ITUB20152896A1

ITUB20152896A1 - Composizioni purificate di acidi grassi polinsaturi, loro metodo di preparazione e loro uso

Info

Publication number: ITUB20152896A1
Application number: ITUB2015A002896A
Authority: IT
Inventors: Tiberio Bruzzese
Original assignee: Tiberio Bruzzese
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2015-08-05
Publication date: 2017-02-05

Description

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda nuove composizioni purificate di acidi grassi poiinsaturi (PUFAs) a lunga catena, o loro sali o esteri, caratterizzate dal fatto di essere essenzialmente prive di altri componenti usualmente presenti, ma strutturalmente diversi, come gli acidi grassi furanici, gli acidi titanico e pristanico, lo squalene, e alcuni oligomeri, come pure dei numerosi inquinanti ambientali cosiddetti “persistenti” (POPs, persistent organic pollutants), come le policlorodibenzo-diossine e policloro-dibenzo-furani, i policloro-bifenili, i polibromo-difenileteri, gli idrocarburi aromatici policiclici, e altri, anche essi usualmente presenti ed estremamente tossici. L’invenzione riguarda anche il metodo di purificazione che porta a dette composizioni e il loro uso come alimento, alimento per uso medico speciale, supplemento alimentare e dietetico, e come farmaco, incluso anche l'uso nell’animale e nella acquacoltura. Π metodo di purificazione consiste nel trattamento di una composizione di PUFAs alla concentrazione desiderata, usualmente ad elevata concentrazione, con ima quantità di urea adeguata alla complessazione totale di tutti i PUFAs presenti, e nella successiva separazione ed isolamento per filtrazione del complesso di inclusione in urea dei PUFAs purificati e della fase solvente contenente gli altri prodotti strutturalmente diversi e i numerosi inquinanti ambientali “persistenti”.

BACKGROUND DELL’INVENZIONE

Gli acidi grassi poiinsaturi a lunga catena, contenenti 2-6 doppi legami e 18 o più atomi di carbonio, vengono contraddistinti in dipendenza dalla posizione del primo doppio legame a partire dal metile terminale, come “omega-6” (oppure n-6) e “omega-3” (oppure n-3).

Tipici rappresentanti delle due famiglie di acidi sono rispettivamente Tacido linoleico (LA, C18:2 n-6) e Tacido alfa-linolenìco (ALA, C18:3 n-3), definiti essenziali in quanto non sono sintetizzati dall’organismo, ma devono essere introdotti con la dieta. Entrambi subiscono nell’organismo un allungamento della catena e un aumento del grado di insaturazione per effetto di specifici sistemi enzimatici denominati elongasi e desaturasi. Gli acidi omega-6 più noti sono l’acido gamma-linolenico (GLA, CI 8:3 n-6) e l’acido arachidonico (ARA, C20:4 n-6) e gli acidi omega-3 definiti acido stearidonico (o acido morottico, SDA, C18:4 n-3), acido eicosatetraenoico (ETÀ, C20:4 n-3), acido eneicosapentaenoico (C21:5 n-3), acido docosapentaenoico (o acido clupanodonico, DPA, C22:5 n-3), e in particolare l’acido eicosapentaenoico (o acido timnodonico, EPA, C20:5 n-3, tutto cis ) e l’acido docosaesaenoico (o acido cervonico, DHA, C22:6 n-3, tutto cis ).

In tutti i casi, gli acidi grassi poiinsaturi a lunga catena si trovano in rapporto variabile tra loro, ed anche in miscela con quantità sostanziali di acidi saturi e monoinsaturi come l’acido oleico (CI 8:1 n-9).

In natura, questi acidi grassi si possono trovare in forme diverse, come p.e. nei fosfolipidi, ecc., ma più frequentemente si trovano sotto forma di oli (o grassi), cioè come esteri con la glicerina (gliceridi). Gli acidi omega-6 sono particolarmente abbondanti negli oli e nei semi vegetali, mentre gli acidi omega-3 e in particolare EPA e DHA hanno prevalentemente provenienza marina e derivano in particolare dagli oli di pesce, anche da acquacolture, o dai “krill oils” oppure ancora da alghe e altri microrganismi oleaginosi, o da “single celi fermentation” a partire da selezionati ceppi di alghe o altri microrganismi.

Questi oli subiscono usualmente dei trattamenti iniziali standard, come lo sbiancamento e la neutralizzazione, quindi l’attuale tecnologia prevede la concentrazione o l’isolamento da queste miscele complesse dei componenti più interessanti per l’uso farmaceutico o come supplementi alimentari o dietetici, come appunto EPA e/o DHA.

A questo scopo, in una prima fase gli oli naturali (i gliceridi) vengono sottoposti a un blando procedimento idrolitico, p.e. mediante potassa alcolica, ottenendo così i corrispondenti sali potassici e quindi gli acidi liberi e - se desiderato - gli esteri alchilici; oppure più spesso si ricorre a reazione di transesterificazione p.e. in presenza di alcoli alifatici in eccesso, preferibilmente C1-C3, e di catalizzatore alcalino o acido, ottenendo così direttamente i corrispondenti esteri alchilici degli acidi grassi, e da questi - se desiderato - i relativi acidi o sali.

A partire da anni recenti, detti procedimenti di idrolisi o alcoolisi, oltre che per via chimica vengono anche condotti per via enzimatica, mediante lipasi selettive, anche immobilizzate: questo permette di operare in condizioni di reazione ancora più blande, inoltre - in virtù della maggiore resistenza dei PUFAs alla scissione enzimatica, rispetto agli acili saturi e monoinsaturi - è possibile isolare composizioni intermedie di gliceroli ancora parzialmente acilati e arricchiti in PUFAs (vedi p.e. Kapoor R e Patii UK, Int Food Res J, 18, 493, 2011), da sottoporre ad idrolisi o alcoolisi in una fase separata. Ritornando al caso più generale , alla prima fase viene generalmente fatto seguire un trattamento destinato ad aumentare la concentrazione del componente desiderato, tipicamente EPA o DHA o la loro miscela in rapporti prefìssati, prevalentemente come esteri etilici o anche come acidi o sali, se preferiti.

Questo trattamento, spesso ripetuto più volte e anche combinando varie metodiche, prevede diverse tecnologie, tra le quali essenzialmente:

-la distillazione sotto alto vuoto, usualmente la distillazione molecolare o short path più idonea a limitare i processi termici degradativi, provvedendo ovviamente agli opportuni frazionamenti;

-alcuni procedimenti cromatografici, anche sotto alta pressione (HPLC), più idonei tuttavia alla scala di laboratorio o a scopo analitico;

-la estrazione contro-corrente;

-la estrazione con nitrato d’argento acquoso;

-la estrazione con fluidi supercritici (SFE), usualmente con C02, anche in abbinamento con processi cromatografici (SFC) su scala preparativa e con idonea fase stazionaria, più specifici per la separazione di componenti singoli, e condotti sia in fase continua sia mediante cromatografia “a batch);

-nel caso più generale ed industrialmente accettato, si ricorre tuttavia ad una reazione di complessazione con urea in solvente alcolico o altri solventi e sospendenti noti all’esperto. E’ noto che l’urea in particolari condizioni può cristallizzare in cristalli esagonali, con formazione di canali in grado di includere le catene lineari degli acidi grassi, e che questa inclusione avviene essenzialmente con gli acidi e con gli esteri saturi e/o monoinsaturi dotati appunto di strutture più lineari. Il complesso di inclusione formatosi precipita per raffreddamento dalla soluzione alcolica e viene allontanato per filtrazione, permettendo quindi di recuperare dalla soluzione una composizione fortemente arricchita in componenti poiinsaturi, come p.e. EPA e DHA. La complessazione con urea si configura pertanto come un processo “passivo” in quanto in realtà avviene soprattutto con i componenti saturi e monoinsaturi, mentre i PUFAs in concentrazione arricchita vengono recuperati dalle acque madri. Rassegne esaurienti su questi complessi con urea e sulla loro preparazione sono quelle di Schlenk H, “Urea inclusion compounds of fatty acids”, in: Progress in thè Chemistry of Fats and Other Lipide Voi II (RT Holmar, ed.), Pergamon Press, New York, pp. 243-267 (1954), e di Swern D, “Techniques of separation. Urea complexes”, in: Fatty Acids, Pari: 3 (KS Markley, ed.), Interscience, New York, pp. 2309-2358 (1963). Altri riferimenti più specifici saranno dati nel prosieguo.

I vari procedimenti generici di arricchimento dei PUFAs sono adeguatamente riassunti da Breivik H, “Concentrates”, in: Long-Chain Omega-3 Specialty Oils (H Breivik, ed.), The Oily Press, Bridgwater, pp.

111-130 (2007) - arricchimento dei PUFAs per via enzimatica, pp. 146-155 - nel seguito citato come “Breivik 2007”.

In genere tutte queste operazioni sono concluse con una fase di distillazione molecolare finale, destinata ad allontanare residue frazioni basso-bollenti, inclusi i solventi organici introdotti durante la lavorazione, o a limitare la presenza di frazioni alto-bollenti costituite in particolare da materiale “oligomerico” (prodotti polari di ossidazione e degradazione, ed a vario grado di polimerizzazione), che sempre accompagna ognuna delle manipolazioni effettuate con queste instabili sostanze polinsature, in accordo con quanto riportato dalla Farmacopea Europea (E.P.), monografia 1250. Questi oligomeri vengono dosati, a differenza dei PUFAs che vengono analizzati per mezzo della gascromatografia (GC), mediante cromatografia “size-exclusion” o “gel permeation” e devono essere infatti secondo la E.P. al massimo 1%.

Una alternativa alla distillazione è data dall’uso di fluidi in condizioni “supercritiche”, che vengono usati sia a scopo soltanto estrattivo, sia a scopo cromatografico p.e. per la graduale separazione di EPA e DHA.

Sappiamo inoltre dalla letteratura che le sostanze poiinsature naturali, e gli oli di pesce in particolare, sono gravemente inquinate da sostanze di varia natura, tutte nocive per la salute se ingerite come farmaco o come alimento o come supplemento alimentare, nell’uomo e nell’animale, e non idonee neppure come alimento del pesce stesso derivante da acquacoltura.

Si tratta per esempio di prodotti di degradazione naturale indotti dagli agenti atmosferici o dalla lavorazione chimica, come gli epossidi e i perossidi, questi ultimi potenzialmente pericolosi per la salute in quanto dotati di azione aterogena e mutagena (p.e. Carroll KK, Cancer Res, 35,3374,1975), e come i sopra citati oligomeri e polimeri. Impurezze “naturali”, ma pur sempre strutturalmente estranee alle composizioni di acidi poiinsaturi prodotte, sono rappresentate dal colesterolo e da altri numerosi steroli vegetali e animali, sistematicamente presenti negli oli di semi e in quelli di origine marina (PCT/WO 87/03899; Connor WE and Lin SE, Metab Clin Exp, 31, 1046, 1982).

Anche spesso presenti sono alcuni idrocarburi ramificati a lunga catena come lo squalene C30H50 e altri. Altri Autori riportano anche la sistematica presenza di numerosissimi derivati ciclici degli acidi grassi, in quantità certamente non trascurabile, genericamente definiti come acidi grassi furanici: tutte queste sostanze non risultano affatto studiate sotto il profilo tossicologico, o lo sono in modo molto parziale, e la loro presenza risulta quindi totalmente ingiustificata sotto il profilo della loro stessa struttura in composizioni per definizione costituite p.e. da “acidi grassi omega-3”, e sotto il profilo della loro sicurezza di impiego in composizioni che sono destinate all’uso come alimento o farmaco nell’uomo. Molti, ma non tutti, degli acidi grassi furanici presenti sono chiaramente evidenziati nell’analisi GC di Figura 1. tratta dalla succitata monografia 1250 “Omega-3-acid ethyl esters 90” della E.P. 6.3 del 2008 (vedi Allegato), e la loro presenza è tuttora confermata nelle più recenti monografie 07/2012: 1250 della E.P. 8.0 e pag. 4059-61 della USP 37 (Tabella 1, riportata qui di seguito), entrambe tuttora in vigore.

TABELLA 1

Estere etilico identificato Tempo di ritenzione relativo

Acido titanico 0.416

C16:3 n-4 0.431

C16:4 n-1 0.468

C 18:3 n-6 0.557

C18:3 n-4 0.574

C18:3 n-3 0.585

CI 8:4 n-3 0.608

C18:4 n-1 0.618

Acido furanico 5 0.691

C19:5 0.710

C20:3 n-6 0.720

C20:4 n-6 0.736

Acido furanico 7 0.744

C20:4 n-3 0.777

Acido furanico 8 0.783

EPA 0.796

Acido furanico 9 0.867

C21:5 n-3 0.889

C22:4 0.917

Acido furanico 10 0.922

C22:5 n-6 0.939

Acido furanico 11 0.963

C22:5 n-3 0.977

DHA 1.000

La struttura chimica di questi acidi furanici è chiaramente

delucidata e riportata nel volume di H Breivik 2007 sopra citato, pagine

130-132 , e nei numerosi Riferimenti bibliografici ivi citati, anche se in

aggiunta è stata riscontrata - anche da noi stessi - la presenza di altri

derivati di-metil-sostituiti nelle posizioni 2 dell'anello {uranico. In

accordo con Breivik, una procedura di concentrazione dei PUFAs

mediante urea e distillazione molecolare porta a un prodotto con

contenuto dei vari acidi furanici da uguale a parzialmente ridotto (vedi Tab.6), ma mai nullo. Probabilmente per il loro elevato numero e per le loro differenziate caratteristiche fisiche, come desumibile dai differenti tempi di ritenzione e quindi dalle differenti posizioni nel cromatogramma GC, non abbiamo conoscenza di significativi tentativi per eliminare questi componenti, che rimangono così presenti negli attuali prodotti commerciali.

Anche usualmente presenti sono l’acido titanico, un acido saturo ramificato a lunga catena (acido tetrametil-esadecanoico, PhA), come dimostrato dalla stessa Tabella 1 e dalla Figura 1 riportata in Allegato, tratte dalle monografie di E.P. 6.3 ed E.P. 8.0, come pure da USP 37, e spesso accompagnato da un omologo inferiore derivante da alfa-ossidazione, l’acido pristanico (acido tetrametil-pentadecanoico, PA), o loro sali o esteri. A differenza della maggior parte degli altri acidi, l’acido titanico non può essere metabolizzato per beta-ossidazione, e p.e. nei soggetti con malattia di Refsum - carenti di capacità alfa-ossidativa - si accumula nel sangue e nei tessuti, portando a polineurite periferica, atassia cerebellare, retinite pigmentosa, anosmia e perdita dell’udito.

La domanda di brevetto US 2011/0033595 (WO 2011/018096), che qui richiamiamo nella sua totalità assieme alle Referenze ivi citate, spiega accuratamente che c’è un generale consenso ad includere nella dieta dei paesi occidentali da 200 a 1000 mg per giorno di composizioni a base di EPA+DHA, ma questi prodotti di origine marina e aigaie contengono significative concentrazioni di PhA (vedi Fig. 3b, par. [0037], la stessa di All. 1), fino a 1000 ppm (0.1%) o più, creando così seri problemi di salute in milioni di consumatori [par. 0001]. Oltre a citare le numerose malattie indotte dall’uso di PhA (par. [0002] e [0003]), viene anche spiegato che recenti studi hanno evidenziato che l’uso continuo di PhA può indurre diversi tipi di tumori, che è citotossico e pro-infiammatorio, oltre che essere un diretto antagonista di EPA e DHA (par. [0004]-[0008]). Per purificare le miscele di PUFA da questo particolare componente, la succitata domanda US201 1/0033595 descrive un procedimento di frazionamento cromatografico con eluente liquido o allo stato supercritico, con isolamento anche di frazioni arricchite di PhA che - dopo ulteriore purificazione - sono idonee all’impiego cosmetico per via topica e per altri usi.

Con riferimento all’acido pristanico, esso condivide molti dei gravi effetti tossici del PhA e si accumula anche esso nell’organismo in diverse malattie ereditarie come p.e. la sindrome di Zellweger.

La stessa domanda US 2011/0033595 cita come riferimento le precedenti domande WO 01/ 10809, EP 1157692, US 5,656,667 (par.

[0025]-[0027]) e altre, nessuna delle quali sembra interferire, come procedura e finalità, con la presente domanda.

WO 01/ 10809 descrive un procedimento per cui i PUFAs in forma di acidi liberi, o esteri o amidi, specialmente EPA e/o DHA, sono recuperati da addotti con urea - come quelli ottenuti come sottoprodotti durante la lavorazione degli oli di pesce o altri oli, e perciò prevalentemente contenenti acidi saturi e monoinsaturi - mediante trattamento con fluidi subcritici o supercritici in determinate condizioni di temperatura e pressione. Lo scopo del procedimento è quello di recuperare - in forma parzialmente concentrata - una parte dei PUFAs persi come sottoprodotti durante la produzione industriale, non quello di purificarli da componenti estranei.

