CN107636006B

CN107636006B - 还原型谷胱甘肽的α型晶体的生产方法和所述晶体的保存方法

Info

Publication number: CN107636006B
Application number: CN201680032873.8A
Authority: CN
Inventors: 井口茉耶; 福本一成; 长野宏
Original assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Current assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date: 2015-06-05
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2036-06-03
Also published as: EP4406960A2; US20180170959A1; WO2016195070A1; CN107636006A; JP2021080265A; JP6868556B2; JPWO2016195070A1; US10407463B2; EP3305801A1; EP3305801A4

Abstract

本发明提供了一种高效且稳定地制造品质和生产性皆优异的还原型谷胱甘肽的α型晶体的方法，以及所述晶体的保存方法。本发明涉及还原型谷胱甘肽的水溶液及α型晶体的生产方法和保存方法。根据本发明，在还原型谷胱甘肽的水溶液及α型晶体的生产和保存过程中，允许选自脂肪族氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸、类似化合物和二肽的至少一种化合物作为媒晶剂共存。因此，抑制还原型谷胱甘肽的β型晶体的形成和/或向β型晶体的转变，从而可以稳定地获得还原型谷胱甘肽的α型晶体。

Description

还原型谷胱甘肽的α型晶体的生产方法和所述晶体的保存方法

技术领域

本发明涉及还原型谷胱甘肽的α型晶体的生产方法和所述晶体的保存方法。

背景技术

还原型谷胱甘肽是由3种氨基酸(谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸)构成的三肽，并且作为具有抗氧化功能和解毒作用的材料被用作医药品或保健食品的原料。近年来，人们也期望开发进入饮料、化妆品等各种各样的市场。

还原型谷胱甘肽的晶体包括α型晶体和β型晶体两种晶体多晶型(非专利文献1)。作为不稳定晶体的α型晶体和作为稳定晶体的β型晶体的溶解度显著不同，在10℃下α型晶体的饱和溶解度为89g/L而β型晶体为30g/L(图1)。因此，具有低溶解度的β型晶体与它难以作为原材料加工并且不易处理的问题相关联。此外，针状的小β型晶体由于其与母液的分离性差而在品质和生产性方面不如柱状且容易放大的α形晶体。

在通过向还原型谷胱甘肽的α型晶体的饱和溶液中添加α型晶体而制备的结晶浆料中，以及在还原型谷胱甘肽的过饱和溶液中，高效地生产作为所期望的晶体形态的α型晶体，在很大程度上被容易形成的作为稳定晶体的β型晶体所妨碍。在这种情况下，迫切需要开发一种在还原型谷胱甘肽的过饱和溶液中抑制β型晶体生成并实现选择性结晶以获得α型晶体的方法。

另一方面，作为控制包括氨基酸的有机化合物的晶体多晶型的形成的方法，添加媒晶剂有时候可以是有效的(专利文献1，非专利文献2)。但是，为了使媒晶剂有效运作，需要满足严格的限制条件；例如作为媒晶剂添加的化合物需要具有与目标化合物极其相似的化学结构(非专利文献2)，此外，媒晶剂需要具有与目标化合物相同或稍小的分子量(非专利文献3)等。由于这些限制，具有低结构相似性的化合物或分子量远远相差于目标化合物的化合物通常被排除在媒晶剂的搜索目标之外。

至于例如还原型谷胱甘肽的由两个或更多个氨基酸组成的肽，其中通过添加媒晶剂来控制晶体多晶型的形成的实例迄今尚属未知。

文献列表

专利文献

专利文献1：JP-A-2010-59125

非专利文献

非专利文献1：Yamasaki,K.等,Bunseki Kagaku,18(7),874-878页(1969)。

非专利文献2：Kuroda,K.等,Yakugaku Zasshi,99,745-751页(1979)。

非专利文献3：Momonaga,M.等,Kagaku Kogaku Ronbunshu,18(5)553-561页(1992)。

发明内容

本发明要解决的技术问题

本发明的技术问题是提供高效且稳定地制造品质和生产性皆优异的还原型谷胱甘肽的α型晶体的方法，以及其保存方法。

解决所述技术问题的手段

为了尝试解决上述问题，本发明人进行了研究，结果发现，当与没有添加媒晶剂相比，媒晶剂和还原型谷胱甘肽的水溶液以及α型晶体的共存，显著抑制了β型晶体的形成和向β型晶体的转变，还有在媒晶剂的共存下将还原型谷胱甘肽结晶为α型晶体，显著抑制了β型晶体的形成和向β型晶体的转变并可高效稳定地生产α型晶体，这些研究结果导致了本发明的完成。

