WO2016195070A1 - 還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法及び当該結晶の保存方法 - Google Patents

還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法及び当該結晶の保存方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2016195070A1
WO2016195070A1 PCT/JP2016/066586 JP2016066586W WO2016195070A1 WO 2016195070 A1 WO2016195070 A1 WO 2016195070A1 JP 2016066586 W JP2016066586 W JP 2016066586W WO 2016195070 A1 WO2016195070 A1 WO 2016195070A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reduced glutathione
crystal
type
crystals
aqueous solution
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/066586
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
茉耶 井口
一成 福本
宏 長野
Original Assignee
協和発酵バイオ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 協和発酵バイオ株式会社 filed Critical 協和発酵バイオ株式会社
Priority to CN201680032873.8A priority Critical patent/CN107636006B/zh
Priority to JP2017522276A priority patent/JP6868556B2/ja
Priority to EP16803501.2A priority patent/EP3305801A4/en
Priority to US15/579,592 priority patent/US10407463B2/en
Publication of WO2016195070A1 publication Critical patent/WO2016195070A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/306—Extraction; Separation; Purification by precipitation by crystallization
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ⁇ -type crystals of reduced glutathione and a method for storing the crystals.
  • Reduced glutathione is a tripeptide composed of three types of amino acids (glutamic acid, cysteine and glycine), and has been used as a raw material for pharmaceuticals and health foods as a material having an antioxidant function and a detoxifying action. In recent years, it is expected to expand to other diverse markets such as beverages and cosmetics.
  • Non-patent Document 1 There are two types of crystal polymorphs, ⁇ -type crystals and ⁇ -type crystals, in reduced glutathione crystals (Non-patent Document 1).
  • the ⁇ -type crystal which is an unstable crystal and the ⁇ -type crystal which is a stable crystal are greatly different in solubility, and the saturated solubility at 10 ° C. is 89 g / L for the ⁇ -type crystal and 30 g / L for the ⁇ -type crystal ( FIG. 1). Therefore, the ⁇ -type crystal having low solubility has a problem that it is difficult to process as a raw material and is difficult to handle. Furthermore, needle-shaped and small ⁇ -type crystals are inferior to ⁇ -type crystals in terms of both quality and productivity because they are poor in separability from mother liquor, whereas ⁇ -type crystals that are columnar crystals that tend to be large.
  • Non-Patent Document 2 a method for controlling the occurrence of crystal polymorphism of organic compounds including amino acids
  • addition of a crystallizing agent may be effective (Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
  • the chemical structure of the compound added as the crystallization agent has extremely high similarity to the chemical structure of the target compound (Non-Patent Document 2)
  • the molecular weight of the crystal clearing agent is subject to severe restrictions such as the molecular weight of the target compound must be the same or slightly smaller (Non-patent Document 3). Because of these restrictions, compounds with low structural similarity and compounds with a molecular weight that is far from the target compound are generally excluded from the target for the search for the crystal modifier.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently and stably producing reduced ⁇ -type crystals of reduced glutathione that are excellent in both quality and productivity and a storage method.
  • the present inventors have studied to solve the above-mentioned problems, and by causing a solution of a reduced glutathione in an aqueous solution and an ⁇ -type crystal to coexist with a crystallization agent, the generation of the ⁇ -type crystal and the transition to the ⁇ -type crystal are remarkable.
  • the generation of ⁇ -type crystal and the transition to the ⁇ -type crystal are remarkable.
  • by performing crystallization of ⁇ -type crystals of reduced glutathione in the presence of a crystallization agent compared to the case where no crystallization agent is added, the generation of ⁇ -type crystals and ⁇
  • the present inventors have found that the transition to a type crystal is remarkably suppressed and that an ⁇ type crystal can be produced efficiently and stably.
  • the present invention is as follows.
  • [1] Generation of ⁇ -form crystals of reduced glutathione and / or ⁇ of reduced glutathione comprising at least one compound selected from the group consisting of aliphatic amino acids, sulfur-containing amino acids, aromatic amino acids, related compounds and dipeptides
  • [2] ⁇ -type crystals of reduced glutathione containing the crystal clearing agent according to [1] above.
  • [3] The crystal according to the above [2], wherein the content of the crystallization agent is 0.01 to 10% by weight with respect to the ⁇ -type crystal of reduced glutathione.
  • An ⁇ -type crystal of reduced glutathione comprising a step of adding the crystallizing agent according to [1] above to an aqueous solution containing reduced glutathione and a step of crystallizing ⁇ -type crystals of reduced glutathione.
  • Production method [5] The method of the above-mentioned [4], wherein the addition amount of the crystallization agent is 0.01 to 10% by weight with respect to reduced glutathione.
  • a method for preserving an aqueous solution of reduced glutathione comprising a step of adding the crystallizing agent according to the above [1] to an aqueous solution of reduced glutathione.
  • a specific crystal clearing agent is allowed to coexist, thereby generating a ⁇ -type crystal and converting the ⁇ -type crystal into a ⁇ -type crystal. Transition to the crystal is remarkably suppressed, and ⁇ -type crystal of reduced glutathione can be produced efficiently and stably.
  • FIG. 1 is a graph showing the solubility curves of ⁇ -type crystals and ⁇ -type crystals of reduced glutathione.
  • the vertical axis represents the solubility of each crystal in water (g / L) at each temperature, and the horizontal axis represents the temperature (° C.). Represents.
  • reduced glutathione means a tripeptide composed of glutamic acid, cysteine and glycine as described above.
  • the reduced glutathione used in the present invention may be obtained by any production method, and examples thereof include those obtained by the method described in JP-B-57-016196. it can.
  • the term “medium crystallizer” generally means an additive added to change the crystal habit of a parent compound or to prevent polymorphic transition.
  • reduced glutathione It means a compound that suppresses the generation of ⁇ -type crystals of reduced glutathione or inhibits the transfer of reduced glutathione from ⁇ -type crystals to ⁇ -type crystals during the production and storage of ⁇ -type crystals.
  • the crystal clearing agent used in the present invention include aliphatic amino acids such as alanine and proline, sulfur-containing amino acids such as cysteine, aromatic amino acids such as phenylalanine and tryptophan, related compounds such as oxidized glutathione, and dipeptides such as alanylcysteine.
  • At least one crystal clearing agent selected from the group consisting of L-cysteine, L-alanine, L-phenylalanine, L-tryptophan and D-proline, oxidized glutathione and L-alanyl-L-cysteine is particularly preferable.
  • the crystallizing agent may be obtained by any production method, and examples thereof include those obtained by a chemical synthesis method, an extraction method, and a fermentation method.
  • aliphatic amino acid means a hydrophobic amino acid that does not contain an aromatic amino acid.
  • examples of the aliphatic amino acid include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline and the like, among which L-alanine and D-proline are preferable.
  • sulfur-containing amino acid means an amino acid having a sulfur atom in its structure.
