JP5721148B2 - エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸のエステルの濃縮物を得るための方法 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

［発明の分野］
本発明は、粗海産油又は精製海産油からエイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸のエステルの濃縮物を得るための方法に関する。

［発明の背景］
ω−３型の長鎖多価不飽和脂肪酸、（ａｌｌ ｃｉｓ）−５，８，１１，１４，１７エイコサペンタエン酸（以下ＥＰＡと呼ばれる）及び（ａｌｌ ｃｉｓ）−４，７，１０，１３，１６，１９ドコサヘキサエン酸（以下ＤＨＡと呼ばれる）の食品又は医薬品成分としての重要性は、とりわけ、動脈硬化及び循環器疾患の予防、炎症状態の軽減並びに腫瘍成長の遅延におけるその有用性のために周知であり、十分に立証されている。結果として、専門家は、前記脂肪酸を０．５〜１０ｇの範囲で毎日摂取することを推奨している。

ＥＰＡ及びＤＨＡの最も豊富な源の１つは、イワシ、マアジ、カタクチイワシ、サケ、タラ等の様々な起源の魚油である。典型的には、前記油中のＥＰＡ及びＤＨＡを合わせた含有量は、約１０〜３５重量％である。その結果、ＥＰＡ及びＤＨＡに富む食品サプリメント及び医薬品を提供するための最初の試みは、人間による消費に好適な食品又は医薬品用の成分としての利用において、それらの特徴である不快な臭気及び風味を除去するために、精製魚油に基づくものであった。これらの精製プロセスは、典型的な植物油精油プロセス、及び前記プロセスを関連原料に特定して適合させたものを主に使用していた（Ｌｉｎｄｓａｙ、米国特許第４，９１５，８７６号、Ｃｈａｎｇ、米国特許第４，８７４，６２９号、Ｍａｒｓｃｈｎｅｒ、米国特許第４，８０４，５５５号、Ｓｔａｇｅ、米国特許第４，５９９，１４３号、Ｍｅｒｃｋ、米国特許第４，８３８，９９７号）。

それにもかかわらず、食品及び医薬品用の成分として好適な精製海産油からのＥＰＡ及びＤＨＡを提供する現在の試みは、官能特性が許容されるとともに、とりわけ胃逆流、胃及び皮膚の炎症並びに膨満等の典型的な副次的作用のない製品を提供することに成功していない。これらの作用は、ＥＰＡ及びＤＨＡが１ｇを超える量、すなわち、約５ｇの魚油に等しい用量で消費された場合に顕著であり、消費者に上述の副次的作用をもたらす。

その結果、ＥＰＡ及びＤＨＡを提供する取り組みは、海産油からこれらの酸の濃縮物を生成することを目指している。これらの濃縮物は、遊離酸の形態、エステル、典型的にはエチルエステル、又はモノ、ジ若しくはトリグリセリドの形態のいずれかの、４０〜９５重量％のＥＰＡ及びＤＨＡを含有し得る。これらのプロセスの目的は、風味、臭気及び色のより良好な官能特性を有するとともに、一般に活性薬剤成分又は食品成分として、人間に対する治療用途の製品中に直接使用することができるＥＰＡ及びＤＨＡの濃縮物を提供することである。それにもかかわらず、最新技術は、良好な感覚特性、長期保存性、及びその所望の官能特性を長期にわたり維持するための酸化安定性を有するという特性を満たす生成物、すなわち、魚の臭気及び風味が時間と共に回復せず、とりわけ胃逆流、鼓腸、アレルギー等の海産油及びその誘導体の典型的な副次的作用がない生成物を提供することができるプロセスを提供しない。

現在市販されているＥＰＡ及びＤＨＡの濃縮物は、食品成分として直接使用されていないが、代わりに、風味が隠されたシロップの形態で、又は糖衣若しくはマイクロカプセル化された丸薬の形態で利用されており、これらは全て、前記生成物において時間と共に発生する望ましくない風味及び臭気を隠す、又は最小限に留めることを目的としている。さらに、これらの濃縮物は、通常１日数グラムという比較的高いＥＰＡ又はＤＨＡ用量を必要とする治療上の用途にも好適ではないが、これは、この用量では濃縮物の望ましくない副次的作用がさらにより顕著となるためである。

人間による消費のための海産油から得られるＥＰＡ又はＤＨＡを提供するための別の手法は、米国特許第６，８４６，９４２号に記載のような、純粋なＥＰＡ又はＤＨＡを得るための方法を開発することであった。それにもかかわらず、純粋なＥＰＡ又はＤＨＡを得ることは、まずＥＰＡ及びＤＨＡの混合物が得られるステップを経由することを意味し、商業的には、この手法の利点はないように思われ、表１の文献中に見ることができるように、開示された方法のほとんどは、遊離酸の形態又はエステルの形態のＥＰＡ及びＤＨＡを含む濃縮物の調製を扱っている。

油からω−３脂肪酸の濃縮物を得ることを問題とした従来技術において開示された数々のプロセスを、表１に示す。

欧州特許第０４０９９０３号は、動物油又は植物油からＥＰＡ及びＤＨＡを含有する混合物を調製するための方法を開示している。この方法は、原材料である動物油又は植物油を鹸化するステップと、鹸化混合物を速やかに酸性化するステップと、次いで形成された酸を枯渇するまで石油エーテルで抽出するステップとを含む。次いで、抽出物を水で洗浄し、溶媒を除去し、残渣を０．１３３Ｐａの圧力及び１１０〜１２０℃の温度での分子蒸留の１つ又は複数のステップに供する。３５〜９０％のＥＰＡ及びＤＨＡを含有する留出物が得られる。

米国特許第５，１３０，０６１号は、魚油からのＥＰＡ及びＤＨＡの高濃縮エチルエステルの混合物の調製のための方法を開示している。開示されたプロセスは、魚油をエチルアルコールでエステル交換するステップと、続いてエステル交換された生成物をヘキサンで抽出するステップと、シリカゲルでのクロマトグラフィーにより抽出物を精製するステップとを含む。次いで、精製された生成物は、約０．００１ｍｍＨｇの圧力及び６５〜７０℃の温度での分子蒸留の１つ又は複数のステップに供される。任意選択で、蒸留前に、クロマトグラフィーから得られた生成物は、アセトン中で−４０℃で結晶化され、次いで蒸留に供されてもよい。

開示された方法の多くは、許容される官能特性を有する生成物を提供し得るが、室温で少なくとも３カ月の期間の保存条件下で中性官能特性を維持し、消費者に顕著な副次的作用を引き起こさない本発明の方法を用いて得られる生成物の場合とは異なり、それらのプロセスの全てにおいて、上述の副次的作用が発生し、魚の臭い及び風味が時と共に回復する。中性官能特性とは、風味又は臭気をマスキングする添加剤の非存在下で許容される官能特性を有する生成物を意味し、許容される官能特性とは、少なくとも９名で構成される熟練した感覚特性パネルにより評価され、外観、香り及び風味等の生成物特性を評価した場合、各パラメータが、当該パラメータの最大値の６０％以上であると認定され、酸敗臭特性を評価した場合、当該パラメータの最大値の８０％以上であると認定された生成物として理解される。

