(更特定地用于单组分分离)结合，并且两者都在连续相且通过“分批“色谱进行；

-但是，在最普通和工业上可接受的情况下，本领域技术人员知晓在醇溶液或其它溶剂和悬浮剂中的尿素络合反应。已知在特定条件下尿素可以结晶为六方晶体，形成能够包合脂肪酸直链的通道，并且这种包合基本上发生在确实具有更直结构的饱和和/或单不饱和的酸和酯上。形成的包合络合物通过从醇溶液冷却而沉淀出来，并通过过滤被移除，然后允许将极其富含多不饱和组分的组分恢复，例如，从溶液中恢复EPA和DHA。因此，尿素络合构成了“被动”过程，其实际上首先发生在饱和及单不饱和组分上，然后从母液中回收高浓度的PUFA。对这些尿素络合物及其制备的详尽综述是由Schlenk H，“Urea inclusioncompounds of fatty acids”，在Progress in the Chemistry of Fats and OtherLipids(脂肪和其它脂类化学进展)第II卷(RTHolmar编辑)，Pergamon出版社，纽约，第243-267页(1954)和Swern D，“Techniques of separation.Urea complexes”，在Fatty Acids，第3部分(KS Markley编辑)，Interscience，纽约，第2309-2358页(1963)做出的那些。将在随后给出其它更具体的参考文献。

多种富集PUFA的通用方法由Breivik H，“Concentrates(浓缩)”在Long-ChainOmega-3Specialty Oils(长链ω-3特定油类)(H Breivik编辑)，Oily出版社，Bridgwater，第111-130页(2007)及enrichment of PUFAs by enzymatic route(通过酶促途径富集PUFA)，第146-155页，以下称为“Breivik 2007”中进行了合适地概述。

一般来说，所有这些操作均以最后阶段的分子蒸馏结束，其目的是除去残余的低沸点馏分，包括在该过程中引入的有机溶剂，或者目的是限制特别是由“低聚物”组成的高沸点馏分(由氧化和降解得到的且具有不同聚合度的极性产物)的存在，其总是涉及对这些不稳定的多不饱和物质进行的任何操作，这与欧洲药典(EP)专论1250相一致。与用气相色谱(GC)分析的PUFA不同，通过“尺寸排阻”或“凝胶渗透”色谱法的这种低聚物是剂量给定的，并且根据EP实际上需要最大为1％。

通过利用“超临界”条件下的流体给出了蒸馏的替代方案，其既仅仅用于提取目的，也用于色谱目的，例如用于逐步分离EPA和DHA。

我们从文献中还得知，天然多不饱和物质，特别是鱼油，是被各种性质的物质严重污染的，如果作为药物或食物或食物补充剂摄入，则对人类和动物的健康是有害的，甚至不可用于作为从水产养殖处获得的鱼的鱼食。

例如这类物质是由大气物质(atmospheric agent)或化学操作产生的天然降解物，如环氧化物和过氧化物，后者由于具有aterogenic和致突变活性对健康具有潜在危险(例如Carroll KK，Cancer Res，35,3374,1975)，以及如上所述的低聚物和聚合物。

“天然”杂质，无论如何在结构上与脂肪酸的组成无关，但是其以胆固醇和几种其它植物甾醇和动物固醇为代表，其系统地存在于种子油和源于海洋的油中(PCT/WO 87/03899；Connor WE和Lin SE，Metab Clin Exp，31,1046,1982)。

通常还存在一些长链支化烃(如角鲨烯C30H50)及其它。其它作者还报道了以绝不可忽略的量系统存在的大量脂肪酸环状衍生物，一般定义为呋喃脂肪酸：根本没有在毒理学方面对所有这些物质进行过研究，或者只进行了部分地研究，并且由于它们结构本身，它们在由定义例如“ω-3脂肪酸”组成的组合物中存在是完全不合理的，并且从安全的观点看它们在目的为作为人类食物或药物使用的组合物中存在是完全不合理的。在从以上提及的E.P.6.3(2008)的专论1250“ω-3酸乙酯90”中提取的图1的GC分析清楚地示出了许多但不是全部的呋喃脂肪酸(参见附图)，且在更近的E.P.8.0专论07/2012:1250及USP 37的第4059-61页(以下报道的表1)中仍确认了它们的存在，两者仍是有效的。

表1

经过鉴定的乙酯	相对保留时间
		植烷酸	0.416
C16:3n-4	0.431
		C16:4n-1	0.468
C18:3n-6	0.557
		C18:3n-4	0.574
C18:3n-3	0.585
		C18:4n-3	0.608
C18:4n-1	0.618
		呋喃酸5	0.691
C19:5	0.710
		C20:3n-6	0.720
C20:4n-6	0.736
		呋喃酸7	0.744
C20:4n-3	0.777
		呋喃酸8	0.783
EPA	0.796
		呋喃酸9	0.867
C21:5n-3	0.889
		C22:4	0.917
呋喃酸10	0.922
		C22:5n-6	0.939
呋喃酸11	0.963
		C22:5n-3	0.977
DHA	1.000

即使我们已经展示并证实了呋喃环的2位上额外存在的其它二-甲基取代的衍生物，但是在以上提及的H Breivik 2007，第130-132页的书中及所引用的几个文后参考文献中清楚地鉴定和报道了这些呋喃酸的化学结构。与Breivik一致，涉及尿素和分子蒸馏的用于PUFA浓缩的方法导致产物中各种呋喃酸的含量相同或部分减少(参见以上表6)，但不为零。

可能是由于从GC色谱图的不同保留时间及因此从不同位置能够推导出来的大量呋喃酸及它们的不同物理性质，我们并不知晓消除如此保持存在于目前商业产品中的这类组分的重要尝试。

通常还存在植烷酸，从E.P.6.3和E.P.8.0的专论及USP 37中提取的以上表1和在 此所附的图1中所示的一种长链支化饱和酸(四甲基-十六烷酸，PhA)，其通常与衍生自α-氧化的低级同系物(即降植烷酸(四甲基-十五烷酸，PA))或其盐或酯连接。与大多数其它酸不同，植烷酸不能通过β-氧化而被代谢，例如，在患有雷夫叙姆病(Refsum disease)的受试者(具有较差的α-氧化能力)中，该植烷酸在血液和组织中积聚，导致外周多发性神经病、小脑性共济失调、视网膜色素变性、嗅觉丧失和听力丧失。

在此回顾的专利申请US 2011/0033595(WO 2011/018096)以其全部内容与所引用的参考文献一起仔细地解释了一种普遍共识，在西方饮食中包括每日200至1000g的基于EPA+DHA的组合物，但是这些海洋和藻类来源的组合物含有显著浓度的PhA(参见图3b，第[0037]段，与我们的附图1相同的图)，直到1000ppm(0.1％)或更多，导致数百万消费者严重的健康问题[第0001段]。除了引用由PhA的使用所引起的几种疾病([0002]和[0003])之外，还解释了最近的研究证明PhA的连续使用可以诱导几种类型的癌症，并且它除了是EPA和DHA的直接拮抗剂之外，还具有细胞毒性和促炎性(第[0004]-[0008]段)。为了从该特定组分中纯化PUFA混合物，所述US2011/0033595申请描述了利用液体或超临界流体洗脱液的色谱分离法，通过其还分离出一些富含PhA的部分，其被进一步纯化以适合于通过局部途径用于化妆用途，和其它用途。

关于降植烷酸，它与PhA一样具有许多严重的毒性作用，并且对于几种遗传疾病，例如泽尔韦格综合征(Zellweger syndrome)，它还积聚于身体内。

相同申请US 2011/0033595作为参考描述了在先申请WO 01/10809、EP 1157692、US 5,656,667(第[0025]-[0027]段)和其它文献，其中无一在其方法和目的方面干扰本申请。

WO 01/10809描述了在确定的温度和压力条件下用亚临界或超临界流体处理从尿素加合物(如在处理鱼油或其它油类期间作为副产物获得的那些，因此主要含有饱和及单不饱和酸)中回收以游离酸或酯或酰胺，特别是EPA和/或DHA形式的PUFA的方法。该方法的目的是以部分浓缩的形式回收在工业生产中作为副产品损失的一部分PUFA，而不存在将其从外来成分中纯化出来的目的。

EP 1157692公开了包含至少80重量％的EPA和DHA及小于3％的其它特定的ω-3组分的脂肪酸组合物。该方法包括酯交换过程，接着用尿素和分子蒸馏进行合适分馏。

US 5,656,667描述了包含至少80重量％的EPA和DHA及至少1.0重量％的C21:5n-3组分或至少80重量％的比例为1:2至2:1的EPA和DHA、以及至少1.5％的不同于EPA和DHA的其它ω-3酸的脂肪酸组合物。即使在这种情况下，酯交换之后是用尿素和分子蒸馏的标准分馏。

申请US 2012/053242(WO 2010/118761)还描述了降低PhA含量的方法，根据该方法，与权利要求1一致，对海洋来源的油进行皂化得到相应的盐，进行酸化得到脂肪酸，将代表该方法的唯一起始物质的这些酸在10℃和27Pa真空下，通常以100,000g进行甘油梯度超速离心24至48小时(权利要求5，6)，然后将甘油梯度进行结晶至0℃至-57℃之间的温度范围，获得固相和液相，该液相包含PhA含量小于90微克/克的多不饱和ω-3酸，将其通过倾析进行分离。

权利要求2公开了还将这些酸酯化以获得ω-3酸甘油三酯(未获得乙酯)，同时还要求ω-3酸的含量在65重量％至99重量％的范围内(权利要求10)，PhA的含量低于5微克/克(权利要求11)，ω-3酸包含65重量％和95重量％之间的DHA(权利要求14)以及在5重量％至35重量％的范围内的EPA(权利要求17)。

其它权利要求19-61基本上是指用于药物和食物用途、营养和食物补充剂的组合物，以及对本发明组合物敏感的病理学的治疗方法。

该说明书广泛描述了PhA(和PA)的负作用，正如US 2011/0033595已经报道的那样，还报告了几种引入市场的产品，并证明了这些产品中高含量的PhA与所含DHA的纯度没有显著相关性(图3)。

我们也注意到，在实施例3中，目的在于分析本发明产品，还报道了关于环境污染物(如PCB、PCDD、PCDF和苯并[a]芘)的一些数据，我们将在后面详细讨论。在不考虑所提供的数据的优点下，无论如何我们都要强调，在该说明书的任何方面都没有说明所提出的方法能够降低所述物质的含量，也不以任何方式要求保护相同事物。然后认为这类数据是非常偶然的，并且最重要的是低含量的污染物仅仅是由于它们在起始油中含量降低的结果，或者是由于来源于低污染海域，或者更简单地是由于处于甘油三酯状态的油本身的先前纯化：实际上已知的是少数环境污染物与甘油三酯相比沸点较低，并继而通过分子蒸馏是可以被除去的。

我们还注意到，几个文后参考文献的引用涉及上面已经提到的用于浓缩ω-3酸的通常的尿素处理，如US 5679809、EP 0347509和其它文献(第[0053]段)，但是如我们所发现的，考虑到关于本申请的不同方法和目的，这些方法无一能构成本申请的有效现有技术，甚至没有向这里讨论的US20120053242申请的作者们提出使用尿素。