  • sulfur-containing amino acid include cysteine, homocysteine, methionine and the like, and among them, L-cysteine is preferable.
  • aromatic amino acid means a hydrophobic amino acid having an aromatic ring and an aromatic heterocyclic ring.
  • Aromatic amino acids include phenylalanine, tryptophan, tyrosine, etc. Among them, L-phenylalanine and L-tryptophan are preferable.
  • oxidized glutathione means a molecule in which two molecules of reduced glutathione are linked by a disulfide bond.
  • oxidized glutathione may be abbreviated as “GSSG”.
  • dipeptide means a molecule in which two molecules of amino acids are linked by peptide bonds.
  • examples of the dipeptide include L-alanine-L-glutamine, L-alanyl-L-cysteine, etc. Among them, L-alanyl-L-cysteine is preferable.
  • aqueous solution means a solution containing only water as a solvent or a solution containing water as a main solvent.
  • the aqueous solution may contain, for example, a water-soluble organic solvent such as methanol, ethanol, propanol, and acetone in addition to water as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • reduced glutathione aqueous solution or “aqueous solution containing reduced glutathione” is an aqueous solution containing at least dissolved reduced glutathione, and may be a solution in which reduced glutathione is completely dissolved. In addition to the dissolved reduced glutathione, ⁇ -type crystals of reduced glutathione may be included. (Preservation method of reduced glutathione aqueous solution of the present invention)
  • the present invention relates to an aliphatic amino acid, a sulfur-containing amino acid, an aromatic amino acid, an analog, and the like in order to suppress the generation of ⁇ -type crystals, which are stable crystals in which crystals are easily precipitated in an aqueous solution.
  • a method for preserving a reduced glutathione aqueous solution (hereinafter, referred to as “the aqueous solution preserving method of the present invention”) characterized in that any one or a plurality of compounds of compounds and dipeptides coexist as a crystal clearing agent. is there.
  • the crystallization agent those described above can be suitably used.
  • the reduced glutathione (containing) aqueous solution is at least one liquid crystal selected from the group consisting of aliphatic amino acids, sulfur-containing amino acids, aromatic amino acids, related compounds and dipeptides, as long as the effects of the present invention are not impaired. Solutes other than may be included. Examples of such solutes include salts and buffering agents. Furthermore, the reduced glutathione (containing) aqueous solution may be a supernatant of a fermentation broth containing reduced glutathione, a reaction solution that produces reduced glutathione, or the like. Examples of the salt include sodium chloride and sodium sulfate, and examples of the buffer include sodium acetate and sodium bicarbonate.
  • the crystallizing agent may be added to the reduced glutathione aqueous solution, or the reduced glutathione aqueous solution may be added to the crystallizing agent.
  • a solid crystallizing agent is added, it is preferably dissolved after the addition to the reduced glutathione aqueous solution.
  • the crystal clearing agent of the present invention can coexist in any step as long as the production of reduced glutathione is not prevented.
  • the crystallizing agent of the present invention can be allowed to coexist with reduced glutathione produced from the raw material.
  • the generation of ⁇ -type crystals and / or the transition from ⁇ -type crystals to ⁇ -type crystals are suppressed for a longer time in the presence of a crystal clearing agent than in the case of non-coexistence. Can do.
  • the temperature of the reduced glutathione aqueous solution is not particularly limited as long as the generation of ⁇ -type crystals and / or the transition from ⁇ -type crystals to ⁇ -type crystals does not occur. Is preferable in terms of suppression of metastasis.
  • the temperature of the reduced glutathione aqueous solution in which generation of ⁇ -type crystals and / or transition to ⁇ -type crystals does not occur depends on the type or concentration of the crystallizing agent, but is usually 60 ° C. or less, preferably 40 ° C. or less. More preferably, it is 25 ° C. or less, particularly preferably 10 ° C. or less.
  • the amount of the crystallizing agent added to the reduced glutathione aqueous solution is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.1% by weight or more, and particularly preferably 1% by weight with respect to the reduced glutathione. % Or more. Moreover, it is desirable that it is 10 weight% or less.
  • a suitable addition amount of the crystallizing agent can be determined, for example, as follows.
  • a crystallizing agent is added to the reduced glutathione aqueous solution so as to be about 5% by weight or less, and stirred for a predetermined time.
  • the crystals precipitated during stirring are observed with a microscope to determine whether all the crystals are ⁇ -type crystals, or ⁇ -type crystals are generated or transition to ⁇ -type crystals. Since the ⁇ -type crystal, which is a large columnar crystal, and the ⁇ -type crystal, which is a small needle crystal, are greatly different in shape, they can be easily distinguished by microscopic observation.
  • the crystals obtained by separating a part are dissolved in water at 25 ° C. so as to be 100 g / L. After stirring and holding for a sufficient time, the solution is tested with a cell having a layer length of 1 cm, using water as a control, by the visible absorbance measurement method, and the transmittance at 430 nm is measured to confirm turbidity.
  • ⁇ -type crystals with low solubility are present, undissolved crystals are detected as turbidity, and the transmittance of the solution is lowered.
  • concentration of reduced glutathione in the solution in the crystallization and slurry is lower than that in the solution containing only ⁇ -type crystals, so the reduced form in the mother liquor from which the coexisting crystals have been removed.
  • the type of coexisting crystals can also be determined by measuring the glutathione concentration.
  • the reduced glutathione concentration in the mother liquor is measured using the following HPLC conditions after the coexisting crystals are removed by filtration or the like, diluted to a constant concentration with a mobile phase, and stirred for a sufficient time.
  • HPLC condition column Inertsil ODS-3 ID 3.0 mm, length 150 mm Column temperature: 35 ° C Detector: UV detector, wavelength 210nm
  • Mobile phase composition 1-sodium heptanesulfonate / potassium dihydrogen phosphate / phosphoric acid / methanol
  • each crystallization component contained in the reduced glutathione aqueous solution for example, about 0.25 g of a sample is precisely weighed and dissolved in pure water, and the volume is adjusted to 25 mL and 1 mL is collected. Add dilution buffer and adjust the volume to 10 mL, then centrifuge the fixed volume at 10000 rpm for 5 minutes, introduce the supernatant into amino acid analyzer JLC-500V (manufactured by JEOL Ltd.), and measure according to the instructions You can also ( ⁇ -type crystal of reduced glutathione of the present invention)
  • the present invention is an ⁇ -type crystal of reduced glutathione (hereinafter also referred to as “ ⁇ -type crystal of the present invention”) containing the above-mentioned crystal clearing agent.
  • the ⁇ -type crystal of reduced glutathione means that the diffraction angle 2 ⁇ is 6.3 °, 12.6 °, 13.8 °, 16.2 °, 22.3 °, 25.7 ° in powder X-ray diffraction. It is a crystal having peaks at 30.1 °, 31.9 °, 32.0 ° and 33.5 °.