許容される官能特性の要件及び安定性に加え、ＥＰＡ及びＤＨＡの濃縮物はまた、環境内に残留し、食物連鎖内に蓄積し、人間の健康及び環境に対して悪影響をもたらすリスクを示す化学物質である、残留性有機汚染物質（ＰＯＰ）として知られる汚染有機化合物の含有量に関する一連の規制基準に適合しなければならない。２００７年５月のストックホルム条約加盟国の第３回会議において認められた１７種の物質を現在含むこれらの汚染物質には、ダイオキシン、フラン、ポリ塩化ビフェニル、多環芳香族炭化水素等の誘導体があり、それらの魚油中濃度は、時と共に増加しており、そのため魚油からこれらの汚染物を除去することができるプロセスを開発するための取り組みがなされている。ストックホルム条約加盟国の間では、食用の生成物中のＰＯＰの最大許容限度に関して現在厳格な基準があり、その食用の生成物の中には、魚油及び魚油から得られる生成物が含まれる。特にＰＯＰの除去に対応するプロセスは、とりわけ米国特許出願公開第２００５／０２５６３２６号及び米国特許出願公開第２００４／００２２９２３号、並びに国際公開第０２／０６４３０号に開示されている方法において見出される。他の規制汚染物質の群は、とりわけヒ素、水銀、カドミウム及び鉛等の重金属である。

欧州特許第０４０９９０３号及び米国特許第５，１３０，０６１号に記載のＥＰＡ及びＤＨＡの濃縮物の生成のための方法は、ＰＯＰの存在の問題については言及していない。したがって、開示された方法の汚染物除去の効率を、本発明の方法の同じ対象に対する有効性と比較するために、既知の濃度のＰＯＰを有する原材料を用いて上述の方法を再現し、本発明の方法により得られた生成物と比較した。結果は比較例１及び２に示される。

米国特許第６，８４６，９４６号においては、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）の問題が言及されているが、その除去に関する解決策は開示されていない。

驚くべきことに、本発明の方法は、従来技術の方法とは異なり、少なくとも３カ月の室内条件での保存期間中、臭気及び風味の不快な特性を回復させることなく、許容される官能特性を有する生成物を提供することができ、また、従来技術の方法とは異なり、ＰＯＰ及び重金属を効率的に低減又は排除することも可能であることが判明した。さらに、開示される方法は、未知の代謝特性の、ＥＰＡ及びＤＨＡ異性体の望ましくないシス−トランス異性化をもたらさず、逆に、非常に驚くべきことに、原材料中に見出される場合、トランス異性体含有量を低減する。

Ｐｒｏｎｏｖａ ＢｉｏＰｈａｒｍａ社（ｗｗｗ．ｐｒｏｎｏｖａ．ｃｏｍ）は、活性薬剤成分としての使用のための、ＥＰＡ及びＤＨＡのエチルエステルの濃縮物の生成のための方法を開示している。前記方法において、まず粗魚油が脱酸されて精製魚油が得られ、この精製魚油が、米国特許出願公開第２００５／０２５６３２６号に開示される方法を用いて、汚染物の除去を特定の目的とするストリッピングプロセスに供される。得られた精製魚油は、続いてエチルアルコールでエステル交換される。エステル交換された生成物は、分子蒸留のいくつかのステップに供される。留出物は尿素で処理され、次いで漂白されて再び分子蒸留され、ＥＰＡとＤＨＡの間の長鎖ω−３脂肪酸を９０％まで含む最終生成物が得られる。この方法の欠点は、ストリッピングステップ中のトランス異性化の可能性である。さらに、市販の生成物は、魚の臭気及び風味を回復し、生成物の摂取後に上述した副次的作用の全てが観察され得る。

Ｎａｐｒｏ Ｐｈａｒｍａ社（ｗｗｗ．ｎａｐｒｏ−ｐｈａｒｍａ．ｎｏ／ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）により開発された、ＥＰＡ及びＤＨＡのエチルエステルの濃縮物の生成のための方法は、ストリッピングステップ及び尿素処理ステップを含まないことを除いてＰｒｏｎｏｖａ ＢｉｏＰｈａｒｍａ社の方法と同様であるが、その生成物もまた、魚の臭気及び風味を回復し、生成物の摂取後に上述した副次的作用の全てが観察され得る。

最新技術の方法により得られるＥＰＡ及びＤＨＡの濃縮物と比較して、本発明の方法により得られる濃縮物は、発明の詳細な説明から明らかとなるように、従来技術に勝る驚くべき予想外の利点を有する。これらの利点は、中性官能性及び安定な生成物の特性を含み、この生成物は、副次的作用を有さず、国際規制基準に適合する残留性有機汚染物質（ＰＯＰ）のレベルを有する。さらに、上述のように、この方法は、シス−トランス異性体の形成を予防するだけでなく、逆に、驚くべき予想外の様式で、原材料中に存在する場合、トランス異性体の濃度を低下させる。これら全ての特性を組み合わせた結果、本発明の方法により得られる生成物は、高用量のＥＰＡ及びＤＨＡを必要とする治療における使用、及び食品成分としての使用に特に適切である。

［発明の概要］
本発明の目的は、中性官能特性、安定性、及び許容限度を下回る残留性有機汚染物の含有量を有し、結果的には医薬品として、又は食品成分としての人間による摂取に好適な、海産油からのＥＰＡ及びＤＨＡのエステルの濃縮物の調製のための新規な方法を提供することである。

前記目的は、
ａ）鹸化海産油を含む混合物が得られるまで、粗海産油又は精製海産油を、１００℃以下の温度で１種又は複数種のアルカリ及び水と接触させるステップと、
ｂ）鹸化混合物を、１種又は複数種の有機溶媒と接触させて、脂肪酸のアルカリ塩を含む精製相及び抽出相を形成するステップと、
ｃ）精製相から抽出相を分離するステップと、
ｄ）精製相を酸の水溶液と混合して、水相及び脂肪酸を含む非水相を形成するステップと、
ｅ）非水相から水相を分離するステップと、
ｆ）脂肪酸のエステルを含むエステル化混合物が得られるまで、分離された非水相を、１５０℃以下の温度でアルコール及びエステル化触媒と混合するステップと、
ｇ）エステル化混合物から触媒を除去して、触媒不含エステル化混合物を得るステップと、
ｈ）触媒不含エステル化混合物から溶媒を除去して、脂肪酸のエステルを得るステップと、
ｉ）最高１８０℃の温度及び１ｍｂａｒ未満の圧力で、短経路蒸留塔内でエステルを蒸留して、ＥＰＡ及びＤＨＡのエステルを含む濃縮物を得るステップと
を含む方法を用いて得られるＥＰＡ及びＤＨＡのエチルエステルを含む濃縮物により達成される。

方法のステップは、協調的な様式で本発明の目的に向けて相乗的に集中する。

［発明の詳細な説明］
原材料
本発明を行うために、ＥＰＡ又はＤＨＡを含有する任意の原材料、好ましくは魚油を使用することができる。本発明の目的に好適である原材料は、イワシ、カタクチイワシ、マアジ、マサバ、マグロ、タラ、サケ、オキアミ及び軟体動物などの油、並びに前記油の混合物、海洋動物の内臓等の海洋動物の加工副生成物の油、並びに、例えばナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ）及びプランクトン等の微細藻類の油等も含む。本発明において、油という用語は、ＥＰＡ又はＤＨＡを含有する脂肪又はワックス及びその副生成物、例えばグリセリド及び脂肪酸等も含む。

Ｔｏｔｏｘ値が３０未満である原材料の使用が好ましいが、本発明の方法は、実施例において示されるように、より高いＴｏｔｏｘ値を有する原材料を用いても行うことができる。