因此，本发明提供以下内容。

[1]一种用于抑制还原型谷胱甘肽的β型晶体的形成和/或还原型谷胱甘肽的α型晶体向β型晶体的转变的媒晶剂，该媒晶剂由选自脂肪族氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸、类似化合物和二肽的至少一种化合物组成。

[2]包含上述[1]所述的媒晶剂的还原型谷胱甘肽的α型晶体。

[3]上述[2]所述的晶体，其中所述媒晶剂的含量相对于所述还原型谷胱甘肽的α型晶体为0.01-10重量％。

[4]一种生产还原型谷胱甘肽的α型晶体的方法，所述方法包括向含有还原型谷胱甘肽的水溶液中添加上述[1]所述的媒晶剂的步骤，和将还原型谷胱甘肽结晶为α型晶体的步骤。

[5]上述[4]所述的方法，其中所述媒晶剂的添加量相对于所述还原型谷胱甘肽为0.01-10重量％。

[6]一种保存还原型谷胱甘肽水溶液的方法，所述方法包括向还原型谷胱甘肽的水溶液中添加上述[1]所述的媒晶剂的步骤。

[7]上述[6]所述的方法，其中所述媒晶剂的添加量相对于所述还原型谷胱甘肽为0.01-10重量％。

[8]一种保存还原型谷胱甘肽的α型晶体的方法，所述方法包括向还原型谷胱甘肽的α型晶体添加上述[1]所述的媒晶剂的步骤。

[9]上述[8]所述的方法，其中所述媒晶剂的添加量相对于所述还原型谷胱甘肽为0.01-10重量％。

本发明的效果

根据本发明，通过在还原型谷胱甘肽的α型晶体的生产(结晶)和保存过程中特定媒晶剂的共存，显著抑制了β型晶体的形成和α型晶体向β型晶体的转变，并且可以高效且稳定地生产还原型谷胱甘肽的α型晶体。

附图说明

图1显示了还原型谷胱甘肽的α型晶体和β型晶体的溶解度曲线，其中纵轴表示各晶体在各温度下在水中的溶解度(g/L)，横轴表示温度(℃)。

具体实施方式

下面详细描述本发明。

(定义)

在本说明书中，所述“还原型谷胱甘肽”是指如上所述的由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽。用于本发明的还原型谷胱甘肽可以通过任何生产方法获得。例如，可以提到通过在JP-B-57-016196等中描述的方法获得的一种。

所述“媒晶剂”一般是指被添加以改变母体化合物的晶体习性并防止多晶型物转变的添加剂。在本发明中，它特别是指在还原型谷胱甘肽的α型晶体的制造和保存过程中，抑制还原型谷胱甘肽的β型晶体的形成和抑制还原型谷胱甘肽的α型晶体向β型晶体转变的化合物。用于本发明的媒晶剂的实例包括：脂肪族氨基酸如丙氨酸、脯氨酸等，含硫氨基酸如半胱氨酸等，芳香族氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸等，类似化合物如氧化型谷胱甘肽等，二肽如丙氨酰半胱氨酸等，以及等等。其中，特别优选选自L-半胱氨酸、L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、D-脯氨酸、氧化型谷胱甘肽和L-丙氨酰-L-半胱氨酸的至少一种媒晶剂。同时所述媒晶剂可以通过任何生产方法获得，例如可以提到通过化学合成方法、提取方法或发酵方法获得的一种。

在本说明书中，所述“脂肪族氨基酸”是指不包括芳香族氨基酸的疏水性氨基酸。所述脂肪族氨基酸的实例包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸等。其中，优选L-丙氨酸和D-脯氨酸。

在本说明书中，所述“含硫氨基酸”是指在其结构中具有硫原子的氨基酸。所述含硫氨基酸的实例包括半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸等。其中，优选L-半胱氨酸。

在本说明书中，所述“芳香族氨基酸”是指具有芳香环和芳香族杂环的疏水性氨基酸。所述芳族氨基酸的实例包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等。其中，优选L-苯丙氨酸和L-色氨酸。

在本说明书中，所述“类似化合物”是指在例如受体结合性等分子生物学性质以及结构上与还原型谷胱甘肽相似的化合物，但具有其中构成还原型谷胱甘肽的原子或原子团被别的原子或原子团取代的组分。所述类似化合物的实例包括氧化型谷胱甘肽、N-L-半胱氨酰甘氨酸、γ谷氨酰半胱氨酸等。其中，优选氧化型谷胱甘肽。