EP1 157692 riporta composizioni di acidi grassi contenenti almeno 80% in peso di EPA e DHA e meno del 3% di altri particolari componenti omega-3. Il procedimento comporta un procedimento di transesterificazione seguito da opportuno frazionamento con urea e distillazione molecolare.

US 5,656,667 descrive una composizione di acidi grassi contenenti almeno 80% in peso di EPA e DHA, e almeno 1.0% del componente C21:5 n-3, oppure almeno 80% in peso di EPA e DHA in rapporto da 1:2 fino a 2:1, e almeno 1.5% di altri acidi omega-3 diversi da EPA e DHA. Anche in questo caso la transesterificazione è seguita da frazionamento standard con urea e distillazione molecolare.

Anche la domanda US 2012/053242 (WO 2010/ 118761) descrive un metodo per abbassare il contenuto di PhA, secondo il quale un olio di origine marina, in accordo con la rivendicazione 1, viene saponificato per dare i corrispondenti sali, acidificato per dare gli acidi grassi, e questi acidi - che rappresentano Tunica sostanza di partenza del procedimento - vengono sottoposti a ultracentrifugazione in gradiente di glicerolo a 10°C e sotto vuoto di 27 Pa, usualmente a 100,000g per 24-48 ore (rivendicazioni 5, 6), e quindi il gradiente è sottoposto a cristallizzazione a temperature tra 0°C e -57°C ottenendo una fase solida e una liquida, quest’ultima contenente acidi grassi poiinsaturi omega-3 con un contenuto inferiore a 90 microgrammi/ g di PhA, che viene separata per decantazione.

La rivendicazione 2 specifica che questi acidi vengono anche esterificati per ottenere i trigliceridi degli acidi omega-3 (non gli esteri alchilici), mentre si rivendica pure che il contenuto di acidi omega-3 è nel range tra 65% e 99% in peso (rivendicazione 10), che il contenuto di PhA è inferiore a 5 microgrammi /g (rivendicazione 11), che gli acidi omega-3 comprendono DHA nel range tra 65% e 95% in peso (rivendicazione 14) ed EPA nel range tra 5% e 35% in peso (rivendicazione 17).

Le altre rivendicazioni 19-61 riguardano essenzialmente composizioni per uso farmaceutico e alimentare, supplementi nutrizionali e alimenti, e i metodi di trattamento nelle patologie sensibili alle composizioni dell’invenzione.

La descrizione descrive diffusamente gli effetti negativi di PhA (e PA), come già descritto in US 2011/0033595, riportando anche numerosi prodotti introdotti sul mercato ed evidenziando l’elevato contenuto di PhA in questi prodotti senza significativa correlazione con la purezza del DHA contenuto (Figura 3).

Noi abbiamo notato inoltre che in Esempio 3, destinato all’analisi del prodotto dell’invenzione, vengono riportati alcuni dati relativi ad inquinanti ambientali come i PCB, i PCDD e PCDF, e il benzopirene, di cui discuteremo dettagliatamente nel prosieguo. Senza entrare nel merito dei dati presentati evidenziamo comunque che in nessun punto della descrizione viene affermato che il metodo presentato è in grado di abbassare il contenuto di dette sostanze, né questo viene in alcun modo rivendicato. Si ritiene pertanto che questi dati siano del tutto occasionali e soprattutto che il basso contenuto di inquinanti sia semplicemente conseguenza del loro ridotto contenuto nell’olio di partenza, proveniente da mari scarsamente inquinati, oppure più semplicemente per effetto di precedente purificazione dell’olio stesso allo stato di trigliceride: è noto infatti che rispetto ai trigliceridi alcuni degli inquinanti ambientali risultano più basso bollenti e allontanabili pertanto mediante distillazione molecolare.

Noi abbiamo anche notato diverse citazioni di riferimenti bibliografici che si riferiscono agli usuali trattamenti con urea - già sopra citati - che vengono effettuati per concentrare gli acidi omega-3, come US 5679809, EP 0347509, e altri (par. [0053]), ma come vedremo nessuno di questi metodi - considerata la differente procedura e finalità rispetto alla presente domanda - ci sembra costituire una valida anteriorità alla presente domanda, come vedremo, né ha indirizzato all’impiego dell’urea gli autori stessi della domanda qui discussa US 20120053242.

Il brevetto US 5679809 riporta che gli esteri etilici degli acidi grassi sono trattati con urea in etanolo, e che per raffreddamento si separa una fase solida contenente i complessi di inclusione insolubili e una fase liquida contenente una frazione arricchita di esteri etilici dei PUFAs.

La domanda EP 0347509 descrive che una miscela di acidi grassi è sottoposta a complessazione con urea per allontanare gli acidi saturi e la maggior parte degli acidi monoinsaturi, e quindi il filtrato è sottoposto a cristallizzazione frazionata a bassa temperatura.

Le impurezze di gran lunga più dannose sono tuttavia quelle di tipo del tutto estraneo al materiale oleoso naturale e derivanti dagli inquinanti ambientali, molti dei quali particolarmente lipo-solubili e tendenzialmente portati a concentrarsi assieme ai vari componenti grassi {POPs, Persistent Organic Pollutants). Le caratteristiche principali di queste sostanze sono la persistenza nel tempo, il bioaccumulo attraverso la catena alimentare, il potenziale per la loro diffusione e trasporto ambientale a lunga distanza, e la. loro tossicità..Molte di queste sostanze sono chiaramente teratogene, mutagene e carcinogene.

Dopo una lunga fase preparatoria, il primo atto ufficiale contro queste sostanze derivò dalla Stockholm Convention on POPs tenutasi il 22-23 Maggio 2001 in Svezia, che individuò 12 distinte classi chimiche (thè “dirty dozen”) come più aggressive e pericolose per la salute dell’uomo e per l’ambiente, inclusa l’agricoltura e l’allevamento del bestiame. Molte di queste sostanze erano nel passato, e alcune lo sono anche attualmente, usate come pesticidi (erbicidi, insetticidi, fungicidi, rodenticidi, ecc). La conclusione della Convention fu quella di bandire la produzione e l’uso di numerose di queste sostanze, anche verso altri usi industriali, di limitare l’uso del DDT al solo controllo della malaria, e di limitare la produzione inconsapevole e non intenzionale di altre sostanze come le “diossine” e i “furani”, sottoprodotti indesiderati di una serie di processi chimici e/o di combustione, e come i “PCB”, il cui uso industriale rimane comunque proibito.

L’obbiettivo di identificare e controllare ulteriori inquinanti (“Pollutants”) Organici Persistenti è stato poi perseguito negli anni successivi dai vari POPs Review Committees, come pure varie Agenzie Regionali per la Protezione Ambientale, come l’italiana ARPA.

A conferma di ciò, numerosi studi riportano l’accumulo di concentrazioni spesso relativamente elevate di inquinanti ambientali come le diossine, i PCB, i ritardanti di fiamma bromurati, ma anche di DDT e suoi metaboliti, e di pesticidi come i toxafeni e altri negli organismi marini e in ambienti vegetali, e quindi negli oli di provenienza marina e da semi vegetali. Il pericolo rappresentato da queste sostanze per l’uomo e gli animali hanno indotto una crescente preoccupazione per il contenuto di sostanze tossiche negli alimenti e nella catena alimentare. Prodotti alimentari che non contengono, o hanno contenuto limitato di inquinanti, stanno guadagnando una maggiore popolarità e capacità di mercato. Pertanto l’eliminazione o la riduzione di inquinanti nei prodotti alimentari ha un grande potenziale per aumentare sostanzialmente la loro possibilità di vendita e il loro valore aggiunto, con particolare riferimento alla loro richiesta nel settore dei “baby foods” e delle “infant formulas”. Particolarmente richiesti dal mercato sono gli acidi polinsaturi, come EPA e DHA, come pure nuove tecnologie per la loro purificazione in quanto queste sostanze sono particolarmente sensibili al riscaldamento ad alte temperature, e pertanto alla distillazione o distillazione molecolare o short path, che rappresenta attualmente la metodica più usuale appunto per la purificazione dagli inquinanti ambientali.

In relazione a questa difficoltà rappresentata dalla sensibilità al calore degli oli contenenti acidi poiinsaturi ed alle metodiche più usuali, viene fatto riferimento alla US 7,732,488 (W004/007654) ed ai Riferimenti ivi citati. US 7,732,488 descrive un procedimento per diminuire la quantità di inquinanti ambientali in una miscela di oli o grassi, per cui si aggiunge alla miscela un "working<*>fluido volatile, e quindi si sottopone la miscela ad almeno una fase di “stripping” durante il quale si distilla una parte dell’inquinante ambientale assieme al “working “ fluido volatile. Questo metodo sembra essere migliorativo, ma non decisivo rispetto all’arte precedente, in quanto è limitato anche esso alla purificazione di oli (trigliceridi) , in quanto solo gli oli sono abbastanza alto bollenti da non co-distillare anche essi in fase di stripping, in quanto il working fluid è definito volatile, ma è rappresentato anche esso da esteri etilici o acidi grassi o simili tali da richiedere una temperatura di 180-200°C per una efficiente fase di stripping, e infine sembra mediamente più idoneo ad una riduzione degli inquinanti che ad una loro totale eliminazione, comportando comunque lunghi tempi di riscaldamento, formazione di sottoprodotti, impianti complessi come il distillatore molecolare, e alti costi. ;Anche gli altri metodi citati della tecnica nota dimostrano che la tecnica della distillazione molecolare, seppure di qualche efficacia, è comunque molto limitata e non rappresenta affatto una definitiva soluzione del grave problema dell’accumulo degli inquinanti ambientali negli oli e nei grassi, che così gravemente ne abbatte il loro valore e il loro uso. Poiché nell’uso umano è ormai regola isolare e concentrare gli acidi grassi poiinsaturi, o loro derivati, considerati essere i componenti di valore terapeutico e alimentare, sarebbero altamente auspicabili nuovi metodi di purificazione diretta dei prodotti di maggior valore per l’uso farmaceutico umano e per l’uso nutrizionale nell’animale, inclusa l’acquacoltura. ;Passando a un esame più dettagliato dei POPs, una delle classi più diffuse e più tossiche è quella definita con il termine generico di diossine, in realtà costituita dalle due famiglie chimiche delle policloro-dibenzo-para-diossine (PCDDs) e dei policloro-dibenzo-furani (PCDFs). ;Le diossine non vengono prodotte intenzionalmente e la fonte di esposizione per l’uomo è prevalentemente quella ambientale, attraverso l’assunzione di cibi contaminati, in particolare gli oli e grassi animali. ;Esistono in totale 75 congeneri di diossine e 135 di furani, che si differenziano per il numero e la posizione degli atomi di cloro sui nuclei benzenici, ma di questi soltanto 7 PCDDs e 10 PCDFs destano particolare preoccupazione dal punto di vista tossicologico. ;Generalmente i PCDD/PCDF non vengono rilevati come singoli composti, ma come miscele di questi ultimi congeneri tossici, avendo attribuito a ciascuno di essi un opportuno “fattore di tossicità equivalente” (TEF), più precisamente il WHO-TEF che viene utilizzato per i campioni alimentari (European Commission Regulation(EC) 1881/2006, Off, J. EU, L364/5; 20 December 2006, p.20). ;I TEF sono stati determinati sperimentalmente come capacità di attivazione del recettore Ah (lo step chiave per il successivo innescarsi degli effetti tossici), misurando raffinità di legame dei vari composti clorurati verso Ah, in confronto a quella della 2, 3,7,8 -tetracloro-dibenzo-diossina (2,3,7,8-TCDD) assunta come valore unitario di riferimento. ;La concentrazione complessiva di PCDD/PCDF viene pertanto espressa come “equivalenti tossici” o “tossicità equivalente” (TEQ), e viene calcolata sommando i valori TEF dei singoli congeneri moltiplicati per le rispettive concentrazioni. Il contributo alla sommatoria in TEQ di ogni congenere non rilevabile è ritenuto pari al rispettivo limite di quantificazione (upper-bound). ;Il massimo livello di WHO PCDD/ PCDF TEQ per oli di origine marina destinati al consumo nell’uomo secondo la suddetta Regulation (EC) 1881/2006, p.18, è pari a 2 pg/g olio {Breivik 2007, pages 246-247). Secondo USP 37, il criterio di accettabilità corrisponde a “non più di” (NMT) 1 pg/g di equivalenti tossici WHO. ;Un altro gruppo di contaminanti chimici è costituito da agenti industriali come i policloro-bifenili (PCBs), costituiti da molecole di bifenile variamente clorurate. ;I PCBs, prima che il commercio e l’uso fossero proibiti, erano prodotti industriali di largo impiego, usati come fluidi dielettrici, antiparassitari, ritardanti di fiamma, componenti di vernici, ecc. L’esposizione per l’uomo è dovuta alla contaminazione ambientale (discariche, smaltimento inadeguato, emissione in atmosfera a seguito di evaporazione o incendio, ecc). ;I policloro-bifenili comprendono una serie di 209 congeneri, ma di questi solo 12 hanno caratteristiche tossicologiche simili alle “diossine” e ai “furani”, e sono pertanto definiti diossino- simili (DL-PCBs). Anche per i DL-PCB sono stati determinati i fattori di tossicità equivalente TEF e la loro tossicità equivalente TEQ è usualmente data cumulativamente con quella delle diossine. Il massimo livello per la somma di diossine e DL-PCB (WHO PCDD/PCDF - DL PCB TEQ), come sopra specificati, è pari a 10,0 pg/g olio. ;La somma di altri 6 congeneri definiti "indicatori” o “markers” (denominazione IUPAC: PCB<'>28, .52, 101, 138, 153, 180) è ritenuto dalla EFSA (European Food Security Agency) un adeguato indicatore della presenza di PCB non diossino simili (NDL-PCBs) e dell’esposizione umana agli stessi. Questo valore è espresso in ng/g olio. ;Secondo USP 37, l’accettabilità dei PCB markers - incluso PCB 118 - è limitata a NMT 0,5 ppm (0,5 microgrammi/ g). ;I PBDEs sono polibromo-difenileteri, costituiti pertanto da molecole di difeniletere variamente bromurate, e quindi con qualche analogia concettuale con la struttura dei PCBs. Comprendono una serie di 209 congeneri, denominati secondo IUPAC con numeri crescenti secondo il numero di atomi di bromo (da 1 a 10), e alcuni di essi sono altamente neuro tossici e anche cancerogeni. ;Sono utilizzati come ritardanti di fiamma in schiume poliuretaniche, in plastiche ABS, nel polistirene, e sono considerati come inquinanti chimici persistenti di tipo “emergente”. Di alcuni termini la produzione industriale è già stata bandita, ma la sua presenza è stata comunque dimostrata in acque inquinate e nelle discariche, e la somma dei PBDEs (DBE-28, 47, 99, 100, 153, 154, e 183) è stata evidenziata fino a 3.8 ng/g o più in campioni di oli di pesce (Zennegg M et al, Organohalogen Compounds, 68,1967,2006; US 7,732,488). ;Gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) sono composti formati da due o più anelli aromatici condensati che derivano dalla combustione incompleta di materia organica, derivati del petrolio o biomassa. Sono trasportati dalle masse d’aria sia allo stato di gas, sia adsorbiti sulla frazione solida, e sono di interesse tossicologico in quanto considerati possibili cancerogeni. Gli IPA sono espressi come sommatoria di diversi composti, a seconda della matrice sulla quale vengono ricercati, usualmente espressa come sostanza marker benzo[a]pirene e con un limite massimo tollerato di 2 ng/g negli oli e nei grassi (Regulation (EC) 1881/2006, Section 6, p.18). ;II problema degli inquinanti ambientali è estremamente grave che non può essere esaurito in un unico studio, ma anche una sola indicazione a carattere estensivo può essere di incommensurabile beneficio per il benessere dell’uomo, del mondo animale e per l’ambiente. Tra gli altri POPs qui non discussi in dettaglio, ma comunque citabili a titolo di esempio, citiamo ancora il 2,2 bis-(pc lo rofenil)- etano (DDE), il 2,2 bis-(p-clorofenil)-l,l-dicloroetano (DDD), e il 2,2 bis-(p-clorofenil)-l,l,l-tricloroetano (DDT), quest’ultimo rintracciato ovunque nell’ambiente globale, i polibromo-bifenili (PBB), l’esaclorobenzene, gli isomeri dell’esacloro-cicloesano, e altri. Anche i metalli pesanti e i composti metallorganici rappresentano un grave problema per la salute dell’uomo e per l’ambiente, e in particolare il metil- mercurio può indurre gravi alterazioni cerebrali nell’infanzia e danni neurologici nell’adulto, per cui la normativa europea ha previsto un limite massimo di 0.5 mg/kg nei prodotti ittici. Tuttavia, poiché i metalli pesanti hanno una maggiore affinità per le proteine, che per i lipidi, la presenza di metalli pesanti negli oli di pesce non rappresenta un problema primario (Breivik 2007, page 133). ;Secondo l’esperto, i POPs dovrebbero essere allontanati, nella quantità maggiore possibile, direttamente dagli oli di partenza, prima di iniziare i procedimenti di concentrazione degli acidi grassi poiinsaturi, sfruttando così la maggiore differenza di punto di ebollizione tra i trigliceridi più alto bollenti e i vari POPs, rendendo così più efficace allo scopo il procedimento di distillazione / distillazione molecolare (Breivik 2007, page 133). Un ulteriore vantaggio viene conseguito mediante l’aggiunta di un cosiddetto “working fluid” prima della distillazione (US 7,732,488), come già riportato. ;Malgrado ciò, la presenza di numerose classi e al loro interno di differenti specie molecolari di POPs, ciascuna con proprie<’>caratteristiche chimico-fisiche e differenti punti di ebollizioni, rendono questo lavoro molto difficoltoso, dispendioso per perdite di tempo e di rese e aumento dei costi, e generalmente in grado di diminuire la presenza di un inquinante senza praticamente eliminarlo mai nella sua totalità, e nel caso favorevole per un singolo prodotto senza poter estendere la purificazione alla totalità dei POPs. ;Altri metodi di parziale utilità per la riduzione dei POPs, ma mai per annullare la loro presenza, comprendono il trattamento con carboni attivi e/o il processo di deodorizzazione per tempi e temperature notevolmente aumentate, e con le relative problematiche, senza risultare competitivi con la distillazione (Breivik 2007, page 133). Anche i processi cromatografici possono avere una qualche efficacia su un singolo composto, mai sul loro assieme che risulta di regola disperso neirintero tracciato cromatografico. ;Noi abbiamo quindi concluso che nessuna delle tecniche attuali è in grado di depurare le composizioni in discussione da tutte le impurezze sopra descritte, e solo se usate in combinazione, ripetutamente e con gravi perdite di resa possono avvicinarsi ai limiti imposte dalle varie legislazioni, senza mai giungere ad una sostanziale assenza di ogni inquinante, come sarebbe auspicabile. ;Per esempio la distillazione molecolare è certamente in grado di allontanare con le frazioni alto-bollenti la maggiore parte delle impurezze più polari, come gli oligomeri e alcuni altri prodotti di ossidazione, pur con gravi perdite di resa, ma non è in grado di eliminare totalmente i succitati inquinanti policlorurati, che in dipendenza del grado di sostituzione presentano un ampio range di temperature di distillazione. ;Così pure l’impiego di fluidi supercritici può portare all’allontanamento delle sostanze polari mediante la estrazione degli acidi grassi, ma questi saranno sempre accompagnati dalle sostanze lipofile inquinanti, altrettanto estraibili dal solvente supercritico. ;Altre tecnologie per l’eliminazione sistematica dei POPs non ci risultano disponibili. In particolare l’impiego di urea viene presentato dalla letteratura solo come idoneo all’ inclusione, e quindi airisolamento ed aH’allontanamento degli acidi grassi saturi e monoinsaturi, e pertanto alla concentrazione degli acidi poiinsaturi, che tuttavia si accompagnerebbero così ad una incrementata concentrazione delle impurezze estranee. L’inclusione dei componenti poiinsaturi appare dalla letteratura di difficoltà crescente al crescere della loro concentrazione e del loro grado relativo di in saturazione. ;Nessuna delle tecnologie note, per quanto a nostra conoscenza, può inoltre portare a composizioni poiinsature sostanzialmente esenti da tutti i sopra riportati componenti “furanici”, dagli acidi titanico e pristanico o loro derivati, da idrocarburi ramificati a lunga catena come lo squalene, da gran parte dei polimeri degli acidi poiinsaturi, e dalla essenziale totalità dei POPs, nel caso più particolare in un unico step. ;SOMMARIO DELL’INVENZIONE ;Noi abbiamo viceversa individuato una nuova e sorprendente tecnologia di purificazione, che consiste essenzialmente nell’estrarre da una composizione comprendente acidi grassi poiinsaturi a lunga catena, di origine animale e/o vegetale, già portata alla concentrazione e al rapporto dei componenti desiderati (o da una sua soluzione), non i sottoprodotti e le sostanze inquinanti, ma direttamente e selettivamente tutti i componenti poiinsaturi voluti, e di isolare così nella soluzione madre esausta tutto il materiale inquinante. Si adotta così, a differenza della prior art, una unica metodica specifica e selettiva per i componenti poiinsaturi desiderati, invece di utilizzare le differenti metodiche estrattive riferibili alle differenti proprietà chimico-fisiche delle varie famiglie di inquinanti discusse. ;in un suo primo aspetto, pertanto, la presente invenzione riguarda una composizione che comprende acidi grassi poiinsaturi a lunga catena di origine animale e/o vegetale, appartenenti alla serie omega-3 e/o omega-6, aventi 2-6 doppi legami e 18 o più atomi di carbonio, o loro sali o esteri e ulteriormente comprendenti acidi grassi furanici o loro corrispondenti sali o esteri, · in concentrazione totale inferiore o uguale a 0,1%, cioè inferiore o uguale a 1000 ppm, e preferibilmente inferiore o uguale a 0,01%, cioè inferiore o uguale a 100 ppm. ;Composizioni preferite sono definite nelle rivendicazioni 2-17. in particolare i suddetti esteri possono essere esteri alchilici, preferibilmente C1-C3, oppure mono-esteri e/o di-esteri e/o tri-esteri glicerici. ;In un suo secondo aspetto, la presente invenzione riguarda un metodo per la preparazione di una composizione come sopra definita, in cui i suddetti esteri sono esteri alchilici, preferibilmente C1-C3, comprendente le fasi di: ;a) sottoporre un olio o grasso di origine animale o vegetale, inclusa la provenienza marina, da acquacoltura, aigaie o fermentativa, comprendente almeno un gruppo acile con almeno 18 atomi di carbonio, avente 2-6 doppi legami della serie omega-3 e/o omega-6, ad idrolisi alcalina o acida oppure a transesterificazione con alcoli alitatici preferibilmente C1-C3, opzionalmente con catalisi enzimatica; ;b) sottoporre il prodotto della suddetta idrolisi o transesterificazione a un procedimento di purificazione mediante inclusione essenzialmente totale in urea, ottenendo un complesso di inclusione, che viene isolato e lavato; ;c) ottenere la suddetta composizione mediante dissoluzione in acqua di tale complesso di inclusione e separazione della fase oleosa separatasi a seguito di detta dissoluzione o mediante estrazione di detta fase oleosa con un solvente organico immiscibile con acqua* tipicamente esano o simili e successiva evaporazione di detto solvente fino a secchezza, o per estrazione diretta da tale complesso di inclusione mediante fluidi allo stato supercritico, in particolare anidride carbonica.