  • the content of the crystallization agent contained in the ⁇ -type crystal of reduced glutathione is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.1% by weight or more, based on the ⁇ -type crystal of reduced glutathione. It is particularly preferably 1.0% by weight or more. Moreover, it is desirable that it is 10 weight% or less.
  • the ⁇ -type crystal of the present invention contains the above-mentioned crystal clearing agent, so that the transition to ⁇ -type crystal having low solubility and difficult to process as a raw material is suppressed.
  • the amount of the crystallizing agent contained in the ⁇ -type crystal of the present invention was determined by diluting the ⁇ -type crystal of the present invention to a constant concentration with a mobile phase, holding the mixture for a sufficient time, and then using the following HPLC conditions. It can be determined by measuring the concentration.
  • HPLC condition column YMC Triart C18 ID 3.0 mm, length 150 mm Column temperature: 40 ° C Detector: Fluorescence detector Excitation wavelength 360nm / Fluorescence wavelength 440nm
  • Mobile phase composition trisodium citrate dihydrate / anhydrous sodium sulfate / n-propanol / sodium lauryl sulfate
  • each crystallizing agent component contained in the ⁇ -type crystal of the present invention for example, about 0.25 g of a sample is precisely weighed, dissolved in pure water, then adjusted to 25 mL, and 1 mL is collected. Add dilution buffer and adjust the volume to 10 mL, then centrifuge the fixed volume at 10000 rpm for 5 minutes, introduce the supernatant into amino acid analyzer JLC-500V (manufactured by JEOL Ltd.), and measure according to the instructions You can also (Preservation method of ⁇ -form crystal of reduced glutathione of the present invention)
  • the present invention relates to an ⁇ -form crystal of reduced glutathione, from an aliphatic amino acid, a sulfur-containing amino acid, an aromatic amino acid, an analogous compound, and a dipeptide in order to suppress the transition to a ⁇ -form crystal that has low solubility and is difficult to process as a raw material.
  • the method for preserving ⁇ -type crystals of the present invention hereinafter referred to as “the method for preserving ⁇ -type crystals of the present invention”.
  • the crystallization agent those described above can be suitably used.
  • the ⁇ -type crystal of reduced glutathione is one kind selected from the group consisting of reduced glutathione and aliphatic amino acids, sulfur-containing amino acids, aromatic amino acids, related compounds, and dipeptides, as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • a substance other than a plurality of types of crystallization agents may be included. Examples of such substances include salts, organic solvents and related compounds.
  • a crystal modifier is allowed to coexist in the ⁇ -type crystal of the reduced glutathione.
  • the ⁇ -type crystal of reduced glutathione is suspended in the solution of the crystallization agent, and then the crystal is separated. Crystals coexisting with the crystallization agent may be obtained, or crystals containing the crystallization agent may be obtained by spraying a solution containing the crystallization agent on ⁇ -type crystals of reduced glutathione.
  • the generation of ⁇ -type crystals and / or the transition from ⁇ -type crystals to ⁇ -type crystals are suppressed for a longer time in the presence of a crystallization agent than in the case of non-coexistence. can do.
  • the storage temperature of ⁇ -type crystals of reduced glutathione is not particularly limited as long as generation of ⁇ -type crystals and / or transition from ⁇ -type crystals to ⁇ -type crystals does not occur. A lower temperature is preferable in terms of suppression of transition.
  • the storage temperature of the ⁇ -type crystal of reduced glutathione that does not generate and / or transfer to the ⁇ -type crystal varies depending on the type or concentration of the crystal clearing agent. It is below, Preferably it is 40 degrees C or less, More preferably, it is 25 degrees C or less, Most preferably, it is 10 degrees C or less.
  • the addition amount of the crystallizing agent coexisting with the ⁇ -type crystal of reduced glutathione is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.1% by weight or more with respect to the ⁇ -type crystal of reduced glutathione. It is particularly preferably 1.0% by weight or more. Moreover, it is desirable that it is 10 weight% or less.
  • the amount of the crystallization agent coexisting with the ⁇ -form crystal of reduced glutathione is determined by diluting the ⁇ -form crystal of reduced glutathione coexisting with the crystallization agent with a mobile phase to a certain concentration, and stirring for a sufficient time. It can be determined by measuring the concentration using the following HPLC conditions.
  • HPLC condition column YMC Triart C18 ID 3.0 mm, length 150 mm Column temperature: 40 ° C Detector: Fluorescence detector Excitation wavelength 360nm / Fluorescence wavelength 440nm
  • Mobile phase composition trisodium citrate dihydrate / anhydrous sodium sulfate / n-propanol / sodium lauryl sulfate
  • the present invention relates to an ⁇ -form crystal of reduced glutathione from an aqueous solution of reduced glutathione in the presence of at least one medium crystallizing agent selected from the group consisting of aliphatic amino acids, sulfur-containing amino acids, aromatic amino acids, related compounds and dipeptides.
  • at least one medium crystallizing agent selected from the group consisting of aliphatic amino acids, sulfur-containing amino acids, aromatic amino acids, related compounds and dipeptides.
  • the crystallizing agent may be added to the reduced glutathione aqueous solution, or the reduced glutathione may be added to the crystallizing agent solution.
  • the crystallizing agent to be added may be a solid or a solution. When a solid crystallizing agent is added, it is preferably dissolved after the addition to the reduced glutathione aqueous solution.
  • the crystal clearing agent of the present invention can coexist in any step as long as the production of reduced glutathione is not prevented.
  • the crystallizing agent of the present invention can be allowed to coexist with reduced glutathione produced from the raw material.
  • the crystallizing agent may be contained in the reduced glutathione aqueous solution before crystallization, or after the ⁇ -type crystals of the reduced glutathione are precipitated, the transition to the ⁇ -type crystals starts. It may be added before.
  • concentration crystallization is performed by concentrating a reduced glutathione aqueous solution
  • cooling crystallization is performed by cooling the reduced glutathione aqueous solution, or reduced crystallization.
  • It can be performed by a poor solvent crystallization in which crystallization is performed by adding a poor solvent to the glutathione aqueous solution, or a method in which these are combined.
  • the poor solvent include alcohols having 1 to 6 carbon atoms, acetone, methyl ethyl ketone, and diethyl ketone.
  • the crystals of the reduced glutathione Crystallize By concentrating or cooling the reduced glutathione aqueous solution and increasing the reduced glutathione concentration above the saturation solubility, or by adding a poor solvent to the reduced glutathione aqueous solution to reduce the saturation solubility, the crystals of the reduced glutathione Crystallize.
  • at least one crystallizing agent selected from the group consisting of aliphatic amino acids, sulfur-containing amino acids, aromatic amino acids, related compounds and dipeptides compared with the case of non-coexistence, Generation of ⁇ -type crystals over a longer period of time and transition to ⁇ -type crystals after precipitation of ⁇ -type crystals can be suppressed, so that ⁇ -type crystals can be obtained efficiently and stably.