美国专利US 5679809报道了用尿素的乙醇溶液处理脂肪酸乙酯，通过冷却，将含有不溶性的包合络合物的固相从包含富含PUFA乙酯部分的液相中分离出来。

申请EP 0347509描述了使脂肪酸混合物与尿素络合以除去饱和酸和大部分单不饱和酸，然后使滤液在低温下进行分步结晶。然而，到目前最具破坏性的杂质对于天然油性物质是完全外来的那些，其来源于环境污染物，其中的许多是极具脂溶性的并且倾向于与多种脂肪组分(POP，持久性有机污染物)聚集在一起。这些物质的主要特性是随着时间而具有持久性、通过食物链而生物积聚、对于散布和远距离环境迁移具有潜力、及其毒性。许多这些物质明显是致畸的、致突变的和致癌的。经过漫长的准备阶段后，于2001年5月22日至23日在瑞典举行了反对来源于关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约(StockholmConvention on POP)的这些物质的第一次官方行动，该次官方行动确定了对人类健康和环境(包括农业和养牛业)最不利和危险的12种不同的化学类别(“脏的十二种(dirtydozen)”)。这些物质中的许多是在过去使用的，但有些甚至在目前仍被用作杀虫剂(除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀鼠剂等)。“公约”的结论是禁止生产和使用许多这些物质，包括其它工业用途，以限制DDT仅在疟疾控制中使用，并限制其它物质如一系列化学过程和/或燃烧产生的不需要的副产品“二噁英”和“呋喃”，和如其工业用途依然被禁止的“PCB”的不知觉和无意生产。

在随后几年内由多个持久性有机污染物审查委员会(POPs Review Committee)以及多个环境保护的地方机构(作为意大利的ARPA)进行了定义和控制其它持久性有机污染物的目标。为了证实这一点，许多研究报道了在海洋生物体和植物环境中及因此在海洋来源的油和蔬菜种子中具有相对较高浓度的环境污染物的积聚，如二噁英、PCB、溴化阻燃剂，以及DDT及其代谢物，和杀虫剂，如毒素和其它物质。这些物质对人类和动物造成的危害，引起了人们越来越关注食物和食物链中有毒物质的含量。不含污染物或污染物含量受限的食物产品越来越受欢迎，并且市场容量也越来越大。因此，消除或减少食物产品中的污染物，具有极大的增加其销售能力和附加值的潜力，特别是涉及其在“婴儿食品产业”和“婴幼儿配方”上的要求。市场上特别需要的是如EPA和DHA的多不饱和酸，以及纯化它们的新技术，因为这些物质对高温加热特别敏感，因此对于目前代表的蒸馏或分子蒸馏或短程蒸馏实际上是从环境污染物中纯化的更常用方法。

关于由含有多不饱和脂肪的油的热敏性所表示的这种困难以及更常用的方法，可以参考US 7,732,488(WO 04/007654)和其中引用的参考文献。US 7,732,488描述了用于减少油或脂肪的混合物中的环境污染物的量的方法，依据此向混合物中加入低沸点的“工作”流体，然后使混合物进行至少一个“汽提“阶段，在此期间，一部分环境污染物随着挥发性的“工作”流体一起被蒸馏掉。该方法似乎是改善的，但对于现有技术不是决定性的，由于它也限于只有油的沸点足够高而在汽提阶段不会共同蒸馏出的油类(甘油三酯)的纯化；由于工作流体被限定为“低沸点”，但其也由乙酯或脂肪酸等表示，例如需要180-200℃的温度用于有效的汽提阶段；无论如何，涉及较长时间的加热、副产物的形成、复杂设备(如分子蒸馏)和高成本，最后看起来平均来说，减少污染物而不是完全消除污染物是更适合的。

另外，现有技术中提及的其它方法表明，分子蒸馏技术虽然具有一定的功效，但无论如何非常有限，并且完全不能代表环境污染物在油脂中积聚的严重问题的确定的解决方案，这严重降低了其价值和其用途。由于在人类用途中，现在已经有将认为是治疗和营养价值组分的多不饱和脂肪酸或其衍生物分离和浓缩的方法，那么将是非常需要用于人类药物用途和动物(包括水产养殖)中的营养用途的最有价值产品的新的直接纯化方法。

关于POP的更详细的研究，最常见和最有毒性的类别之一是由二噁英的通用术语定义的，实际上由两个化学品家族(多氯二苯并对二噁英(PCDD)和多氯二苯并呋喃(PCDF))组成。

二噁英不是特意生产的，并且对于人类的暴露源主要是环境产生的，通过摄取经受污染的食物，尤其是动物油脂。

总共存在75种二噁英同系物和135种呋喃同系物，它们苯基上的氯原子的数量和位置不同，但从毒理学观点来看，这些中只有7种PCDD和10种PCDF是令人特别关注的。通常，PCDD/PCDF不是作为单个化合物，而是作为后者毒性同系物的混合物而被检测到的，归因于它们中的每一个都具有适当的“毒性当量因子”(TEF)，更确切地说是用于食品样品的WHO-TEF(欧洲委员会规则(EC)1881/2006，Off.J.EU，L364/5；2006年12月20日，第20页)。

通过测量多种氯化化合物对Ah的结合亲和力，与作为参考单位值的2,3,7,8-四氯-二苯并二噁英(2,3,7,8-TCDD)的结合亲和力相比较，将经实验测定的TEF值作为受体Ah的激活能力(下一次引发毒性作用的关键步骤)。

因此，PCDD/PCDF的总体浓度表示为“毒性当量”或“等效毒性”(TEQ)，并通过将乘以相应浓度的各个同系物的TEF值求和来计算。每个同系物的TEQ总和对检测不到的贡献被认为等于定量限(上限)。

根据以上规则(EC)1881/2006(第18页)，意图用于人类消费的源自海洋的油类的最高WHO PCDD/PCDF TEQ为2pg/g油(Breivik 2007，第246-247页)。根据USP 37，接受标准对应于“不超过”(NMT)1pg/g WHO毒性当量。

另一组化学污染物是由工业试剂(如多氯联苯(PCB))组成，由各种氯化联苯分子组成。在PCB的交易和使用被禁止之前，PCB被广泛用于工业产品，用作介电流体，杀虫剂，阻燃剂，涂料组分等。暴露于人类是由于环境污染(垃圾填埋、废物处理不充分、由蒸发或火灾而排放至大气等)。

多氯联苯包括一系列的209个同系物，但其中仅有12个具有与“二噁英”和“呋喃”类似的毒理学性质，因此被称为二噁英类PCB(DL-PCB)。即使确定了这些DL-PCB，但是毒性当量因子TEF和它们的毒性当量TEQ通常与二噁英的TEF和TEQ一起积聚。如上所述，二噁英和DL-PCB(WHO PCDD/PCDF-DL-PCB TEQ)的总和的最大值等于10.0pg/g油。

定义为“指示物”或“标记物”的其它6个同系物的总和(IUPAC名称：PCB 28、52、101、138、153、180)被EFSA(欧洲食品安全局(European Food Security Agency))认定为是否存在非二噁英类PCB(NDL-PCB)以及人类暴露于它们的合适的指示物。该值以ng/g油表示。

根据USP 37，PCB标记物(包括PCB 118)的可接受性限于NMT 0.5ppm(0.5微克/克)。

PBDE是多溴二苯醚，因而由不同溴化二苯醚分子构成，并且与PCB的结构具有一些概念上的类似。它们包括一系列的209个同系物，其根据IUPAC命名，根据溴原子的数量(1至10个)其数量越来越大，其中的一些具有极高的神经毒性和致癌性。

它们被用于作为聚氨酯泡沫、塑料ABS、聚苯乙烯中的阻燃剂，并且被认为是“紧急”持久性化学污染物。在某些条款下，已被禁止用于工业生产，但无论如何都表现其存在于污染水域和垃圾填埋场，而且在鱼油样品中的PBDE(DBE-28、47、99、100、153、154和183)的总和突出至达到3.8ng/g或更高(Zennegg M等人，Organohalogen Compounds，68,1967,2006；US 7,732,488)。

多环芳烃(PAH)是由两个或更多个稠合芳环形成的由有机物质、石油衍生物或生物质不充分燃烧所产生的。它们被气团运送到气体状态，或被吸附到固体部分上，并且由于它们被认为是可能的致癌物质，而具有毒理学价值。根据基质中所发现的不同化合物，PAH表示为不同化合物的总和，目前将其表示为标记物质苯并[a]芘，并且在油脂中的最大耐受限值为2ng/g(规则(EC)1881/2006，第6节，第18页)。

环境污染问题非常严重，因而不能以单次研究穷尽，但是具有广泛性的单个指标对人类福祉、动物和环境界可以具有无法估量的益处。在本文没有详细讨论，但仍然可以通过举例引用的其它POP中，还提到了以下：2,2-双(对氯苯基)-乙烷(DDE)、2,2-双(对氯苯基)-1,1-二氯乙烷(DDD)和2,2-双(对氯苯基)-1,1,1-三氯乙烷(DDT)(后者在全球环境中的任何地方都有踪迹)，多溴联苯(PBB)、六氯苯、六氯环己烷异构体等。即使重金属和有机金属化合物对于人类健康和环境也是一个严重的问题，特别是甲基汞可以导致严重的儿童脑改变和成年人神经损伤，因此欧洲立法规定了在鱼产品中的最大限量为0.5mg/kg。然而，由于重金属对蛋白质的亲和力强于脂质，因此鱼油中重金属的存在并不是主要问题(Breivik 2007，第133页)。

根据专家的说法，在开始对多不饱和脂肪酸进行浓缩过程之前，应该最大可能地直接从起始油中除去POP，从而利用大多数高沸点的甘油三酯和各种POP之间的沸点极其不同的优势，从而使蒸馏/分子蒸馏方法更有效的(Breivik 2007年，第133页)。如已经报道的，在蒸馏之前添加所谓的“工作流体”可以获得其它的优势(US 7,732,488)。

尽管如此，存在许多类别并且在其中存在不同的POP分子种类(各自具有自身的化学-物理性质和不同的沸点)，使得由于其时间和收益的损失以及成本增加而非常耗费人力，并且通常能够减少污染物的存在，但实际上不会完全消除污染物，并且在有利于单种产品的情况下而不能将纯化扩展到全部的POP中。

在对于降低POP具有部分功效但绝不能消除其存在的其它方法中，包括用活性炭处理和/或时间和温度显著增加的除臭过程，并且具有相关问题而不能与蒸馏相竞争(Breivik2007，第133页)。即使色谱方法对单一化合物具有一定功效，但是对于一般分散在整个色谱图中的全部POP绝不具有功效。

因此，我们得出结论，目前技术无一能够从上述的所有杂质中纯化所述组合物，并且只有在组合使用时，反复地且具有严重的产率损失才能接近各种法律所施加的限制，而不能实现如所期望的基本上除去每种污染物。

例如，分子蒸馏当然能够除去含有大部分极性较大的杂质的高沸点馏分，作为低聚物和某些其它的氧化产物，即便产率损失严重，但也不能完全消除上述多氯化的污染物，这取决于取代度在大范围内的蒸馏温度。

同样地，超临界流体的使用可以通过提取脂肪酸来除去极性物质，但是这些将总是伴随有同样能够从超临界溶剂中提取出的亲脂性污染物质。人们认为，还没有可用于系统性地消除POP的其它技术。特别地，在文献中尿素的使用仅适用于包合，然后分离和消除饱和及单不饱和的脂肪酸，并且因此浓缩多不饱和酸，然而伴随着外来杂质的浓度增加。从文献看多不饱和组分的包合似乎随着其浓度和相对不饱和度的增加，而越来越困难。

据我们目前所知，现有技术无一还可以导致基本上不含以上提及的所有“呋喃”组分、植烷酸和降植烷酸或其衍生物、支化长链烃(如角鲨烯)、大部分的多不饱和酸的聚合物和基本上全部POP的多不饱和组合物，更特别是在单个步骤的情况下。