Aspetti preferiti del metodo di preparazione in questione sono definiti nelle rivendicazioni 19 e 20.

In un suo ulteriore aspetto, la presente invenzione riguarda un metodo per la purificazione di una composizione comprendente acidi grassi poiinsaturi a lunga catena di origine animale e/o vegetale, appartenenti alla serie omega-3 e/o omega-6 e aventi 2-6 doppi legami e 18 o più atomi di carbonio, o loro sali o esteri alchilici, preferibilmente C1-C3, il metodo comprendendo le fasi di:

a) trattare una parte in peso della suddetta composizione con almeno 3 parti in peso di urea in un solvente polare, preferibilmente un solvente protico come un alcool inferiore, quale metanolo o etanolo, eventualmente contenente fino al 20% di acqua, alla temperatura di ebollizione, per formare un complesso ureico di inclusione contenente la suddetta composizione;

b) raffreddare fino a precipitazione di tale complesso ureico e isolarlo mediante filtrazione o centrifugazione;

c) ottenere una composizione purificata mediante dissoluzione in acqua di tale complesso ureico di inclusione e separazione della fase oleosa separatasi a seguito di detta dissoluzione o mediante estrazione di detta fase oleosa con un solvente organico immiscibile con acqua, tipicamente esano o simili e successiva evaporazione di detto solvente fino a secchezza, o per estrazione diretta da tale complesso ureico di inclusione mediante fluidi allo stato supercritico, in particolare anidride carbonica.

Aspetti preferiti del metodo di purificazione in questione sono definiti nelle rivendicazioni 22-30.

Una composizione purificata secondo l’invenzione particolarmente preferita prevede che gli acidi grassi abbiano provenienza marina e derivino in particolare da oli di pesce, incluso pesce da acquacoltura, o da “krill oils” oppure da alghe e altri microrganismi oleaginosi, o da “single celi fermentation” a partire da selezionati ceppi di alghe o altri microrganismi, e comprendano acido eicosapentaenoico (EPA, C20:5 n-3, tutto cis) e/o acido docosaesaenoico (DHA, C22:6 n-3, tutto cis), o un loro sale o estere alchilico, preferibilmente C1-C3.

Convenientemente, nella suddetta composizione purificata preferita gli esteri sono esteri etilici, e la concentrazione di EPA o EPA estere etilico, oppure di DHA o DHA estere etilico, oppure la loro somma, sono compresi tra 15 e 100%, preferibilmente tra 50 e 100% , del peso della composizione.

Come ulteriore aspetto dell’invenzione, dette composizioni purificate possono essere usate per la sintesi di nuovi derivati lipidici, sia per via chimica che enzimatica: tra questi in particolare i già citati mono-esteri e/o di-esteri e/o tri-esteri glicerici di EPA e/o DHA, che risulteranno anche essi compresi tra 15 e 100%, preferibilmente tra 50 e 100% del peso della composizione.

L’invenzione riguarda inoltre l’uso della suddetta composizione purificata preferita per la preparazione di formulazioni utili come ingredienti alimentari, integratori alimentari e dietetici, alimenti per scopi medici speciali {alimenti funzionali), alimenti per uso animale e per acquacoltura, formulazioni alimentari per l’infanzia, preparazioni cosmetiche e farmaceutiche, in virtù del loro elevato contenuto di acidi grassi a lunga catena o loro derivati, a carattere poiinsaturo o specificamente della serie omega-3, oppure per la preparazione per via chimica di altri derivati come p.e. i corrispondenti mono-, di-, o trigliceridi.

In un suo ulteriore aspetto, la presente invenzione si riferisce alla suddetta composizione purificata per l’utilizzo nella prevenzione e nel trattamento di fattori di rischio per malattie cardiache, cardiovascolari e cardiocircolatorie, come l’ipertensione, i difetti della coagulazione e dell’aggregazione piastrinica , ripertrigliceridemia severa e moderata (risp. >500mg/dl e >200mg/dl) e l’ipercolesterolemia, in particolare le forme famigliari e genetiche, anche in associazione con altri farmaci e in particolare con le statine, nella prevenzione e nel trattamento di malattie cardiache, cardiovascolari e cardiocircolatorie, come quelle coronariche-atero sclerotiche e gli stati ischemici cardiaci e cerebrali, inclusi l'infarto miocardico e cerebrale e la riduzione del rischio di mortalità cardiaca improvvisa conseguente ad infarto del miocardio; quelle da causa elettrica e coinvolgenti l’insorgenza e la propagazione del ritmo cardiaco, includenti l’aritmia e la fibrillazione atriale e/o ventricolare; e quelle dovute ai difetti meccanici della pompa cardiaca, come ..l’in sufficienza e lo scompenso cardiaco e/o la “heart failure” congestizia, per l’utilizzo nella prevenzione e nel trattamento di disordini del sistema nervoso centrale (CNS), includenti l’epilessia, le varie forme depressive, i disordini bipolari, le patologie pediatriche da difetto dell’attenzione e disordini da iperattività {ADHD}, i difetti dell’apprendimento e della memoria, le varie forme di schizofrenia, la malattia di Alzheimer e le diverse forme di demenza, e infine per l’utilizzo nella prevenzione e nel trattamento della retinopatia e dei sintomi di secchezza oculare, della sindrome metabolica, di difetti del metabolismo e correlati all’obesità, del diabete di tipo 2, delle disfunzioni epatiche, di malattie del tessuto connettivo e delle articolazioni, degli stati infiammatori, di malattie autoimmuni, della colite ulcerosa, della psoriasi e della malattia tumorale.

Elaborazioni e sviluppi vantaggiosi della presente invenzione sono deducibili dalle rivendicazioni dipendenti più sotto riportate.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA

Nella presente descrizione i sali degli acidi poiinsaturi sono rappresentati dai sali con metalli alcalini, p.e. sodio e potassio, metalli alcalino-terrosi, p.e. calcio, con aminoacidi basici come lisina e arginina, con meglumina, con colina e mono-, di-, e tri-etanolamina, e simili, se farmacologicamente accettabili.

Gli esteri alchilici sono rappresentati da esteri con alcoli alifatici, anche a catena molto lunga come reperibili nelle “cere” naturali, ma sono preferibilmente rappresentati da esteri con alcoli inferiori C1-C3.

E’ ovvio anche che queste composizioni purificate possono essere poi modificate per via chimica o per via enzimatica per dare composizioni purificate di altri derivati, come p.e. i corrispondenti mono-, di-, e tri-gliceridi.

Questi gliceridi sono riportati anche come monoacil-gliceroli (p.e. omega-3 monoacil-glicerolo) in posizione sn -1 o sn -2, oppure come diacil-gliceroli in posizione sn -1,2 o sn -1,3, oppure ancora come triacil-gliceroli.

La produzione per via enzimatica di questi acil-gliceroli mediante specifiche lipasi, è dettata da ben precise condizioni sperimentali secondo letteratura, ed è ben riassunta p.e. da “Breivik 2007”, pp. 157-159.

Questa nostra metodica si basa essenzialmente suirinclusione delle sostanze poiinsature in una quantità di urea in eccesso rispetto ai requisiti della letteratura. Noi abbiamo confermato che il processo di inclusione è in effetti preferenziale per i componenti saturi e monoinsaturi, quando questi sono prevalenti nella composizione, come avviene nei prodotti naturali non ancora sottoposti ai processi di concentrazione delle sostanze poiinsature, ma che è comunque possibile complessare anche la totalità dei componenti poiinsaturi quando l'urea è utilizzata in eccesso, e che questo in definitiva è altrettanto agevole quando i componenti saturi e monoinsaturi sono relativamente scarsi nella composizione e quasi o del tutto assenti: se essenzialmente assenti, noi abbiamo trovato che un eccesso di urea non è neppure necessario e che una complessazione totale è facilmente ottenibile anche in 1 unico step, ciò che appare del tutto sorprendente. In questi casi, il processo avviene agevolmente nei riguardi degli acidi grassi, o loro sali o esteri, sia a media che a lunga catena, come per esempio LA, ALA, ARA e gli altri prima citati, e come EPA e DHA, ed abbiamo riscontrato che si presta poi agevolmente al recupero di tutti questi prodotti a partire dal complesso ureico formatosi, attraverso procedimenti standard della letteratura.

L'aspetto comunque più sorprendente della nuova procedura è che sostanzialmente tutte le impurezze , i sottoprodotti e gli inquinanti sopra descritti possono essere eliminati in un solo step operativo, rimanendo non complessati nella fase solvente: comprendiamo in questa affermazione la quasi totalità delle sostanze strutturalmente non assimilabili agli acidi grassi, ai loro esteri e ai loro derivati più semplici, che definiamo in questa sede come composti strutturalmente “ingombranti”, cioè gran parte di quelli contenenti una ramificazione nella catena dell'acido grasso o un anello organico e quelli policiclici, condensati o no, saturi o insaturi, come comunque citeremo nel prosieguo o individualmente o suddivisi per classi.

Il processo di purificazione si estende così sostanzialmente alla totalità degli inquinanti sopra descritti, e comprende p.e. tutti gli acidi furanici, gli acidi grassi e gli idrocarburi a lunga catena ramificati, come pure le diossine e i furani, i policlorobifenili, i polibromodifenileteri, gli idrocarburi ciclici e policiclici, semplici e condensati, e altri POPs.

Rimane anche inteso che nel presente processo di purificazione, ciascuna delle sostanze suddette compresa in ciascun intervallo di concentrazione e la loro somma nell’ambito delimitato dagli stessi intervalli, risulteranno almeno 5 volte ridotte (riduzione di almeno 80%), o preferibilmente almeno 10 volte ridotte (riduzione di almeno 90%) rispetto alle composizioni da cui provengono, oppure ancora nella grande maggioranza dei casi saranno “essenzialmente zero” o “zero”. Un contenuto definito “essenzialmente zero” indica una concentrazione inferiore al limite di rilevazione (LOD) ma precauzionalmente identificato con il limite di quantificazione (LOQ), mentre è definito "zero” se il valore inferiore al LOD viene identificato come zero.