本発明の方法を行うために、粗海産油又は精製海産油中に存在する脂肪酸のグリセリド又は他のエステルを加水分解するためのアルカリを使用して、粗海産油又は精製海産油を鹸化し、粗海産油又は精製海産油の鹸化性化合物のアルカリ塩及び非鹸化性物質を含む鹸化混合物を得る。この目的のために、粗海産油又は精製海産油を水及び１種又は複数種の適切なアルカリと接触させ、任意選択で、アルコール及び炭化水素等の１種若しくは複数種の溶媒と、又は１種若しくは複数種の適切な酸化防止剤と接触させる。鹸化プロセスに適切なアルカリは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム及び前記水酸化物の混合物を含む。アルカリの量は、粗海産油又は精製海産油各１００ｇに対してアルカリ５〜４０グラムの範囲であるが、粗海産油又は精製海産油に対するアルカリの好ましい比は、粗海産油又は精製海産油１００ｇ当たりアルカリ約１５グラムである。使用される水の量は、粗海産油又は精製海産油１００ｇ当たり水１０〜５００ｇの範囲であるが、粗海産油又は精製海産油に対する水の好ましい比は、粗海産油又は精製海産油１００ｇ当たり水５０〜２００ｇの範囲である。エタノール等のアルコールが使用される場合、アルコールの量は、粗海産油又は精製海産油１００ｇ当たりアルコール１０〜５００ｇの範囲であるが、粗海産油又は精製海産油に対するアルコールの好ましい比は、粗海産油又は精製海産油１００ｇ当たりアルコール５０〜２００ｇの範囲である。ヘキサン等の炭化水素が使用される場合、溶媒の量は、粗海産油又は精製海産油１００ｇ当たり溶媒１０〜５００ｇの範囲であり、好ましくは、粗海産油又は精製海産油１００ｇ当たり溶媒５０〜２００ｇの範囲である。例えばＢＨＴ、トコフェロール又はアスコルビン酸及びそれらの誘導体等の適切な酸化防止剤が使用される場合、使用される酸化防止剤の量は、好ましくは、粗海産油又は精製海産油１００ｇ当たり１ｇ以下である。粗海産油又は精製海産油、水、１種又は複数種のアルカリ及び任意選択の１種又は複数種の溶媒の間の接触は、撹拌槽内で連続的に又はバッチ式で、１０〜１００℃の温度、好ましくは４０〜８５℃の温度、及び０．１〜５ｂａｒの圧力、好ましくは大気圧で行うことができる。バッチ式操作の場合の粗海産油又は精製海産油の鹸化を完了させるための時間、又は、連続操作の場合の滞留時間は、１０〜４００分、好ましくは３０〜１２０分の範囲である。

鹸化された海産油を含む混合物は、抽出相及び抽出相と混合不可能な精製相が形成されるまで１種又は複数種の有機溶媒と接触させられるが、抽出相は有機溶媒及び溶解した材料を含み、精製相は脂肪酸のアルカリ塩を含む。前記相は、沈降又は遠心分離により分離される。鹸化された粗海産油又は精製海産油を含む混合物と有機溶媒との間の接触は、バッチ式又は連続的に、１０〜１００℃、好ましくは２０〜８０℃の温度、及び０．１〜５ｂａｒ、好ましくは大気圧で行うことができる。抽出に適切な溶媒又は有機溶媒の混合物は、石油エーテル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、アセトン、トルエン、キシレン、メチルキシレン、エチルベンゼン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、二塩化エチレン、三塩化エチレン、過塩化エチレン、ジメチルスルホキシド及びテトラヒドロフランからなる群から選択することができる。それにもかかわらず、好ましい溶媒は、石油エーテル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン又はこれらの溶媒の混合物等の脂肪族炭化水素を含む。鹸化混合物に対する溶媒（複数可）の比は、混合物１００ｇ当たり５０〜１０００ｇ、好ましくは混合物１００ｇ当たり１００〜５００ｇの範囲である。精製相が抽出相から分離されたら、所望により、開示された条件下で１種又は複数種の溶媒と再び接触させて第２の抽出相及び第２の精製相を形成してもよく、所望により、精製相をさらに抽出するプロセスを行ってもよい。

酸性化ステップにおいて、水相及び脂肪酸を含む非水相が形成されるまで、精製相を硫酸、塩酸、リン酸、酢酸、トリクロロ酢酸又は炭酸等の酸の溶液と接触させる。酸性化ステップにおいて使用される酸の量は、鹸化ステップにおいて使用されるアルカリの化学量の最大１．５倍、好ましくは、精製相の完全中和に必要なアルカリの化学量の１．０５倍であってもよい。精製相を酸性化するために必要な酸の量は、精製相の全アルカリ度を測定することにより決定することができる。精製相と酸とを接触させて酸性化混合物を形成するステップは、撹拌槽内でバッチ式又は連続的に、１０〜１００℃、好ましくは２０〜６０℃の温度、及び０．１〜５ｂａｒの圧力、好ましくは大気圧で、連続操作の場合は１〜１２０分、好ましくは５〜６０分の範囲の滞留時間で行うことができる。任意選択で、混合物はまた、ＢＨＴ、トコフェロール又はアスコルビン酸及びその誘導体等の酸化防止剤又は酸化防止剤の混合物を含んでもよい。続いて、沈降又は遠心分離により非水相が水相から分離される。分離された非水相は、１０〜１００℃、好ましくは２０〜６０℃の温度、及び０．１〜５ｂａｒの圧力下、好ましくは大気圧で、水、一価アルコール、アセトン又は硫酸ナトリウム若しくは塩化ナトリウムの水溶液を含む洗浄混合物で洗浄される。洗浄後の非水相は、任意選択で濾過されて不溶性固体が排除されてもよい。以下で使用される非水相という用語は、上述のような酸性化ステップの後に得られた、洗浄後の非水相と、洗浄及び濾過後の非水相の両方を指す。

任意選択で、非水相のいずれも、好ましくは減圧下及び１５０℃未満の温度での溶媒の蒸発により、部分的又は完全に脱溶媒化して、いわゆる部分的又は完全脱溶媒化非水相を得ることができる。

任意選択で、非水相又は部分的若しくは完全脱溶媒化非水相のいずれも、結晶化ステップに供することができる。この目的のために、相は、石油エーテル、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、トルエン、キシレン、メチルキシレン、エチルベンゼン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、二塩化エチレン、三塩化エチレン、過塩化エチレン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド及びテトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、アセトン及びメチルエチルケトンからなる群から選択される溶媒又は溶媒の混合物と混合される。好ましい溶媒は、ヘキサン、エタノール、アセトン又はこれらの混合物である。このステップにおいて使用される溶媒の量は、結晶化される相１００ｇ当たり５０〜１０００ｇ、好ましくは結晶化される相１００ｇ当たり１００〜５００ｇの間で変動し得る。形成される混合物は、続いて、液相中に固体結晶化相が形成されるまで、０〜−５０℃、好ましくは−２０〜−４０℃の範囲の温度に冷却される。結晶化の操作は、バッチ式又は連続的に、好ましくは大気圧で行うことができる。結晶化した固相及び液相は、続いて、好ましくは結晶化の最終温度と同じ温度で、濾過又は遠心分離により分離される。次いで、溶媒の蒸発により液相の溶媒が部分的又は完全に除去され、使用された粗海産油又は精製海産油中の濃度よりも高い濃度のＥＰＡ及びＤＨＡを含む、結晶化ステップにおいて得られたいわゆる第１の部分的又は完全脱溶媒化相が得られる。