发明内容

反之亦然，我们已经确定了新的令人惊讶的纯化技术，其主要在于从含有动物和/或植物来源的长链多不饱和脂肪酸的、组分已经达到所需浓度和比例的组合物(或从其溶液)中直接和选择性地提取出所有所需的多不饱和组分，而不含副产物和污染物，因此在耗尽的母液中分离出所有的污染物质。因此，与现有技术不同，它采用了用于所需多不饱和组分的特定和选择性方法，而不是使用与所讨论的各种污染物家族的不同化学-物理性质相关的不同提取方法。

因此，第一方面，本发明涉及包含属于ω-3和/或ω-6系列、具有2-6个双键和18个或更多个碳原子的动物和/或植物来源的长链多不饱和脂肪酸或其盐或酯的组合物，所述组合物基本上不含呋喃脂肪酸或其盐或酯，其中所述呋喃脂肪酸或其相应的盐或酯的总浓度不高于0.1％，即不高于1000ppm，且优选不高于0.01％，即不高于100ppm。

权利要求2-17阐述了优选的组合物。

特别地，所述酯可以是烷基酯，优选C1-C3，或甘油单酯和/或二酯和/或三酯。

第二方面，本发明涉及制备如上定义的组合物的方法，其中所述酯是烷基酯，优选C1-C3，包括以下步骤：

a)使包含具有至少18个碳原子和ω-3和/或ω-6系列的2-6个双键的至少一个酰基的动物或植物来源(包括海洋、水产养殖、藻类或发酵来源)的油或脂肪进行碱水解或酸水解或者与脂肪醇(优选C1-C3)，任选在酶催化下进行酯交换；

b)通过使上述水解或酯交换的产物全部包合在尿素中来进行纯化过程，以获得经过分离和洗涤的包合络合物；

c)通过将这种包合络合物溶解在水中并分离溶解后所形成的油相，或者通过用与水不混溶的有机溶剂(典型为己烷)提取所述油相，随后蒸发所述溶剂至干，或者通过借助处于超临界状态的流体(特别是二氧化碳)从包合络合物中直接提取，而获得上述组合物。

权利要求19和20定义了所讨论的制备方法的优选方面。

在另一方面，本发明涉及用于纯化包含属于ω-3和/或ω-6系列且具有2-6个双键和18个或更多个碳原子的动物和/或植物来源的长链多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯(优选C1-C3)的组合物的方法，该方法包括以下步骤：

a)在沸腾温度下，用极性溶剂，优选质子溶剂(如低级醇，如甲醇或乙醇，任选地含有多达20％的水)中的至少3重量份的尿素来处理1重量份的上述组合物，以形成含有上述组合物的尿素包合络合物；

b)冷却以沉淀这种尿素络合物并通过过滤或离心将其分离出来；

c)通过将这种尿素包合络合物溶解在水中并分离所述溶解之后所形成的油相，或者通过用与水不混溶的有机溶剂(典型为己烷等)提取所述油相，随后蒸发所述溶剂至干，或者通过借助超临界流体(特别是二氧化碳)从尿素包合络合物中直接提取，而获得纯化的组合物。权利要求22-30定义了所讨论的纯化方法的优选方面。

根据本发明的特别优选的纯化组合物设想了海洋来源并且特别是源自鱼油(包括来自水产养殖的鱼)、或“磷虾油”、或源自藻类及其它产油微生物、或源自从选定的藻类菌株或其它微生物菌株开始的“单细胞发酵”的脂肪酸，并且其包含二十碳五烯酸(EPA，C20:5n-3，全顺式)和/或二十二碳六烯酸(DHA，C22:6n-3，全顺式)、或其盐或烷基酯，优选C1-C3。

方便地，在上述优选的纯化组合物中，烷基酯是乙酯，并且EPA或EPA乙酯、或者DHA或DHA乙酯、或其总和的浓度在组合物重量的15％和100％之间，优选在50％和100％之间。

作为本发明的另一方面，所述纯化组合物可以通过化学和酶促途径用于合成新的脂质衍生物：在它们之中特别是已经提到的EPA和/或DHA的甘油单酯和/或二酯和/或三酯，它们也将包括在组合物重量的15％和100％之间，优选50％和100％之间。

本发明还涉及以上提及的优选的纯化组合物借助其高含量的具有多不饱和特性或特别是属于ω-3系列的长链脂肪酸或其衍生物，在制备可用于食品配料、食品和膳食补充剂、特殊医疗用途食品(功能性食品)、动物用途和水产养殖用食品、婴幼儿食品配方、化妆品和药物制剂的用途，或者通过化学途径制备其它衍生物，例如相应的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的用途。

在另一方面，本发明涉及上述纯化的组合物用于在以下各项中使用：预防和治疗心脏、心血管和心脏循环疾病的风险因子，如高血压、凝血障碍和血小板凝聚、严重和中度高甘油三酯血症(分别为>500mg/dl和>200mg/dl)和高胆固醇血症(特别是家族性和遗传性形式)，还与其它药物且特别是与他汀类药物一起预防和治疗心脏、心血管和心脏循环疾病(如冠状动脉粥样硬化性疾病，和包括心肌和脑梗塞在内的心脏和脑缺血状态)，以及降低由心肌梗塞引起的心脏猝死危险；由于电的原因引起并涉及心律的发作和传播的那些，包括心律失常和心房和/或心室纤颤；和由于心脏泵的机械缺陷引起的那些，如心功能不全和代偿失调，和/或充血性“心力衰竭”；进一步用于在预防和治疗中枢神经系统(CNS)疾病，包括癫痫、各种形式的抑郁症、双相障碍、注意力缺陷和多动障碍(ADHD)的儿科障碍、学习和记忆缺陷、各种形式的精神分裂症、阿尔茨海默病和各种形式的痴呆症中使用；以及最终用于在预防和治疗视网膜病和干眼症、代谢综合征、代谢和肥胖相关的缺陷、2型糖尿病、肝病、结缔组织和关节疾病、炎性疾病、自身免疫病、溃疡性结肠炎、牛皮癣和肿瘤疾病中使用。

从以下从属权利要求能够推断本发明的有利的加工和发展前景。

具体实施方式

在本说明书中，如果药理学上可接受的话，多不饱和酸的盐表示为用碱金属(例如，钠和钾)、碱土金属(例如，钙)，用碱性氨基酸(如赖氨酸和精氨酸)，用葡甲胺、胆碱和单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺等形成的盐。

烷基酯表示为用脂肪醇形成的酯，甚至具有如在天然“蜡”中发现的非常长的链，但优选地表示为用低级醇C1-C3形成的的酯。

同样明显的是，随后可以将这些纯化的组合物进行化学修饰或酶修饰，以提供纯化组合物的其它衍生物，例如相应的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。

这些甘油酯也被报道称为在sn-1或sn-2位上的单酰基-甘油(例如，ω-3单酰基甘油)，或者在sn-1,2或sn-1,3位上的二酰基-甘油，或者也被报道称为三酰基-甘油。

通过特定的脂肪酶对这些酰基甘油进行酶促生产是根据文献以精确的实验条件来进行的，并且由“Breivik 2007”，第157-159页得以良好概括。

本发明的方法主要基于将多不饱和物质按照文献要求包合在过量的尿素中。

我们已经证实，当饱和及单不饱和组分在组合物中普遍存在时，如在未经受多不饱和物质的浓缩过程的天然产物中所发生的，对于饱和及单不饱和组分，包合过程实际上是优先的，但是在使用过量尿素时能够将全部的多不饱和组分络合，并且当饱和及单不饱和组分在组合物中相对缺乏且几乎或完全不存在时，最终这种络合同样是简单的：如果基本上不存在饱和及单不饱和组分，我们发现过量的尿素甚至不是必要的，并且以一个单一步骤能够容易地获得完全络合，这是完全令人惊讶的。在这些情况下，对于中等长度和长链脂肪酸或其盐或酯，如LA、ALA、ARA和上述其它脂肪酸，如EPA和DHA，该过程均平稳地进行。正如我们已经发现的那样，通过文献的标准方法，其还允许从所形成的尿素络合物中容易地回收所有的这些产物。

然而，新方法更令人惊讶的方面是，可以以一个操作步骤将基本上以上描述的所有杂质、副产物和污染物消除，使非络合的物质保留在溶剂相中：我们在本声明中几乎包括与脂肪酸、酯类及其最简单的衍生物在结构上不相同的所有物质，我们在本文定义为结构“庞大的”化合物的物质，例如含有在脂肪酸或有机的环状化合物和多环化合物中分支的链的那些中的大多数，其是缩合或不缩合的，饱和或不饱和的，如在任一种情况下，我们将在下文中单独地或分类地进行报告。

因此，该纯化过程基本上扩展了以上描述的全部污染物，并且包括例如所有的酸性呋喃、长链支化脂肪酸和烃，以及二噁英和呋喃、多氯联苯、多溴二苯醚、环状和多环烃、简单和缩合的烃以及其它POP。

还应理解的是，在该纯化方法中，包含在每个浓度区间中的前述物质中的每一种及其在相同区间内的总和与它们所源于的组合物中的相比，将减少至少5倍(减少至少80％)，或优选减少至少10倍(减少至少90％)，或者在绝大多数的情况下，它们将是“基本为零”或“零”。定义为“基本为零”的含量表示低于检测限(LOD)的浓度，但是作为确定为定量限(LOQ)的预防措施，而如果将小于LOD的值确定为零，那么将其定义为“零”。

还按照方法的建议，仔细洗涤尿素络合物以用于除去母液和其污染物，明显地获得了所有这些不需要物质的消除程度，但是已知文献并未充分强调该方法，由于非常担心由于洗涤溶剂导致络合物的部分再溶解，而使产率相当大地损失。

下面将给出用本发明方法能够获得的区间和最大值的详情。

也将减少低聚物和聚合物、过氧化衍生物、金属离子和金属有机化合物和一些甾醇物质中的一些或大多数。

一个重要的考虑因素是不需要根据起始物质中存在的待被消除的污染物和副产物的含量而改变本发明的纯化方法，例如，延长时间或者改变根据现有技术的蒸馏中的“汽提”温度，或在通过用超临界流体进行色谱纯化的情况下的待丢弃的部分的数量或尺寸。

采用该新的方法，它将同样使用任何物质，还包括受到严重污染的物质，例如，在被污染的海域捕获的鱼内的油，因此富含POP，因而不被市场接纳或以便宜的价格出售；或以富含植烷酸的废食物喂养的鱼油或来自高度污染场所的植物油。

总之，根据本发明的纯化方法的第一个方面，可以以3个连续的步骤用3-6总重量份的尿素处理含有较低含量(等于15-30％)的多不饱和酸或其盐或酯的组合物，首先获得主要含有饱和或单不饱和酸且含有逐渐增多的多不饱和酸的络合物，然后将络合物合并，并回收酸，以得到具有相同的低初始含量的多不饱和酸(如果其是需要的话)，但基本上不含上述所有杂质(用络合反应的最终母液除去)的组合物。与天然产物相比，这种方法非常适合于获得具有类似浓度或稍微增加的浓度的多不饱和组分的纯化组合物，在许多种子油中我们将其表示为大于15％、或约20-30％，例如在许多鱼油中，典型的情况是18％EPA+12％DHA。

根据本发明的纯化方法的第二方面，可以以两个连续的步骤用3-5总重量份的尿素处理含有中等含量(含量等于31-80％)的多不饱和酸或其盐或酯的组合物。

在本发明的该第二方面，可以利用文献中报道的所有浓缩方法以及我们以上提及的从低浓度组合物开始的浓缩方法获得用于纯化步骤的中等浓度的这种组合物。

在这些方法中，特别有利的是利用以相对于起始物质的0.1重量份至多达3重量份的最大量，通常为1-2重量份使用的尿素，仅仅使用络合技术，根据所需的浓度程度改变尿素量。