Il grado di eliminazione di tutte queste sostanze indesiderate è evidentemente ottenuto anche mediante l’accurato lavaggio dei complessi ureici per rallontanamento delle acque madri e del loro carico inquinante, come raccomandato dal procedimento, cosa mai sufficientemente evidenziata dalla letteratura nota, per l’evidente timore di sensibili perdite di resa dovute a parziale ridissoluzione dei complessi col solvente di lavaggio.

Dettagli degli intervalli e dei contenuti massimi ottenibili col procedimento dell’invenzione saranno dati nel prosieguo.

Anche ridotti risulteranno parte o gran parte degli oligomeri e polimeri, dei perossi-derivati, degli ioni metallici e dei composti metalloorganici, e di alcune sostanze steroliche.

Una importante considerazione è che il procedimento di purificazione dell’invenzione non richiede di essere modificato secondo il contenuto degli inquinanti e dei sottoprodotti da eliminare presenti nel materiale di partenza, come p.e. prolungando i tempi o variando le temperature di “stripping” nelle distillazioni secondo prior art, oppure il numero o le dimensioni delle frazioni da scartare in caso di purificazione per cromatografia con fluidi supercritici.

Con il nuovo procedimento si potrà invece utilizzare altrettanto bene qualsiasi materiale, anche fortemente inquinato, come p.e. l’olio proveniente da pesce pescato in mari particolarmente inquinati e ricco pertanto di POPs e come tale rifiutato dal mercato o acquistabile a prezzi fortemente ridotti; oppure olio di pesce nutrito con alimento di scarto ricco in acido titanico, o ancora oli vegetali provenienti da siti fortemente inquinati.

In conclusione, secondo un primo aspetto del metodo di purificazione secondo l’invenzione, una composizione a basso contenuto di acidi poiinsaturi o loro sali o esteri, ovvero con un contenuto pari a 15-30%, può essere sottoposta a trattamento con 3-6 parti totali in peso di urea in 3 step consecutivi, ottenendo dapprima un complesso prevalentemente con gli acidi saturi o monoinsaturi, e poi progressivamente con gli acidi poiinsaturi, quindi i complessi vengono riuniti e gli acidi vengono recuperati per ottenere una composizione con lo stesso basso contenuto iniziale di acidi poiinsaturi, se questo è desiderato, ma sostanzialmente esente da tutte le impurezze succitate, eliminate con le acque madri finali del processo di complessazione. Questo procedimento si presta bene ad ottenere composizioni purificate di concentrazione in componenti poiinsaturi simile - o lievemente aumentata - rispetto a quella dei prodotti naturali, che indichiamo orientativamente come superiore al 15% in molti, oli di semi, o attorno a 20-30%, tipicamente EPA 18% DHA 12% come avviene p.e. in molti oli di pesce.

Secondo un secondo aspetto del metodo di purificazione secondo l’invenzione, una composizione a medio contenuto di acidi poiinsaturi o loro sali o esteri, ovvero con un contenuto pari a 31-80%, può essere sottoposta a trattamento con 3-5 parti totali in peso di urea in 2 step successivi.

Nell’ambito di questo secondo aspetto dell’invenzione, tali composizioni a media concentrazione, da utilizzare nella fase di purificazione, possono essere ottenute con tutte le metodiche di concentrazione riportate nella letteratura e da noi sopra citate, a partire da composizioni a bassa concentrazione.

Tra queste metodiche, particolarmente vantaggiosa è quella di usare proprio la tecnologia di complessazione con urea, da utilizzare in dose da 0,1 parti in peso fino a un massimo di 3 parti in peso, usualmente 1-2 parti in peso, rispetto al materiale di partenza, variando questa quantità in dipendenza dal grado di concentrazione desiderato. Isolato ed eliminato il primo complesso ottenuto, ricco in acidi saturi e meno poiinsaturi, è possibile poi proseguire con la fase di purificazione utilizzando direttamente le acque madri della concentrazione, senza preventivo isolamento degli acidi poiinsaturi concentrati.

Questo procedimento permette di ottenere agevolmente composizioni purificate a media concentrazione di acidi poiinsaturi, come p.e 50-60% in peso o più in accordo con la monografia 2063 della E.P. 5.0, ma anche nell’intervallo 30-80% in peso, preferibilmente 50-80% in peso, in dipendenza dal tipo e dal numero di trattamenti della fase di concentrazione.

Secondo un terzo aspetto del metodo di purificazione secondo l’invenzione, una composizione ad alto contenuto di acidi poiinsaturi o loro sali o esteri, ovvero con un contenuto superiore a 80%, può essere sottoposta a trattamento con 3-4 parti totali, preferibilmente 4 parti, in peso di urea in un unico step.

Una variante vantaggiosa del procedimento è quella di effettuare la purificazione per complessazione con urea subito prima della distillazione finale, o dell’estrazione con fluidi supercritici, se desiderate, ciò che permette l’eliminazione totale dei residui solventi organici di reazione eventualmente presenti.

Il procedimento così condotto permette di ottenere agevolmente composizioni purificate a concentrazione p.e. superiori a 80% in peso dei componenti poiinsaturi EPA e/o DHA e superiori a 90% in peso di omega-3 totali, come quelli richiesti dalla monografia 1250 della E.P, oppure compresi nell’intervallo di 80-100% in peso di EPA e/o DHA.

Per completare la descrizione complessiva del procedimento dell’invenzione per la preparazione di composizioni di acidi poiinsaturi altamente purificati, a partire da composizioni naturali di oli e grassi e includendo altri step di trattamento già noti, il procedimento può essere illustrato brevemente come segue:

-un opportuno olio o· grasso di origine animale o vegetale, inclusa la provenienza marina, da acquacoltura, aigaie o fermentativa, e comprendente almeno un gruppo acile avente 2-6 doppi legami della serie omega-3 e/o omega-6 e 18 o più atomi di carbonio, è sottoposto ad idrolisi alcalina o acida oppure a transesterificazione con alcoli alifatici, preferibilmente C1-C3 secondo procedure standard note all’esperto;

-se desiderato, il prodotto è sottoposto a procedimento opzionale di concentrazione dei componenti poiinsaturi mediante distillazione, distillazione molecolare o “short path”, frazionamento per progressiva complessazione con urea dei componenti saturi o monoinsaturi (o genericamente meno insaturi) seguita da eliminazione dei complessi, estrazione contro-corrente, estrazione con nitrato d’argento acquoso, estrazione e/o frazionamento con fluidi supercritici, procedimenti cromatografici, il tutto secondo procedure standard note all’esperto e proseguendo fino al grado di arricchimento e di variazione del rapporto dei componenti desiderato per la composizione finale, includendo anche l’isolamento di composizioni essenzialmente contenenti solo EPA o solo DHA;

-come fase essenziale di purificazione secondo l’invenzione, la composizione grezza come sopra ottenuta e opzionalmente concentrata in componenti poiinsaturi, è sottoposta a procedimento di purificazione mediante inclusione essenzialmente totale in urea, seguito da isolamento e accurato lavaggio del complesso di inclusione ottenuto, sua dissoluzione eventuale in acqua e successivo recupero dei componenti polinsaturi purificati mediante estrazione con solvente (o con fluidi supercritici) della composizione e successiva evaporazione a secchezza;

-se desiderato, il recupero finale della composizione purificata è effettuato mediante distillazione molecolare/ short path o estrazione con fluidi supercritici, secondo procedure standard note all’esperto.

Opzionalmente la composizione purificata può essere sottoposta a ulteriori procedimenti di concentrazione o di aggiustamento del rapporto dei componenti, oppure può essere modificata per via chimica a comprendere altri derivati, come p.e. i corrispondenti mono-, di-, o trigliceridi, allo stato purificato, che rientrano quindi anche essi nello spirito della presente invenzione.

Ancora opzionalmente la soluzione madre dello step di purificazione, dopo filtrazione del complesso lipidico di inclusione, può essere concentrata a secchezza portando a una composizione arricchita in acidi furanoici, acido fitanico, acido pristanico, o loro sali o esteri alchilici, e in squalene, utili per l’isolamento di detti composti mediante tecniche note, come la distillazione molecolare e/o i procedimenti cromatografici con solventi organici o altri fluidi allo stato supercritico, come l’anidride carbonica.

L’esecuzione del nuovo procedimento di compie esazione si differenzia da quello della letteratura solo in quanto aggiuntivo ed effettuato per un differente scopo, ma non si differenzia sostanzialmente nella procedura. Si utilizza ancora preferibilmente p.e. una soluzione di acidi grassi poiinsaturi in metanolo o etanolo, etanolo parzialmente acquoso (contenente fino a 20% di acqua) o altri solventi polari equivalenti, come riportato da Schlenk H e da Swern D, prima citati. La quantità di di solvente usata nel procedimento è usualmente di 4,5-7 parti in peso di metanolo, oppure di 45-65 parti in peso di etanolo, quindi si tratta con almeno 3 parti in peso di urea, si riscalda brevemente fino all’ebollizione ed a soluzione completa. Si raffredda quindi attorno a 0°C (range 25/-20°C, come d’uso), ottenendo precipitazione del complesso ureico degli acidi poiinsaturi desiderati, e scartando quindi la soluzione madre contenente tutte le sostanze inquinanti, come sopra descritto: risulterà ben chiaro che il nuovo procedimento utilizza il complesso ureico ed elimina le acque madri, giusto l’opposto di quanto avviene nel processo della letteratura.

Tale fase di trattamento con urea viene preferibilmente eseguita come segue:

- se la composizione ha un contenuto dei suddetti acidi grassi poiinsaturi o loro sali o esteri alchilici compreso fra 15 e 30% , si tratta una parte in peso della composizione con 3-6 parti in peso totali di urea in tre step successivi;

- se la composizione ha un contenuto dei suddetti acidi grassi poiinsaturi o loro sali o esteri alchilici compreso fra 31 e 80% , si tratta una parte in peso della composizione con 3-5 parti in peso totali di urea in due step successivi;

- se la composizione ha un contenuto dei suddetti acidi grassi poiinsaturi o loro sali o esteri alchilici superiore a 80% , si tratta una parte in peso della composizione con 3-4 parti, preferibilmente 4 parti, in peso di urea in un unico step.

Una utile variante è quella di concentrare la soluzione madre prima di eliminarla, p.e. fino a metà volume, in modo da recuperare una seconda aliquota di complesso ureico di inclusione e da migliorare il rendimento del processo.

Il precipitato solido viene lavato accuratamente con metanolo o etanolo, eventualmente saturato con urea ed a freddo per minimizzare le perdite, viene poi disciolto in acqua e la composizione purificata è separata come fase oleosa oppure è estratta con solvente organico immiscibile, come p.e. con esano o simili. Dopo evaporazione del solvente, come ben noto all’esperto del settore, ed eventuali altri trattamenti di letteratura, come p.e. la distillazione molecolare, si ottengono così gli acidi poiinsaturi richiesti in forma altamente purificata.

Come alternativa, la composizione purificata è estratta direttamente dal complesso solido lavato mediante fluidi supercritici, in particolare C02.

Un aspetto di particolare rilievo rispetto alle metodiche note riguarda la quantità di urea, che in detti procedimenti noti viene accuratamente limitata per evitare eventuali perdite di componenti poiinsaturi, mentre secondo l’invenzione deve essere in opportuno eccesso per un recupero quantitativo di tutto il materiale. Il quantitativo dipenderà ovviamente dalla composizione del materiale da purificare, ma è generalmente costituito da 3 a 4 o 5 parti in peso, o più. E’ tuttavia degno di nota che detto eccesso diminuirà nel caso dei composti poiinsaturi concentrati essendo inferiore la complessazione competitiva dei composti saturi o monoinsaturi, e 3 parti in peso o poco più di urea saranno usualmente sufficienti.

Con l’uso dell’invenzione, noi abbiamo trattato e purificato ogni tipo di composizione a base di acidi grassi poiinsaturi, e ad ogni concentrazione, anche se il trattamento sarà sempre nel concreto più importante con il crescere della loro concentrazione a scapito degli altri componenti saturi e monoinsaturi, e quanto più la composizione risulterà di interesse neH'alimentazione umana o addirittura per l’uso farmaceutico: ma è anche evidente come non sia ammissibile neppure nell’alimentazione animale, p.e. nell’acquacoltura, rimettere in circolo come alimenti i sottoprodotti e gli inquinanti ambientali persistenti (POPs) già presenti negli alimenti e nelle composizioni non ancora purificate.

In maggiore dettaglio vengono qui riportate alcune composizioni trattate secondo il nuovo procedimento allo scopo di esemplificazione non limitativa:

a) Composizioni comprendenti acidi grassi poiinsaturi a lunga catena di origine animale e/o vegetale, o loro sali o esteri alchilici, p.e. di provenienza marina e ottenute a partire dagli oli di pesce o dai krill oils, oppure da oli di pesce da acquacoltura, oppure ancora da alghe o altri microrganismi oleaginosi, o da “single celi fermentation” a partire da selezionati ceppi di alghe o di altri microrganismi, anche ricombinanti, oppure p.e. provengono dagli oli di semi o da altri oli e grassi di origine vegetale, e in cui le composizioni hanno essenzialmente la stessa concentrazione di componenti poiinsaturi come negli oli e grassi di origine animale e/o vegetale da cui derivano, generalmente maggiore del 15-20%.

b) Composizioni di acidi grassi omega-3 e/o omega-6, comprendenti p.e. acido eicosapentaenoico (EPA, C20:5 n-3, tutto cis) e/o acido dosaesaenoico (DHA, C22:6 n-3, tutto cis), o un loro sale o estere alchilico, preferibilmente C1-C3, di qualsiasi origine e in ogni rapporto tra loro, ed a concentrazione maggiore del 15%, o una concentrazione media generalmente del 20-50%, o una concentrazione particolarmente elevata del 50-100%.

c) Composizioni di “omega-3-acid ethyl esters 60” come essenzialmente descritte nella monografia n. 2063 della European Pharmacopoeia (E.P.5.0), tipicamente contenenti un minimo del 50% di EPA estere etilico (minimo 25-40%) e DHA estere etilico (minimo 20-40%), e un minimo del 55%, 60% o 65% di esteri etilici di acidi omega-3 totali.

d) Composizioni comprendenti acidi grassi poiinsaturi a lunga catena, o loro sali o esteri alchilici, in cui la concentrazione di EPA estere etilico, oppure di DHA estere etilico, oppure della loro somma, è compresa tra 50% e 100% della composizione.

e) Composizioni di “omega- 3 acid ethyl esters 90” come essenzialmente descritte nella monografia n. 1250 della E.P. suppl.2000 e successive, tipicamente contenenti un minimo di 80% di EPA estere etilico e DHA estere etilico, di cui un minimo di 40% di EPA estere etilico e un minimo di 34% di DHA estere etilico, e un minimo di 90% di esteri etilici di acidi omega-3 totali.

f) Composizioni come essenzialmente descritte nella monografìa “Omega- 3 -Acid Ethyl Esters” della USP 37, tipicamente contenenti non meno di (NLT) 800 mg/g e non più di (NMT) 880 mg/g di EPA estere etilico (EPAee) e DHA estere etilico (DHAee), NLT 430 mg/g e NMT 495 mg/g di EPAee, NLT 347 mg/G e NMT 403 mg/g di DHAee, e NLT 90% in peso del totale di esteri etilici degli acidi omega-3.

g) Composizioni di acidi grassi come essenzialmente descritte nel brevetto IT 1235879, tipicamente contenenti almeno 80% in peso di acidi grassi poiinsaturi omega-3, tra i quali EPA e DHA sono presenti in rapporto da 1 : 2 a 2 : 1 e costituiscono almeno il 75% in peso di acidi grassi totali e gli altri acidi omega-3 C20, C21 e C22 costituiscono almeno il 3% in peso, e in cui detti acidi possono essere tutti presenti sotto forma di sali o di derivati accettabili dal punto di vista farmaceutico.

h) Composizioni comprendenti acidi grassi poiinsaturi a lunga catena, o loro sali o esteri alchilici, in cui la concentrazione di EPA estere etilico, oppure di DHA estere etilico, è superiore o uguale a 80%, preferibilmente superiore o uguale a 90%, oppure la somma delle loro concentrazioni è compresa tra 50% e 100% della composizione.

Come già prima accennato, rimane comunque inteso che tutte le composizioni, dopo purificazione secondo il metodo dell’invenzione, portano a corrispondenti composizioni aventi concentrazioni di componenti poiinsaturi essenzialmente uguali, salvo le opportune ovvie correzioni in aumento dovute alle impurezze totalmente eliminate attraverso il procedimento e già ripetutamente citate e descritte: l’intera classe dei numerosi acidi grassi furanici, gli acidi fitanico e pristanico, o loro sali o esteri alchilici, lo squalene, come pure i numerosi pesticidi e inquinanti ambientali (POPs), ubiquitariamente diffusi in tutto il mondo animale e vegetale.