任意選択で、非水相のいずれか、又は非水性の部分的若しくは完全脱溶媒化相のいずれか、又は結晶化ステップにおいて生成された第１の部分的若しくは完全脱溶媒化相は、脂肪酸又はその誘導体と錯体又は付加物を形成する尿素又は別の化合物で処理することができる。この目的のために、５０〜１００℃の温度で溶解物が形成されるが、溶解物は、有機溶媒中で錯体又は付加物を形成する化合物の溶液、好ましくはエタノール１００ｇ当たり尿素約３０ｇを含有するエタノール中の尿素１００ｇ毎に、尿素処理に供される相５〜４０ｇで構成される。次いで、溶解物が室温以下まで冷却されると、錯体又は付加物を含む固相及び固体不含液相が形成される。錯体又は付加物及び固体不含液相は、濾過又は遠心分離により分離され、固体不含液相は、その相に溶解している錯体又は付加物を形成する残留化合物が抽出されるまで、水又は酸性溶液で洗浄される。次いで、完全に又は部分的に固体不含液相の溶媒が除去されて、錯体形成ステップにおいて生成され、原材料中よりも高い濃度のＥＰＡ及びＤＨＡを含む、いわゆる第２の部分的又は完全脱溶媒化相が得られる。

次いで、非水相のいずれか、又は非水性の部分的若しくは完全脱溶媒化相のいずれか、又は結晶化ステップにおいて生成された第１の部分的若しくは完全脱溶媒化相、又は錯体形成において生成された第２の部分的若しくは完全脱溶媒化相は、エステル化ステップに供される。この目的のために、相は、メタノール若しくはエタノール等の一価アルコール、又はグリセロール等の多価アルコールと、相１００ｇ毎にアルコール５００ｇから相１００ｇ毎にアルコール２０ｇ、好ましくは２０〜２００ｇの範囲の比で混合され、硫酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の触媒と、又はアンバーライト等の樹脂と、相１００ｇ毎に触媒０．０５〜１０ｇの比で混合される。エステル化ステップは、撹拌反応器内でバッチ式又は連続的に、１０〜１５０℃、好ましくは３０〜８０℃の温度、及び０．１〜５ｂａｒの圧力下、好ましくは大気圧で行うことができる。バッチ式操作の場合のエステル化時間又は連続操作の場合の滞留時間は、３０〜６００分、好ましくは６０〜２４０分の範囲である。エステル化ステップの最後に、脂肪酸のエステルを含むエステル化混合物が得られる。次いで、固体触媒の場合は濾過により、又は液体触媒の場合は中和及び水溶液での洗浄により、エステル化混合物から触媒が除去され、触媒不含エステル化混合物が形成される。触媒不含エステル化混合物は、好ましくは減圧下及び１５０℃未満の温度で蒸発により脱溶媒化され、脂肪酸のエステルを含む脱溶媒化混合物が得られる。

続いて、脱溶媒化された脂肪酸のエステルの混合物が短経路蒸留塔内で蒸留され、留出物及び残渣が得られる。

留出物又は残渣を再び上記条件下で蒸留し、第２の留出物及び第２の残渣を得ることができる。留出物又は所望の濃度のＥＰＡ及びＤＨＡのエステル若しくはＥＰＡ及びＤＨＡの濃縮物を含有する残渣が得られるまで、プロセスを繰り返すことができる。蒸留は、１８０℃未満、好ましくは１５０℃未満の温度、及び１ｍｂａｒ未満、好ましくは０．１ｍｂａｒ未満の圧力で行うことができる。得られた濃縮物は、９５重量％のＥＰＡ及びＤＨＡエステルを含み得る。

ＥＰＡ及びＤＨＡ又は任意のエステル含有分画は、さらに、−５℃未満の温度での冷却及び濾過又は遠心分離による固体分離を用いた分別、減圧下及び２００℃未満、好ましくは１５０℃未満の温度での、窒素又は脱臭用蒸気を使用した充填カラム又はトレイカラムにおける脱臭、とりわけ滴虫土、活性炭、ゼオライト及びモレキュラーシーブを用いた吸着等、１つ又は複数の追加的精製ステップに供することができる。

同様に、任意選択で、ＥＰＡ及びＤＨＡの濃縮物をグリセリンでエステル交換して、ＥＰＡ及びＤＨＡの濃縮グリセリドを形成することができる。

ＥＰＡ及びＤＨＡの濃縮物に、とりわけトコフェロール、トコフェロールのエステル、アスコルビン酸及びそれらの誘導体、ローズマリー抽出物、ボルド抽出物等の、１種又は複数種の適切な酸化防止剤が添加されてもよい。好ましくは、濃縮物中の酸化防止剤の量は、濃縮物の１重量％未満、好ましくは０．５重量％未満である。

得られるＥＰＡ及びＤＨＡの濃縮物は、とりわけ胃逆流、胃及び皮膚の炎症並びに膨満等の、魚油の誘導体の摂取に関連した望ましくない副次的作用がない。さらに、驚くべきことに、ＥＰＡ及びＤＨＡの濃縮物は、魚の臭気又は風味の回復を示さず、風味及び臭気マスキング剤、カプセル化並びにマイクロカプセル化を使用することのない、食品又は医薬品の成分としての使用を可能とする。さらに、開示された方法は、魚油中に存在し得る残留性有機汚染物質及び重金属の含有量を、国際的に許容される最大レベル未満まで大きく低減する。さらに、開示された方法は、トランス脂肪酸を生成せず、その上、驚くべきことに、また予想外にも、開示された方法はまた、原材料中に存在する場合にはトランス脂肪酸の含有量を低減し得る。