在本说明书中，所述“氧化型谷胱甘肽”是指其中两分子还原型谷胱甘肽通过二硫键连接的分子。以下，有时将氧化型谷胱甘肽缩写为“GSSG”。

在本说明书中，所述“二肽”是指其中两个氨基酸分子通过肽键连接的分子。所述二肽的实例包括L-丙氨酸-L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-半胱氨酸等。其中，优选L-丙氨酰-L-半胱氨酸。

在本说明书中，所述“水溶液”是指仅含有水作为溶剂的溶液或含有水作为主要溶剂的溶液。只要不损害本发明的效果，所述水溶液可以含有例如甲醇、乙醇、丙醇、丙酮等的水溶性有机溶剂。

在本说明书中，所述“还原型谷胱甘肽水溶液”或“含有还原型谷胱甘肽的水溶液”是至少含有溶解的还原型谷胱甘肽的水溶液，可以是其中还原型谷胱甘肽完全溶解的溶液，也可以是除了溶解的还原型谷胱甘肽之外还含有还原型谷胱甘肽的α型晶体的溶液。

(本发明的还原型谷胱甘肽水溶液的保存方法)

为了抑制还原型谷胱甘肽水溶液中β型晶体的形成，所述β型晶体是在水溶液中具有低溶解度且易于沉淀的稳定晶体，本发明提供一种还原型谷胱甘肽水溶液的保存方法，该方法包括将脂肪族氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸、类似化合物和二肽中的任一种或多种化合物作为媒晶剂共存(下文称作“本发明的水溶液的保存方法”)。可以优选使用上文提到的那些作为媒晶剂。

所述(含有)还原型谷胱甘肽的水溶液中除了媒晶剂之外可以含有至少一种溶质，所述媒晶剂选自脂肪族氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸、类似化合物和二肽，只要不损害本发明的效果即可。这种溶质的实例包括盐和缓冲剂。另外，所述(含有)还原型谷胱甘肽的水溶液也可以是含有还原型谷胱甘肽的发酵液的上清液，还原型谷胱甘肽的生产反应液的上清液等。上述盐的实例包括氯化钠、硫酸钠等，上述缓冲剂的实例包括乙酸钠、碳酸氢钠等。对于将媒晶剂共存的方法没有特别的限制，媒晶剂可被添加到还原型谷胱甘肽水溶液中，也可以将还原型谷胱甘肽水溶液添加到媒晶剂中。当固体媒晶剂被加入时，优选在加入到还原型谷胱甘肽水溶液后被溶解。在通过发酵方法、提取方法或化学合成方法生产还原型谷胱甘肽的过程中，只要还原型谷胱甘肽的生产不受抑制，本发明中的媒晶剂可以共存在任何步骤中。另外，使用含有本发明的媒晶剂的原料时，由该原料生产的还原型谷胱甘肽也可以同时含有本发明的媒晶剂。

在本发明的水溶液的保存方法中，与没有共存媒晶剂的情况相比，在媒晶剂的共存下可以长时间抑制β型晶体的形成和/或α型晶体向β型晶体的转变。

在本发明的水溶液的保存方法中，对所述还原型谷胱甘肽水溶液的温度没有特别的限制，只要β型晶体的形成和/或α型晶体向β型晶体的转变不发生即可。然而，为了抑制所述转变，优选较低的温度。尽管不发生β型晶体的形成和/或向β型晶体的转变的还原型谷胱甘肽水溶液的温度根据所述媒晶剂的种类或浓度而变化，但一般不超过60℃，优选不超过40℃，更优选不超过25℃，特别优选不超过10℃。

要在还原型谷胱甘肽水溶液中共存的媒晶剂的添加量相对于所述还原型谷胱甘肽优选不少于0.01重量％，更优选不少于0.1重量％，特别优选不少于1重量％。可取的是不多于10重量％。

即使在还原型还原谷胱甘肽水溶液中的还原型谷胱甘肽的浓度不低于β型晶体在10℃时的饱和溶解度30g/L时，添加媒晶剂也能够抑制β型晶体的形成并维持澄清水溶液的状态。当还原型谷胱甘肽水溶液含有α型晶体时，即使当体系中还原型谷胱甘肽的浓度不低于30g/L时，也可以防止β型晶体的形成和向β型晶体的转变。