E’ anche inteso che le concentrazioni dei componenti poiinsaturi in tutte le composizioni purificate, e in quanto tali predisposte ai più svariati usi nell’animale e soprattutto nell’uomo, p.e come integratori alimentari, come alimenti per uso medico, come farmaci, ecc., saranno espresse come concentrazioni “in peso” rispetto al peso totale della composizione. La metodica contemplata è quella dell’analisi gascromatografica GC, ma l’analisi sarà condotta in confronto con sostanze pure al 100% e determinando i necessari fattori di risposta GC. E ben noto infatti che la concentrazione dedotta semplicemente attraverso i rapporti delle aree cromatografiche, come spesso effettuato sulle composizioni di scarsa purezza, può portare ad errori di valutazione estremamente gravi in quanto ovviamente molte impurezze sono trattenute nella colonna gascromato grafica e non sono rivelate dal detector dello strumento, diminuendo così l'area GC totale del campione e portando quindi ad una sopravvalutazione dei componenti polinsaturi, come p. e EPA e DHA.

Dopo purificazione in accordo con il procedimento dell’invenzione, sono state ottenute numerose composizioni purificate di acidi grassi poiinsaturi, delle quali riportiamo qui di seguito in modo sommario e in termini generici alcuni esempi ovviamente non limitativi:

1) Composizioni che comprendono acidi grassi poiinsaturi a lunga<'>catena di origine animale e/o vegetale, appartenenti alla serie omega-3 e/o omega-6, aventi 2-6 doppi legami e 18 o più atomi di carbonio, o loro sali o esteri.

2) Composizioni come definite in 1), in cui gli acidi grassi hanno provenienza marina e derivano in particolare dagli oli di pesce o dai “krill oils”, oppure derivano da oli di pesce da acquacoltura, oppure ancora da alghe e altri microrganismi oleaginosi, o da “single celi fermentation” a partire da selezionati ceppi di alghe o altri microrganismi, anche ricombinanti, e comprendono acido eicosapentaenoico (EPA, C20:5 n-3, tutto cis) e/o acido docoesaenoico (DHA, C22:6 n-3, tutto cis), o un loro sale o estere alchiìico, preferibilmente C1-C3, in ogni rapporto tra loro.

3) Composizioni come definite in 2), in cui gli esteri sono esteri alchilici, preferibilmente C1-C3.

4) Composizioni come definite in 2) in cui gli esteri sono mono-esteri e/o di-esteri e/o tri-esteri glicerici.

5) Composizioni come definite in 3, in cui gli esteri alchilici sono esteri etilici, e la concentrazione di EPA o EPA estere etilico, oppure di DHA o DHA estere etilico, oppure la somma delle loro concentrazioni, sono comprese tra 15 e 100% del peso della composizione, preferibilmente tra 50 e 100% del peso.

6} Composizioni come definite in 5), in cui la somma delle concentrazioni di EPA estere etilico e di DHA estere etilico è superiore o uguale a 80% in peso, preferibilmente superiore o uguale a 84% in peso, essendo EPA estere etilico superiore o uguale a 40% in peso, DHA superiore o uguale a 34% in peso e la somma di tutti gli acidi omega-3 esteri etilici superiore o uguale a 90% in peso.

7) Composizioni come definite in 5), in cui la somma delle concentrazioni di EPA estere etilico e di DHA estere etilico è compresa tra 80% e 88% in peso, essendo EPA estere etilico compreso tra 43% e 49,5% in peso, DHA estere etilico compreso tra 34,7% e 40,3% in peso, e la somma degli esteri etìlici degli acidi omega-3 totali superiore o uguale a 90% in peso.

8) Composizioni come definite in 5), in cui la concentrazione di EPA estere etilico, oppure di DHA estere etilico è superiore o uguale a 80%, preferibilmente superiore o uguale a 90% in peso.

9) Composizioni come definite in 4), in cui la concentrazione di EPA o di DHA oppure la loro somma, sono comprese tra 15 e 100%, preferibilmente tra 50 e 100%, del peso della composizione.

Tutte queste composizioni sono particolarmente caratterizzate dal fatto di comprendere:

- una somma di acidi grassi furanici o loro corrispondenti sali o esteri alchilici, preferibilmente C1-C3, in concentrazione totale inferiore o uguale a 0,1%, cioè inferiore o uguale a 1000 ppm e preferibilmente inferiore o uguale a 0,01%, cioè inferiore o uguale a 100 ppm.

Dette composizioni sono anche generalmente caratterizzate dal fatto di comprendere:

- acido titanico e/o acido pristanico, o loro corrispondenti sali o esteri alchilici, in concentrazione totale inferiore o uguale a 0,01%, cioè inferiore o uguale a 100 ppm e preferibilmente inferiore o uguale a 0,001%, cioè inferiore o uguale a 10 ppm;

- squalene in concentrazione inferiore o uguale a 0,01%, cioè inferiore o uguale a 100 ppm e preferibilmente inferiore o uguale a 0,001%, cioè inferiore o uguale a 10 ppm;

- oligomeri degli acidi, o sali o esteri, in concentrazione inferiore o uguale a 1,0%;

- policloro-dibenzo-para-diossine (PCDDs) e policloro-dibenzofurani (PCDFs) in concentrazione complessiva inferiore o uguale 1,0 pg/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,1 pg/g, valore determinato in accordo con i fattori di tossicità equivalente (TEFs) della WHO ed espressi come equivalenti tossici (TEQs);

- PCDDs, PCDFs e policloro-bifenili (PCBs) diossino-simili (DL-PCBs) in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 5,0 pg/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,5 pg/g, valore determinato come sopra definito (TEQs);

- PCBs marker in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 5,0 ng/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,5 ng/g;

- polibromo-difenileteri (PBDEs) in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 5,0 ng/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,5 ng/g;

- una somma di idrocarburi aromatici policiclici (PAHs), espressa come sostanza marker benzo[a]pirene, inferiore o uguale a 1,0 ng/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,1 ng/g;

- altri inquinanti ambientali (pollutants) organici persistenti (POPs) comprendenti 2,2 bis-(p-diclorofenil)-etano (DDE), e/o 2,2 bis-(pdiclorofenil)-l,l-dicloroetano (DDD), e/o 2,2 bis-(p-diclorofenil)- 1,1,1 -tricloroetano (DDT) in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 2,0 ng/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,2 ng/g, polibromobifenili (PBB) in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 5,0 ng/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,5 ng/g; esaclorobenzene in concentrazione inferiore o uguale a 0,1 ng/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,01 ng/g e isomeri di esacloro-cicloesano in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 0,1 ng/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,01 ng/g.

Mentre nel processo di purificazione si riscontra che gli oligomeri sono semplicemente ridotti rispetto al contenuto nei materiali di partenza, trovandosi comunque nella parte più bassa dell’intervallo descritto, ciascuna delle altre sostanze comprese in detti intervalli di concentrazione e la loro somma nell’ambito delimitato dagli stessi intervalli, risulta almeno 5 volte ridotta, o preferibilmente almeno 10 volte ridotta rispetto al loro contenuto nelle composizioni non purificate da cui provengono, oppure nella grande maggioranza dei casi è “essenzialmente zero” o “zero”.

Tutte le composizioni purificate sopra dettagliatamente descritte, possono poi essere formulate - tal quali o previa addizione con idonei diluenti, eccipienti, sospendenti, ecc e/o con idonei conservanti, antiossidanti,ecc, secondo tutte le tecnologie note nell’arte per dare tutte le formulazioni note neH’arte per permettere il loro utilizzo in tutti gli usi proposti. Dette formulazioni comprendono, oltre alla loro inclusione diretta p.e. nei vari alimenti, oppure sotto forma di micro incapsulati o nano incapsulati ottenuti secondo l’arte nota, anche le formulazioni per l’uso orale - come gocce, capsule di gelatina molle, capsule auto sigillanti di gelatina dura, compresse, se necessario previo adsorbimento su sopporto solido o come complesso di inclusione, se necessario anche in formulazione gastroresistente, ecc - come noto nell’arte, oppure per l’uso topico - come creme, pomate, ecc - come pure noto nell’arte, oppure ancora per l’uso iniettivo - come fiale per l’uso intramuscolare, flebo per infusione endovenosa lenta, ecc, previa sterilizzazione e/o se necessario previa modificazione per via chimica e/o fisica, p.e. come i gliceridi in emulsione, come pure noto nell’arte.

Con riferimento al loro uso, dette composizioni purificate e le loro formulazioni saranno indirizzate alla preparazione e all’uso come alimento o ingrediente alimentare, di ogni tipo e per ogni scopo, come supplemento alimentare e dietetico, alimento per scopi medici speciali (alimento funzionale), sia nuovi che deducibili dall’uso farmaceutico, alimento per uso animale e per acquacoltura, formula alimentare per l’infanzia, cosmetico e preparato farmaceutico, tutti contenenti o arricchiti in acidi grassi a lunga catena o loro derivati, a carattere poiinsaturo o specificamente della serie omega-3, oppure il loro uso sarà indirizzato alla preparazione per via chimica o, preferibilmente, per via enzimatica, mediante apposite lipasi, come descritto in letteratura, di altri derivati come p.e. i corrispondenti mono-, di-, o trigliceridi, che risulteranno così altrettanto purificati.

Per tutti gli usi, ma in particolare il preparato per l’uso farmaceutico, sarà preferibilmente arricchito e concentrato nei componenti poiinsaturi, in particolare in EPA e/o in DHA, o loro sale, o loro estere etilico.

Di grande e crescente importanza risultano gli alimenti per scopi medici speciali, o alimenti funzionali - comprendenti anche bevande e supplementi - che comprendono specifici ingredienti, come in particolare gli acidi omega-3 in ogni loro forma, in grado di impartire certi specifici benefici per la salute (fortified foods). Questi particolari benefici saranno in definitiva quelli desumibili dall’uso farmaceutico stesso di quegli specifici ingredienti, ma potranno anche essere nuovi. Questi alimenti funzionali sono attualmente noti con il termine inglese FOSHU (Foods for Specified Health Use) o con il termine giapponese Tokuho.

Tutti gli usi sotto riportati, in particolare gli usi farmaceutici, non ci appaiono affatto ovvi e scontati su base di letteratura, se si considera che tute le composizioni purificate utilizzate sono del tutto esenti da acidi grassi furanici, laddove diversi autori atribuiscono proprio ad essi razione cardioprotettiva degli oli di pesce, come G.Spiteller, Lipids 40, 755, 2005 e altri, l’azione anti- infiammatoria, come T. Wakimoto et al, Proc Nati Acad Sci 108, 17533, 2011 e altri, e ulteriori atività similari.

Scendendo al particolare, l’uso delle composizioni sarà indirizzato alla prevenzione e al tratamento di fatori di rischio per malattie cardiache, , - cardiovascolari e cardiocircolatorie, come l’ipertensione, l’ipertrigliceridemia severa e moderata (risp. >500mg/dl e >200mg/dl) e l’ipercolesterolemia, in particolare le forme famigliari e genetiche, anche in associazione con altri farmaci e in particolare con le statine, e come i difetti della coagulazione e dell’aggregazione piastrinica.

Un uso di grande rilievo è quello per la prevenzione e il trattamento di malattie cardiache, cardiovascolari e cardiocircolatorie, come quelle coronariche- aterosclerotiche e gli stati ischemici cardiaci e cerebrali, includendo l’infarto miocardico e cerebrale e la riduzione del rischio di mortalità cardiaca improvvisa conseguente ad infarto del miocardio; quelle di origine elettrica e coinvolgenti l’insorgenza e la propagazione del ritmo cardiaco, includenti l’aritmia e la fibrillazione atriale e/o ventricolare; e quelle dovute ai difetti meccanici della pompa cardiaca, come l’insufficienza e lo scompenso cardiaco e/o la “heart failure” congestizia.

In altri usi farmaceutici le composizioni sono utilizzate per la prevenzione e il trattamento di disordini del sistema nervoso centrale (CNS), includenti l’epilessia, le varie forme depressive, i disordini bipolari, le patologie pediatriche da difetto dell’attenzione e disordini da iperattività (ADHD), i difetti dell’apprendimento e della memoria, le varie forme di schizofrenia, la malattia di Alzheimer e le diverse forme di demenza.

Ancora altri usi farmaceutici includono la prevenzione e il trattamento della retinopatia e dei sintomi di secchezza oculare, della sindrome metabolica, di difetti del metabolismo e correlati all’obesità, del diabete di tipo 2, delle disfunzioni epatiche, di malattie del tessuto connettivo e delle articolazioni, degli stati infiammatori, di malattie autoimmuni, della colite ulcerosa, della psoriasi e della malattia tumorale.

ESEMPI SPERIMENTALI

L’invenzione sarà ora illustrata per mezzo di alcuni Esempi che non avranno comunque nessun carattere limitativo. Questi Esempi sono quindi presentati soltanto per scopi illustrativi e pertanto molte altre materie prime potranno essere usate, così pure molte altre variazioni del procedimento potranno essere effettuate e molte altre composizioni purificate di PUFA potranno essere ottenute, rientrando comunque nello spirito e nella lettera di quanto esposto nella Descrizione.

ESEMPIO 1

La purificazione è stata effettuata su un lotto di PUFA ad elevata concentrazione, più precisamente è stato usato un lotto di esteri etilici di acidi omega-3 in accordo con la monografia n.1250 della Farmacopea europea {omega-3-acid ethyl estere 90, batch 201308), anche definiti come PUFA_EE oppure PUFAee, regolarmente analizzati e approvati. Il contenuto di EPA estere etilico e di DHA estere etilico in questo lotto è relativamente elevato, mentre gli altri esteri omega-3 sono relativamente ridotti, ma nel complesso la composizione rientra nei limiti indicati nella Farmacopea Europea. I valori di acidità, anisidina, perossidi e oligomeri sono anche conformi alle richieste della Farmacopea.

E’ ovvio che la stessa purificazione sarebbe fattibile anche con un prodotto avente p.e. i limiti descritti dalla Farmacopea americana.

Metodica analitica

Il contenuto percentuale dei vari PUFAJEE è stato determinato mediante analisi GCMS (gascromatografia abbinata alla spettrometria di massa). Questa metodica permette di modificare le condizioni gascromatografiche, prolungando i tempi di ritenzione e separando meglio i singoli picchi, senza pregiudicare l’identificazione dei singoli picchi (che manterranno comunque la sequenza mostrata dai grafici di Farmacopea).

II campione in esame viene sciolto a 25 mg/mL pesando accuratamente 250 mg /- 0.1 mg di campione e diluendo in 10 mL di isoottano, addizionato di 5 mg di butil-idrossitoluene, in pallone tarato.

I picchi dei PUFA_EE sono identificati mediante ricerca bibliografica degli spettri di massa. La quantità di ciascun estere etilico viene calcolata per normalizzazione delle aree, quando necessario usando idonei fattori di correzione.

Le condizioni cromatografiche GCMS vengono riassunte come segue:

Parametro Parametro fissato

Autocampionatore Shimadzu AOC-5000

Siringa 10 uL (Liq)

Volume di iniezione 1 uL

Velocità di 5 uL/s

Velocità di iniezione 50 uL/s

Ritardo pre-iniezione 500 ms

Ritardo post-iniezione 500 ms

Gascromatografo Shimadzu GC 17A

Durata della GC 85 min

Dettagli della 250 °C, SPLIT = 200, High pressure inject = Colonna BGB Analytics BGB-WAX (60m x 0.25 mm x Parametri del forno 170 °C held for 0.5 min, 1.0 °C/min to 220 °C, Parametri del carrier Helium at 1.0 mL/min,

Spectrometro di Shimadzu QP5050A (EI, 70eV)

Parametri di Low m/z = 40, High m/z = 550, Det V = 1.7 kV Acquisizione dei dati Solvent cut time = 3.9 min

I picchi gascromatografici di questo lotto di partenza sono riportati in Figura 2, mentre la loro attribuzione supportata dalla spettrometria di massa e le concentrazioni % sono riportate in Tabella 2.

Tabella 2

Peak Ret. time

Area Area % Library search resulta

No. [min]

1 40.332 312271 0.10 C18:4n3

2 46.870 494559 0.16 10,13-Epoxy- 11 -methyloctadecadienoic acidJEE 3 48.517 218511 0.07 C19:5_EE?

4 49.201 298509 0.10 C20:3n6_EE

5 50.550 7782595 2.51 C20:4n6_EE

6 53.504 2822847 0.91 C20:4n3„EE

7 53.794 723191 0.23 12,15-Epoxy- 13, 14-dimethyloctadecadienoic acidJEE 8 54.294 329794 0.11 Unknown

9 54.855 157473628 50.81 C20:5n3_EE (EPA)

10 56.640 464865 0.15 Unknown

11 60.301 933119 0.30 C21:5n3_EE

12 61.875 484604 0.16 C22:4_EE

13 62.084 679442 0.22 12,15-Epoxy- 13, 14-dimethyleicosadienoìc acid_EE 14 63.313 8014262 2.59 C22:5n6_EE

15 65.794 3954434 1.28 C22:5n3_EE

16 66.885 459514 0.15 Unknown

17 67.584 122269289 39.46 C22:6n3_EE (DHA)

18 68.977 227002 0.07 Unknown

19 69.794 747365 0.24 Unknown

20 70.428 1183869 0.38 4,5-epoxy-Cholestane?