図１を参照すると、粗魚油がライン（１）を通して撹拌槽である鹸化反応器（４）に供給され、この撹拌槽には、油の鹸化指数に等しい比率で、又は最大２０％を超過する比率で水酸化ナトリウム溶液ストリームもまたライン（２）を介して供給され、またライン（３）を介して５０％のエタノール水溶液のストリームが反応器に供給される。反応器（４）は、４０〜８５℃の温度、１〜２ｂａｒの圧力及び４５分の滞留時間で作動し、鹸化混合物を生成する。前記鹸化混合物は、ライン（７）を介して、２〜５ｂａｒの圧力及び２０〜６０℃の温度で作動する向流抽出カラム（８）に供給される。抽出カラム（８）には、ライン（９）を介して、沸点が６０〜８０℃の範囲である脂肪族炭化水素の混合物が供給され、ライン（１０）を介して、脂肪族炭化水素の混合物を含む抽出相及び前記相中に抽出された材料が回収され、ライン（１１）を介して、脂肪酸のアルカリ塩を含む精製相が回収される。精製相は、ライン（１１）を介して酸性化反応器（１２）に供給され、この反応器には、ライン（１３）を介して、精製相の全アルカリ度に等しい比率又は最大１０％を超過する比率で塩酸のストリームもまた供給される。反応器（１２）は、撹拌下で２０〜７０℃の温度、１〜２ｂａｒの圧力及び最長３０分の滞留時間で作動し、酸性化混合物を生成する。酸性化混合物は、ライン（１４）を介して沈降器（１５）に供給され、酸性化の水相から非水相が分離される。沈降器（１５）は、２０〜７０℃の温度、１〜２ｂａｒの圧力及び５〜６０分の滞留時間で作動する。後続の処理のためにライン（１６）を介して水相が除去され、溶媒及びグリセリンが回収される。ライン（１７）を介して、沈降器（１５）において分離された非水相は洗浄反応器（１８）に供給され、撹拌下で、５０％のエタノール水溶液を含むストリーム（１９）と接触し、洗浄混合物を生成する。反応器（１８）は、２０〜７０℃の温度、１〜２ｂａｒの圧力及び１〜３０分の滞留時間で作動する。反応器（１８）の洗浄混合物は、ライン（２０）を介してデカンタ（２１）に供給され、洗浄混合物の重質相から軽質相が分離される。デカンタ（２１）は、２０〜７０℃の温度、１〜２ｂａｒの圧力及び５〜６０分の滞留時間で作動する。後続の処理のためにライン（２２）を介して重質相が除去され、溶媒が回収されるか、又は溶媒若しくはその一部が洗浄反応器（１８）に再循環される。ライン（２３）を介して、沈降器（２１）において分離された軽質相はエステル化反応器（２４）に供給され、この反応器には、ライン（２５）を介して、エタノール中に溶解したｐ−トルエンスルホン酸の溶液のストリームもまた供給される。反応器（２４）は、撹拌下で４０〜８５℃の温度、０．５〜２ｂａｒの圧力及び１８０分の滞留時間で作動し、エステル化混合物を生成する。エステル化混合物は、ライン（２６）を介して洗浄及び中和反応器（２７）に供給され、撹拌下、２０〜７０℃の温度、１〜２ｂａｒの圧力及び１〜３０分の滞留時間で、５％の炭酸ナトリウム水溶液を含むストリーム（２８）と接触し、中和された洗浄混合物を生成する。洗浄反応器（２７）の中和された洗浄混合物は、ライン（３０）を介して沈降器（３１）に供給され、脂肪酸のエステルの混合物及び水相が分離される。デカンタ（３１）は、２０〜７０℃の温度、１〜２ｂａｒの圧力及び６〜６０分の滞留時間で作動する。後続の処理のためにライン（３２）を介して水相が除去され、溶媒が回収される。ライン（３３）を介して、沈降器（３１）において分離された脂肪酸のエステルの混合物は、５０〜１８０℃の温度、１〜１００ｍｂａｒの圧力及び３０分以内の滞留時間で作動する流下膜式蒸発器（３４）に供給され、留出物及び脂肪酸のエステルを含む脱溶媒化された残渣が得られる。ライン（３５）を介して、留出物は、図示されていない貯蔵タンクに供給される。脱溶媒化された脂肪酸のエステルは、ライン（３６）を介して、５０〜１８０℃の温度、０．００１〜１ｍｂａｒの圧力で作動する短経路蒸発器（３７）に供給される。ライン（３８）を介して、短経路蒸発器（３７）から留出物が除去され、ライン（３９）を介して、短経路蒸発器（３７）の蒸留の残渣が除去されて、短経路蒸発器（４０）に供給される。短経路蒸発器（４０）は、５０〜１８０℃の温度、０．００１〜１ｍｂａｒの圧力で作動する。ライン（４１）を介して、短経路蒸発器（４０）の蒸留の残渣が除去され、ライン（４２）を介して、ＥＰＡ及びＤＨＡのエステルの濃縮混合物を含む短経路蒸発器（４０）の留出物が除去される。

実施例１〜１１は、本発明を行うことができる様式、並びに得られる濃縮物の卓越した官能特性及び酸化安定性を示す。

比較実施例１（欧州特許第０４０９９０３号）
欧州特許第０４０９９０３号により開示された方法による、サケ油からのＥＰＡ及びＤＨＡのエチルエステル濃縮物の調製
表２にその特性が示されるサケ油（試料Ｍ１）３００ｇ、エタノール１５０ｇ及び蒸留水中２８％の水酸化ナトリウム溶液１５０ｇを、２０００ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を１時間還流及び窒素パージすると、サケ油の完全な鹸化が生じ、その後２６％の塩酸水溶液１６０ｇを添加し、混合物を５分間激しく振盪した。次いで、石油エーテル４５０ｍｌを添加し、もう一度振盪した。混合物を２０００ｍｌの分液漏斗に入れ、沈降させて上相及び下相に分離させた。上相を除去し、下の水相を石油エーテル４５０ｍｌでさらに２回抽出した。石油エーテルの抽出物を２０００ｍｌの漏斗に回収し、中性となるまで水で洗浄した。洗浄後の抽出物を、１０ｍｂａｒ及び６０℃で作動しているロータリーエバポレータ内で蒸発させた。続いて、ロータリーエバポレータによる蒸発の残渣を、流速１２５０ｍｌ／ｈ、ジャケット温度９０℃、濃縮器温度−４℃、ローラ速度３５０ｒｐｍ及び圧力４ｍｂａｒで短経路蒸留塔ＫＤＬ５ ＵＩＣに供給することにより、微量の石油エーテルを除去した。３０．１％の長鎖ω−３脂肪酸を含むサケ油の脂肪酸の混合物が得られた（試料Ｍ２）。

サケの脂肪酸の混合物を、流速１００ｍｌ／ｈ、ジャケット温度６５℃、濃縮器温度４℃、ローラ速度３５０ｒｐｍ、圧力０．００５ｍｂａｒで短経路蒸留塔ＫＤＬ５ ＵＩＣに供給すると、第１の留出物及び第１の残渣が得られた。第１の残渣を８５℃の温度で短経路蒸留の第２のステップに供すると、第２の留出物及び第２の残渣が得られた。第２の留出物は、５２．２％の長鎖ω−３脂肪酸を含有していた（試料Ｍ３）。

比較例１の試料の分析を表２に示す。

比較例２（米国特許第５，１３０，０６１号）
米国特許第５，１３０，０６１号により開示された方法による、サケ油からのＥＰＡ及びＤＨＡのエチルエステル濃縮物の調製
比較例１において使用されたサケ油３００ｇ及び無水エタノール中５％の硫酸溶液２００ｇを、２０００ｍｌの三角フラスコ内で混合した。混合物を８時間還流及び窒素パージした。反応混合物を室温まで冷却しながら、過剰のエタノールを減圧下で蒸留により除去した。蒸留の残渣をヘキサン４００ｍｌで希釈し、水５００ｍｌで洗浄した。不均質混合物を激しく振盪した。分液漏斗内で水相をヘキサン相から分離し、水相のｐＨが中性となるまで、ヘキサン相を水で繰り返し洗浄した。洗浄後のヘキサン抽出物を、シリカゲルカラムに通過させることにより精製した。続いて、精製されたヘキサン抽出物を、ロータリーエバポレータ内で１０ｍｂａｒ及び６０℃まで蒸発させた。蒸発の残渣を、流速１２５０ｍｌ／ｈ、ジャケット温度９０℃、濃縮器温度−４℃、ローラ速度３５０ｒｐｍ及び圧力４ｍｂａｒで短経路蒸留塔ＫＤＬ５ ＵＩＣに供給することにより、微量の溶媒を除去した。２７．９％の長鎖（エステル化）ω−３脂肪酸を含有するエチルエステルの混合物が得られた（試料Ｍ４）。

エチルエステルの混合物を、流速１００ｍｌ／ｈ、ジャケット温度６５℃、濃縮器温度４℃、ローラ速度３５０ｒｐｍ、圧力０．００５ｍｂａｒで短経路蒸留塔ＫＤＬ５ ＵＩＣに供給すると、第１の留出物及び第１の残渣が得られた。第１の残渣を８５℃の温度で短経路蒸留の第２のステップに供すると、第２の留出物及び第２の残渣が得られた。第２の留出物は、５１．６％の長鎖（エステル化）脂肪酸を含有していた（試料Ｍ５）。