分离并消除所获得的富含饱和酸且贫含多不饱和酸的第一络合物，然后可以通过直接利用浓缩的母液来继续进行纯化步骤，而不预先分离浓缩的多不饱和酸。

根据E.P.5.0的2063专论，该方法允许容易地获得含有中等浓度(例如，50-60重量％或更多)的多不饱和酸的纯化组合物，但也在30-80重量％、优选50-80重量％的范围内，这取决于浓缩步骤的处理类型和数量。

根据本发明的纯化方法的第三方面，可以以一个单一步骤利用3-4总重量份、优选4重量份的尿素处理含有高含量(含量大于80％)的多不饱和酸或其盐或酯的组合物。

该方法的一个有利变体是通过在即将进行最后蒸馏之前用尿素进行络合，或者如果需要的话用超临界流体提取来进行纯化，这允许完全消除可能存在的反应的残余有机溶剂。

该方法由此导致能够容易地获得具有浓度例如大于80重量％的多不饱和组分EPA和/或DHA和浓度大于90重量％的总ω-3(如根据EP专论1250所要求的那些)、或浓度在80-100重量％的范围内的EPA和/或DHA的纯化组合物。

为了完成用于制备高度纯化的多不饱和酸的组合物的本发明方法的总体描述，该方法从天然的油脂组合物开始且包括已知的其它处理步骤，本方法可以简单地解释如下：

-根据专家已知的标准方法，对动物或植物来源(包括海洋来源、来自水产养殖、藻类或发酵来源)且包含具有ω-3和/或ω-6系列的2-6个双键和18个或更多个碳原子的至少一个酰基的合适油脂进行碱水解或酸水解或者利用脂肪醇(优选C1-C3)进行或酯交换；

-如果需要的话，通过蒸馏、分子或“短程“蒸馏，利用尿素以逐渐络合反应而分馏出饱和或单不饱和(或通常不饱和度低的)的组分，随后通过逆流提取、用硝酸银水溶液提取、用超临界流体、色谱法提取和/或分馏进行络合物的消除，使产物进行任选的多不饱和组分的浓缩过程，所有这些都按照专家已知的标准方法进行，并持续达到需要的最终组合物的组分的富集程度和比例变化，还包括分离出主要仅含有EPA或DHA的组合物；

-作为根据本发明的主要纯化步骤，通过以下将如上获得的且任选地具有浓缩的多不饱和组分的粗制组合物进行纯化过程：使其基本上全部包合于尿素中，随后分离并彻底洗涤所获得的包合络合物，最终溶解于水中且随后通过将组合物溶剂提取(或用超临界流体)而回收纯化的多不饱和组分，随后蒸发至干；

-如果需要的话，根据专家已知的标准方法，通过分子/短程蒸馏或用超临界流体提取进行纯化的组合物的最终回收。

任选地，可以使纯化的组合物进行浓缩或调节组分比例的其它方法，或者可以通过化学方式进行改性以包括其它衍生物，如处于纯化状态的相应的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，这也落入本发明的精神中。

还任选地，在过滤脂质包合络合物之后，可以将纯化步骤的母液浓缩至干，产生富含呋喃酸、植烷酸、降植烷酸或其盐或烷基酯和角鲨烯的组合物，可用于通过已知技术，如分子蒸馏和/或利用有机溶剂或超临界态的其它流体(如二氧化碳)的色谱法分离所述化合物。

新的络合方法的执行与文献中的区别仅仅在于，它是附加的并且是为了不同的目的而进行的，但是它们在方法上没有实质性的差异。它仍优选地采用例如多不饱和脂肪酸的甲醇或乙醇溶液、部分含水的乙醇(含有高达20％的水)或其它等同的极性溶剂，如之前提及的Schlenk H和Swern D所报道的。在该方法中采用的溶剂量通常为4.5-7重量份的甲醇或45-65重量份的乙醇，然后加入至少3重量份的尿素，短暂加热至沸点且完全溶解。然后将其冷却至约0℃(范围+25/-20℃，如通常的)，如上所述的获得所需多不饱和酸的尿素络合物的沉淀，然后丢弃含有所有污染物的溶液：很明显的是，新方法使用了尿素络合物且消除了母液，这与文献方法中发生的恰恰相反。

优选地按如下进行用尿素处理的阶段：

-如果组合物具有包括在15％-30％之间的上述多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯的含量，那么以三个连续的步骤利用3-6总重量份的尿素处理1重量份的组合物；

-如果组合物具有31％和80％之间的上述多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯的含量，那么以两个连续的步骤利用3-5总重量份的尿素处理1重量份的组合物；

-如果组合物具有大于80％的上述多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯的含量，那么以一个步骤利用3-4重量份(优选的4重量份)的尿素处理1重量份的组合物。

一种有用的变体是在消除母液之前将其浓缩，例如高达到一半的体积，以便回收第二等分的尿素包合络合物并提高该方法的产率。

用甲醇或乙醇仔细地洗涤沉淀的固体，可能的是用尿素饱和且冷却以使损失最小化，然后将其溶解在水中，并将纯化的组合物作为油相分离，或用与水不混溶的有机溶剂(例如，用己烷等)提取。在溶剂蒸发后，如本领域的专家所熟知的，以及任何其它文献的处理方法，例如，分子蒸馏，如此获得以高度纯化形式的所需多不饱和酸。

作为替代方法，用超临界流体，特别是CO2从已经洗涤过的固体络合物中直接地提取纯化的组合物。

关于已知方法特别重要的一个方面涉及尿素的量，在所述已知方法中仔细地进行限制以避免多不饱和组分的任何损失，而根据本发明其需要过度地适合于定量回收所有物质。该数量当然将取决于待纯化物质的组成，但通常由3至4或5重量份或更多组成。然而，值得注意的是，在浓缩的多不饱和化合物的情况下，饱和或单不饱和化合物的竞争性络合作用降低，因而所述过量将降低，通常3重量份的尿素是足够的。

通过使用本发明，我们处理和纯化了基于多不饱和脂肪酸的各种类型的组合物以及任何浓度，即使随着其浓度的增加而损害其它饱和及单不饱和组分，实际上处理将是越来越重要的。此外，该组合物对于人类消费或甚至对于药物用途而言将具有更大的利益，但是也很显然的是，甚至不允许将已经存在副产品和污染物(POP)的食物和尚未纯化的组合物作为动物(例如，水产养殖)的食物循环利用。

在本文中较详细地报道了作为非限制性实例的根据新方法处理的一些组合物：

a)包含动物和/或植物来源的长链多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯的组合物，例如，海洋来源并从鱼油或磷虾油、或来自水产养殖鱼的油、或仍来自藻类或其它产油微生物、或从选定的藻类菌株或其它微生物菌株(包括重组菌株)的“单细胞发酵“所获得的，或者例如源自种子油或植物来源的其它油脂，并且其中组合物具有与它们所源于的植物/动物来源的油脂中基本上相同浓度的多不饱和组分，通常大于15％-20％。

b)脂肪酸ω-3和/或ω-6的组合物，包括例如，任何来源且以它们之间的任何比率，及浓度高于15％、或平均浓度通常为20-50％、或特别高的浓度为50-100％的二十碳五烯酸(EPA，C20:5n-3，全顺式)和/或二十二碳六烯酸(DHA，C22:6n-3，全顺式)或盐或烷基酯，优选C1-C3。

c)基本上在欧洲药典(EP 5.0)的专论第2063号中描述的“ω-3-酸乙酯60”的组合物，典型地含有最少50％的EPA乙酯(最少25-40％)以及DHA乙酯(最少20-40％)，和最少55％、60％或65％的总ω-3酸的乙酯。

d)包含长链多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯的组合物，其中EPA乙酯或DHA乙酯的浓度或其总和在组合物的50％和100％之间。

e)基本上在E.P.补充2000的专论第1250号中描述的“ω-3酸乙酯90”的组合物，且随后典型地含有最少80％的EPA乙酯和DHA乙酯，其中最少40％的EPA乙酯和最少34％的DHA乙酯，和最少90％的总ω-3酸的乙酯。

f)基本上在USP 37的专论“ω-3-酸乙酯”中描述的组合物，典型地包含不少于(NLT)800mg/g且不多于(NMT)880mg/g的EPA乙酯(EPAee)和DHA乙酯(DHAee)、NLT430mg/g和NMT 495mg/g的EPAee、NLT 347mg/g和NMT 403mg/g的DHAee和NLT 90重量％的总ω-3酸的乙酯。

g)基本上如专利IT 1235879中所描述的脂肪酸组合物，典型地含有至少80重量％的ω-3多不饱和脂肪酸，在它们之中EPA和DHA以1:2至2:1的比例存在，且占总脂肪酸的至少75重量％，并且其它ω-3酸C20、C21和C22构成至少3重量％，并且其中所述酸可以全部以药学上可接受的盐或衍生物的形式存在。

h)包含长链多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯的组合物，其中EPA乙酯或DHA乙酯的浓度大于或等于80％，优选大于或等于90％，或者其浓度的总和在组合物的50％和100％之间。

然而，如前所述，应当理解的是，根据本发明的方法纯化之后，所有组合物导致相应的组合物的多不饱和组分的浓度基本相同，除了对由于通过本方法完全除去杂质导致的升高作出的合适明显的修正，已经反复地引用和描述了该杂质：全部种类的大量呋喃脂肪酸、植烷酸和降植烷酸或其盐或烷基酯、角鲨烯以及许多杀虫剂和环境污染物(POP)，其无处不在地分布在整个动物和植物世界。

还可以理解的是，所有纯化的组合物中的多不饱和组分的浓度(且易于受到动物且特别是人类的大多数变化用途影响，例如食品补充剂、医疗用食品、药品等)将表示为相对于组合物总重量的“重量”浓度。所设想的方法是气相色谱GC，但是将与100％的纯物质进行比较而进行分析，并确定需要的GC响应因子。众所周知，如低纯度的组合物经常进行的，通过色谱面积比简单地相减得到的浓度会导致非常严重的评估错误，因为很明显地许多杂质保留在气相色谱柱中，并且不通过仪器的检测器显示，因此降低了样品总GC面积，并因此导致多不饱和组分(如EPA和DHA)的高估。

在根据本发明的方法纯化后，获得了大量的多不饱和脂肪酸的纯化组合物，下文简要且概括地描述了其中一些当然不是限制性的实施例：

1)包含属于ω-3和/或ω-6系列、具有2-6个双键和18个或更多个碳原子的动物和/或植物来源的长链多不饱和脂肪酸或其盐或酯的组合物。

2)如1)中定义的组合物，其中脂肪酸具有海洋来源并特别地源自鱼油或“磷虾油”，或源自水产养殖的鱼油、或仍来自藻类或其它产油微生物、或从选定的藻类菌株或其它微生物菌株(包括重组菌株)的“单细胞发酵”，并且以任何比率包含二十碳五烯酸(EPA，C20:5n-3，全顺式)和/或二十二碳六烯酸(DHA，C22:6n-3，全顺式)，或其盐或酯。

3)如2)中定义的组合物，其中酯是烷基酯，优选C1-C3。

4)如2)中定义的组合物，其中酯是甘油单酯和/或二酯和/或三酯。

5)如3)中定义的组合物，其中烷基酯是乙酯，并且EPA或EPA乙酯或者DHA或DHA乙酯的浓度或者其浓度的总和是包括在组合物重量的15％和100％之间，优选在50重量％和100重量％之间。

