CN107643344A

CN107643344A - 利用高效液相色谱‑荧光检测（hplc‑fld）法分析测定燕麦生物碱

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Publication number: CN107643344A
Application number: CN201710520315.2A
Authority: CN
Inventors: 任虹; 兰社益; 谢佳颖; 朱帅; 万慧洁; 陈阳
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2018-01-30

Abstract

利用HPLC‑FLD法分析检测燕麦生物碱(N‑(肉桂酰)邻氨基苯甲酸类化合物)，此技术是利用该类化合物的荧光特性，即激发波长为330nm，发射波长为430nm，以燕麦生物碱结构类似物‑曲尼司特作为标准参照物，建立燕麦生物碱的HPLC‑FLD分析方法。方法：1.HPLC‑FLD分析曲尼司特的最佳液相条件：Prosphere C₁₈色谱柱(5μm，4.6nm×250nm)，流动相为38％乙腈和水(含10mM乙酸)，柱温30℃，进样量10μL；荧光检测条件：激发波长330nm，发射波长430nm。2.燕麦麸皮经溶剂分级萃取、大孔树脂层析，得到燕麦生物碱提取物，HPLC‑FLD分析燕麦生物碱的最佳液相条件同1，梯度洗脱程序：0‑4min(5％B‑36％B，95％A‑64％A)，4‑50min(36％B‑50％B，64％A‑50％A)，50‑60min(50％B‑50％B，50％A‑50％A)。荧光检测条件：激发波长330nm，发射波长430nm。

Description

利用高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)法分析测定燕麦生物碱

技术领域

本发明涉及利用高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)法分析检测燕麦生物碱。燕麦生物碱是一系列N-(肉桂酰)邻氨基苯甲酸类化合物，研究发现，燕麦生物碱提取物具有抗氧化、降血脂、抑制肿瘤细胞增殖、消炎止痒等功能，广泛应用于药品、功能保健品及化妆品领域，但目前没有高效灵敏的检测分析燕麦生物碱的方法，也没有从燕麦中分离纯化得到燕麦生物碱单体化合物，燕麦生物碱检测分析方法的不完善严重阻碍了燕麦生物碱的开发利用，因此，燕麦生物碱的分析检测方法亟待解决。

背景技术

曲尼司特是燕麦生物碱的结构类似物，其化学结构式为N-(3，4-二甲氧基肉桂酰)邻氨基苯甲酸，是一种淡黄色粉末。我们以曲尼司特作为标准参照物，探索N-(肉桂酰)邻氨基苯甲酸类化合物的分析检测方法。

现有检测曲尼司特的方法有两种：紫外分光光度法、高效液相-紫外检测(HPLC-DAD) 法。两种方法都基于曲尼司特的紫外吸收特性，即在330nm下有最大吸收值，但母核侧链上的生色团与助色团会明显影响其紫外吸收，且光谱信息在紫外-可见光谱范围重叠现象严重，都会造成误差，可见，单纯依靠单一检测方法分析曲尼司特具有很大局限性。

本发明的目的是定量分析检测燕麦生物碱，利用该类化合物的荧光特性，以燕麦生物碱的结构类似物曲尼司特作为标准参照物，利用高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)技术定量分析检测曲尼司特，利用HPLC-FLD的荧光强度量化曲尼司特浓度，建立曲尼司特HPLC-FLD的标准曲线，以此来定量分析燕麦生物碱含量。

发明内容

本发明所要解决的问题是检测分析燕麦生物碱。

本发明涉及检测分析燕麦生物碱的方法及其应用，其特征是基于燕麦生物碱的荧光特性，以燕麦生物碱的结构类似物曲尼司特作为标准参照物，建立HPLC-FLD技术定量分析燕麦生物碱的方法。

附图说明

1、曲尼司特是燕麦生物碱的结构类似物，见图1.

2、曲尼司特的荧光性质

图2是曲尼司特在激发波长330nm，38％和50％浓度下的发射全波长图，显示了曲尼司特的荧光特性，即在激发波长330nm下产生430nm发射光。

3、曲尼司特的荧光稳定性：

配制0.1mg/mL曲尼司特溶液，在室温、不避光条件下保存，HPLC-FLD法分析其在40天内的荧光强度变化，确定其稳定性。表1给出曲尼司特的荧光稳定性。

表1 曲尼司特的稳定性(0.1mg/mL)

4、确定HPLC-FLD定量检测分析曲尼司特的方法

用乙醇配制0.1mg/mL曲尼司特样品溶液进行HPLC-FLD，流动相为62％水(含10mM乙酸)和38％乙腈等梯度洗脱20min，柱温30℃，进样量10μL，荧光检测条件是激发波长330nm、发射波长430nm，如图3所示，图4是曲尼司特在330nm下的HPLC-DAD图谱。

5、绘制曲尼司特标准曲线

在激发波长330nm、发射波长430nm条件下，利用HPLC-FLD检测分析曲尼司特。图 5是在浓度范围为10^-9～1.0mg/mL内，曲尼司特的荧光强度与浓度的关系，可见在0～0.1mg/mL 浓度内呈线性关系，图6是曲尼司特的荧光强度与浓度的标准曲线图。

6、检测限

选取两个低于标准曲线线性范围最低浓度0.001mg/mL的曲尼司特溶液即0.0008mg/mL 和0.0009mg/mL进行HPLC-FLD测定，见表2，结果显示0.0008mg/mL和0.0009mg/mL曲尼司特溶液对应的荧光值分别为19.3300EU和21.9327EU，均有明显的响应信号，说明可以运用国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)对检测限的定义计算。取k＝3，此时置信区间为99.6％；以乙醇溶液为空白对照样品，在相同HPLC-FLD检测条件下测定其20次，计算得空白信号的平均值和标准偏差s_b1；根据IUPAC定义计算检测限：