比較例２の試料の分析を表３に示す。

実施例１
サケ油のＥＰＡ及びＤＨＡのエチルエステルの濃縮物の調製
比較例１において使用されたサケ油３００ｇ、エタノール１５０ｇ及び蒸留水中２８％の水酸化ナトリウム溶液１５０ｇを、２０００ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を１時間還流及び窒素パージすると、サケ油の完全な鹸化が生じた。

鹸化混合物を３０００ｍｌの分液漏斗に入れ、エタノール１５０ｇ、蒸留水１５０ｇ、及びヘキサン９００ｇを漏斗に加えた。得られた混合物を激しく振盪し、沈降させた。上のヘキサン相を分離し、下の水相をヘキサン７００ｍｌでさらに３回抽出した。ヘキサン抽出物を、ロータリーエバポレータ内で減圧下で脱溶媒化した。

２０％の塩酸水溶液２００ｇを添加することにより、水相を酸性化した。得られた有機物を５０％のエタノール水溶液の一部でｐＨ４〜５まで洗浄し、次いでロータリーエバポレータ内で１０ｍｂａｒ及び６０℃で蒸発させた。２９．６％の長鎖ω−３脂肪酸を含有する脂肪酸の混合物が得られた（試料Ｍ６）。

脂肪酸の混合物を無水エタノール中１．０％の硫酸溶液１００ｇと混合し、２時間還流した。反応は、混合物が一定の酸価に達した時点で終了したとみなした。反応混合物を蒸留水中１０％の炭酸ナトリウム溶液４０ｇで中和し、続いて蒸留水４０ｇの一部で洗浄した。続いて、混合物を、ロータリーエバポレータ内で１０ｍｂａｒ及び６０℃で蒸発させた。蒸発の残渣を、流速１２５０ｍｌ／ｈ、ジャケット温度９０℃、濃縮器温度−４℃、ローラ速度３５０ｒｐｍ及び圧力４ｍｂａｒで短経路蒸留塔ＫＤＬ５ ＵＩＣに供給することにより、微量の溶媒を除去した。３０．９％の長鎖ω−３脂肪酸を含有するエチルエステルの混合物が得られた（試料Ｍ７）。

エチルエステルの混合物を、流速１００ｍｌ／ｈ、ジャケット温度６５℃、濃縮器温度４℃、ローラ速度３５０ｒｐｍ、圧力０．００５ｍｂａｒで短経路蒸留塔ＫＤＬ５ ＵＩＣに供給すると、第１の留出物及び第１の残渣が得られた。第１の残渣を８５℃の温度で短経路蒸留塔内で再び蒸留すると、第２の留出物及び第２の残渣が得られた。第２の留出物は、５２．３％の長鎖ω−３脂肪酸を含有していた（試料Ｍ８）。

実施例１の試料の分析を表４に示す。

実施例２
イワシ油からのＥＰＡ及びＤＨＡのエチルエステルの濃縮物の調製
Ｔｏｔｏｘ値４５のイワシ油を使用して実施例１を繰り返した。試料の分析を表５に示す。

実施例３
マアジ油からのＥＰＡ及びＤＨＡのエチルエステルの濃縮物の調製
Ｔｏｔｏｘ値３３のマアジ油を使用して実施例１を繰り返した。実施例の結果を表６に示す。

実施例４
２００リットル反応器内でのイワシ油からのＥＰＡ及びＤＨＡのエチルエステルの濃縮物の調製
２００リットルのバッフル及びジャケット付きタービン撹拌ステンレススチール製反応器に、エタノール１５ｋｇ、１８．７％の水酸化ナトリウム水溶液１５ｋｇ、及び表７にその特性が示されるイワシ油１５ｋｇ（試料Ｍ１０）を投入した。混合物を１時間５５℃まで加熱し、次いで４５℃に冷却した。次いで、ヘキサン４５ｋｇを添加し、１０分間撹拌した。混合物を１５分間沈降させ、有機相を水相から分離した。同じ手順を使用して水相を２回抽出した。ヘキサン抽出物を回収し、減圧下で脱溶媒化した。水相又は精製相を、２５℃の温度で１０％の塩酸溶液２８ｋｇで酸性化し、混合物を５分間撹拌した。水相及び有機相を分離させるために、酸性化混合物を１５分間沈降させた。有機相を、除去後、ｐＨ５まで５０％のエタノール水溶液１０ｋｇで洗浄した。洗浄後の有機相を濾過し、懸濁固体を分離した。洗浄及び濾過後の有機相を、ヘキサンで２０重量％まで希釈し、１５０リットルの第２の反応器に移し、アンカー型撹拌器及び冷却ジャケットを装着し、−２５℃まで冷却した。−２５℃で冷却された混合物を、バッグフィルタ内で１０ミクロンのポリエステルメッシュを通して濾過した。得られた濾液を２００リットルの反応器に投入し、２００ｍｂａｒの圧力で５５℃で加熱した。脱溶媒化脂肪酸の混合物を、エタノール５５ｋｇ中に溶解した尿素２０ｋｇの溶液に８０℃で接触させた。混合物を撹拌して尿素との錯体を形成させ、次いで１５℃に冷却した。沈殿した固体を濾過により分離すると、固体不含濾液が得られた。固体不含濾液を１℃に冷却して濾過すると、第２の固体不含濾液が得られた。第２の固体不含濾液を水５０ｋｇ中に溶解した塩酸３ｋｇ及びヘキサン２０ｋｇと混合し、撹拌し、沈降させた。酸性水相を分離し、ｐＨが中性となるまで有機相を水５ｋｇで洗浄した。有機相を８０℃及び５０ｍｂａｒで脱溶媒化した。７７．２％のω−３脂肪酸を含有する脂肪酸の混合物２．３ｋｇが得られた（試料Ｍ１１）。

次いで、エタノール１０ｋｇ中に溶解した硫酸４０ｇを反応器に投入し、８０℃で加熱した。続いて、反応器を４０℃に冷却し、水５ｋｇ中に溶解した炭酸ナトリウム７０ｇとともに、ヘキサン１０ｋｇを添加した。混合物を５分間撹拌し、次いで沈降後に水相を有機相から分離した。有機相を水５ｋｇで洗浄し、８０℃及び５０ｍｂａｒで脱溶媒化した。７０．９％のω−３脂肪酸を含有する脂肪酸のエチルエステルの混合物２．５ｋｇが得られた（試料Ｍ１２）。

混合物を、流速１２５０ｍｌ／ｈ、ジャケット温度８０℃、濃縮器温度−５℃、ローラ速度３５０ｒｐｍ及び圧力４ｍｂａｒで短経路蒸留塔ＫＤＬ５ ＵＩＣに供給することにより、エチルエステルから微量の溶媒を除去した。蒸留後のエチルエステルの混合物を、流速９０ｍｌ／ｈ、ジャケット温度８５℃、濃縮器温度４℃、ローラ速度３５０ｒｐｍ、圧力０．００５ｍｂａｒで短経路蒸留塔ＫＤＬ５ ＵＩＣに供給すると、第１の留出物及び第１の残渣が得られた。