6)如5)中定义的组合物，其中EPA乙酯和DHA乙酯的浓度总和高于或等于80重量％，优选高于或等于84重量％，其中EPA乙酯高于或等于40重量％，DHA乙酯高于或等于34重量％和所有ω-3乙酯的总和高于或等于90重量％。

7)如5)中定义的组合物，其中EPA乙酯和DHA乙酯的浓度总和在80重量％和88重量％之间，EPA乙酯是包括在43重量％和49.5重量％之间，DHA乙酯在34.7重量％和40.3％重量％之间，并且总ω-3酸的乙酯总和高于或等于90重量％。

8)如5)中定义的组合物，其中EPA乙酯或DHA乙酯的浓度大于或等于80重量％，优选大于或等于90重量％。

9)如4)所定义的组合物，其中EPA或DHA的浓度或者其总和在组合物重量的15％和100％之间，优选在50％和100％之间。

将所有的这些组合物具体地表征为包含：

-呋喃脂肪酸或其相应的盐或烷基酯(优选C1-C3)的总和，其总浓度为小于或等于0.1％，即小于或等于1000ppm，且优选地小于或等于0.01％，即小于或等于100ppm。

所述组合物通常还表征为包含：

-植烷酸和/或降植烷酸或其相应的盐或烷基酯，其总浓度小于或等于0.01％，即小于或等于100ppm，且优选地小于或等于0.001％，即小于或等于10ppm；

-角鲨烯，其浓度小于或等于0.01％，即小于或等于100ppm，且优选地小于或等于0.001％，即小于或等于10ppm；

-酸的低聚物或盐或酯，其浓度小于或等于1.0％；

-多氯二苯并对二噁英(PCDD)和多氯二苯并呋喃(PCDF)，其总浓度小于或等于1.0pg/g，优选地小于或等于0.1pg/g，根据WHO的毒性当量因子(TEF)确定并表示为毒性当量(TEQ)的值；

-PCDD、PCDF和多氯联苯(PCB)二噁英类(DL-PCB)，总体浓度小于或等于5.0pg/g，优选地小于或等于0.5pg/g，如以上定义确定的值(TEQ)；

-PCB标记物，其总体浓度小于或等于5.0ng/g，优选地小于或等于0.5ng/g；

-多溴二苯醚(PBDE)，其总体浓度小于或等于5.0ng/g，优选地小于或等于0.5ng/g；

-表示为标记物质苯并[a]芘的多环芳烃(PAH)的总和，其小于或等于1.0ng/g，优选地小于或等于0.1ng/g；

-包含总体浓度小于或等于2.0ng/g、优选地小于或等于0.2ng/g的2,2-双(对二氯苯基)-乙烷(DDE)、和/或2,2-双(对二氯苯基)-1,1-二氯乙烷(DDD)和/或2,2-双(对二氯苯基)-1,1,1-三氯乙烷(DDT)；总体浓度小于或等于5.0ng/g、优选地小于或等于0.5ng/g的多溴联苯(PBB)；浓度小于或等于0.1ng g、优选地小于或等于0.01ng/g的六氯苯和总体浓度小于或等于0.1ng/g、优选地小于或等于0.01ng/g的六氯环己烷异构体的其它环境“持久性有机污染物”(POP)。

在纯化过程中发现，与起始物质中的含量相比，其中在任何情况下包括在这些浓度范围内的其它物质中的每一种以及其在相同区间内的总和是在所描述范围的较小部分，低聚物被简单地减少了，相比于它们所源于的未纯化的组合物中的含量，其含量减少至少5倍，或优选至少10倍，或者绝大多数情况下“基本为零”或“零”。

然后，根据本领域已知的所有技术，可以就其本身将以上详细描述的所有纯化的组合物进行配制，或者添加有合适的稀释剂、辅料、悬浮剂等和/或添加有合适的防腐剂、抗氧化剂等进行配制，得到在本领域已知的允许其在所有提出的适应症中使用的所有制剂。所述制剂除了直接包含例如在各种食品中，或者以根据现有技术获得的微胶囊化产品或纳米胶囊化产品的形式外，还包括用于本领域已知的口服制剂(如滴剂、软明胶胶囊、硬明胶自密封胶囊、片剂，如果需要的话吸附于固体上后的制剂或作为包合络合物，如果需要的话作为肠溶制剂等)，或者用于本领域熟知的局部用制剂(如乳膏剂、软膏剂等)，或者还包括用于在灭菌后和/或如果需要的话在化学和/或物理改性后的注射给药(如用于肌内使用的小瓶，缓慢静脉滴注等)，例如，如本领域所熟知的作为乳剂中的甘油酯。

关于它们的用途，这些纯化的组合物及其制剂将被用于制备和用作为任何种类和任何目的的食品或食品成分，如食品和膳食补充剂、用于特殊医疗目的的食品(功能性食品)(新型的和可从医药用途推断出的)、动物用途和水产养殖的食物、婴幼儿配方食品、化妆品和药物制剂，所有都包含或富含长链脂肪酸或其衍生物，具有多不饱和特性或特别是属于ω-3系列，或其用途是用于通过化学途径或优选通过酶促途径(通过如文献中所描述的合适脂肪酶)来制备其它衍生物，例如相应的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，其将同样得以良好纯化。

对于所有用途，特别是药物用途，优选地使制剂浓缩有或富含多不饱和组分，特别是EPA和/或DHA或其盐或其乙酯。

非常也越来越重要的是包含特定成分，特别是如以其所有形式的ω-3酸的特定医疗目的的食品或功能性食品(也包括饮料和补充剂)，能够对健康带来某些特定益处(强化食品)。这些特定的益处最终将从这些特定成分的药物用途中推断出来，但其也可能是新用途。这些功能性食品目前由英文术语FOSHU(特定健康用途食品)或日本术语Tokuho所知。

如果认为所使用的所有纯化的组合物都完全不含呋喃脂肪酸，在不同作者仅仅将它们认为具有鱼油的心脏保护作用(如G.Spiteller,Lipids 40,755,2005和其它文献)、抗炎作用(如T.Wakimoto等人，Proc Natl Acad Sci 108,17533,2011和其它文献)及更多的类似作用的情况下，以下列出的所有用途，特别是医药用途，基于文献并不是完全明显和可预见的。

特别地，组合物的用途将涉及预防和治疗心脏、心血管和心脏循环疾病的风险因子，特别是以家族性和遗传性形式的，如高血压、严重和中度高甘油三酯血症(分别为>500mg/dl和>200mg/dl)和高胆固醇血症，其还与其它药物，特别是与他汀类药物组合用于预防和治疗，如凝血和血小板凝聚的缺陷。

非常相关的用途是用于预防和治疗心脏、心血管和心脏循环疾病，如冠状动脉粥样硬化性疾病和包括心肌和脑梗塞在内的心脑血管缺血状态，以及降低心肌梗塞之后的心脏猝死的风险；由于电的原因引起并涉及心律的发作和传播的那些，包括心律失常和心房和/或心室纤颤；和由于心脏泵的机械缺陷引起的那些，如心功能不全和代偿失调，和/或充血性“心力衰竭”。

在其它药物用途中，组合物用于预防和治疗中枢神经系统(CNS)疾病，包括癫痫、各种形式的抑郁症、双相障碍、注意力缺陷和多动障碍(ADHD)的儿科障碍、学习和记忆缺陷、各种形式的精神分裂症、阿尔茨海默病和其它痴呆症。

其它的药物用途还包括预防和治疗视网膜病和干眼症、代谢综合征、代谢和肥胖相关的缺陷、2型糖尿病、肝病、结缔组织和关节疾病、炎症、自身免疫病、溃疡性结肠炎、牛皮癣和肿瘤疾病。

实施例

现在将通过一些实施例来说明本发明，然而这些实施例不具有任何限制性目的。然后提供这些实施例仅用于举例说明的目的，因此可以使用许多其它的原料，以及可以进行该方法的许多其它的变化，并且可以获得许多其它的纯化PUFA的组合物，然而其也包括在本发明的范围内。

实施例1

对一批高浓度的PUFA进行了纯化，更确切地说，根据欧洲药典的n.1250专论，采用了一批ω-3酸乙酯(ω-3-酸乙酯90，第201308批)，也被称为PUFA_EE或PUFAee，其是经过定期分析和批准的。此批中的EPA乙酯和DHA乙酯的含量相对较高，而其它的ω-3酯相对减少，但总体上组合物是在欧洲药典规定的限制之内。酸度值、茴香胺、过氧化物和低聚物也符合药典的要求。

明显的是，对于例如具有美国药典描述的限制的产品，同样的纯化也是可行的。

分析方法

通过GCMS分析(气相色谱结合质谱法)确定各种PUFA_EE的百分比含量。该方法允许改变GC条件，延长保留时间并更好地分离各个峰，而不影响对各个峰的鉴定(仍保留在药典图谱示出的序列中)。

通过精确称量250mg+/-0.1mg的样品并在容量瓶中用加入5mg丁羟基甲苯的10mL异辛烷稀释，将测试样品以25mg/mL溶解。

通过对质谱的文献检索来鉴定PUFA_EE的峰。通过面积归一化来计算每种乙酯的量，必要时使用适当的校正因子。

GCMS色谱条件总结如下：

图2示出了起始批次的气相色谱峰，而表2列出了其由质谱法支持的属性和浓度百分比。

表2

峰编号	保留时间[min]	面积	面积％	文库查询结果
					1	40.332	312271	0.10	C18:4n3
2	46.870	494559	0.16	10,13-环氧-11-甲基十八碳二烯酸_EE
					3	48.517	218511	0.07	C19:5_EE？
4	49.201	298509	0.10	C20:3n6_EE
					5	50.550	7782595	2.51	C20:4n6_EE
6	53.504	2822847	0.91	C20:4n3_EE
					7	53.794	723191	0.23	12,15-环氧-13,14-二甲基十八碳二烯酸_EE
8	54.294	329794	0.11	未知
					9	54.855	157473628	50.81	C20:5n3_EE(EPA)
10	56.640	464865	0.15	未知
					11	60.301	933119	0.30	C21:5n3_EE
12	61.875	484604	0.16	C22:4_EE
					13	62.084	679442	0.22	12,15-环氧-13,14-二甲基二十碳二烯酸_EE
14	63.313	8014262	2.59	C22:5n6_EE
					15	65.794	3954434	1.28	C22:5n3_EE
16	66.885	459514	0.15	未知
					17	67.584	122269289	39.46	C22:6n3_EE(DHA)
18	68.977	227002	0.07	未知
					19	69.794	747365	0.24	未知
20	70.428	1183869	0.38	4,5-环氧-胆甾烷？

从以上数据可以看出，所涉及的这批PUFA_EE品质优良，符合欧洲药典的规格，其中EPA乙酯＝50.81重量％以及DHA乙酯＝39.46重量％(将面积比％归一化并用各自的响应因子进行校正)。然而，其含有至少3种也是以乙酯形式的呋喃酸，其量超过所采用分析方法的定量限(LOQ>0.01％)(气相色谱保留时间，RT:46.87分钟、53.79分钟、62.08分钟；它们的百分含量分别为0.16％、0.23％和0.22％)。虽然药典没有明确禁止这些呋喃脂肪酸，这确实强调了其可能的存在性，但它们不符合所声明的PUFA结构，因此其作为食品补充剂等以及利用更多的证据作为药物使用，应该至少从人类用途中排除出去。