要添加的所述媒晶剂的优选量可以例如如下确定。以不多于约5重量％的量添加媒晶剂到还原型谷胱甘肽水溶液中，并将该混合物搅拌给定时间。在显微镜下观察搅拌过程中析出的晶体，并判断晶体是否全部是α型晶体或者已发生了β型晶体的形成或向β型晶体的转变。由于为大柱状晶体的α型晶体的形状与为小针状晶体的β型晶体的形状明显不同，因此通过显微镜观察可以容易地辨别它们。为了定量地掌握β型晶体的污染状态，将一部分分离，并将得到的晶体在25℃的水中溶解至100g/L。在保持搅拌充分时间之后，通过可见吸光度测量方法来测试溶液，使用具有1cm层长的池以水作为对照，并且在430nm处测量透过率(permeability)并确认浊度。透过率可表示为透过率(T％)430nm＝100×10^-A(A＝Abs：430nm，1cm)。当存在具有低溶解度的β型晶体时，由于未溶解的晶体被检测为浑浊，所述溶液的透过率降低。由于β型晶体的形成导致浆液中的溶液中的还原型谷胱甘肽的结晶和浓度低于仅含有α型晶体的溶液中的还原型谷胱甘肽的浓度，所以共存晶体的种类也可以通过测量母液中的还原型谷胱甘肽的浓度来辨别，所述母液中已经去除了所述共存晶体。通过过滤等除去共存晶体、用流动相稀释至给定浓度、维持搅拌充分时间、在下述HPLC条件下测定浓度的方法测定所述母液中的还原型谷胱甘肽的浓度。

HPLC条件

柱：Inertsil ODS-3内径3.0mm，长度150mm

柱温：35℃

检测器：UV检测器波长210nm

流动相组成：1-庚烷硫酸钠/磷酸二氢钾/磷酸/甲醇

还原型谷胱甘肽水溶液中含有的各种媒晶剂成分的种类和含量也可以被测定，例如，通过精确称量约0.25g样品，将其溶解于纯水中，定容至25mL，收集1mL，向其加入稀释缓冲液，将混合物定容至10mL，10000rpm离心所述恒定体积的溶液5min，将上清液加入氨基酸分析仪JLC-500V(日本电子株式会社(JEOL)制造)，然后按照说明书的说明进行测定。

(本发明的还原型谷胱甘肽的α型晶体)

本发明提供含有上述媒晶剂的还原型谷胱甘肽的α型晶体(以下也称为“本发明的α型晶体”)。

所述还原型谷胱甘肽的α型晶体为通过粉末X-射线衍射在衍射角2θ为6.3°，12.6°，13.8°，16.2°，22.3°，25.7°，30.1°，31.9°，32.0°和33.5°处具有峰的晶体。

在所述还原型谷胱甘肽的α型晶体中含有的媒晶剂的含量相对于还原型谷胱甘肽的α型晶体优选为不少于0.01重量％，更优选为不少于0.1重量％，特别优选为不少于1重量％。可取的是不多于10重量％。

由于含有上述媒晶剂，所以本发明的α型晶体向溶解度低、难以作为原料进行加工的β型晶体的转变受到抑制。

本发明的还原型谷胱甘肽的α型晶体中要含有的媒晶剂的量可以通过将本发明的α型晶体用流动相稀释至给定浓度、保持搅拌充分时间并在下列HPLC条件下测量浓度的方法进行确定。

HPLC条件

柱：YMC Triart C18内径3.0mm，长度150mm

柱温：40℃

检测器：荧光检测器激发波长360nm/荧光波长440nm

流动相组成：柠檬酸三钠二水合物/无水硫酸钠/正丙醇/月桂基硫酸钠

在本发明的α型晶体中含有的各种媒晶剂成分的种类和含量也可以被测定，例如，通过精确称量约0.25g样品，将其溶解于纯水中，定容至25mL，收集1mL，向其加入稀释缓冲液，将混合物定容至10mL，10000rpm离心所述恒定体积的溶液5min，将上清液加入氨基酸分析仪JLC-500V(日本电子株式会社(JEOL)制造)，然后按照说明书的说明进行测定。

(本发明的还原型谷胱甘肽的α型晶体的保存方法)

为了抑制还原型谷胱甘肽的α型晶体中的向溶解度低且难以作为原料进行加工的β型晶体的转变，本发明提供一种还原型谷胱甘肽的α型晶体的保存方法，该方法包括将脂肪族氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸、类似化合物和二肽中的任一种或多种化合物作为媒晶剂共存(下文称作“本发明的α型晶体的保存方法”)。可以优选使用上文提到的那些作为媒晶剂。

所述还原型谷胱甘肽的α型晶体可以含有还原型谷胱甘肽，以及不同于媒晶剂的一种或多种物质，所述媒晶剂选自脂肪族氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸、类似化合物和二肽，只要不损害本发明的效果即可。这种物质的实例包括盐、有机溶剂和类似化合物。