第１の残渣を、７０℃及び減圧下で３０分間、１％のトンシル（Ｔｏｎｓｉｌ）と混合して濾過すると、精製された濾液が得られ、この濾液を９８℃の温度で短経路蒸留の第２のステップに供すると、第２の留出物及び第２の残渣が得られた。第２の留出物は、８６．２％の長鎖ω−３脂肪酸を含有していた。第２の留出物を、−２５℃で１２時間冷却し、次いで濾過した。得られた濾液を、１３０℃及び１５ｍｂａｒの圧力の窒素を脱臭に使用して、１００℃の温度で脱臭カラムに供給した。長鎖ω−３脂肪酸のエチルエステルの脱臭後濃縮物（試料Ｍ１３）が得られ、これに２５５０ｐｐｍの濃度のトコフェロールのエステル、パルミチン酸アスコルビル及びローズマリー抽出物の混合物を添加した。

実施例４の試料の分析を表７に示す。

実施例５
２００リットル反応器内でのマアジ油からのＥＰＡ及びＤＨＡのエチルエステルの濃縮物の調製
２００リットルのバッフル及びジャケット付きタービン撹拌ステンレススチール製反応器に、エタノール１５ｋｇ、１７．４％の水酸化ナトリウム水溶液１５ｋｇ、及び表８にその特性が示される実施例３のマアジ油１５ｋｇを投入した。混合物を１時間７５℃で加熱し、次いで４５℃に冷却した。次に、ヘキサン４５ｋｇを添加し、１０分間撹拌した。混合物を１５分間沈降させ、有機相を水相から分離した。同じ手順により水相を２回抽出した。水相又は精製相を、２５℃の温度で１０％の塩酸溶液２６ｋｇで酸性化し、５分間撹拌した。酸性化混合物を１５分間沈降させ、次いで水相を有機相から分離した。有機相を、ｐＨ５まで５０％のエタノール水溶液１０ｋｇで洗浄した。洗浄後の有機相を、エタノール１０ｋｇ中に溶解した硫酸１００ｇと混合し、８０℃の温度に達するまで、溶媒混合物を蒸留しながら加熱した。続いて、反応器を４０℃に冷却し、水５ｋｇ中に溶解した炭酸ナトリウム３５０ｇを添加し、１０分間撹拌した。水層を分離した。有機相を水５ｋｇで洗浄し、８０℃及び５０ｍｂａｒで脱溶媒化した。２４．７％のω−３脂肪酸を含有する脂肪酸のエチルエステルの混合物１４．６ｋｇが得られた（試料Ｍ１４）。

混合物を、流速１２５０ｍｌ／ｈ、ジャケット温度８０℃、濃縮器温度−５℃、ローラ速度３５０ｒｐｍ及び圧力４ｍｂａｒで短経路蒸留塔ＫＤＬ５ ＵＩＣに供給することにより、エチルエステルの微量の溶媒を除去した。蒸留後のエチルエステルを、流速９０ｍｌ／ｈ、ジャケット温度８５℃、濃縮器温度４℃、ローラ速度３５０ｒｐｍ、圧力０．００５ｍｂａｒで短経路蒸留塔ＫＤＬ５ ＵＩＣに供給すると、第１の留出物及び第１の残渣が得られた。

続いて、第１の残渣を９６℃の温度で第２の短経路蒸留に供すると、第２の留出物及び第２の残渣が得られた。第２の留出物は、５１．２％の長鎖ω−３脂肪酸を含有していた（試料Ｍ１５）。最後に、２０００ｐｐｍの酢酸トコフェロール（グリンドックストコ７０（Ｇｒｉｎｄｏｘ Ｔｏｃｏ ７０）、Ｄａｎｉｓｃｏ社製）を第２の留出物と混合した。

実施例５の試料の分析を表８に示す。

実施例６
実施例２及び３の濃縮物中のＥＰＡのシス／トランス異性体
実施例２の第２の留出物１グラムを、水酸化カリウムの水性メタノール溶液で、１０℃で２４時間鹸化した。次いで、鹸化混合物を１％の塩酸で１０℃で酸性化した。酸性化混合物を石油エーテルで３回抽出した。石油エーテルの抽出物を回収し、２０％のメタノール水溶液で洗浄し、洗浄後の抽出物をロータリーエバポレータ内で２０℃及び５ｍｂａｒで脱溶媒化した。三フッ化ホウ素を使用して、残渣をメチル化した。長鎖ω−３脂肪酸のメチルエステル８７０ｍｇが得られた。実施例３の第２の留出物の長鎖ω−３脂肪酸のメチルエステルの試料を、同様に調製した。

同様に、実施例２のイワシ油及び実施例３のマアジ油の脂肪酸のメチルエステルを、上述の技法を使用して調製した。

ａｌｌ ｃｉｓ（５，８，１１，１４，１７）エイコサペンタエン酸のメチルエステルの標準試料を、内径０．２５ｍｍ及び膜厚０．２０ミクロンの１００メートルＳＰ２５６０カラムを用いた、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製の５９７５Ｃｉｎｅｒｔの選択質量検出器を備えたガスクロマトグラフシリーズ７８９０Ａに注入した。クロマトグラフィーのプログラムは、初期温度１４０℃で５分間、２℃／分の速度で最高２４０℃までの昇温、及び２４０℃で３０分間保持であった。注入器及び検出器温度は２５０℃であった。超高純度ヘリウムをキャリアとして使用した。標準試料の質量スペクトルをデータライブラリに保存した。

続いて、実施例２及び３の第２の留出物の試料から調製されたメチルエステル、並びに実施例２及び３の原料油から得られたメチルエステルの試料を、クロマトグラフに注入した。ソフトウェアＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎを使用して、メチル化された試料のそれぞれに対して９９％の「一致品質」を得た。さらに、クロマトグラフィーを行った全てのメチルエステルのクロマトグラム及びスペクトログラムを比較したが、ＥＰＡの異性体化に関連した新たなピークは検出されなかった。

さらに、脂肪酸のトランス異性体の内容は、ＡＯＣＳ Ｃｅ １ｈ−０５の方法に従い、１６〜２２個の炭素原子と決定された。結果を表９に示す。表９から分かるように、実施例２及び３の試験においては、トランス異性体は生成されておらず、予想外にも、最終生成物において前記異性体の減少が見られた。

実施例７
実施例２及び３の脂肪酸のエチルエステルの試料の感覚特性評価及び安定性の決定
１２人のパネラーの熟練したパネルにより、官能特性及び安定性を評価した。３つの無作為な数字が付され、試料１５ｍｌを含む小型グラス内の評価試料を、各パネラーに与えた。評価は、感覚特性評価研究所（Ｓｅｎｓｏｒｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において午前１１：００時頃に行った。

生成物の感覚特性の評価の順番において、外観、芳香、風味、酸敗臭、並びに外的な風味及び臭気の存在というパラメータを考慮した。前記パラメータの測定の尺度は、１〜９ポイントの範囲であり、９は、風味の場合、「秀逸、標準的、極めて快適」を表し、１は、「奇妙、不快、腐敗」を表す。酸敗臭の場合、基準には５ポイントの範囲があり、５は「酸敗臭なし」を意味し、１は「著しい酸敗臭」を意味した。

表１０は、脂肪酸のエチルエステルの試料Ｍ１５の官能性評価において得られた、新鮮な試料、実施例５（Ａ）、及び室温で２９週間の保存後の同試料の平均的結果を示す。試料には、風味、臭気又は外観のマスキング剤は添加しなかった。

外観：評点７．５、つまり外観は「良」であった。
芳香：得られた評点は７．６であり、「良」として認定された。
風味：風味に関しては、試料の評点は７．１、つまり「良」であった。
酸敗臭：試料の評点は４．６、つまり「低酸敗臭」であった。
表１０から分かるように、試料は全て許容される官能特性及び安定性を有していた。