POP的分析显示，PCDD和PCDF的总和为0.06pg/g的毒性当量(TEQ)WHO，DL-PCB的累计总和等于0.28pg/g的TEQ WHO，PCB标记物的总和为15ng/g，PBDE的总和为0.44ng/g且IPA的总和等于0.1ng/g的苯并[a]芘。

与以上类似，还将呈现根据以下方法制备的产物所获得的结果。

方法

向装配有搅拌器、冷凝器和温度计的四颈烧瓶中加入1500mL甲醇和750g尿素，然后在搅拌下加热回流，得到澄清溶液。

然后加入250g PUFA_EE的油性混合物(PUFA_EE:尿素的重量比为1:3)，在颜色为淡黄色，在沸腾的同时将混合物搅拌10分钟，从而获得乳白色的溶液，静置时在其表面上显示出少许油性物质。

假定络合完成，则加入另外的500mL甲醇和250g尿素(PUFA_EE:尿素的总重量比为1:4)，再次加热回流，搅拌几分钟，然后使混合物冷却。

描述了这一操作，很显然的，对于相同量的250g PUFA_EE，通过直接地使用2000mL甲醇和1000g尿素，将有利地进行该反应。

随着反应的进行，在58-60℃下开始进行PUFA_EE在尿素内的包合络合物的沉淀。当温度降到30℃时，在氮气气氛下关闭烧瓶，转移至约5℃的冰箱中，并静置约20小时(一夜)而不进行搅拌。

最后，在抽吸下通过布氏漏斗过滤而回收沉淀物，在布氏漏斗上充分挤压以完全除去母液，并用每份为300ml的饱和的尿素甲醇溶液且预先冷却至+5℃(通过将160g尿素溶解于1000mL甲醇中所获得的)的两份溶液连续地充分洗涤，由此获得无色的洗涤水。

然后在降低的温度和压力下干燥白色的结晶沉淀物，获得955g的尿素络合物，通过在约30℃下在2000mL的5％NaCl水溶液中溶解来回收PUFA_EE。这得到了表面上具有油分离的浑浊溶液。

然后用2份600mL正己烷连续地提取油相，且轻轻搅拌10分钟。

将上层有机层与水相分离并收集有机层，随后在降低的压力下并外部加热至约35℃，将正己烷蒸发至干而达到恒重，由此获得210g的无色油状残余物，其由纯化状态的所期望的PUFA_EE组成，其在氮气气氛下和5℃的冰箱中将其存储于密封容器中。

通常按照产品本身的样子使用产品，而不进行其它的操作。仍然可以除去任何痕量的溶剂，例如通过快速分子蒸馏或通过用超临界流体提取，两者都是在专家已知的标准条件下；根据EP1685222，可以通过少量硅胶\洗脱液正己烷的快速渗滤来消除任何痕量的极性物质。

如以上描述的通过GCMS分析产物，并且图3示出了气相色谱峰，同时表3列出了其由质谱法支持的属性和浓度百分比。

表3

EPA乙酯的含量为49.94重量％，DHA乙酯的含量为40.21重量％。

从这些数据推断的最明显的考虑是指对应于上述的3种呋喃脂肪酸的乙酯的峰完全消失。

气相色谱面积的轻微增加也主张了至少部分的具有低聚物结构的产物消除。

POP的值基本上全都是零。

实施例1A

遵照实施例1的方法，但是在用100g沸腾的尿素甲醇溶液(200mL)初始地处理25gPUFA_EE之后，向乳白色溶液中加入溶解于50mL沸腾甲醇的另外25g尿素(PUFA_EE:尿素的总重量比为1:5)，试图完成任何仍未反应的物质的络合，然后将混合物加热至沸腾，再持续10分钟。

仍然遵照实施例1的方法，最终得到的纯化的油性残余物的重量没有显著地成比例增加，其气相色谱图基本上与根据实施例1获得的相同。

实施例1B

将根据实施例1获得的络合反应的甲醇母液和甲醇洗涤溶液合并并在降低的压力下浓缩，并通过外部加热至约35℃直到消除约50％的甲醇，并开始形成白色沉淀物。

为了有助于沉淀，将混合物保持在冰浴中10分钟，然后通过在布氏漏斗上真空过滤来收集固体沉淀物，并充分挤压以完全除去母液。

然后如以上所述的，用两份预先冷却至+5℃的100ml饱和的尿素甲醇溶液连续地仔细洗涤沉淀物，以获得无色洗涤水。

然后在真空下干燥白色结晶沉淀物，得到178g产物，根据实施例1所描述的，在约30℃下将该产物溶解在1000mL 5％NaCl水溶液中，用200mL等分的正己烷提取两次，温和搅拌10分钟，以回收油性包合物质。

将上层有机相分离并合并有机相，同时弃去水相，然后将正己烷溶液在降低的压力下和约35℃的浴中浓缩至干，得到6.0g油状残留物，在氮气和5℃下将其保持在容器中，用于分析目的。

然而，GCMS分析显示不存在气相色谱峰，因此将油状物的结构归因于完全不存在各种PUFA乙酯的低聚物。

实施例1C

将根据实施例1B获得的甲醇母液和甲醇洗涤水合并并在降低的压力下浓缩，并通过外部加热至约35℃至干，以得到蜡质油状半固体残余物，通过随后的分析，显示由尿素、有限量的包合和不包合在尿素内的PUFA_EE、和大量不具有PUFA_EE结构且甚至完全是外来物的杂质组成。

例如，如实施例1或1B所描述的，然后从该残余物开始将PUFA_EE和所有存在的有机物质(还包括未包合在尿素络合物中的有机物质)全部回收，因此在约30℃下将残余物溶解于1000mL 5％NaCl水溶液中，随后在温和搅拌下用300mL等分的正己烷提取两次。

随后弃去水相，同时将两个上层有机相分离并合并有机相，然后在约35℃的水浴中，在降低的压力下将正己烷浓缩至干，得到34g蜡质油状残留物，在氮气和5℃下将其保持在容器中，用于分析目的。

如以上描述的，进行了GCMS分析，并且图4示出了气相色谱峰，同时表4列出了其由质谱法支持的属性和浓度百分比。

表4

然而，由于相对于原料，特别是相对于实施例1中提及的纯化部分，总GC面积大大降低(约-40/-45％)，这些浓度百分比仅表示GC单个面积相对于总面积的百分比，而没有考虑未被仪器检测器显示的物质(低聚物和聚合物，降解产物等)，因此将仅具有指示性意义。

该相对较少部分的EPA乙酯的含量为56.07％，而DHA乙酯的含量为30.72％。

从整个GC数据中扣除的首要的也是最明显的考虑是指，以强烈增加的浓度(具有与所得到的部分所减少的重量大致成反比的值)存在于起始物质中的3种呋喃脂肪酸的相应峰(RT:46.83min、53.75min、62.04min；相应地，含量百分比为2.35％、2.81％和2.33％)的存在性。

很显然的是，在起始物质的GC谱中未检测到对应于4种新呋喃酸的4个新峰的出现，显然是因为它们的浓度低于分析方法的检测限(LOD)和定量限(LOQ)((RT:48.62min、50.97min、58.85min、64.64min，含量百分比分别为0.15％、0.49％、0.52％和0.21％)。

还发现存在1个被鉴定为植烷酸乙酯的GC峰(RT:24.28min，含量为0.17％)，即使对于昂贵的色谱法也是如此：由于在起始物质中缺乏检测和计量，在这种情况下不是令人惊讶的，尽管药典并未明确禁止，但是在最近几年发现这种物质的毒性是越来越明显的并且对人体健康是有害的，就一些最明智的生产商而言正在做出大量努力以将其存在限制在检测限和定量限之下。

最后，发现了1个对应于角鲨烯的峰，即具有式C30H50而不具有脂肪酸结构的长链脂族烃(RT:65.92min，含量为1:29％)，由于其浓度低于检测限，在初始产物中也未被检测出。

POP的分析导致PCDD和PCDF的总和为0.48pg/g TEQ WHO，DL-PCB的累计总和为2.3pg/g TEQ WHO，PCB标记物的总和为118ng/g(0.118ppm)，PBDE的总和为3.1ng/g且最后与苯并[a]芘有关的物质为0.7ng/g。

通常将这种部分或类似部分丢弃，但是如果需要的话也可以使用其用于回收非常适量的EPA和/或DHA的乙酯，以及用于分离其它副产物，如用于特殊目的的植酸乙酯和呋喃脂肪酸乙酯。

在回收这些物质不会带来任何利益下，除了实施例1A中所描述的之外，还免去了纯化过程，同样免去了实施例1B和1C的纯化阶段，并且因此限制为仅有实施例1的方法，从而明显简化了方法并降低了相关成本。

实施例2

该实施例采用了与实施例1所使用的批次相同的ω-3酸的乙酯(图2示出了GC峰，表2列出了峰的属性和浓度的重量百分比)，同样也使用了相同的分析方法。此外，方法是有些类似的，具有使用乙醇作为溶剂所建议的几种变体，这导致溶解能力大大降低。

方法

将400mL乙醇和75g尿素装入烧瓶中，然后在搅拌下加热至回流，获得仍有少量尿素未溶解的基本溶液。

然后加入25g PUFA_EE油状混合物(PUFA:尿素的重量比为1:3)，然后将混合物在搅拌下继续沸腾10分钟，得到微黄色的混合物，几乎没有残余的悬浮物。

混合物在搅拌下自然冷却，在65℃时，所需的络合物开始沉淀。在30℃时，在氮气下关闭烧瓶，并置于约5℃的冰箱中，静置一夜以完成沉淀。

最后，通过布氏漏斗过滤来收集沉淀物，充分挤压以除去大部分母液，并用两份预先冷却至+5℃的50mL饱和的尿素乙醇溶液(通过将30g尿素溶解于200mL乙醇中所获得的)彻底洗涤，由此最终获得无色洗涤水。

干燥之后，随后获得74.6g白色结晶沉淀，通过在约30℃下将其溶解于200mL的5％NaCl水溶液中，然后用每份为100mL正己烷的两份溶液提取，来对纯化的PUFA_EE进行回收。

从水相中分离这两个有机相，并且进行合并，然后在约35℃和降低的压力下将正己烷蒸发至干，直至恒重，获得11.9g由纯化的PUFA_EE组成的无色油性残余物，在约5℃和氮气气氛围下将其存储。

通常按照产物本身的样子使用。如果需要的话，可以通过实施例1中记载的已知方法来消除任何痕量的溶剂或极性杂质。

GCMS分析表明，组合物完全与已经在图3和表3中描述的相似。特别是，确认了在起始原料中完全不存在3种呋喃酸乙酯。

实施例2A

在约35℃和降低的压力下，如以上实施例2所描述的，将过滤PUFA_EE在尿素内的包合络合物所分离出来的乙醇母液与乙醇洗涤溶液合并，进行浓缩，以消除约50％的乙醇，仅获得痕量的沉淀物。

随后加入另外的25g尿素(PUFA:尿素的总重量比为1:4，参考初始反应情况)，在缓慢搅拌下使混合物沸腾10分钟，以实现完全溶解。

然后使其在搅拌下冷却，在约60℃时开始沉淀，然后在约5℃的冰箱中静置过夜。

最后，通过布氏漏斗过滤沉淀物，挤压以完全除去母液，并用两份预先冷却至+5℃的50mL饱和的尿素乙醇溶液充分洗涤，如实施例2中所描述的。

干燥之后，由此获得34.5g白色沉淀物，通过溶解于200mL 5％NaCl水溶液并用两份100mL正己烷提取，如实施例2中所描述的，从中基本上回收了PUFA_EE，。