式中，x_L——检测限；——空白均值；k——与置信度有关的常数；s_b1——空白值标准偏差；c_L——最低检出浓度；s——低浓度时的灵敏度，即标准工作曲线在低浓度范围内的斜率。

表2 曲尼司特的检测限

7、回收率

在曲尼司特标准曲线的线性范围内，选择浓度分别为0.04mg/mL，0.08mg/mL和0.09mg/mL 曲尼司特溶液进行HPLC-FLD检测，5次平行测其平均值，计算曲尼司特的回收率及其绝对标准偏差S和相对标准偏差RSD，见表3。

表3 曲尼司特的回收率

本发明解决了现有曲尼司特分析方法的局限性，主要优点在于：

1、本发明基于曲尼司特、燕麦生物碱的荧光特性，利用高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)法分析检测该类物质，避免了紫外检测法分析的误差。

2、所利用的荧光检测器比紫外检测器的最低检测限更低，检测结果更准确，提出了该类含氮酚酸类化合物的新的分析检测方法。

具体实施方式

本发明涉及的利用高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)定量分析检测燕麦生物碱的方法，将通过下面的实施例而得到更具体的描述。

实施实例建立高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)分析检测曲尼司特的方法

1.用乙醇配制0.1mg/mL曲尼司特样品溶液进行HPLC-FLD分析，HPLC条件：Prosphere C₁₈色谱柱(5μm，4.6nm×250nm)，流动相为62％水(含10mM乙酸)和38％乙腈，等梯度洗脱，柱温30℃，进样量10μL，进样时间20min，荧光检测条件是激发波长为330nm，发射波长为430nm。

2.上述HPLC-FLD法分析，在0～0.1mg/mL浓度范围内，曲尼司特的荧光强度与浓度之间呈线性关系，绘制标准曲线。

3.配制0.1mg/mL曲尼司特溶液，在室温、不避光条件下保存，HPLC-FLD法分析其在40天内荧光性稳定性。

4.回收率

在曲尼司特标准曲线的线性范围内，选择不同浓度的曲尼司特溶液进行HPLC-FLD检测， 5次平行测其平均值，计算曲尼司特的回收率及其绝对标准偏差和相对标准偏差。

实施实例利用高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)定量分析检测燕麦生物碱

1.从燕麦麸皮中提取燕麦生物碱，工艺流程见图7。

2.采用上述HPLC-FLD法分析提取过程中的燕麦生物碱含量，HPLC条件：ProsphereC₁₈色谱柱(5μm，4.6nm×250nm)，流动相A为62％水(含10mM乙酸)和B为38％乙腈梯度洗脱60min，柱温30℃，进样量10μL，梯度洗脱程序为：

0-4min(5％B-36％B，95％A-64％A)

4-50min(36％B-50％B，64％A-50％A)

50-60min(50％B-50％B，50％A-50％A)

荧光检测条件：激发波长为330nm，发射波长为430nm。

3.采用AB-8大孔树脂层析获得中等极性和弱极性两种燕麦生物碱成分，层析条件：层析柱 (16mm×50cm)，处理的AB-8大孔树脂50g，3倍柱床体积平衡液，平衡速率为1.0mL/min；动态上样，上样速率0.5mL/min；3倍柱床体积洗脱液，洗脱速率2mL/min；洗脱梯度依次为水、20％、60％、95％乙醇溶液(均含0.1％乙酸)。弃去20％乙醇洗脱的极性杂质；60％乙醇洗脱液洗脱下中等极性燕麦生物碱成分，得率为1.83μg/g， HPLC-FLD测定生物碱含量为2.42μg/mg(2420ppm)；95％乙醇洗脱液洗脱下弱极性燕麦生物碱成分，得率为1.77μg/g，HPLC-FLD测定生物碱含量为0.93μg/mg(930ppm)。

附图说明

图1是燕麦生物碱的种类及其化学结构

图2是曲尼司特在激发波长330nm、浓度为38％和50％下的发射全波长图

图3是曲尼司特的荧光图谱(激发波长330nm、发射波长430nm)

图4是曲尼司特在330nm下的高效液相-紫外检测(HPLC-DAD)图谱

图5是在10^-9～1.0mg/mL浓度范围内，曲尼司特浓度与荧光强度关系图

图6是曲尼司特浓度与荧光强度的标准曲线图

图7是燕麦生物碱分离纯化流程图。

Claims

1.利用高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)法分析测定燕麦生物碱，燕麦生物碱是一系列N-(肉桂酰)邻氨基苯甲酸类化合物，该方法的特征是利用燕麦生物碱的荧光特性，即利用高效液相色谱在激发波长为330nm、发射波长为430nm条件下检测。通过标准品曲尼司特的高效液相荧光强度量化其浓度，绘制曲尼司特的标准曲线，分析其稳定性、检测限和回收率等基本性质，建立N-(肉桂酰)邻氨基苯甲酸类化合物的高效液相色谱-荧光检测方法。

实验用曲尼司特标准品由中国药品生物制品检定所提供。

2.根据权利要求1所述的利用HPLC-FLD法检测分析燕麦生物碱，包括天然提取的各种N-(肉桂酰)邻氨基苯甲酸类物质。

3.根据权利要求1所述的利用HPLC-FLD法检测分析燕麦生物碱，包括人工合成的各种N-(肉桂酰)邻氨基苯甲酸类物质。

4.根据权利要求1所述的利用HPLC-FLD法检测分析燕麦生物碱，包括各种燕麦中的生物碱物质。