在本发明的α型晶体的保存方法中，为了抑制还原型谷胱甘肽的α型晶体转变为β型晶体，将媒晶剂与还原型谷胱甘肽的α型晶体共存。将媒晶剂与还原型谷胱甘肽的α型晶体共存的方法没有限制，还原型谷胱甘肽的α型晶体可以悬浮于媒晶剂的溶液中，并且将晶体分离以得到所述媒晶剂共存于其中的晶体，或将含有媒晶剂的溶液喷雾到还原型谷胱甘肽的α型晶体上，以得到所述媒晶剂共存于其中的晶体。

在本发明的α型晶体的保存方法中，与没有共存媒晶剂的情况相比，在媒晶剂的共存下可以长时间抑制β型晶体的形成和/或α型晶体向β型晶体的转变。

在本发明的α型晶体的保存方法中，对所述α型晶体的保存温度没有特别的限制，只要β型晶体的形成和/或α型晶体向β型晶体的转变不发生即可。然而，为了抑制转变，优选较低的温度。尽管不发生β型晶体的形成和/或向β型晶体的转变的所述还原型谷胱甘肽的α型晶体的温度根据所述媒晶剂的种类或浓度而变化，但是具体地，该温度一般不超过60℃，优选不超过40℃，更优选不超过25℃，特别优选不超过10℃。

在还原型谷胱甘肽的α型晶体中共存的媒晶剂的添加量相对于所述还原型谷胱甘肽的α型晶体优选为不少于0.01重量％，更优选为不少于0.1重量％，特别优选为不少于1重量％。理想的是不多于10重量％。

与还原型谷胱甘肽的α型晶体共存的所述媒晶剂的量可以通过将与媒晶剂共存的还原型谷胱甘肽的α型晶体用流动相稀释至给定浓度、保持搅拌充分时间并在下列HPLC条件下测量浓度的方法进行确定。

HPLC条件

柱：YMC Triart C18内径3.0mm，长度150mm

柱温：40℃

检测器：荧光检测器激发波长360nm/荧光波长440nm

在还原型谷胱甘肽的α型晶体中含有的各种媒晶剂成分的种类和含量也可以被测定，例如，通过精确称量约0.25g样品，将其溶解于纯水中，定容至25mL，收集1mL，向其加入稀释缓冲液，将混合物定容至10mL，10000rpm离心所述恒定体积的溶液5min，将上清液加入氨基酸分析仪JLC-500V(日本电子株式会社(JEOL)制造)，然后按照说明书的说明进行测定。

(本发明的还原型谷胱甘肽的α型晶体的生产方法)

本发明提供一种还原型谷胱甘肽的α型晶体的生产方法，所述方法包括在至少一种媒晶剂的共存下将还原型谷胱甘肽从谷胱甘肽水溶液中结晶为α型晶体以得到还原型谷胱甘肽的α型晶体，所述媒晶剂选自脂肪族氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸、类似化合物和二肽(下文称作“本发明的生产方法”)。可以优选使用上文提到的那些作为媒晶剂。

为了实现媒晶剂与还原型谷胱甘肽的共存，可以将媒晶剂加入到还原型谷胱甘肽水溶液中，或者可以将还原型谷胱甘肽加入到媒晶剂溶液中。要添加的媒晶剂可能是固体或溶液。当固体媒晶剂被加入时，优选在加入到还原型谷胱甘肽水溶液后被溶解。在通过发酵方法、提取方法或化学合成方法生产还原型谷胱甘肽的过程中，只要还原型谷胱甘肽的生产不受抑制，本发明中的媒晶剂可以共存在任何步骤中。另外，使用含有本发明的媒晶剂的原料时，由该原料生产的还原型谷胱甘肽也可以同时含有本发明的媒晶剂。

在本发明的生产方法中，可以在结晶之前向还原型谷胱甘肽水溶液中添加媒晶剂，也可以在还原型谷胱甘肽的α型晶体析出之后并向β型晶体开始转变之前添加媒晶剂。

对结晶的方法没有特别的限制，通过浓缩还原型谷胱甘肽水溶液从而进行结晶的浓缩结晶法，通过冷却还原型谷胱甘肽水溶液从而进行结晶的冷却结晶法，或通过向还原型谷胱甘肽水溶液中加入不良溶剂从而进行结晶的不良溶剂结晶法，或这些方法的组合。所述不良溶剂的实例包括具有1-6个碳原子的醇以及丙酮、甲基乙基酮和二乙基酮。

将还原型谷胱甘肽水溶液浓缩或冷却以使还原型谷胱甘肽的浓度上升至饱和溶解度以上，或向还原型谷胱甘肽水溶液中添加不良溶剂以使饱和溶解度降低，从而使还原型谷胱甘肽的晶体析出。与没有共存媒晶剂的情况相比，在这种情况下，选自脂肪族氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸，类似化合物和二肽中的至少一种媒晶剂的共存长时间抑制β型晶体的形成和α型晶体向β型晶体的转变。因此，可以高效且稳定地得到α型晶体。