根据实施例2将正己烷提取物蒸发至干，产生了另外的5.8g无色油状残余物，其也由纯化的PUFA_EE组成，将其存储于氮气和5℃中。

GCMS分析证实了产物的纯度，并且显示其组成基本上与图3和表3中所描述的相同，因此将该产物与实施例2的产物合并，从而得到17.7g的总产量。

POP的分析表明，其含量“基本为零”。

实施例2B

基本上按照实施例1C的步骤进行，在降低的压力和约35℃的温度下，将前一阶段的乙醇母液和乙醇洗涤液浓缩至干，随后用5％NaCl水溶液处理所得到的蜡质固体残余物，并用正己烷提取两次，以回收任何最终仍存在的包合在尿素内的PUFA_EE，以及不b包合在尿素内的除了PUFA之外的其它物质。

最后，弃去水相，同时将正己烷蒸发至干，回收8.2g蜡质固体残余物，并存储于+5℃和氮气下，用于分析目的以及用于特定物质的最终回收。

与实施例1C中记载的数据相比较，GCMS分析示出了GC面积显著降低，低于10％的量级，还通过相对于实施例1C的3.6g由8.2g的重量所显示的(大于约2.3倍)，表明较多量的EPA和DHA的酯保留在从纯化反应得到的含有杂质的该部分中。

GC面积比示出了，EPA酯含量为56.94％，且DHA酯含量为34.68％。

除了证明它们的浓度由于较高稀释度而低约2.3倍之外，外来杂质的图像与实施例1C的图像几乎完全重叠。

因此，已经在原料中突出的，在44.91min(0.71％)、51.83min(0.91％)和60.10min(0.83％)处展示了3种呋喃脂肪酸的乙酯，并且在48.93min(0.16％)、57.11min(0.18％)、62.46min(0.09％)处展示了3种其它的呋喃酸的酯，而在这种情况下，根据实施例1C，RT为48.62min处的唯一酯仍在检测限以下。

也证实了在23:21min处的植烷酸乙酯(0.03％)和在63.64min处的角鲨烯(0.70％)。

即使证实了POP的浓度是起始原料的2-3倍，但是没有达到实施例1C得到的部分的浓度。

实施例3(根据文献)

将一批中等浓度的ω-3酸乙酯用于纯化。

众所周知，PUFA起始浓度取决于它们的生产来源，例如，通常鱼油具有的ω-3的最大含量为20-30％，产物通常具有18％的EPA和12％的DHA。相当粗略的指标包括饱和、单不饱和及n-3多不饱和酸(少量的n-6)，每类大概占组合物的三分之一。

在酯交换或水解之后，例如，通过蒸馏低沸点馏分，或者通过用适量的尿素使饱和及单不饱和组分和/或比EPA和DHA饱和的不饱和组分进行部分选择性络合反应，获得了中等浓度的组合物。

在该实施例3中，采用了与欧洲药典6.3的专论2063表明的组合物之一(ω-3-酸乙酯60)明显一致的一批ω-3-酸乙酯(第065/07批)，如其GC面积与总面积的比率所测量的，含有乙酯形式的EPA 36.1％和DHA 26.9％。由于特定的“尺寸排阻”色谱所导致的面积减少，这些数据分别对应于33.0重量％和24.6重量％。

其它组分是饱和的C18:0(0.6％)，单不饱和的组分如C18:1n9(6.9％)、C18:1n7(2.7％)、C20:1n9(2.0％)、C22:1n11(1.7％)，及多不饱和组分如C18:2n6(1.1％)、C18:3n3(0.7％)、C18:4n3(2.0％)、C20:4n6(2.4％)、C20:4n3(1.9％)、C21:5n3(1.7％)、C22:5n6(0.8％)和C22:5n3(5.2％)。

其它的许多组分都低于0.5％。

已经在实施例1中使用的批次所突出的，在该样品中也检测到了3种呋喃酸的乙酯，每种浓度约为0.2％且植烷酸乙酯的浓度为0.16％。

对POP的分析显示，PCDD和PCDF的总和为以WHO TEQ表示的0.56pg/g，若加上DL-PCB则达到3.6pg/g TEQ，PCB标记物为75ng/g，且PBDE为5.2ng/g，基本上不含苯并[a]芘。

方法

制备150g沸腾的尿素甲醇溶液，然后加入100g上述脂肪酸乙酯的混合物(PUFA:尿素的重量比为1:1.5)。

按照实施例1进行的，将混合物冷却至约5℃过夜，得到由各种酸酯的尿素包合络合物所组成的大量沉淀物。

然后如实施例1中的，用布氏漏斗过滤沉淀物，充分挤压以除去母液，并用饱和的尿素甲醇溶液彻底洗涤(推荐，在文献的描述中通常不存在)，并冷却至+5℃。

干燥之后，将沉淀物溶解于5％NaCl水溶液中，总是按照实施例1中的，用正己烷将所分离的油提取两次。

然后将溶剂蒸发以获得约42g的油性残余物，如GC分析所证实的，其主要包含饱和酸、单不饱和酸及比EPA和DHA饱和的多不饱和酸的乙酯组成，并且还包含总共10-15％的EPA和DHA的酯。

然而，注意到，存在于起始物质中的三种呋喃酸和植烷酸的酯完全不存于该该残留物中，另外通过特定分析还证实了上述类别的杀虫剂(POP)完全不存在。

根据文献，然而产品的该部分被丢弃，或者大多数用于回收所存在的受限量的EPA和DHA的酯。

实施例3A(根据文献)

例如，如实施例1C所示的，将实施例3的甲醇母液与甲醇洗涤水合并，浓缩至干，随后将残余物溶解于5％NaCl水溶液中，并且用正己烷将分离出的油相提取两次。

在除去水相之后，将有机溶剂蒸发至干，得到56g橙棕色的油性残余物，其包含在实施例3的方法中未与尿素络合的PUFA酯。

该产物的GC分析显示了，基于GC面积比的EPA和DHA的乙酯含量为86.4％，对应于50.1％的EPA和36.3％的DHA。

然而，由于GC总面积非常低，并且物质的颜色本身清楚地表明了降解物质的积聚，因此显然需要进行纯化步骤，例如，通过分子蒸馏。总之，在标准文献条件下蒸馏后，获得了含有49.0重量％的EPA乙酯和36.2重量％的DHA乙酯形式的浅黄色组合物，总共为85.2重量％。该产物还包含痕量的饱和及单不饱和酸的酯、及约2％的C18:4n3、约0.5％的C20:4n3、1.6％的C21:5n3和1.8％的C22:5n3，另外还有2.5％的C20:4n6和0.8％的C22:5n6。

其它组分的数量大大减少，每种都低于0.5％，然而，存在的严重缺点是，与它们在原料中的相比，植烷酸的乙酯和所有呋喃酸的酯的浓度基本上是几乎双倍的。

即使各种POP也是全部存在的，然而与获得的组合物的重量成反比例地增加，因此所获得组合物的浓度几乎是初始产物的两倍。

实施例3B(新的)

如实施例1所述的，在搅拌下将根据实施例3A所获得的56g蒸馏组合物加入到224g沸腾的尿素甲醇溶液中(PUFA:尿素的重量比为1:4)。

按照实施例1继续进行该方法，冷却后，最终通过过滤收集PUPA在尿素内的包合络合物的大量沉淀物。总是按照实施例1中的，在彻底洗涤沉淀物后，按照相同的方法进行PUFA_EE的回收，最后得到纯化的无色油，其具有基本上相同的测定结果，EPA酯等于49重量％且DHA酯等于36重量％或更高(总含量>85重量％)，但完全不含植烷酸和呋喃酸的酯，也不含持久性有机污染物POP。

如果需要的话，例如，为了除去残留的痕量有机溶剂，可以将产物进一步进行分子蒸馏或用超临界流体提取。可以消除含有各种杂质的络合相的甲醇滤液。如果为了分析目的而回收，例如，根据实施例1C，获得了12g油状物质，其含有约70％的EPA和DHA的乙酯(如果需要的话，可以通过与尿素进一步络合来寻求回收)，且浓度约10倍更高，尽管含有存在于原料中的所有杂质和POP。

实施例3C(新的)

与实施例3B相一致地处理根据实施例3A获得的56g橙棕色的粗组合物的样品，并且类似地将其加入到224g沸腾的尿素甲醇溶液(PUFA:尿素的重量比为1:4)中。

通过分离和洗涤PUFA在尿素内的包合络合物，然后以相似方式回收48g已经纯化的PUFA_EE，其是以无色油状物的形式，且完全不含植烷酸和呋喃酸的酯和持久性有机污染物POP。

通过分子蒸馏非常少量的低沸点馏分，得到了高度纯化的组合物，例如含有47重量％的EPA_EE和38重量％或更高的DHA_EE(根据E.P.和USP的说明书，总含量>85重量％)。

其它次要组分，包括不饱和度比EPA和DHA低的PUFA的酯，与实施例3A的初始产物基本上没有区别。

可替换地，使用了如实施例3A中所描述的且含有56g粗PUFA组合物但未事先分离的甲醇母液，并且将该甲醇溶液加热至沸腾并添加224g尿素(PUFA:尿素的重量比为1:4)。

然后，通过上述进行的，最终得到了与上述实施例3C中的非常相当的纯化的PUFA组合物。

实施例3D(新的)

将含有单不饱和及多不饱和酸的各种酯及其它组分的物质的样品(根据实施例3的方法获得的，其全部具有低测定值，但基本上不含植烷酸和呋喃酸的酯以及POP)与具有高测定值(85重量％或更高)的EPA和DHA的乙酯的样品(其也不含相同的杂质，例如根据实施例3C获得的)混合。样品的比率将基于在纯化步骤中获得的重量，例如，42:48。

如实施例3中所述的，所得样品的组成基本上与初始产物的组成相同，其含有约33.0重量％的EPA乙酯和约24.6重量％的DHA乙酯，但具有高度纯化的优点，即基本上不含植烷酸和呋喃酸的乙酯以及POP。

此外，次要PUFA的其它酯组分将具有基本相同的含量。

可替换地，也可以直接从例如根据相同的实施例3和3C获得的包合物的混合物开始，并彻底洗涤，然后共同进行回收所有包合的PUFA，例如33.0重量％的EPA和24.6重量％的DHA，即中等浓度，并且不含所有已经指出的杂质。

实施例3E(新的)

作为另一种替换方案，在一个步骤中用含有过量尿素的沸腾甲醇溶液(以与所有存在的脂肪酸酯形成包合络合物的量)处理如实施例3所述的含有中等浓度的EPA和DHA的同一批次的长链脂肪酸乙酯的样品(脂肪酸酯:尿素的重量比为1:4或更高)。

如上所述，收集通过冷却而沉淀的络合物并对其彻底洗涤，用常规方法回收具有与反应样品的组合物基本相同的组合物、但完全不含植烷酸和呋喃酸的乙酯及POP的无色油性组合物。

Claims (38)

1.一种组合物，其包含属于ω-3和/或ω-6系列、具有2-6个双键和18个或更多个碳原子的动物和/或植物来源的长链多不饱和脂肪酸或其盐或酯，所述组合物基本不含呋喃脂肪酸或其盐或酯，其中所述呋喃脂肪酸或其相应的盐或酯的总浓度不高于0.1％，即不高于1000ppm，且优选不高于0.01％，即不高于100ppm。