Dai dati ottenuti si evidenzia che il lotto di PUFA__EE in esame è di eccellente qualità e conforme alle specifiche della Eu. Ph., essendo EPA estere etilico = 50.81% in peso e DHA estere etilico = 39.46% in peso (rapporto % delle aree normalizzate e corrette con i rispettivi fattori di risposta). Esso contiene tuttavia almeno 3 acidi furanici, anche essi in forma di esteri etilici, in quantità superiore al limite di quantificazione (LOQ > 0.01%) della metodica analitica adottata (Tempi di Ritenzione gascromatografica, RT: 46.87 min, 53.79 min, 62.08 min; loro contenuto %, 0.16, 0.23 e 0.22% rispettivamente). Questi acidi grassi furanici, sebbene non proibiti esplicitamente dalle farmacopee, che anzi ne evidenziano la possibile presenza, non hanno tuttavia una struttura conforme a quella dei PUFA dichiarati, e dovrebbero pertanto essere esclusi almeno dall’uso umano, sia come integratori alimentari e simili, sia con evidenza ancora maggiore, dall’uso come farmaci.

L’analisi dei POPs evidenzia una somma dei PCDD e PCDF pari a 0,06 pg/g di equivalenti tossici (TEQ) WHO, una somma cumulativa con i DL-PCB pari a 0,28 pg/g TEQ WHO, una somma dei PCB markers di 15 ng/g, una somma di PBDE di 0,44 ng/g e una somma di IPA pari a 0,lng/g di benzo[a]pirene.

Analogamente a quanto sopra, saranno presentati anche i risultati ottenuti sui prodotti preparati secondo il procedimento che segue.

Procedimento

In un pallone a 4 colli attrezzato con agitatore, condensatore e termometro, si caricano 1500 mL di metanolo e 750 g di urea, quindi si riscalda a riflusso sotto agitazione ottenendo una soluzione limpida. Si aggiungono quindi 250 g della miscela oleosa di PUFA_EE (rapporto in peso PUFA_EE : urea 1 : 3), di colore debolmente giallo, si lascia in agitazione per 10 min all’ebollizione ottenendo una soluzione opalescente che per riposo evidenzia poco materiale oleoso in superficie.

Nell’ipotesi di completare la complessazione, si aggiungono ulteriori 500 mL di metanolo e 250 g di urea (rapporto totale in peso PUFA_EE : urea 1 : 4), si riscalda ancora a riflusso sotto agitazione per qualche minuto, e si lascia quindi raffreddare.

Descritta questa operazione, è evidente che la reazione sarà vantaggiosamente condotta utilizzando direttamente 2000 mL di metanolo e 1000 g di urea per la stessa quantità di 250 g di PUFAJEE.

Proseguendo la reazione, a 58-60 °C inizia la precipitazione del complesso di inclusione dei PUFA_EE in urea. Quando la temperatura raggiunge 30 °C, il pallone è chiuso in atmosfera di azoto, trasferito in frigorifero a circa 5 °C e lasciato a riposo per circa 20 ore (1 notte) senza agitazione.

Alla fine il precipitato viene recuperato per filtrazione su buckner sotto aspirazione, spremuto bene su buckner per allontanare completamente le acque madri, e lavato accuratamente in successione con due porzioni, ciascuna da 300 mL, di soluzione metanolica satura di urea e preraffreddata a 5 °C (ottenuta per dissoluzione di 160 g di urea in 1000 mL di metanolo), ottenendo così acque di lavaggio incolori.

Il precipitato bianco cristallino viene quindi essiccato a temperatura e pressione ridotte, ottenendo 955 g di complesso ureico dal quale si procede al recupero dei PUFA_EE mediante dissoluzione a circa 30 °C in 2000 mL di soluzione al 5% di NaCl in acqua. Si ottiene così una soluzione torbida con separazione di un olio in superfìcie.

La fase oleosa viene quindi estratta in successione con 2 porzioni da 600 mL di n-esano e blanda agitazione per 10 min.

Gli strati organici superiori vengono separati dalla fase acquosa e riuniti, quindi il n-esano viene evaporato a secchezza fino a peso costante, a pressione ridotta e con riscaldamento esterno a circa 35 °C, ottenendo così 210 g di residuo oleoso incolore, costituito dai desiderati PUFA_EE allo stato purificato, che vengono conservati in contenitore chiuso sotto atmosfera di azoto ed in frigorifero a 5 °C.

Il prodotto viene usualmente usato tal quale, senza ulteriore manipolazione. Eventuali tracce di solventi possono comunque essere allontanate p.e. per rapida distillazione molecolare o per estrazione con fluidi supercritici, entrambe in condizioni standard note all’esperto; eventuali tracce di sostanze polari possono essere eliminate per rapida percolazione su piccole quantità di gel di silice, eluente n-esano, secondo EP 1685222.

Il prodotto viene analizzato mediante GCMS come sopra descritto e i picchi gascromatografici sono riportati in Figura 3. mentre la loro attribuzione supportata dalla spettrometria di massa e le concentrazioni % in peso sono riportate in Tabella 3.

Tabella 3

Peak Ret. time

Area Area % Library search resulta

No. [min]

1 40.321 350875 0.11 C18:4n3

2 48.499 209102 0.06 C19:5_EE?

3 49.177 237939 0.07 C20:3n6_EE

4 50.541 9072473 2.72 C20:4n6_EE

5 53.033 170013 0.05 Unknown

6 53.496 3440930 1.03 C20:4n3_EB

7 54.301 334423 0.10 Unknown

8 54.847 166684659 49.94 C20:5n3_EE (EPA)

9 55.706 174468 0.05 Unknown

10 56.344 160782 0.05 Unknown

11 56.618 347039 0.10 Unknown

12 60.286 1094998 0.33 C21:5n3_EE

13 61.889 472742 0.14 C22:4_EE

14 63.304 9194499 2.75 C22:5n6_EE

15 65.790 4366628 1.31 C22:5n3_EE

16 66.880 488408 0.15 Unknown

17 67.585 134195980 40.21 C22:6n3_EE (DHA)

18 68.529 434518 0.13 Unknown

19 68.931 317571 0.10 Unknown

20 69.817 852795 0.26 Unknown

21 70.451 1147423 0.34 4,5-epoxy-Cholestane?

Il contenuto di EPA estere etilico risulta essere del 49.94% in peso, quello di DHA estere etilico del 40.21% in peso.

La considerazione più evidente deducibile da questi dati si riferisce alla scomparsa totale dei picchi corrispondenti agli esteri etilici dei 3 acidi grassi furanici sopra citati.

il lieve aumento dell’area gascromatografica depone inoltre per una eliminazione almeno parziale dei prodotti a struttura oligomera.

I valori dei POPs risultano tutti essenzialmente zero. ESEMPIO 1 A

Si procede in accordo con il metodo dell’Esempio 1 , ma dopo il trattamento iniziale di 25 g di PUFA_EE con 100 g di urea in 200 mL di metanolo all’ebollizione, la soluzione opalescente viene addizionata di ulteriori 25 g di urea disciolta a caldo in 50 mL di metanolo (rapporto totale in peso PUFA_EE : urea 1 : 5), in un tentativo di completare la complessazione di eventuale materiale ancora non reagito, riscaldando poi la miscela all’ebollizione per ulteriori 10 min.

Si procede poi secondo l’Esempio 1, e alla fine il peso del residuo oleoso purificato ottenuto non è proporzionalmente aumentato in modo significativo e il suo quadro gascromatografico si dimostra sostanzialmente uguale a quello ottenuto in accordo con l’Esempio 1.

ESEMPIO 1 B

Le acque madri metanoliche della complessazione e le acque metanoliche di lavaggio ottenute secondo Esempio 1, vengono riunite e concentrate a pressione ridotta e per riscaldamento esterno a circa 35 °C fino ad eliminazione di circa 50% del metanolo e inizio di formazione di un precipitato bianco.

Per aiutare la precipitazione la miscela viene tenuta in bagno di ghiaccio per 10 minuti, quindi il precipitato solido viene raccolto per filtrazione su buckner sotto vuoto e spremuto bene per allontanare completamente le acque madri.

Il precipitato viene quindi lavato con cura con due porzioni successive da 100 mL di soluzione satura di urea in metanolo e preraffreddata a 5 °C, come già sopra descritto, fino ad ottenere così acque di lavaggio incolori.

Il precipitato bianco cristallino viene quindi essiccato sotto vuoto per dare 178 g di prodotto dal quale si procede al recupero del materiale oleoso di inclusione come descritto in Esempio 1, per dissoluzione a circa 30 °C in 1000 mL di soluzione acquosa al 5% di NaCl, ed estrazione per due volte con aliquote da 200 mL di n-esano, sotto blanda agitazione per 10 minuti.

Le fasi organiche superiori vengono separate e riunite, mentre la fase acquosa viene scartata, quindi la soluzione di n-esano viene concentrata a secchezza a pressione ridotta e su bagno a circa 35°C, ottenendo un residuo oleoso di 6.0 g che viene mantenuto in contenitore sotto azoto ed a 5 °C per scopi analitici.

L’analisi GCMS non mostra tuttavia nessun picco gascromatografico, per cui la struttura del materiale oleoso viene attribuita ad oligomeri con assenza totale degli esteri etilici dei singoli PUFA.

ESEMPIO 1 C

Le acque madri metanoliche e le acque metanoliche di lavaggio ottenute secondo Esempio 1 B, vengono riunite e concentrate a pressione ridotta e per riscaldamento esterno a circa 35 °C fino a secchezza ottenendo un residuo semi-solido di tipo ceroso - oleoso, che sulla base di analisi successive si dimostra costituito da urea, da limitate quantità di PUFA_EE inclusi e non inclusi in urea, e da numerose impurezze non aventi una struttura di PUFA_EE o anche totalmente estranee.

Da questo residuo si procede quindi al recupero totale dei PUFA_EE e di tutto il materiale organico presente, anche quello non incluso nel complesso ureico, p.e. come descritto in Esempio 1 o 1 B, e pertanto sciogliendo il residuo a circa 30 °C in 1000 mL di soluzione acquosa al 5% di NaCl, ed estraendo poi per due volte con aliquote da 300 mL di n-esano, sotto blanda agitazione.

La fase acquosa viene quindi scartata, mentre le due fasi organiche superiori vengono separate e riunite, quindi il n-esano viene concentrato a secchezza a pressione ridotta e su bagno a circa 35°C, ottenendo un residuo oleoso - ceroso di 34 g che viene mantenuto in contenitore sotto azoto ed a 5 °C per scopi analitici.

L’analisi GCMS è condotta come sopra descritto e i picchi gascromatografici sono riportati in Figura 4. mentre la loro attribuzione supportata dalla spettrometria di massa e le concentrazioni % sono riportate in Tabella 4.

Tabella 4

Peak Ret. time

Area Area % Library Bearch re suite

No. [min]

1 24.282 317977 0.17 Ethyl phytanoate

2 40.320 358967 0.19 C18:4n3

3 45.599 949288 0.51 Unknown

4 46.830 4347822 2.35 10,13-Epoxy-l 1-methyloctadecadienoic acid_EE 5 48.442 140213 0.08 C19:5_EE?

6 48.616 279503 0.15 12,1 5-Epoxy- 13-raethyloctadecadienoic acid_EE 7 49.584 2307 11 0.12 Unknown

8 50.499 2053514 1.11 C2Ó:4n6_EE

9 50.966 904406 0.49 10,13-Epoxy-l 1,12-dimethyloctadecadienoic acid_EE 10 53.753 5194103 2.81 12,1 5-Epoxy- 13,14-dimethyloctadecadienoic acid_EE 11 54.767 103732660 56.07 C20:5n3_EE (EPA)

12 58.848 968133 0.52 12, 15-EpoJty-13-methyleicosadienoic acidJEE 13 60.252 192585 0.10 C21:5n3JEE

14 62.043 4306882 2.33 12, 15-Epoxy- 13, 14-dimethyleicosadienoic acid_EE 15 63.259 1587215 0.86 C22:5n6_EE

16 64.639 395174 0.21 14,17-Epoxy- 15, 16-dimethyleicosadienoic acid_EE 17 65.923 2379503 1.29 Squalene

18 66.794 162498 0.09 Unknown

19 67.440 56844015 30.72 C22:6n3JSE (DHA)

Poiché tuttavia l’area GC totale risulta fortemente ridotta (attorno a -40/ -45%), sia rispetto alla materia prima, sia in particolare rispetto alla frazione purificata di cui all’Esempio 1 , queste concentrazioni % sono solo espresse come % delle singole aree GC rispetto all’area totale, senza tener conto del materiale non rivelato dal detector dello strumento (oligomeri o polimeri, prodotti di degradazione e simili), e avranno pertanto solo significato orientativo.

Il contenuto di EPA estere etilico di questa relativamente piccola frazione risulta del 56.07%, quello di DHA estere etilico del 30.72%.

La prima e più evidente considerazione deducibile dall’assieme dei dati GC si riferisce alla presenza, in concentrazione fortemente incrementata, con valore circa inversamente proporzionale al ridotto peso della frazione ottenuta, dei picchi corrispondenti esteri dei 3 acidi grassi furanici presenti nel materiale di partenza (RT: 46.83 min, 53.75 min, 62.04 min; contenuto % rispettivamente 2.35, 2.81 e 2.33%).

Si evidenzia inoltre la comparsa di 4 nuovi picchi corrispondenti a 4 nuovi acidi furanici, non rilevati nello spettro GC del materiale di partenza evidentemente in quanto la loro concentrazione era inferiore al limite di rivelazione (LoD) e quantificazione (LoQ) del metodo analitico (RT: 48.62 min, 50.97 min, 58.85 min, 64.64 min, contenuto % rispettivamente 0.15, 0.49, 0.52 e 0.21%).

Si riscontra anche la presenza di 1 picco GC identificato come estere etilico dell’acido Titanico (RT:24.28 min, contenuto 0.17%): non sorprende in questo caso il mancato riscontro e dosaggio nel materiale di partenza, in quanto - pur non essendo esplicitamente proibito in Farmacopea - la tossicità di questa sostanza è risultata in anni recenti sempre più evidente e pericolosa per la salute umana, ed è in atto un notevole sforzo da parte di alcuni dei produttori più avveduti per limitarne la presenza al di sotto del limite di rilevazione e quantificazione, pur a fronte di dispendiosi procedimenti cromatografici.

Si evidenzia infine 1 picco corrispondente allo squalene, un idrocarburo alifatico a lunga catena di formula C30H50, non avente quindi struttura di acido grasso (RT: 65.92 min, contenuto 1.29%), anche esso non rilevato nel prodotto di partenza in quanto in concentrazione inferiore al limite di rivelazione.

L’analisi dei POPs porta ad una somma di PCDD e PCDF di 0,48 pg/g TEQ WHO, una somma cumulativa con i DL-PCB di 2,3 pg/g TEQ WHO, una somma dei PCB markers di 118 ng/g (0,118 ppm), una somma di PBDE di 3,1 ng/g e infine di sostanze affini al benzo[a]pirene.parì a 0,7 ng/g.

Questa frazione, o frazioni similari, vengono usualmente scartate, ma possono anche essere utilizzate - se richiesto - per il recupero di quantità molto moderate degli esteri etilici di EPA e/o DHA e per l’isolamento di altri sottoprodotti come il fitanato d’etile e gli esteri etilici degli acidi grassi furanici da destinare ad usi speciali.

In assenza di ogni interesse al recupero di dette sostanze, il procedimento di purificazione eviterà - oltre a quanto descritto in Esempio 1 A - anche le fasi degli Esempi 1 B e 1C, e si limiterà pertanto alla sola procedura dell’Esempio 1 con evidente semplificazione della procedura e riduzione dei relativi costi.

ESEMPIO 2

E’ stato utilizzato lo stesso lotto di esteri etilici degli acidi omega-3 che è stato usato nell’Esempio 1 (picchi GC riportati in Fig. 2, attribuzione dei picchi e concentrazioni % in peso riportate in Tab. 2), così pure è stata usata la stessa metodica analitica. Anche il procedimento è risultato similare, con alcune varianti suggerite dall’uso come solvente di etanolo, che risulta dotato di potere solvente notevolmente ridotto.

Procedimento

Si caricano in un pallone 400 mL di etanolo e 75 g di urea, quindi si riscalda a riflusso sotto agitazione ottenendo una sostanziale soluzione con poca urea ancora indisciolta.

Si aggiungono quindi 25 g della miscela oleosa dei PUFA_EE (rapporto in peso PUPA : urea 1 : 3), e si lascia quindi sotto agitazione e all 'ebollizione,ancora per 10 min, ottenendo una miscela giallastra con poca sospensione residua.