  • ⁇ -type crystals of reduced glutathione may be added as seed crystals prior to or during the concentration of the reduced glutathione aqueous solution, the cooling operation or the addition of the poor solvent, or during these operations.
  • the ⁇ -type crystal of reduced glutathione can be obtained, for example, by crystallization at 25 ° C. or lower from a reduced glutathione aqueous solution.
  • a reduced glutathione aqueous solution is concentrated to precipitate a part of the reduced glutathione as ⁇ -type crystals, and the resulting slurry is cooled to dissolve dissolved reduced glutathione. Is further precipitated as ⁇ -type crystals.
  • a crystal clearing agent before or after concentration of the reduced glutathione aqueous solution, or at least before the crystals of reduced glutathione crystallize.
  • the temperature at which the ⁇ -type crystal of reduced glutathione is crystallized is not particularly limited as long as the generation of the ⁇ -type crystal and / or the transition from the ⁇ -type crystal to the ⁇ -type crystal does not occur.
  • a lower temperature is preferable in terms of yield.
  • the temperature for crystallization of the ⁇ -type crystal of reduced glutathione that does not cause the generation of ⁇ -type crystals and / or the transition from ⁇ -type crystals to ⁇ -type crystals varies depending on the type or concentration of the crystal clearing agent, and is appropriately set. Although it is desirable, it is preferably 40 ° C or lower, more preferably 25 ° C or lower, and particularly preferably 10 ° C or lower.
  • the concentration of the crystallizing agent coexisting in the reduced glutathione aqueous solution is preferably 0.01% by weight with respect to the reduced glutathione when the crystallization temperature is 25 ° C. and the crystallization time is 24 hours or more. % Or more, more preferably 0.1% by weight or more, and particularly preferably 1.0% by weight or more. Moreover, it is desirable that it is 10 weight% or less.
  • the type of crystallization agent the temperature at which crystallization is performed, the type and concentration of components other than the reduced glutathione and the crystallization agent contained in the reduced glutathione aqueous solution, the generation of ⁇ crystals by the crystallization agent and the ⁇ type
  • the inhibitory effect of the transition to crystals can vary.
  • the suitable addition amount of the crystallization agent is appropriately set according to the reduced glutathione aqueous solution to which the present invention is applied, the type and concentration of the crystallization agent used, and the crystallization temperature. In order to extend the time for generating the ⁇ -type crystal or the transition from the ⁇ -type crystal to the ⁇ -type crystal, it is preferable to increase the concentration of the crystallizing agent.
  • the ⁇ -type crystal of reduced glutathione is obtained by separating the crystal from the mother liquor.
  • the ⁇ -type crystal can remove excess crystallization agent and impurities by recrystallization or crystal washing.
  • the obtained ⁇ -type crystal is desirably dried to prevent further transition to the ⁇ -type crystal.
  • the drying temperature only needs to be a temperature at which reduced glutathione does not decompose, and is preferably 100 ° C. or lower, more preferably 60 ° C. or lower, and particularly preferably 25 ° C. or lower.
  • the dried ⁇ -form crystals of reduced glutathione can be appropriately packaged to obtain a final product.
  • L-alanine hereinafter sometimes abbreviated as L-Ala
  • L-cysteine hereinafter also abbreviated as L-Cys
  • L-phenylalanine hereinafter abbreviated as L-Phe
  • L-tryptophan hereinafter also abbreviated as L-Trp
  • D-proline hereinafter also abbreviated as D-Pro
  • AlaCys L-alanyl-L-cysteine
  • L-His L-histidine hydrochloride
  • the amount of the crystallizing agent added to the aqueous solution of reduced glutathione is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.1% by weight or more, based on the reduced glutathione. Particularly preferably, it was found to be 1% by weight or more.
  • Reduced glutathione (50 g) and water (500 mL) were added to a 1 L beaker.
  • 2.5 g each of L-alanine, L-cysteine or oxidized glutathione was added to the prepared solution, heated at 40 ° C. to completely dissolve the crystals, and filtered using a membrane filter.
  • the reduced glutathione concentration in the prepared solution (filtrate) was concentrated by an evaporator so that the saturated solubility of ⁇ -type crystals was equal to or higher than that of the ⁇ -type crystals, and concentrated crystallization of reduced glutathione was performed.
  • the concentrated solution was cooled to 25 ° C. and stirred for 24 hours, and then the crystals in the slurry were observed with a microscope to determine the presence or absence of transition to ⁇ -type crystals.
  • Reduced glutathione (50 g) and water (500 mL) were added to a 1 L beaker. 10% by weight of L-alanine or L-cysteine was added to the prepared solution, respectively, with respect to reduced glutathione, heated at 40 ° C. to completely dissolve the crystals, and filtered using a membrane filter.
  • the reduced glutathione concentration in the prepared solution (filtrate) was concentrated by an evaporator so that the saturated solubility of ⁇ -type crystals was equal to or higher than that of the ⁇ -type crystals, and concentrated crystallization of reduced glutathione was performed.
  • the concentrate was cooled to 25 ° C. and stirred for 24 hours, and then the presence or absence of transition to ⁇ -type crystals was determined by observing the crystals in the slurry under a microscope.
  • ⁇ -type crystal of reduced glutathione when a reduced glutathione ⁇ -type crystal is produced (crystallized) and stored, a specific crystal clearing agent or preservative is allowed to coexist, thereby generating ⁇ -type crystals and ⁇ -type crystals.
  • the ⁇ -type crystal of reduced glutathione can be produced efficiently and stably.