在另一个实施方案中，可以在浓缩、冷却操作或加入还原型谷胱甘肽水溶液的不良溶剂之前或在这些操作期间将还原型谷胱甘肽的α型晶体作为晶种加入。还原型谷胱甘肽的α型晶体可以例如通过在25℃以下从还原型谷胱甘肽水溶液中结晶而得到。

当还原型谷胱甘肽的晶体从还原型谷胱甘肽水溶液中析出时，在不存在媒晶剂的情况下容易发生还原型谷胱甘肽的β型晶体的形成或者α型晶体向β型晶体的转变。在高温时这种现象更为显著。相比之下，与没有媒晶剂的共存相比，在媒晶剂的共存下，可以提高还原型谷胱甘肽转变成β型晶体时的温度。即使在温度相同的情况下，也可以延长在发生还原型谷胱甘肽的α型晶体向β型晶体的转变之前的时间。

在本发明的制造方法的一种实施方式中，通过浓缩还原型谷胱甘肽水溶液，使一部分还原型谷胱甘肽作为α型晶体析出，并且将所得浆料冷却，以使溶解的还原型谷胱甘肽以α型晶体的形式进一步析出。在这种情况下，期望在浓缩所述的还原谷胱甘肽水溶液之前或之后或至少在还原型谷胱甘肽的结晶之前添加媒晶剂。

在本发明的制造方法中，对还原型谷胱甘肽结晶为α型晶体的温度没有特别限制，只要不发生β型晶体的形成或者α型晶体向β型晶体的转变即可。然而，就产率而言，优选较低的温度。由于还原型谷胱甘肽以α型晶体的形式结晶的温度以及β型晶体的形成和/或α型晶体向β型晶体的转变发生/不发生的温度，根据媒晶剂的种类和浓度而变化，所以需要适当地进行确定。优选不超过40℃，更优选不超过25℃，特别优选不超过10℃。

在还原型谷胱甘肽水溶液中共存的媒晶剂的浓度，例如当结晶温度为25℃并且结晶时间不少于24小时的时候，相对于所述还原型谷胱甘肽，优选为不低于0.01重量％，更优选为不低于0.1重量％，特别优选为不低于1.0重量％。理想的是不超过10重量％。然而，所述媒晶剂对β型晶体的形成和向β型晶体的转变的抑制作用可以根据媒晶剂的种类、进行结晶的温度、还原型谷胱甘肽以及与还原谷胱甘肽水溶液中所含的除媒晶剂不同的成分的种类和浓度等而变化。因此，理想的是根据本发明所应用的还原型谷胱甘肽水溶液、所使用的媒晶剂的种类和浓度以及结晶温度，适当地确定待添加的媒晶剂剂的优选量。为了延长在发生β型晶体的形成或α型晶体向β型晶体的转变之前的时间，优选提高所述媒晶剂的浓度。

在如上所述的还原型谷胱甘肽的α型晶体沉淀之后，从母液中分离所述晶体，从而获得还原型谷胱甘肽的α型晶体。通过重结晶、晶体洗涤等可以从α型晶体中除去过量的媒晶剂和杂质。所获得的α型晶体理想地被干燥以防止进一步转变成β型晶体。

尽管所述干燥方法不受限制，例如可以使用减压干燥和通风干燥。干燥温度可以是还原型谷胱甘肽不分解的温度，优选不超过100℃，更优选不超过60℃，特别优选不超过25℃。干燥后的还原型谷胱甘肽的α型晶体可以适当地被包装成最终产品。

具体实施方式

实施例

尽管通过实施例更具体地解释本发明，但是本发明不受其描述的限制。

实施例1

在还原型谷胱甘肽的α型晶体的保存过程中添加媒晶剂对向β型晶体的转变的抑制作用的验证试验

将还原型谷胱甘肽的α型晶体(9g)和水(30mL)在玻璃瓶中混合。向制备的溶液中分别加入各自为0.45g的L-丙氨酸(以下有时缩写为L-Ala)，L-半胱氨酸(以下有时缩写为L-Cys)，L-苯丙氨酸(以下有时缩写为L-Phe)，L-色氨酸(以下有时缩写为L-Trp)，D-脯氨酸(以下有时缩写为D-Pro)，L-丙氨酰-L-半胱氨酸(以下有时缩写为AlaCys)或氧化型谷胱甘肽(GSSG)，并溶解于其中。将玻璃瓶在设定为25℃的盘式干燥器中振荡24小时。24小时后，用显微镜观察浆液中的晶体，并确定是否存在向β型晶体的转变。