Si lascia raffreddare sotto agitazione e a 65 °C inizia la precipitazione del complesso desiderato.

A 30 °C il pallone è chiuso in atmosfera di azoto e messo in frigorifero a circa 5 °C, a riposo per una notte per completare la precipitazione.

Alla fine il precipitato è raccolto per filtrazione su buckner, spremuto bene per allontanare al massimo le acque madri e lavato a fondo con 2 porzioni da 50 mL di una soluzione satura di urea in etanolo, preraffreddata a 5 °C (ottenuta sciogliendo 30 g di urea in 200 mL di etanolo), ottenendo così alla fine acque di lavaggio incolori.

Si ottengono quindi dopo essiccamento 74.6 g di precipitato bianco cristallino, dal quale si procede al recupero dei PUFA_EE purificati per dissoluzione a circa 30 °C in 200 mL di soluzione al 5% di NaCl in acqua e successiva estrazione con 2 porzioni ciascuna da 100 mL di n-esano.

Le 2 fasi organiche vengono separate dalla fase acquosa e riunite, quindi il n-esano viene evaporato a secchezza a circa 35 °C ed a pressione ridotta fino a peso costante, ottenendo 11.9 g di residuo oleoso incolore costituito da PUFA_EE purificati che vengono conservati attorno a 5 °C in atmosfera di azoto.

Il prodotto è usualmente utilizzato tal quale. Eventuali tracce di solventi o impurezze polari possono essere eliminate, se desiderato, con metodi noti come riportato in Esempio 1.

L’analisi GCMS dimostra che la composizione è del tutto simile a quella già descritta in Figura 3 e in Tabella 3. In particolare viene confermata la totale assenza dei 3 esteri etilici degli acidi furanici presenti nella materia prima di partenza.

ESEMPIO 2 A

Le acque madri etanoliche isolate per filtrazione del complesso di inclusione dei PUFA_EE in urea, riunite con Fetanolo di lavaggio come sopra descritto in Esempio 2, vengono concentrate a circa 35 °C ed a pressione ridotta fino ad eliminazione di circa 50% dell’etanolo, ottenendo solo tracce di precipitato.

Si aggiungono quindi altri 25 g di urea (rapporto totale in peso PUFA : urea, riferito alla situazione di reazione iniziale, di 1 : 4) e si porta la miscela all’ebollizione per 10 minuti sotto lenta agitazione ottenendo soluzione completa.

Si lascia quindi raffreddare sempre sotto agitazione, ottenendo a circa 60 °C un inizio di precipitazione, quindi si lascia a riposo per una notte in frigorifero a circa 5 °C.

Alla fine si filtra il precipitato su buckner, si allontanano a fondo le acque madri, e si lava bene con 2 porzioni da 50 mL di una soluzione satura di urea in etanolo e preraffreddata a 5 °C, come descritto in Esempio 2.

Si ottengono così dopo essiccamento 34.5 g di precipitato bianco, dal quale sì recuperano i PUFA„EE essenzialmente come descritto in Esempio 2, mediante dissoluzione in 200 mL di soluzione acquosa al 5% di NaCl ed estrazione con 2 porzioni da 100 mL di nes ano.

L’evaporazione a secchezza degli estratti in n-esano secondo Esempio 2 porta a un ulteriore residuo oleoso incolore di 5.8 g, costituito anche esso da PUFA_EE purificati, che viene conservato a 5 °C sotto azoto.

L’analisi GCMS conferma la purezza del prodotto e dimostra che la sua composizione è essenzialmente uguale a quella descritta in Figura 3 e in Tabella 3, per cui il prodotto viene riunito a quello dell’Esempio 2, portando così a una resa totale di 17.7 g.

L’analisi dei POPs dimostra che il loro contenuto è “essenzialmente zero”.

ESEMPIO 2 B

Le acque madri etanoliche e l’etanolo di lavaggio della fase precedente vengono concentrate a secchezza a pressione ridotta ed a temperatura di circa 35 °C, quindi Ϊ1 residuo solido ceroso ottenuto viene trattato con una soluzione acquosa al 5% di NaCl ed estratto 2 volte con n-esano essenzialmente con la procedura dell’Esempio 1 C, allo scopo di recuperare eventuali PUFA_EE ancora presenti, inclusi in urea, come pure gli altri materiali, anche di tipo estraneo ai PUFA, non inclusi in urea.

Alla fine la fase acquosa viene scartata, mentre per evaporazione a secchezza del n-esano si recuperano 8.2 g di residuo solido ceroso, che viene conservato a 5 °C sotto azoto per scopo analitico e per eventuale recupero di particolari sostanze.

In confronto con i dati riportati in Esempio 1 C, Fanalisi GCMS ha mostrato una riduzione dell’area

GC sensibilmente inferiore, dell’ordine del 10%, dimostrando che una maggiore quantità di esteri di EPA e DBA è rimasta in questa frazione contenente le impurezze risultanti dal processo di purificazione, come anche dimostrato dal peso di 8.2 g rispetto a 3.6 g dell’Esempio 1 C, cioè circa 2.3 volte maggiore.

Dal rapporto delle aree GC, il contenuto dell’estere di EPA risulta 56.94%, quello di DHA del 34.68%.

Il quadro delle impurezze estranee si dimostra quasi perfettamente sovrapponibile a quello dell’Esempio 1 C, tranne che la loro concentrazione si dimostra circa 2.3 volte inferiore a causa della maggiore diluizione.

Si rivelano così gli esteri etilici di 3 acidi grassi furanici a 44.91 min (0.71%), 51.83 min (0.91%), e 60.10 min (0.83%), già evidenziati nella materia prima, e gli esteri di altri 3 acidi furanici a 48.93 min (0.16%), 57.11 min (0.18%), 62.46 min (0.09%), mentre il solo estere a RT 48.62 min secondo Esempio 1 C, rimane in questo caso sotto il limite di rivelazione.

Si evidenziano inoltre il fitanato d’etile a 23.21 min (0.03%) e lo squalene a 63.64 min (0.70%).

Anche i POPs dimostrano una concentrazione 2-3 volte superiore di quella della materia prima di partenza, senza tuttavia raggiungere quella della frazione dell’Esempio 1 C.

ESEMPIO 3 (sec. letteratura)

Viene usato per la purificazione un lotto di esteri etilici di acidi omega-3 a media concentrazione.

E’ noto che la concentrazione di partenza dei PUFA dipende dalla loro fonte di produzione, e p.e. gli oli di pesce hanno usualmente un contenuto massimo di omega-3 del 20-30%, un tipico prodotto avendo EPA 18% e DHA 12%. Una indicazione del tutto orientativa comprende acidi saturi, acidi monoinsaturi, e acidi poiinsaturi, n3 e in piccola parte n6, ciascuna classe presente per un terzo della composizione.

Dopo trans esterificazione o idrolisi, si ottengono composizioni a media concentrazione p.e. per distillazione di frazioni basso-bollenti o per compie s sazione parzialmente selettiva dei componenti saturi e monoinsaturi, e/o meno insaturi di EPA e DHA, con moderate quantità di urea.

In questo Esempio 3 si utilizza un lotto di esteri etilici di acidi omega-3 (batch 065/07) in apparente accordo con una delle composizioni indicate dalla monografia 2063 della Eu.Ph. 6.3 (omega-3-acid ethyl esters 60), contenente in forma di esteri etilici EPA 36,1% e DHA 26,9%, valutati come rapporto delle loro aree GC rispetto all’area totale. Questi dati, diminuiti delle aree risultanti da specifica cromatografia per “size exclusion”, corrispondono rispettivamente a 33,0% e 24,6% del peso.

Altri componenti di tipo saturo sono C18:0 (0,6%), monoinsaturi come C18:l n9 (6,9%), C18:l n7 (2,7%), C20:l n9 (2,0%), C22: l nl l (1,7%), e poiinsaturi come C18:2 n6 (1,1%), C18:3 n3 (0,7%), C18:4 n3 (2,0%), C20:4 n6 (2,4%), C20:4 n3 (1,9%), C21:5 n3 (1,7%), C22:5 n6 (0,8%) e C22:5 n3 (5,2%). Gli altri numerosi componenti risultano tutti inferiori a 0,5%.

Si evidenziano anche in questo campione gli esteri etilici dei 3 acidi furanici già evidenziati nel lotto usato in Esempio 1, ognuno alla concentrazione di circa 0,2%, e il fitanato d’etile allo 0,16%.

L’analisi dei POPs mostrava una somma di PCDD e di PCDF pari a 0,56 pg/g espressi come TEQ WHO, raggiungendo 3,6 pg/g di TEQ se sommati ai DL-PCB, 75 ng/g di PCB markers e 5,2 ng/g di PBDE, in sostanziale assenza di benzo[a]pirene.

Procedimento

Si prepara una soluzione di 150 g di urea in metanolo all’ebollizione e si aggiungono poi 100 g di miscela di esteri etilici degli acidi grassi sopra descritti (rapporto in peso PUFA : urea 1 : 1.5).

Procedendo in accordo con l’Esempio 1, si raffredda a circa 5 °C per una notte ottenendo un abbondante precipitato costituito da complessi di inclusione in urea di esteri di vari acidi.

II precipitato viene quindi filtrato su buckner, spremuto bene per allontanare le acque madri e lavato a fondo {raccomandazioni usualmente assenti nelle descrizioni della letteratura!) con soluzione metanolica satura di urea e raffreddata a 5 °C, come in Esempio 1.

Dopo essiccamento, il precipitato viene sciolto in soluzione acquosa al 5% di NaCl e Folio che si separa viene estratto 2 volte con nesano, sempre in accordo con l’Esempio 1.

Si evapora quindi il solvente ottenendo un residuo oleoso di circa 42 g costituito prevalentemente degli esteri etilici degli acidi saturi, degli acidi monoinsaturi e degli acidi poiinsaturi meno insaturi di EPA e DHA e comprendente anche 10-15% in totale di esteri di EPA e DHA, come dimostrato dall’analisi GC.

Si riscontra tuttavia in questo residuo la totale assenza degli esteri dei 3 acidi furanici e dell’acido titanico presenti nel materiale di partenza, inoltre le analisi specifiche confermano in aggiunta l’assenza totale di pesticidi delle classi già discusse (POPs).

Secondo letteratura, questa frazione di prodotto viene comunque scartata o al più destinata al recupero delle limitate quantità di esteri di EPA e DHA presenti,

ESEMPIO 3 A (sec. letteratura)

Le acque madri metanoliche dell’Esempio 3, riunite con le acque metanoliche di lavaggio, vengono concentrate a secchezza p.e. come indicato in Esempio 1 C, quindi il residuo viene sciolto in soluzione acquosa al 5% di NaCl e la fase oleosa separatasi viene estratta per 2 volte con n-esano.

Dopo eliminazione della fase acquosa, il solvente organico viene evaporato a secchezza per dare 56 g di residuo oleoso di colore arancio-bruno costituito dagli esteri dei PUFA non complessati con urea durante il procedimento dell’Esempio 3.

All’analisi GC questo prodotto dimostra un contenuto di esteri etilici di EPA e DHA dell’86,4%, corrispondente ad EPA 50,1% e DHA 36,3% basati sul rapporto delle aree GC.

Tuttavia, poiché l’area GC totale risulta fortemente carente e il colore stesso del materiale indica con chiarezza l’accumulo di materiale di degradazione è evidente la necessità di procedere ad una fase di purificazione, p.e. mediante distillazione molecolare. In conclusione, dopo distillazione in condizioni standard della letteratura, si ottiene una composizione di colore debolmente gialla avente in forma di esteri etilici, EPA 49,0% del peso e DHA 36,2% del peso, per un totale quindi di 85,2% del peso. Il prodotto contiene inoltre solo tracce non dosabili di esteri di acidi saturi e monoinsaturi, e circa 2% di C18:4 n3, circa 0,5% di C20:4 n3, 1,6% di C21:5 n3 e 1,8% di C22:5 n3, oltre a 2,5% di C20:4 n6 e 0,8% di C22:5 n6.

Gli altri componenti, in numero fortemente ridotto, risultano essere ciascuno inferiore a 0,5%, presentando tuttavia il grave svantaggio che l’estere etilico dell’acido Titanico e tutti gli esteri degli acidi furanici risultano sostanzialmente in concentrazione quasi doppia rispetto al loro contenuto nella materia prima.

Anche i vari POPs risultano interamente conservati e incrementati in proporzione inversa rispetto al peso della composizione ottenuta, e pertanto in concentrazione quasi doppia rispetto al prodotto di partenza.

ESEMPIO 3 B (nuovo)

Un campione di 56 g della composizione distillata ottenuta secondo Esempio 3 A viene aggiunta sotto agitazione ad una soluzione all’ebollizione di 224 g di urea in metanolo come descritto in Esempio 1 (rapporto in peso PUFA : urea 1: 4).

Si prosegue quindi secondo Esempio 1 e alla fine dopo raffreddamento si raccoglie per filtrazione l’abbondante precipitato del complesso di inclusione dei PUFA in urea.

Dopo accurato lavaggio del precipitato sempre in accordo con l’Esempio 1, si procede ed recupero dei PUFA_EE seguendo la stessa metodica e ottenendo alla fine un olio incolore purificato, avente sostanzialmente lo stesso titolo in peso di esteri di EPA pari al 49% e di DHA pari al 36%, o più (titolo totale in peso > 85%), ma del tutto esente di esteri dell’acido fitanico e degli acidi furanici, come pure di inquinanti organici persistenti POPs.

Se desiderato, p.e. per allontanare tracce residue di solventi organici, il prodotto può essere ulteriormente sottoposto a distillazione molecolare o ad estrazione con fluidi supercritici.

II filtrato metanolico della fase di complessazione, contenente le varie impurezze, può essere eliminato. Se recuperato a scopo analitico, p.e. secondo Esempio 1 C, si ottengono 12 g di materiale oleoso contenente circa 70% di esteri etilici di EPA e DHA (che se desiderato può essere avviato al recupero mediante ulteriore complessazione con urea), contenente tuttavia tutte le impurezze e i POPs presenti nella materia prima, ma in concentrazione circa 10 volte superiore.

ESEMPIO 3 C (nuovo)

Si procede come in Esempio 3 B utilizzando un campione di 56 g della composizione grezza di colore arancio-bruna ottenuta secondo Esempio 3 A, che viene aggiunto analogamente ad una soluzione all’ebollizione di 224 g di urea in metanolo (rapporto in peso PUFA : urea 1 : 4).

Isolando e lavando il complesso di inclusione dei PUFA in urea, si recuperano quindi 48 g di PUFA_EE purificati in modo analogo, sotto forma di olio incolore e totalmente privi di esteri dell’acido fitanico e degli acidi furanici, e di inquinanti organici persistenti POPs.

Per distillazione molecolare di minime quantità di frazioni basso-bollenti, si ottengono p.e. composizioni altamente purificate contenenti EPA_EE 47% del peso e DHA_EE 38% del peso, o più (titolo totale in peso > 85%, in accordo con le specifiche della E.P. e della USP).

Gli altri componenti minori, comprendenti esteri di PUFA a grado di insaturazione minore di EPA e DHA, risultano sostanzialmente non dissimili dal prodotto di partenza dell’Esempio 3 A.

In alternativa vengono utilizzate le acque madri metanoliche come descritte in Esempio 3 A e contenenti 56 g della composizione grezza dei PUFA, ma senza preventivo isolamento degli stessi, e questa soluzione metanolica viene riscaldata all’ebollizione ed addizionata di 224 g di urea (rapporto in peso PUFA : urea 1 : 4).

Procedendo quindi come sopra descritto, si ottiene alla fine una composizione purificata di PUFA del tutto sovrapponibile a quella sopra descritta in questo Esempio 3 C.

ESEMPIO 3 D (nuovo)

Un campione di materiale contenente tra l’altro vari esteri di acidi monoinsaturi e poiinsaturi, tutti a basso titolo, ma sostanzialmente esenti da esteri dell’acido titanico e degli acidi furanici, e da POPs, ottenuto secondo il procedimento dell’Esempio 3, viene mescolato con un campione di esteri etilici di EPA e DHA ad alto titolo totale, 85% in peso o più, anche esso esente dalle stesse impurezze, come ottenuto p.e. secondo Esempio 3 C. Il rapporto dei campioni sarà in base ai pesi ottenuti durante le fasi di purificazione, p.e. 42 : 48.

La composizione del campione risultante sarà sostanzialmente uguale a quella del prodotto di partenza, come descritto in Esempio 3, contenente come percentuale in peso gli esteri etilici di EPA attorno al 33,0% e di DHA attorno al 24,6%, ma con il vantaggio di essere altamente purificati, cioè sostanzialmente esenti da esteri etilici dell’acido titanico e degli acidi furanici, e da POPs.