  • ⁇ -type crystals of reduced glutathione that are excellent in both quality and productivity can be stably supplied, and thus are useful in various fields such as pharmaceuticals, foods, and cosmetics.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

品質及び生産性の両面において優れた還元型グルタチオンのα型結晶を効率的かつ安定的に製造する方法及び保存方法を提供する。　本発明は、還元型グルタチオンの水溶液又はα型結晶の製造方法及び保存方法に関する。本発明によれば、還元型グルタチオンの水溶液又はα型結晶の製造及び保存の際に、脂肪族アミノ酸、含硫アミノ酸、芳香族アミノ酸、類縁化合物及びジペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の化合物を媒晶剤として共存させることにより、還元型グルタチオンのβ型結晶の発生及び／又はβ型結晶への転移が抑制され、安定的に還元型グルタチオンのα型結晶を取得することができる。

Description

還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法及び当該結晶の保存方法
　本発明は、還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法及び当該結晶の保存方法に関する。
　還元型グルタチオンは、３種類のアミノ酸（グルタミン酸、システイン及びグリシン）から構成されるトリペプチドであり、抗酸化機能、解毒作用を有する素材として医薬品或いは健康食品の原料として利用されてきた。近年では他にも、飲料、化粧品など多岐にわたる市場への展開が期待されている。
　還元型グルタチオンの結晶には、α型結晶とβ型結晶という２種類の結晶多形が存在する（非特許文献１）。不安定晶であるα型結晶と安定晶であるβ型結晶は、溶解度が大きく異なっており、１０℃における飽和溶解度は、α型結晶が８９ｇ／Ｌ、β型結晶が３０ｇ／Ｌである（図１）。そのため、溶解度の低いβ型結晶は、原料として加工しにくく、取り扱いにくいという問題があった。更に、柱状晶で大型化しやすいα型結晶に対して、針状で小型のβ型結晶は、母液との分離性が悪いため、品質及び生産性の両面でα型結晶に劣っている。
　また、還元型グルタチオンのα型結晶の飽和溶液にα型結晶を添加して調製した結晶スラリー及び還元型グルタチオンの過飽和溶液中では、安定晶であるβ型結晶が容易に発生するため、望ましい結晶形であるα型結晶の効率的な製造を大きく妨げていた。このような状況においては、還元型グルタチオンの過飽和溶液において、β型結晶の発生を抑制し、α型結晶を選択的に結晶化させる方法の開発が強く望まれていた。
　一方、アミノ酸をはじめとする有機化合物の結晶多形の発生を制御する方法として、媒晶剤の添加が有効な場合がある（特許文献１、非特許文献２）。しかし、媒晶剤が有効に機能するためには、媒晶剤として添加する化合物の化学構造が、目的とする化合物の化学構造と極めて高い類似性を有すること（非特許文献２）、更には、媒晶剤の分子量は目的とする化合物の分子量と同じかやや小さい必要があること（非特許文献３）など、厳しい制約を受ける。これらの制約があることから、構造類似性の低い化合物や、分子量が目的化合物からかけ離れた化合物については、媒晶剤探索の対象から除外されるのが一般的である。
　還元型グルタチオンのような２個以上のアミノ酸からなるペプチドについて、媒晶剤を添加することにより結晶多形の発生を制御した例は、これまで知られていない。
特開2010-59125号公報
Yamasaki, K. et al., 分析化学, 18(7), p874-878 (1969) Kuroda, K. et al., Yakugaku Zasshi, 99, p745-751 (1979) Momonaga,M. et al., 化学工学論文集, 18（5）p553-561 (1992)
　本発明の課題は、品質及び生産性の両面において優れた還元型グルタチオンのα型結晶を効率的かつ安定的に製造する方法及び保存方法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために検討を行い、還元型グルタチオンの水溶液及びα型結晶に媒晶剤を共存させることにより、β型結晶の発生及びβ型結晶への転移が顕著に阻害されること、また、還元型グルタチオンのα型結晶の晶析を媒晶剤共存下で行うことにより、媒晶剤を添加していない場合と比較して、β型結晶の発生及びβ型結晶への転移が顕著に抑制され、α型結晶を効率良く、かつ安定的に製造できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］脂肪族アミノ酸、含硫アミノ酸、芳香族アミノ酸、類縁化合物及びジペプチドからなる群より選択される少なくとも１つの化合物からなる、還元型グルタチオンのβ型結晶の発生及び／又は還元型グルタチオンのα型結晶からβ型結晶への転移を抑制するための媒晶剤。
［２］上記［１］記載の媒晶剤を含有する、還元型グルタチオンのα型結晶。
［３］媒晶剤の含有量が、還元型グルタチオンのα型結晶に対して０．０１～１０重量％である、上記［２］記載の結晶。
［４］還元型グルタチオンを含有する水溶液に、上記［１］記載の媒晶剤を添加する工程、及び還元型グルタチオンのα型結晶を晶析させる工程を含む、還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法。
［５］媒晶剤の添加量が、還元型グルタチオンに対して０．０１～１０重量％である、上記［４］記載の方法。
［６］還元型グルタチオンの水溶液に、上記［１］記載の媒晶剤を添加する工程を含む、還元型グルタチオンの水溶液の保存方法。
［７］媒晶剤の添加量が、還元型グルタチオンに対して０．０１～１０重量％である、上記［６］記載の方法。
［８］還元型グルタチオンのα型結晶に、上記［１］記載の媒晶剤を添加する工程を含む、還元型グルタチオンのα型結晶の保存方法。
［９］媒晶剤の添加量が、還元型グルタチオンに対して０．０１～１０重量％である、上記［８］記載の方法。
　本発明によれば、還元型グルタチオンのα型結晶の製造（晶析）や保存の際に、特定の媒晶剤を共存させておくことにより、β型結晶の発生及びα型結晶からβ型結晶への転移が顕著に抑えられ、還元型グルタチオンのα型結晶を効率良く、安定的に製造することができる。
図1は、還元型グルタチオンのα型結晶とβ型結晶の溶解度曲線を示す図であり、縦軸は各温度における各結晶の水への溶解度（ｇ／Ｌ）、横軸は温度（℃）を表す。
　以下、本発明について詳細に説明する。
（定義）
　本明細書中、「還元型グルタチオン」とは、前記した通り、グルタミン酸、システイン及びグリシンから構成されるトリペプチドを意味する。本発明に用いる還元型グルタチオンとしては、どのような製造法によって得られたものであってもよいが、例えば、特公昭５７－０１６１９６号公報等に記載の方法により得られたものを挙げることができる。