2.根据权利要求1所述的组合物，其基本上不含植烷酸和/或降植烷酸或其相应的盐或酯，其中所述植烷酸和/或降植烷酸或其相应的盐或酯的总浓度不高于0.01％，即不高于100ppm，且优选不高于0.001％，即不高于10ppm。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的组合物，其基本上不含角鲨烯，其中所述角鲨烯的浓度不高于0.01％，即不高于100ppm，且优选不高于0.001％，即不高于10ppm。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其基本上不含根据权利要求1-3所述的长链多不饱和脂肪酸或其盐或酯的低聚物，其中所述低聚物的浓度不高于1.0％。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其基本上不含多氯二苯并对二噁英(PCDD)和多氯二苯并呋喃(PCDF)，其中所述PCDD和所述PCDF的总浓度不高于1.0pg/g，优选不高于0.1pg/g，根据WHO的毒性当量因子(TEF)确定并表示为毒性当量(TEQ)的值。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其基本上不含PCDD、PCDF和二噁英类多氯联苯(DL-PCB)，其中所述PCDD、PCDF和DL-PCB的总浓度不高于5.0pg/g，优选不高于0.5pg/g，根据权利要求5确定的值。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其基本上不含PCB标记物，其中所述PCB标记物的总浓度不高于5.0ng/g，优选不高于0.5ng/g。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其基本上不含多溴二苯醚(PBDE)，其中所述PBDE的总浓度不高于5.0ng/g，优选不高于0.5ng/g。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其基本上不含多环芳烃(PAH)，其中表示为苯并[a]芘标记物质的所述PAH的总浓度不高于1.0ng/g，优选不高于0.1ng/g。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其基本上不含其它持久性有机环境污染物(POP)，所述POP包括2,2-双(对二氯苯基)-乙烷(DDE)、和/或2,2-双(对氯苯基)-1,1-二氯乙烷(DDD)、和/或2,2-双(对氯苯基)-1,1,1-三氯乙烷(DDT)、和/或多溴-联苯(PBB)、和/或六氯苯和/或六氯环己烷的异构体，其中所述DDE和/或DDD和/或DDT的总浓度不高于2.0ng/g，优选不高于0.2ng/g，所述PBB的总浓度不高于5.0ng/g，优选不高于0.5ng/g，所述六氯苯的浓度不高于0.1ng/g，优选不高于0.01ng/g，并且所述六氯环己烷的异构体的总浓度不高于0.1ng/g，优选不高于0.01ng/g。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述脂肪酸具有海洋来源，特别是源于包括水产养殖鱼的鱼油，或源于磷虾油，或甚至源于藻类和其它产油微生物，或源于从选定的藻类菌株或其它微生物菌株的“单细胞发酵”，并且包含二十碳五烯酸(EPA，C20:5n-3，全顺式)和/或二十二碳六烯酸(DHA，C22:6n-3，全顺式)或其盐或酯。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述酯是烷基酯，优选C1-C3。

13.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述酯是甘油单酯和/或二酯和/或三酯。

14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述烷基酯是乙酯，并且EPA或EPA乙酯或者DHA或DHA乙酯或其总和的浓度是包括在所述组合物的15重量％和100重量％之间，优选50重量％和100重量％之间。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述EPA乙酯或所述DHA乙酯的浓度大于或等于80重量％，优选大于或等于90重量％，或者它们的总和大于或等于80重量％，优选大于或等于84重量％，即所述EPA乙酯的浓度大于或等于40重量％，所述DHA乙酯的浓度大于或等于34重量％，并且所有ω-3乙酯的浓度总和大于或等于90重量％，符合欧洲药典(EP)的规定。

16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述EPA乙酯和所述DHA乙酯的浓度总和是包括在80.0重量％和88.0重量％之间，即所述EPA乙酯的浓度是包括在43.0重量％和49.5重量％之间，所述DHA乙酯的浓度是包括在34.7重量％和40.3重量％之间，并且所有ω-3乙酯的浓度总和大于或等于90重量％，符合美国药典(USP)的规定。

17.根据权利要求13所述的组合物，其中EPA或DHA或其总和的浓度是包括在所述组合物的15重量％和100重量％之间，优选在50重量％和100重量％之间。

18.一种制备根据权利要求1-12和14-16中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括以下阶段：

a)使包含具有至少18个碳原子和ω-3和/或ω-6系列的2-6个双键的至少一个酰基的包括海洋、水产养殖、藻类或发酵来源的动物或植物来源的油或脂肪进行碱水解或酸水解或者与脂肪醇，优选C1-C3，任选在酶催化下进行酯交换；

b)通过使所述水解或所述酯交换的所述产物全部包合在尿素中来进行纯化过程，以获得经过分离和洗涤的包合络合物；

c)通过将所述包合络合物溶解在水中并分离所述溶解后所形成的油相，或者通过用与水不混溶的有机溶剂，通常为己烷提取所述油相，随后蒸发所述溶剂至干，或者通过借助超临界流体，特别是二氧化碳，从所述包合络合物中直接提取，而获得根据权利要求1-12和14-16中任一项所述的组合物。

19.根据权利要求18所述的方法，包括以下阶段a')：在进行包合于尿素中的所述步骤b)之前，通过蒸馏、或分子或“短程”蒸馏，通过利用尿素以逐渐络合反应而分馏出饱和组分及其它不饱和度低的组分，并通过逆流提取、硝酸银水溶液提取、超临界流体提取和/或分馏来消除所形成的络合物，使由阶段a)的所述水解或所述酯交换获得的所述产物进行所述多不饱和组分的浓缩过程。

20.根据权利要求18和19中任一项所述的方法，包括以下阶段d)：使在所述阶段c)中回收的所述多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯进行分子/短程蒸馏或用超临界流体提取。

21.一种用于纯化包含属于ω-3和/或ω-6系列且具有2-6个双键和18个或更多个碳原子的动物和/或植物来源的长链多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯，优选C1-C3的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在沸腾温度下，用极性溶剂，优选质子溶剂，如甲醇或乙醇，任选地含有多达20％的水中的至少3重量份的尿素，来处理1重量份的所述组合物，以形成含有所述组合物的尿素包合络合物；

b)冷却以沉淀所述尿素络合物并通过过滤或离心将其分离出来；

c)通过将所述尿素包合络合物溶解在水中并分离所述溶解之后所形成的油相，或者通过用与水不混溶的有机溶剂，典型为己烷等，提取所述油相，随后蒸发所述溶剂至干，或者通过借助超临界流体，特别是二氧化碳，从所述尿素包合络合物中直接提取，而获得根据权利要求1-12和14-16中任一项所述的组合物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中在将通过过滤分离出来的所述尿素络合物溶解于水中或用超临界状态的流体提取之前，利用先前用尿素饱和的所述极性溶剂进行洗涤。

23.根据权利要求21和22中任一项所述的方法，其中包含动物和/或植物来源的长链多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯的所述组合物具有海洋来源，以及源自可能来自水产养殖鱼的鱼油，或源自磷虾油，或甚至源自藻类或其它产油微生物，或从选定的藻类菌株或包括重组菌株的其它微生物菌株的单细胞发酵，并且包含EPA和/或DHA或其盐或烷基酯，优选C1-C3，或者所述组合物源自种子油或植物来源的其它油脂，并且具有大于或等于15％的多不饱和组分的平均浓度。

24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述组合物的所述多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯的含量是包括在15％和30％之间，并且其中用尿素处理所述组合物的所述阶段a)是以3个连续的步骤用3-6总重量份的尿素处理1重量份的所述组合物来进行的。

25.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述组合物的所述多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯的含量是包括在31％和80％之间，并且其中用尿素处理所述组合物的所述阶段a)是以2个连续的步骤用3-5总重量份的尿素处理1重量份的所述组合物来进行的。

26.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述组合物的所述多不饱和脂肪酸或其盐或烷基酯的含量大于80％，并且其中用尿素处理所述组合物的所述阶段a)是以单个步骤用3-4重量份，优选4重量份的尿素处理1重量份的所述组合物来进行的。

27.根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中所述包含长链多不饱和脂肪酸的组合物的EPA乙酯或DHA乙酯的浓度或其浓度总和是包括在所述组合物的15％和100％之间、优选50％和100％之间，或者所述EPA乙酯和所述DHA乙酯的浓度总和大于或等于80％，即所述EPA乙酯大于或等于40％，所述DHA乙酯大于或等于34％，并且所有ω-3酸乙酯的浓度总和大于或等于90％。

28.根据权利要求21-27中任一项所述的方法，其中用尿素处理所述组合物的所述阶段a)是通过采用4.5-7重量份的量的甲醇或45-65重量份的量的乙醇作为所述极性溶剂进行的。

29.根据权利要求21-28中任一项所述的方法，其中根据阶段c)利用与水不混溶的有机溶剂提取溶解于水后所分离出的所述油相并随后蒸发所述溶剂至干，得到了进行分子/短程蒸馏的残余物。

30.根据权利要求21-29中任一项所述的方法，其中将从分离所述尿素包合络合物的所述阶段b)过滤或离心后获得的所述溶液浓缩至干，以得到富含呋喃酸、植烷酸、降植烷酸或其盐或烷基酯，优选C1-C3，和角鲨烯的组合物，可用于通过如利用有机溶剂或超临界条件下的其它流体，如二氧化碳进行的分子蒸馏和/或色谱法的技术分离所述化合物。

31.根据权利要求11-17中任一项所述的组合物在制备用作食品配料、食品和膳食补充剂、特殊医疗用途食品(功能性食品)、动物和水产养殖用食品、婴幼儿食品配方、化妆品和药物制剂的用途，由于其具有多不饱和特性或特别是属于ω-3系列的长链脂肪酸或其衍生物的含量高，或者通过化学途径制备其它衍生物，例如相应的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的用途。

32.根据权利要求11-12和14-16中任一项所述的组合物用于通过化学途径或优选的酶促途径来制备属于ω-3和/或ω-6系列、具有2-6个双键和18个或更多个碳原子的动物和/或植物来源的所述长链多不饱和脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的用途。

33.根据权利要求11-17中任一项所述的组合物，可选地与其它药物且特别是与他汀类药物组合，用于在预防和治疗心脏、心血管和心脏循环疾病的风险因子，特别是以家族性和遗传性形式的，如高血压、凝血和血小板凝聚的缺陷、严重和中度高甘油三酯血症(相应地>500mg/dl和>200mg/dl)和高胆固醇血症中使用。

34.根据权利要求11-17中任一项所述的组合物，用于在预防和治疗心脏、心血管和心脏循环疾病，如冠状动脉粥样硬化性疾病和包括心肌和脑梗塞在内的心脑血管缺血状态，以及降低心肌梗塞之后的心脏猝死的风险；由于电的原因引起并涉及心律的发作和传播的疾病，包括心律失常和心房和/或心室纤颤；和由于心脏泵的机械缺陷引起的疾病，如心功能不全和代偿失调，和/或充血性心力衰竭中使用。

35.根据权利要求11-17中任一项所述的组合物，用于在预防和治疗中枢神经系统(CNS)疾病，包括癫痫、各种形式的抑郁症、双相障碍、注意力缺陷和多动障碍(ADHD)的儿科障碍、学习和记忆缺陷、各种形式的精神分裂症、阿尔茨海默病和其它形式痴呆症中使用。

36.根据权利要求11-17中任一项所述的组合物，用于在预防和治疗视网膜病和干眼症、代谢综合征、代谢和肥胖相关的缺陷、2型糖尿病、肝病、结缔组织和关节疾病、炎症、自身免疫病、溃疡性结肠炎、牛皮癣和肿瘤疾病中使用。

37.一种包含根据权利要求11-17中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体的药物制剂。

38.根据权利要求1-12和14-16中任一项所述的组合物，其中所述酯是烷基酯，优选C1-C3，并且所述组合物是通过根据权利要求21-29中任一项所述的方法能够获得的。