Anche gli altri componenti esteri di PUFA minori, saranno essenzialmente di identico contenuto.

in alternativa, sarà anche possibile procedere direttamente alla mescola dei prodotti di inclusione ottenuti p.e. secondo gli stessi Esempi 3 e 3 C, accuratamente lavati, e procedere poi congiuntamente al recupero di tutti i PUFA inclusi, esemplificati come EPA 33,0% e DHA 24,6% in peso, cioè a media concentrazione, ed esenti da tutte le impurezze già indicate.

ESEMPIO 3 E (nuovo)

Come ulteriore alternativa, un campione dello stesso lotto di esteri etilici di acidi grassi a lunga catena, a media concentrazione in EPA e DHA come descritto in Esempio 3, viene trattato in un unico step con una soluzione metanolica all’ebollizione contenente urea in eccesso, in quantità tale da dare complessi di inclusione con tutti gli esteri di acidi grassi presenti (rapporto in peso di esteri di acidi grassi : urea di 1 : 4 o più).

Dal complesso precipitato per raffreddamento, raccolto e lavato a fondo come già descritto, si recupera con metodo usuale una composizione oleosa incolore avente essenzialmente la stessa composizione del campione posto in reazione, ma totalmente esente da esteri etilici dell’acido titanico e degli acidi furanici, e da inquinanti organici persistenti POPs.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Una composizione che comprende acidi grassi poiinsaturi a lunga catena di origine animale e/o vegetale, appartenenti alla serie omega-3 e/o omega-6, aventi 2-6 doppi legami e 18 o più atomi di carbonio, o loro sali o esteri, e ulteriormente comprendenti acidi grassi furanici o loro corrispondenti sali o esteri, in concentrazione totale inferiore o uguale a 0,1%, cioè inferiore o uguale a 1000 ppm e preferibilmente inferiore o uguale a 0,01%, cioè inferiore o uguale a 100 ppm.
2. Una composizione secondo la rivendicazione 1, ulteriormente comprendente acido titanico e/o acido pristanico, o loro corrispondenti sali o esteri, in concentrazione totale inferiore o uguale a 0,01%, cioè inferiore o uguale a 100 ppm, e preferibilmente inferiore o uguale a 0,001%, cioè inferiore o uguale a 10 ppm.
3. Una composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1 e 2, ulteriormente comprendente squalene in concentrazione inferiore o uguale a 0,01%, cioè inferiore o uguale a 100 ppm, e preferibilmente inferiore o uguale a 0,001%, cioè inferiore o uguale a 10 ppm.
4. Una composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1-3, ulteriormente comprendente oligomeri di detti acidi, o sali o esteri, secondo le rivendicazioni 1-3 in concentrazione inferiore o uguale a 1,0%.
5. Una composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1-4, ulteriormente comprendente policloro-dibenzo-para-diossine (PCDDs) e policloro-dibenzo-furani (PCDFs) in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 1,0 pg/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,1 pg/g, valore determinato in accordo con i fattori di tossicità equivalente (TEFs) della WHO ed espressi come equivalenti tossici (TEQs).
6. Una composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1-5, ulteriormente comprendente PCDDs, PCDFs e policloro-bifenili (PCBs) diossino-simili (DL-PCBs) in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 5,0 pg/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,5 pg/g, valore determinato in accordo con la rivendicazione 5.
7. Una composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1-6, ulteriormente comprendente PCBs marker in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 5,0 ng/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,5 ng/ g .
8. Una composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1-7, ulteriormente comprendente polibromo-difenileteri (PBDEs) in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 5,0 ng/g, preferibilmente inferiore a 0,5 ng/g.
9. Una composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1-8, ulteriormente comprendente una somma di idrocarburi aromatici policiclici (PAHs), espressa come sostanza marker benzo[a]pirene, inferiore o uguale a 1,0 ng/g, preferibilmente inferiore a 0, 1 ng/g.
10. Una composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1-9, ulteriormente includente altri inquinanti ambientali (pollutants) organici persistenti (POPs) comprendenti 2,2 bis-(p-diclorofenil)-etano (DDE), e/o 2,2 bis-(p-diclorofenil)-l,l-dicloroetano (DDD), e/o 2,2 bis(p-diclorofenil)-l, l,l-tricloroetano (DDT) in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 2,0 ng/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,2 ng/g, polibromo-bifenili (PBB) in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 5,0 ng/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,5 ng/g,esaclorobenzene in concentrazione inferiore o uguale a 0,1 ng/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,01 ng/g, e isomeri di esacìorocicloesano in concentrazione complessiva inferiore o uguale a 0,1 ng/g, preferibilmente inferiore o uguale a 0,01 ng / g.
11. Una composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-10, in cui gli acidi grassi hanno provenienza marina e derivano in particolare da oli di pesce, incluso pesce da acquacoltura, o da “krill oils” oppure da alghe e altri microrganismi oleaginosi, o da “single celi fermentation” a partire da selezionati ceppi di alghe o altri microrganismi, e comprendono acido eicosapentaenoico (EPA, C20:5 n-3, tutto cis) e/o acido docosaesaenoico (DHA, C22:6 n-3, tutto cis), o un loro sale o estere alchilico, preferibilmente C1-C3.
12. Una composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-11, in cui detti esteri sono esteri alchilici, preferibilmente C1-C3.
13. Una composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-11, in cui detti esteri sono mono-esteri e/o di-esteri e/o tri-esteri glicerici.
14. Una composizione secondo la rivendicazione 12, in cui detti esteri alchilici sono esteri etilici, e la concentrazione di EPA o EPA estere etilico, oppure di DHA o DHA estere etilico, oppure la loro somma, sono compresi tra 15 e 100%, preferibilmente tra 50 e 100% , del peso della composizione.
15. Una composizione secondo la rivendicazione 14, in cui la concentrazione in peso di EPA estere etilico, oppure di DHA estere etilico, è superiore o uguale a 80%, preferibilmente superiore o uguale a 90%, oppure la loro somma è superiore o uguale a 80%, preferibilmente superiore o uguale a 84%, essendo la concentrazione di EPA estere etilico superiore o uguale a 40%, la concentrazione di DHA estere etilico superiore o uguale a 34% e la somma delle concentrazioni di tutti gli esteri etilici omega-3 superiore o uguale a 90% in accordo con le specifiche della farmacopea europea (EP).
16. Una composizione secondo la rivendicazione 14, in cui la somma delle concentrazioni in peso di EPA estere etilico e di DHA estere etilico è compresa tra 80,0 e 88,0%, essendo la concentrazione di EPA estere etilico compresa tra 43,0 e 49,5%, la concentrazione di DHA estere etilico compresa tra 34,7 e 40,3%, e la somma delle concentrazioni di tutti gli esteri etilici omega-3 superiore o uguale a 90% in accordo con le specifiche della farmacopea degli Stati Uniti (USP).
17. Una composizione secondo la rivendicazione 13, in cui la concentrazione di EPA o di DHA oppure la loro somma, sono comprese tra 15 e 100%, preferibilmente tra 50 e 100%, del peso della composizione.
18. Un metodo per la preparazione di una composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1-12 e 14-16, comprendente le fasi di: a) sottoporre un olio o grasso di origine animale o vegetale, inclusa la provenienza marina, da acquacoltura, aigaie o fermentativa, comprendente almeno un gruppo acile con almeno 18 atomi di carbonio, avente 2-6 doppi legami della serie omega-3 e/o omega-6, ad idrolisi alcalina o acida oppure a transesterificazione con alcoli alifatici preferibilmente C1-C3; b) sottoporre il prodotto di detta idrolisi o transesterificazione a un procedimento di purificazione mediante inclusione essenzialmente totale in urea, ottenendo un complesso di inclusione, che viene isolato e lavato; c) ottenere detta composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 1-12 e 14-16 mediante dissoluzione in acqua di detto complesso di inclusione e separazione della fase oleosa separatasi a seguito di detta dissoluzione o mediante estrazione di detta fase oleosa con un solvente organico immiscibile con acqua, tipicamente esano o simili e successiva evaporazione di detto solvente fino a secchezza, o per estrazione diretta da detto complesso di inclusione mediante fluidi allo stato supercritico, in particolare anidride carbonica.
19. Metodo secondo la rivendicazione 18, compredente la fase a’) di sottoporre il prodotto ottenuto dall’idrolisi o transesterificazione della fase a) ad un procedimento di concentrazione dei componenti poiinsaturi mediante distillazione, o distillazione molecolare o “short path”, mediante frazionamento per progressiva complessazione con urea dei componenti saturi ed eventualmente d parte dei componenti a basso grado di insaturazione, seguita da eliminazione dei complessi, mediante estrazione contro-corrente, estrazione con nitrato d’argento acquoso, estrazione e/o frazionamento con fluidi supercritici, prima di eseguire detta fase b) di inclusione in urea,
20. Metodo secondo una qualunque della rivendicazioni 18 e 19, comprendente una fase d) di sottoporre detti acidi grassi poiinsaturi o loro sali o esteri alchilici recuperati in detta fase c) a distillazione molecolare/ short path o a estrazione mediante fluidi supercritici.
21. Un metodo per la purificazione di una composizione comprendente acidi grassi poiinsaturi a lunga catena di origine animale e/o vegetale, appartenenti alla serie omega-3 e/o omega-6 e aventi 2-6 doppi legami e 18 o più atomi di carbonio, o loro sali o esteri alchilici, preferibilmente C1-C3, il metodo comprendendo le fasi di: a) trattare una parte in peso di detta composizione con almeno 3 parti in peso di urea in un solvente polare, preferibilmente un solvente protico come un alcool inferiore, quale metanolo o etanolo, eventualmente contenente fino al 20% di acqua, alla temperatura di ebollizione, per formare un complesso ureico di inclusione contenente detta composizione; b) raffreddare fino a precipitazione di detto complesso ureico e isolarlo mediante filtrazione o centrifugazione; c) ottenere una composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-12 e 14-16 mediante dissoluzione in acqua di detto complesso ureico di inclusione e separazione della fase oleosa separatasi a seguito di detta dissoluzione o mediante estrazione di detta fase oleosa con un solvente organico immiscibile con acqua, tipicamente esano o simili e successiva evaporazione di detto solvente fino a secchezza, o per estrazione diretta da detto complesso ureico di inclusione mediante fluidi allo stato supercritico, in particolare anidride carbonica.
22. Metodo secondo la rivendicazione 21, in cui detto complesso ureico isolato mediante filtrazione viene lavato con detto solvente polare, previamente saturato di urea, prima di essere disciolto in acqua o estratto mediante fluidi allo stato supercritico.
23. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 21 e 22 in cui detta composizione comprendente acidi grassi poiinsaturi a lunga catena di origine animale e/o vegetale, o loro sali o esteri alchilici, ha provenienza marina e deriva da oli di pesce, eventualmente da acquacoltura, o da krill oils, oppure deriva da alghe o altri microrganismi oleaginosi, o da “single celi fermentation’’’ a partire da selezionati ceppi di alghe o altri microrganismi, anche ricombinanti, e comprende EPA e/o DHA, o un loro sale o estere alchilico, preferibilmente C1-C3 oppure proviene da oli di semi o da altri oli e grassi di origine vegetale ed ha una concentrazione media di componenti poiinsaturi superiore o uguale a 15%.
24. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 21-23, in cui detta composizione ha un contenuto di detti acidi grassi poiinsaturi o loro sali o esteri alchilici compreso fra 15 e 30% e in cui detta fase a) di trattamento di detta composizione con urea viene eseguita trattando una parte in peso di detta composizione con 3-6 parti in peso totali di urea in tre step successivi.
25. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 21-23, in cui detta composizione ha un contenuto di detti acidi grassi poiinsaturi o loro sali o esteri alchilici compreso fra 31 e 80% e in cui detta fase a) di trattamento di detta composizione con urea viene eseguita trattando una parte in peso di detta composizione con 3-5 parti in peso totali di urea in due step successivi.
26. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 21-23, in cui detta .composizione ha un contenuto di detti acidi grassi poiinsaturi o loro sali o esteri alchilici superiore all’80% e in cui detta fase a) di trattamento di detta composizione con urea viene eseguita trattando una parte in peso di detta composizione con 3-4 parti, preferibilmente 4 parti, in peso di urea in un unico step.
27. Un metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 21-26 in cui la composizione comprendente acidi grassi poiinsaturi a lunga catena ha una concentrazione di EPA estere etilico, oppure di DHA estere etilico, oppure una somma delle loro concentrazioni, compresa tra 15 e 100%, preferibilmente tra 50 e 100 % della composizione, oppure la somma dei 2 esteri etilici è superiore o uguale a 80%, essendo EPA estere etilico superiore o uguale a 40%, DHA estere etilico superiore o uguale a 34% e la somma di tutti gli acidi n-3 esteri etilici superiore o uguale a 90%.
28. Un metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 21-27 in cui detta fase a) di trattamento di detta composizione con urea viene eseguita utilizzando quale solvente polare metanolo in quantità pari a 4,5-7 parti in peso oppure etanolo in quantità pari a 45-65 parti in peso.
29. Un metodo secondo la rivendicazione 28, in cui, in detta fase c), l’estrazione di detta fase oleosa separatasi a seguito di detta dissoluzione con un solvente organico immiscibile con acqua e la successiva evaporazione di detto solvente fino a secchezza danno luogo ad un residuo, che viene sottoposto a distillazione molecolare / short path.
30. Un metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni 21-29 in cui il filtrato o il liquido residuo dalla centrifugazione ottenuto da detta fase b) di isolamento di detto complesso ureico di inclusione viene concentrato a secchezza, dando luogo ad una composizione arricchita in acidi furanici, acido titanico, acido pristanico, o loro sali o esteri alchilici preferibilmente C1-C3, e in squalene, utile per l’isolamento di detti composti mediante tecniche quali distillazione molecolare e/o procedimenti cromatografici con solventi organici o fluidi allo stato super critico, come l’anidride carbonica.
31. Uso di ima composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 11-17, per la preparazione di formulazioni utili come ingredienti alimentari, integratori alimentari e dietetici, alimenti per scopi medici speciali (alimenti funzionali), alimenti per uso animale e per acquacoltura, formulazioni alimentari per l’infanzia, preparazioni cosmetiche e farmaceuticche, in virtù del loro elevato contenuto di acidi grassi a lunga catena o loro derivati, a carattere poiinsaturo o specificamente della serie omega~3.
32. Uso di una composizione secondo ciascuna delle rivendicazioni 11-12 e 14-16 per la preparazione per via chimica o, preferibilmente, enzimatica di mono-, di-, o trigliceridi di detti acidi grassi poiinsaturi a lunga catena di origine animale e/o vegetale, appartenenti alla serie omega-3 e/o omega-6, aventi 2-6 doppi legami e 18 o più atomi di carbonio.
33. Composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 11-17 per l’utilizzo nella prevenzione e nel trattamento dì fattori di rischio per malattie cardiache, cardiovascolari e cardiocircolatorie, come l’iper tensione, i difetti della coagulazione e dell’aggregazione piastrinica , l’ipertrigliceridemia severa e moderata (risp. >500mg/dl e >200mg/dl) e l’ipercolesterolemia, in particolare le forme famigliari e genetiche, anche in associazione con altri farmaci e in particolare con le statine.
34. Composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 11-17 per l’utilizzo nella prevenzione e nel trattamento di malattie cardiache, cardiovascolari e cardiocircolatorie, come quelle coronaricheaterosclerotiche e gli stati ischemici cardiaci e cerebrali, inclusi l’infarto miocardico e cerebrale e la riduzione del rischio di mortalità cardiaca improvvisa conseguente ad infarto del miocardio; quelle da causa elettrica e coinvolgenti l’insorgenza e la propagazione del ritmo cardiaco, includenti aritmia e la fibrillazione atriale e/o ventricolare; e quelle dovute ai difetti meccanici della pompa cardiaca, come l’in sufficienza e lo scompenso cardiaco e/o la “heart failure” congestizia.
35. Composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 11-17 per l’utilizzo nella prevenzione e nel trattamento di disordini del sistema nervoso centrale (CNS), includenti l’epilessia, le varie forme depressive, i disordini bipolari, le patologie pediatriche da difetto dell’attenzione e disordini da iperattività (ADHD), i difetti deU'apprendimento e della memoria, le varie forme di schizofrenia, la malattia di Alzheimer e le diverse forme di demenza.
36. Composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 11-17 per l’utilizzo nella prevenzione e nel trattamento della retinopatia e dei sintomi di secchezza oculare, della sindrome metabolica, di difetti del metabolismo e correlati all’obesità, del diabete di tipo 2, delle disfunzioni epatiche, di malattie del tessuto connettivo e delle articolazioni, degli stati infiammatori, di malattie autoimmuni, della colite ulcerosa, della psoriasi e della malattia tumorale.
37. Formulazione farmaceutica comprendente una composizione secondo una qualunque delle rivendicazioni 11-17 e un veicolo farmaceuticamente accettabile.