　「媒晶剤」とは、一般に、母化合物の晶癖を変化させたり、多形の転移を阻止するために添加される添加剤を意味するが、本発明においては、特に、還元型グルタチオンのα型結晶の製造及び保存の際に、還元型グルタチオンのβ型結晶の発生を抑制したり、還元型グルタチオンのα型結晶からβ型結晶への転移を阻害する化合物を意味する。本発明に用いる媒晶剤としては、アラニン、プロリン等の脂肪族アミノ酸、システイン等の含硫アミノ酸、フェニルアラニン、トリプトファン等の芳香族アミノ酸、酸化型グルタチオン等の類縁化合物、アラニルシステイン等のジペプチド等が挙げられる。中でも、Ｌ－システイン、Ｌ－アラニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン及びＤ－プロリン、酸化型グルタチオン及びＬ－アラニル－Ｌ－システインからなる群より選択される少なくとも１つの媒晶剤が特に好ましい。媒晶剤は、どのような製造方法によって得られたものであってもよいが、例えば、化学合成法、抽出法及び発酵法により得られたものを挙げることができる。
　本明細書中、「脂肪族アミノ酸」とは、疎水性アミノ酸のうち、芳香族アミノ酸を含まないものを意味する。脂肪族アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン等が挙げられるが、中でも、Ｌ－アラニン及びＤ－プロリンが好ましい。
　本明細書中、「含硫アミノ酸」とは、その構造中に硫黄原子を有するアミノ酸を意味する。含硫アミノ酸としては、システイン、ホモシステイン、メチオニン等が挙げられるが、中でも、Ｌ－システインが好ましい。
　本明細書中、「芳香族アミノ酸」とは、芳香環及び芳香族複素環を有する疎水性アミノ酸を意味する。芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン等が挙げられるが、中でも、Ｌ－フェニルアラニン及びＬ－トリプトファンが好ましい。
　本明細書中、「類縁化合物」とは、還元型グルタチオンと受容体結合特性などの分子生物学的な性質や構造が類似しているが、還元型グルタチオンを構成する原子又は原子団が別の原子又は原子団と置換された組成を持つ別の化合物を意味する。類縁化合物としては、酸化型グルタチオン、Ｎ－Ｌ－システイニルグリシン、γグルタミルシステイン等が挙げられるが、中でも、酸化型グルタチオンが好ましい。
　本明細書中、「酸化型グルタチオン」とは、２分子の還元型グルタチオンがジスルフィド結合によって連結した分子を意味する。以下、酸化型グルタチオンを「ＧＳＳＧ」と略記することもある。
　本明細書中、「ジペプチド」とは、２分子のアミノ酸がペプチド結合によって連結した分子を意味する。ジペプチドとしては、Ｌ－アラニン－Ｌ－グルタミン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン等が挙げられるが、中でも、Ｌ－アラニル－Ｌ－システインが好ましい。
　本明細書中、「水溶液」とは、水のみを溶媒とする溶液、又は水を主溶媒とする溶液を意味する。水溶液は、本発明の効果を害さない限り、水以外に、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン等の水溶性有機溶媒を含んでいてもよい。
　本明細書中、「還元型グルタチオン水溶液」又は「還元型グルタチオンを含有する水溶液」とは、少なくとも溶解した還元型グルタチオンを含む水溶液であり、還元型グルタチオンが完全に溶解した溶液であってもよく、溶解した還元型グルタチオンに加え、還元型グルタチオンのα型結晶を含んでいてもよい。
（本発明の還元型グルタチオン水溶液の保存方法）
　本発明は、還元型グルタチオン水溶液において、溶解度が低く水溶液中で結晶が容易に析出する安定晶であるβ型結晶の発生を抑制するために、脂肪族アミノ酸、含硫アミノ酸、芳香族アミノ酸、類縁化合物及びジペプチドのいずれか１種、又は複数種の化合物を媒晶剤として共存させることを特徴とする、還元型グルタチオン水溶液の保存方法（以下、「本発明の水溶液の保存方法」という。）である。媒晶剤としては、前記したものを好適に用いることができる。
　還元型グルタチオン（を含有する）水溶液は、本発明の効果を害さない限り、脂肪族アミノ酸、含硫アミノ酸、芳香族アミノ酸、類縁化合物及びジペプチドからなる群より選択される少なくともの１つの媒晶剤以外の溶質を含んでいてもよい。そのような溶質としては、例えば、塩及び緩衝剤を挙げることができる。更に、還元型グルタチオン（を含有する）水溶液は、還元型グルタチオンを含む発酵液の上清、還元型グルタチオンを生成する反応液等であってもよい。前記塩としては、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられ、前記緩衝剤としては、例えば、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。媒晶剤を共存させる方法に特に制限はなく、還元型グルタチオン水溶液に媒晶剤を添加してもよく、又は媒晶剤に還元型グルタチオン水溶液を添加してもよい。固体の媒晶剤を添加する場合は、還元型グルタチオン水溶液に添加後に溶解させることが好ましい。また、発酵法、抽出法又は化学合成法によって還元型グルタチオンを生成させる過程において、還元型グルタチオンの生成を妨げない限りは、いずれの工程においても本発明の媒晶剤を共存させることができる。更に、本発明の媒晶剤を含む原材料を用いることにより、当該原材料から製造された還元型グルタチオンに本発明の媒晶剤を共存させることもできる。
　本発明の水溶液の保存方法において、媒晶剤共存下では、非共存下に比べて、より長時間にわたってβ型結晶の発生、及び／又はα型結晶からβ型結晶への転移を抑制することができる。
　本発明の水溶液の保存方法において、還元型グルタチオン水溶液の温度は、β型結晶の発生及び／又はα型結晶からβ型結晶への転移が起らない限り、特に制限されないが、より低温の方が転移の抑制の点で好ましい。β型結晶の発生及び／又はβ型結晶への転移が起らない還元型グルタチオン水溶液の温度は、媒晶剤の種類又は濃度によっても異なるが、通常６０℃以下であり、好ましくは４０℃以下であり、より好ましくは２５℃以下、特に好ましくは１０℃以下である。
　還元型グルタチオン水溶液に共存させる媒晶剤の添加量は、還元型グルタチオンに対して、好ましくは０．０１重量％以上であり、より好ましくは０．１重量％以上であり、特に好ましくは１重量％以上である。また、１０重量％以下であることが望ましい。
　媒晶剤を添加することにより、還元型グルタチオン水溶液中の還元型グルタチオン濃度がβ型結晶の１０℃における飽和溶解度である３０ｇ／Ｌ以上であってもβ型結晶の発生が抑制され、澄明な水溶液の状態を維持することができる。また、還元型グルタチオン水溶液がα型結晶を含む場合は、系中の還元型グルタチオン濃度が３０ｇ／Ｌ以上であっても、β型結晶の発生及びβ型結晶への転移を防止することができる。