结果，在L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、D-脯氨酸、L-丙氨酰-L-丙氨酸和氧化型谷胱甘肽中任一化合物的共存下，发现对α型晶体向β型晶体的转变的抑制作用。

实施例2

在还原型谷胱甘肽的α型晶体的保存过程中添加媒晶剂对向β型晶体的形成的抑制作用的验证试验。

在各自含有5重量％(相对于还原型谷胱甘肽)的L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-丙氨酰-L-半胱氨酸或氧化型谷胱甘肽(GSSG)、或用于比较试验的L-组氨酸盐酸盐(以下有时缩写为L-His)中的水溶液(10mL)中，浸渍还原型谷胱甘肽的α型晶体(5g)，然后将使用膜过滤器进行分离得到的晶体的总量装入瓶内，并将瓶放在恒温槽中，使所述晶体部分的温度为40℃。3小时后，将晶体(各1g)在25℃下溶解于水(10mL)中，测定430nm下的透过率，确认浊度，以确定是否存在向β型晶体的转变。结果如表1所示。在表1中的媒晶剂效果中，○表示抑制β型晶体的形成，x表示形成β型晶体。

表1

加入的物质

L-Ala

L-Cys

L-Phe

L-Trp

AlaCys

GSSG

L-His

无

透过率(％)

100

99

95

87

媒晶剂效果

○

x

如表1所示，通过还原型谷胱甘肽的α型晶体与L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-丙氨酰-L-半胱氨酸或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的共存，抑制了β型晶体的形成。

实施例3

在还原型谷胱甘肽水溶液的保存过程中添加媒晶剂的效果的验证试验。

称量还原型谷胱甘肽(100g)于1L烧杯中，加水至1L。将该混合物在40℃加热以使所述晶体完全溶解，并通过膜过滤器过滤。向制备的还原型谷胱甘肽水溶液(100g/L)中加入各5重量％(相对于还原型谷胱甘肽)的[实施例1]中确认具有媒晶剂效果的化合物或用于比较试验的L-组氨酸盐酸盐，并将各混合物冷却至10℃并搅拌24小时。24小时后，通过孔径为0.45μm的过滤器过滤其上清液，通过HPLC测量所述上清液中还原型谷胱甘肽的浓度，并根据浓度的变化确定是否存在β型晶体的形成。结果如表2所示。在表2中的媒晶剂效果中，○表示抑制β型晶体的形成，x表示形成β型晶体。

表2

加入的物质

L-Ala

L-Cys

L-Phe

L-Trp

D-Pro

AlaCys

GSSG

L-His

无

浓度[g/L]

111.1

111.0

111.1

111.6

111.7

108.2

110.8

41.7

28.9

媒晶剂效果

○

x

分别含有L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、D-脯氨酸、L-丙氨酰-L-半胱氨酸或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的还原型谷胱甘肽水溶液抑制了β型晶体的形成。

实施例4

考虑在还原型谷胱甘肽水溶液的保存过程中抑制β型晶体的形成所必需的媒晶剂的添加量。

称量还原型谷胱甘肽(100g)于1L烧杯中，加水至1L。将混合物在40℃加热以使所述晶体完全溶解，并通过膜过滤器过滤。向所制备的还原型谷胱甘肽水溶液(100g/L)中加入0.01重量％-1重量％(相对于还原型谷胱甘肽)的被确认具有媒晶剂效果的L-丙氨酸，将所述混合物冷却至10℃并搅拌15小时。15小时后，通过孔径为0.45μm的过滤器过滤上清液，通过HPLC测量所述上清液中还原型谷胱甘肽的浓度，并通过观察还原型谷胱甘肽浓度的变化来确定β型晶体的形成的存在与否以及程度。表3中示出了经过时间和由于存在或不存在媒晶剂而引起的还原型谷胱甘肽的浓度变化的结果。

表3

*还原型谷胱甘肽的浓度(g/L)

发现未添加L-丙氨酸的还原型谷胱甘肽水溶液在15小时后含有约20％的还原型谷胱甘肽为β型晶体。另一方面，发现添加L-丙氨酸作为媒晶剂的水溶液显示出抑制了β型晶体的形成。另外发现，添加量较大的L-丙氨酸使β型晶体形成的发生可能性降低。

发现作为共存于还原型谷胱甘肽水溶液中的媒晶剂的L-丙氨酸的添加量相对于还原型谷胱甘肽优选为不少于0.01重量％，更优选为不少于0.1重量％，特别优选为不少于1重量％。