実施例８
摂取された試料の副次的作用
魚油から得られたＥＰＡ及びＤＨＡの異なる濃縮物により引き起こされる副次的作用を比較するために、１０名のボランティアを、５人ずつの２つの群Ａ及びＢに分けた。

ヨーグルト９００ｇを、ＥＰＡ３３ｇ及びＤＨＡ２２ｇを含有する市販の脂肪酸調製物のエチルエステル１００ｇと混合した（試料１）。並行して、実施例５の試料Ｍ１５のエチルエステル１００ｇを、同様にヨーグルト９００ｇと混合した（試料２）。

Ａ群の各メンバーは、試料１のヨーグルト混合物１５０ｇを摂取し、Ｂ群の各メンバーは、試料２のヨーグルト混合物１５０ｇを摂取した。摂取から３時間後、Ａ群の４名のメンバー及びＢ群の１名のメンバーは、胃逆流の経験を報告した。

１週間後、同じＡ群及びＢ群の人たちに対し、新しく調製した上述の試料１及び試料２を用いて試験を繰り返したが、今回は、Ａ群のメンバーに試料２を与え、Ｂ群のメンバーに試料１を与えた。摂取から３時間後、Ａ群のメンバーのいずれも胃逆流を経験せず、一方Ｂ群の５人全てのメンバーは、胃逆流の経験を報告した。

本明細書において開示された方法により調製されたＥＰＡ及びＤＨＡの濃縮物は、魚油誘導体の摂取に一般に関連する特徴的な副次的作用を示さないと結論付けることができる。

実施例９
酸化条件下に維持された試料の感覚特性評価
実施例５の試料Ｍ１５ ２０ｇを入れた直径１５ｃｍのペトリ皿を、強制対流式オーブン内で４５℃で６時間維持した。続いて、試料をオーブンから取り出し、冷却した。

５人のパネルにより試料を評価した。魚の臭いは検出されなかった。

比較例１の試料Ｍ３について、試験を繰り返した。魚の酸敗臭がパネルにより認められた。

比較例２の試料Ｍ５について、試験を繰り返した。この場合も、魚の酸敗臭がパネルにより認められた。

実施例８において使用された脂肪酸３３／２２ＥＰＡ／ＤＨＡのエチルエステルの試料について、試験を繰り返した。この場合も、魚の酸敗臭がパネルにより認められた。

実施例１０
試料Ｍ１５の酸化安定性の決定
実施例５の試料Ｍ１５の一部の酸化安定性を、Ｒａｎｃｉｍａｔ試験法を用いて測定した。８０℃での誘導時間は、２８．１１±０．９７時間であった。並行して、実施例８において使用されたエチルエステル３３／２２の試料に対してＲａｎｃｉｍａｔ試験を行った。８０℃での誘導時間は、１．６７±０．１０時間であった。

実施例１１
試料の質量スペクトル
実施例４のヘキサン残渣の試料を、質量検出器を備えた５９７５Ｃｉｎｅｒｔに連結されたＨＰ７８９０クロマトグラフにおけるＧＣ−ＭＳにより測定した。クロマトグラフの報告は、表１１から分かるように、１０００ｐｐｍより高い濃度の５０種を超える化合物が試料中に存在することを示していた。

表１１に示されるデータから結論付けることができるように、開示された方法は、多くの魚油濃縮物の副次的作用並びに風味及び臭気の望ましくない回復に関与し得る、異なるω−３脂肪酸の天然由来化合物及び汚染物の両方を含む海産油中の広範な種類の化合物を除去することができる。

Claims (11)

1. 粗海産油又は精製海産油からＥＰＡ及びＤＨＡのエステルの濃縮物を得るための方法において、
   ａ）鹸化海産油を含む混合物が得られるまで、粗海産油又は精製海産油を、最高１００℃の温度で１種又は複数種のアルカリ及び水と接触させるステップと、
   ｂ）鹸化混合物を、１種又は複数種の有機溶媒と接触させて、脂肪酸のアルカリ塩を含む精製相及び抽出相を形成するステップと、
   ｃ）精製相から抽出相を分離するステップと、
   ｄ）精製相を酸の水溶液と混合して、脂肪酸を含む非水相及び水相を形成するステップと、
   ｅ）非水相から水相を分離するステップと、
   ｆ）脂肪酸のエステルを含むエステル化混合物が得られるまで、分離された非水相を、最高１５０℃の温度でアルコール及びエステル化触媒と混合するステップと、
   ｇ）エステル化混合物から触媒を除去して、触媒不含エステル化混合物を得るステップと、
   ｈ）触媒不含エステル化混合物を脱溶媒化して、脂肪酸のエステルを得るステップと、
   ｉ）少なくとも１８０℃の温度及び１ｍｂａｒ未満の圧力で、短経路蒸留塔内で脂肪酸のエステルを蒸留して、ＥＰＡ及びＤＨＡのエステルを含む濃縮物を得るステップと
   を含むことを特徴とする方法。
2. ステップ（ａ）におけるアルカリが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム及びそれらの混合物からなる群から選択され、粗油又は精製油に対するアルカリの重量比が、０．１５：１であり、粗油又は精製油に対する水の重量比が、０．５：１〜２：１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ａ）の混合物が、エタノールを含み、粗油又は精製油に対するエタノールの重量比が、０．５：１〜２：１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. ステップ（ａ）の混合物が、ヘキサンを含み、粗油又は精製油に対するヘキサンの重量比が、０．５：１〜２：１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. ステップ（ａ）の混合物が、１種又は複数種の酸化防止剤を含み、粗油又は精製油に対する酸化防止剤の重量比が、１：１００未満であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. ステップ（ａ）の混合物が、３０〜１２０分の期間、１ｂａｒの圧力及び１００℃以下の温度に維持されて、鹸化海産油が得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. ステップ（ｂ）において、温度が２０〜６０℃であり、圧力が１ｂａｒであり、使用される溶媒が、石油、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン及びオクタンからなる群から選択され、反応させる混合物に対する溶媒の重量比が、１：１〜５：１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
8. ステップ（ｄ）において、酸が、硫酸、リン酸、酢酸、ギ酸、トリクロロ酢酸及び炭酸からなる群から選択され、温度が２０〜７０℃であり、圧力が１ｂａｒであり、ステップ（ａ）のアルカリに対する酸の化学量論比が、１．０５：１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
9. ステップ（ｆ）のアルコールが、メタノール、エタノール及びグリセロールからなる群から選択され、温度が３０〜８０℃であり、圧力が１ｂａｒであり、エステル化混合物が、６０〜２４０分の期間、３０〜８０℃の温度に維持されて、エステル化混合物が形成されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
10. 脂肪酸のエステルが、０．１ｍｂａｒ未満の圧力及び１５０℃未満の温度で蒸留されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. ＥＰＡ及びＤＨＡのエステルの総含有量が、濃縮物の少なくとも４０重量％であり、前記濃縮物のトランス異性体の含有量が、粗海産油又は精製海産油のトランス異性体の含有量以下であり、濃縮物が、中性官能特性及び酸化安定性を有し、そのＰＣＢ含有量が９０ｎｇ／濃縮物ｇ未満であり、そのダイオキシン及びフラン含有量が、最高で２ｐｇ／濃縮物１ｇであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法により得られるＥＰＡ及びＤＨＡのエステルの濃縮物。
    

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