　好適な媒晶剤の添加量は、例えば、以下のようにして決定することができる。還元型グルタチオン水溶液に対し、媒晶剤を５重量％以下程度になるように添加し、一定時間攪拌する。攪拌中に析出した結晶を顕微鏡で観察して、結晶がすべてα型結晶か、或いはβ型結晶の発生又はβ型結晶への転移が起きているかを判断する。大型柱状晶であるα型結晶と、小型針状晶のβ型結晶では形状が大きく異なっていることから、両者は顕微鏡観察によって容易に区別することができる。β型結晶の混入状況を定量的に把握するためには、一部を分離して得られた結晶を２５℃の水で１００ｇ／Ｌになるように溶解させる。十分な時間、攪拌保持した後、溶解液を層長１ｃｍのセルを用いて、水を対照として可視吸光度測定法により試験を行い、４３０ｎｍにおける透過率を測定し濁りを確認する。透過率は、透過率（Ｔ％）４３０ｎｍ＝１００×１０－Ａ（Ａ＝Ａｂｓ：４３０ｎｍ、１ｃｍ）で表すことができる。溶解度の低いβ型結晶が存在すると、溶け残った結晶が濁りとして検出されるため、該溶解液の透過率が低下する。また、β型結晶が発生することにより晶析やスラリー中の溶液の還元型グルタチオン濃度が、α型結晶のみを含む溶液のそれよりも低下するため、共存する結晶を除去した母液中の還元型グルタチオン濃度を測定することによっても、共存する結晶の種類を判別することができる。母液中の還元型グルタチオン濃度は、共存する結晶を濾過などで除去したのち、一定の濃度に移動相で希釈し、十分な時間、攪拌保持した後、以下のＨＰＬＣ条件を用いて測定する。
　ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３　内径３．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ
カラム温度：３５℃
検出器：ＵＶ検出器　波長２１０ｎｍ
移動相組成：１－ヘプタンスルホン酸ナトリウム／リン酸二水素カリウム／リン酸／メタノール
　還元型グルタチオン水溶液に含まれる各媒晶剤成分の種類と含有量は、例えば、試料を約０．２５ｇ精秤し、純水に溶解後、２５ｍＬに定容し１ｍＬを採取する。希釈緩衝液を加え、１０ｍＬに定容した後、定容液を１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上澄み液をアミノ酸アナライザー ＪＬＣ－５００Ｖ（日本電子社製）に導入し、説明書の記載に従い、測定することもできる。
（本発明の還元型グルタチオンのα型結晶）
　本発明は、前記した媒晶剤を含有する、還元型グルタチオンのα型結晶（以下、「本発明のα型結晶」ともいう。）である。
　還元型グルタチオンのα型結晶とは、粉末Ｘ線回折において、回折角２θが、６．３°、１２．６°、１３．８°、１６．２°、２２．３°、２５．７°、３０．１°、３１．９°、３２．０°及び３３．５°にピークを有する結晶である。
　還元型グルタチオンのα型結晶に含まれる媒晶剤の含有量は、還元型グルタチオンのα型結晶に対して、好ましくは０．０１重量％以上であり、より好ましくは０．１重量％以上であり、特に好ましくは１．０重量％以上である。また、１０重量％以下であることが望ましい。
　本発明のα型結晶は、前記した媒晶剤を含有することにより、溶解度が低く原料として加工しにくいβ型結晶への転移が抑制される。
　本発明のα型結晶に含有される媒晶剤の量は、本発明のα型結晶を一定の濃度に移動相で希釈し、十分な時間、攪拌保持した後、以下のＨＰＬＣ条件を用いて濃度を測定することにより決定することができる。
　ＨＰＬＣ条件
カラム：ＹＭＣ　Ｔｒｉａｒｔ　Ｃ１８　内径３．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
検出器：蛍光検出器　励起波長３６０ｎｍ／蛍光波長４４０ｎｍ
移動相組成：クエン酸三ナトリウム二水和物／無水硫酸ナトリウム／ｎ－プロパノール／ラウリル硫酸ナトリウム
　本発明のα型結晶に含まれる各媒晶剤成分の種類と含有量は、例えば、試料を約０．２５ｇ精秤し、純水に溶解後、２５ｍＬに定容し１ｍＬを採取する。希釈緩衝液を加え、１０ｍＬに定容した後、定容液を１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上澄み液をアミノ酸アナライザー ＪＬＣ－５００Ｖ（日本電子社製）に導入し、説明書の記載に従い、測定することもできる。
（本発明の還元型グルタチオンのα型結晶の保存方法）
　本発明は、還元型グルタチオンのα型結晶において、溶解度が低く原料として加工しにくいβ型結晶への転移を抑制するために、脂肪族アミノ酸、含硫アミノ酸、芳香族アミノ酸、類縁化合物及びジペプチドからなる群より選択される１種又は複数種を媒晶剤として共存させることを特徴とする、還元型グルタチオンのα型結晶の保存方法（以下、「本発明のα型結晶の保存方法」という。）である。媒晶剤としては、前記したものを好適に用いることができる。
　また、還元型グルタチオンのα型結晶は、本発明の効果を害さない限り、還元型グルタチオン、並びに脂肪族アミノ酸、含硫アミノ酸、芳香族アミノ酸、類縁化合物及びジペプチドからなる群より選択される１種又は複数種の媒晶剤以外の物質を含んでいてもよい。そのような物質としては、例えば、塩、有機溶媒及び類縁化合物を挙げることができる。
　本発明のα型結晶の保存方法において、還元型グルタチオンのα型結晶からβ型結晶への転移を抑制するために、還元型グルタチオンのα型結晶に媒晶剤を共存させる。還元型グルタチオンのα型結晶に媒晶剤を共存させる方法に制限はないが、還元型グルタチオンのα型結晶を、媒晶剤の溶解液に懸濁した後に該結晶を分離して、媒晶剤を共存させた結晶を得てもよく、還元型グルタチオンのα型結晶に媒晶剤を含む溶液を噴霧することにより、媒晶剤を共存させた結晶を得てもよい。
　本発明のα型結晶の保存方法において、媒晶剤共存下では、非共存下に比べて、より長時間にわたってβ型結晶の発生、及び／又はα型結晶からβ型結晶への転移を抑制することができる。
　本発明のα型結晶の保存方法において、還元型グルタチオンのα型結晶の保存温度は、β型結晶の発生及び／又はα型結晶からβ型結晶への転移が起らない限り特に制限されないが、より低温の方が転移の抑制の点で好ましい。β型結晶の発生及び／又はβ型結晶への転移が起らない還元型グルタチオンのα型結晶の保存温度は、媒晶剤の種類又は濃度によっても異なるが、具体的には、通常６０℃以下であり、好ましくは４０℃以下であり、より好ましくは２５℃以下、特に好ましくは１０℃以下である。
　還元型グルタチオンのα型結晶に共存させる媒晶剤の添加量は、還元型グルタチオンのα型結晶に対して、好ましくは０．０１重量％以上であり、より好ましくは０．１重量％以上であり、特に好ましくは１．０重量％以上である。また、１０重量％以下であることが望ましい。
　還元型グルタチオンのα型結晶に共存する媒晶剤の量は、媒晶剤を共存させた還元型グルタチオンのα型結晶を一定の濃度に移動相で希釈し、十分な時間、攪拌保持した後、以下のＨＰＬＣ条件を用いて濃度を測定することにより決定することができる。
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＹＭＣ　Ｔｒｉａｒｔ　Ｃ１８　内径３．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
検出器：蛍光検出器　励起波長３６０ｎｍ／蛍光波長４４０ｎｍ
移動相組成：クエン酸三ナトリウム二水和物／無水硫酸ナトリウム／ｎ－プロパノール／ラウリル硫酸ナトリウム