实施例5

还原型谷胱甘肽的α型晶体的生产方法(1)

将还原型谷胱甘肽(50g)和水(500mL)加入到1L烧杯中。向所制备的溶液中加入各自为2.5g的L-丙氨酸、L-半胱氨酸或氧化型谷胱甘肽，并将所述混合物在40℃加热以完全溶解所述晶体并通过膜过滤器过滤。通过蒸发器将制备的溶液(滤液)浓缩，使还原型谷胱甘肽的浓度不低于α型晶体的饱和溶解度，以进行还原型谷胱甘肽的浓缩结晶。将浓缩液冷却至25℃，搅拌24小时，用显微镜观察浆液中的晶体，并确定是否存在向β型晶体的转变。

结果，加入L-丙氨酸、L-半胱氨酸或氧化型谷胱甘肽的结晶仅产生α型晶体，而不形成β型晶体。

实施例6

还原型谷胱甘肽的α型晶体的生产方法(2)

将还原型谷胱甘肽(50g)和水(500mL)加入到1L烧杯中。向所制备的溶液中加入各自为10重量％的L-丙氨酸或L-半胱氨酸，并将所述混合物在40℃加热以完全溶解所述晶体并通过膜过滤器过滤。通过蒸发器将制备的溶液(滤液)浓缩，使还原型谷胱甘肽的浓度不低于α型晶体的饱和溶解度，以进行还原型谷胱甘肽的浓缩结晶。将浓缩液冷却至25℃，搅拌24小时，用显微镜观察浆液中的晶体，并确定是否存在向β型晶体的转变。

结果，加入L-丙氨酸或L-半胱氨酸结晶仅产生α型晶体，而不形成β型晶体。

发现通过添加各自为10重量％的L-丙氨酸或L-半胱氨酸进行结晶获得的晶体均为通过粉末X-射线衍射在衍射角2θ为6.3°，12.6°，13.8°，16.2°，22.3°，25.7°，30.1°，31.9°，32.0°和33.5°处具有峰的谷胱甘肽的α型晶体。

工业适用性

根据本发明，在还原型谷胱甘肽的生产(结晶)和保存过程中特定媒晶剂或保存剂的共存，显著抑制了β型晶体的形成和α型晶体向β型晶体的转变，并可以高效且稳定地生产还原型谷胱甘肽的α型晶体。另外，根据本发明，由于能够稳定地供给品质和生产性均优异的还原型谷胱甘肽的α型晶体，因此可用于医药品、食品、化妆品等广泛领域。

本申请基于在日本提交的专利申请号2015-114855，其内容全部并入本文。

Claims

1.媒晶剂用于抑制还原型谷胱甘肽的β型晶体的形成和/或还原型谷胱甘肽的α型晶体向β型晶体的转变的用途，其中该媒晶剂由选自L-丙氨酸、D-脯氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、氧化型谷胱甘肽和L-丙氨酰-L-半胱氨酸的至少一种化合物组成。

2.还原型谷胱甘肽的α型晶体，其包含媒晶剂，其中该媒晶剂由选自L-丙氨酸、D-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、氧化型谷胱甘肽和L-丙氨酰-L-半胱氨酸的至少一种化合物组成，以及其中所述媒晶剂的含量相对于所述还原型谷胱甘肽的α型晶体为0.01-10重量％。

3.一种生产还原型谷胱甘肽的α型晶体的方法，所述方法包括向含有还原型谷胱甘肽的水溶液添加媒晶剂的步骤，其中该媒晶剂由选自L-丙氨酸、D-脯氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、氧化型谷胱甘肽和L-丙氨酰-L-半胱氨酸的至少一种化合物组成；和将还原型谷胱甘肽结晶为α型晶体的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述媒晶剂的添加量相对于所述还原型谷胱甘肽为0.01-10重量％。

5.一种保存还原型谷胱甘肽水溶液的方法，所述方法包括向还原型谷胱甘肽的水溶液中添加媒晶剂的步骤，其中所述媒晶剂由选自L-丙氨酸、D-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、氧化型谷胱甘肽和L-丙氨酰-L-半胱氨酸的至少一种化合物组成，以及其中所述媒晶剂的添加量相对于所述还原型谷胱甘肽为0.01-10重量％。

6.一种保存还原型谷胱甘肽的α型晶体的方法，所述方法包括向还原型谷胱甘肽的α型晶体添加媒晶剂的步骤，其中该媒晶剂由选自L-丙氨酸、D-脯氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、氧化型谷胱甘肽和L-丙氨酰-L-半胱氨酸的至少一种化合物组成。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述媒晶剂的添加量相对于所述还原型谷胱甘肽为0.01-10重量％。