　還元型グルタチオンのα型結晶に含まれる各媒晶剤成分の種類と含有量は、例えば、試料を約０．２５ｇ精秤し、純水に溶解後、２５ｍＬに定容し１ｍＬを採取する。希釈緩衝液を加え、１０ｍＬに定容した後、定容液を１００００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上澄み液をアミノ酸アナライザー ＪＬＣ－５００Ｖ（日本電子社製）に導入し、説明書の記載に従い、測定することもできる。
（本発明の還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法）
　本発明は、脂肪族アミノ酸、含硫アミノ酸、芳香族アミノ酸、類縁化合物及びジペプチドからなる群より選択される少なくともの１つの媒晶剤共存下で、還元型グルタチオン水溶液から還元型グルタチオンのα型結晶を晶析させ、還元型グルタチオンのα型結晶を取得することを特徴とする、還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法（以下、「本発明の製造方法」という。）である。媒晶剤としては、前記したものを好適に用いることができる。
　還元型グルタチオンに媒晶剤を共存させるには、還元型グルタチオン水溶液に媒晶剤を添加してもよく、媒晶剤溶液に還元型グルタチオンを添加してもよい。添加する媒晶剤は、固体であってもよく、溶液であってもよい。固体の媒晶剤を添加する場合は、還元型グルタチオン水溶液に添加後に溶解させることが好ましい。更に、発酵法、抽出法又は化学合成法によって還元型グルタチオンを生成させる過程において、還元型グルタチオンの生成を妨げない限りは、いずれの工程でも本発明の媒晶剤を共存させることができる。また、本発明の媒晶剤を含む原材料を用いることにより、当該原材料から製造された還元型グルタチオンに本発明の媒晶剤を共存させることもできる。
　本発明の製造方法において、媒晶剤は、晶析を行う前に還元型グルタチオン水溶液に含有させてもよく、又は還元型グルタチオンのα型結晶が析出した後、β型結晶への転移が始まる前に添加してもよい。
　晶析の方法については、特に制限はないが、還元型グルタチオン水溶液を濃縮することにより晶析を行う濃縮晶析、還元型グルタチオン水溶液を冷却することにより晶析を行う冷却晶析、又は還元型グルタチオン水溶液に貧溶媒を添加することにより晶析を行う貧溶媒晶析、或いはこれらを組み合わせる方法によって行うことができる。貧溶媒としては、炭素数１～６のアルコール、並びにアセトン、メチルエチルケトン及びジエチルケトンを挙げることができる。
　還元型グルタチオン水溶液を濃縮又は冷却し、還元型グルタチオン濃度を飽和溶解度以上に高めることによって、或いは、還元型グルタチオン水溶液に貧溶媒を添加して飽和溶解度を低下させることによって、還元型グルタチオンの結晶が起晶する。その際に、脂肪族アミノ酸、含硫アミノ酸、芳香族アミノ酸、類縁化合物及びジペプチドからなる群より選択される少なくともの１つの媒晶剤を共存させることによって、非共存下の場合と比較して、より長い時間にわたってβ型結晶の発生、及びα型結晶が析出した後のβ型結晶への転移を抑制することができるため、効率的かつ安定的にα型結晶の結晶を得ることができる。
　また、別の態様として、還元型グルタチオン水溶液の濃縮、冷却操作又は貧溶媒添加に先立って、又はこれらの操作中に、還元型グルタチオンのα型結晶を種晶として添加してもよい。還元型グルタチオンのα型結晶は、例えば、還元型グルタチオン水溶液から２５℃以下で晶析を行うことによって、取得することができる。
　還元型グルタチオン水溶液から還元型グルタチオンの結晶を晶析させる際、媒晶剤非共存下では、還元型グルタチオンのβ型結晶の発生、又はα型結晶からβ型結晶への転移が容易に起こる。この現象は、温度が高くなるとより顕著である。それに対し、媒晶剤共存下では非共存下に比べて、還元型グルタチオンのβ型結晶への転移が起こる温度をより高くすることができる。また、同じ温度であっても、還元型グルタチオンのα型結晶からβ型結晶への転移が起こるまでの時間を延長することができる。
　本発明の製造方法の一形態においては、還元型グルタチオン水溶液を濃縮して還元型グルタチオンの一部をα型結晶として析出させ、得られたスラリーを冷却することにより、溶存している還元型グルタチオンをα型結晶として更に析出させる。その際、還元型グルタチオン水溶液の濃縮の前又は後、或いは少なくとも還元型グルタチオンの結晶が起晶する前に媒晶剤を添加するのが望ましい。
　本発明の製造方法において、還元型グルタチオンのα型結晶の晶析を行う温度は、β型結晶の発生及び／又はα型結晶からβ型結晶への転移が起こらない限り特に制限されないが、より低温で行う方が収率の点で好ましい。β型結晶の発生及び／又はα型結晶からβ型結晶への転移が起こらない還元型グルタチオンのα型結晶の晶析を行う温度は、媒晶剤の種類又は濃度によっても異なるため適宜設定することが望ましいが、好ましくは４０℃以下であり、より好ましくは２５℃以下であり、特に好ましくは１０℃以下である。
　還元型グルタチオン水溶液に共存させる媒晶剤の濃度としては、例えば、晶析温度が２５℃であり、かつ晶析時間が２４時間以上の場合は、還元型グルタチオンに対して好ましくは０．０１重量％以上であり、より好ましくは０．１重量％以上であり、特に好ましくは１．０重量％以上である。また、１０重量％以下であることが望ましい。しかし、媒晶剤の種類、晶析を行う温度、還元型グルタチオン水溶液に含まれる還元型グルタチオン及び媒晶剤以外の成分の種類や濃度等によって、媒晶剤によるβ型結晶の発生及びβ型結晶への転移の阻害効果は変化し得る。従って、好適な媒晶剤の添加量は、本発明が適用される還元型グルタチオン水溶液、使用する媒晶剤の種類及びその濃度、並びに晶析温度に応じて、適宜設定することが望ましい。β型結晶の発生、又はα型結晶からβ型結晶への転移が起きる時間を延長するためには、媒晶剤の濃度を上げることが好ましい。
　上記のようにして還元型グルタチオンのα型結晶を析出させた後、結晶を母液から分離することにより、還元型グルタチオンのα型結晶が得られる。α型結晶は、再結晶又は結晶洗浄等により、過剰な媒晶剤や不純物を除去することができる。得られたα型結晶は、β型結晶へのさらなる転移を防ぐために乾燥させることが望ましい。
　乾燥の方法に制限はないが、例えば、減圧乾燥や通風乾燥を用いることができる。乾燥温度は、還元型グルタチオンが分解しない温度であればよく、好ましくは１００℃以下であり、より好ましくは６０℃以下であり、特に好ましくは２５℃以下である。乾燥させた還元型グルタチオンのα型結晶は、適宜包装して最終製品とすることができる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの記載に限定されるものではない。
〔実施例１〕
還元型グルタチオンのα型結晶の保存時における媒晶剤の添加によるβ型結晶への転移抑制効果の確認試験
　還元型グルタチオンのα型結晶（９ｇ）と水（３０ｍＬ）をガラス瓶中で混合した。その調製液にＬ－アラニン（以下、Ｌ－Ａｌａと略記することもある）、Ｌ－システイン（以下、Ｌ－Ｃｙｓと略記することもある）、Ｌ－フェニルアラニン（以下、Ｌ－Ｐｈｅと略記することもある）、Ｌ－トリプトファン（以下、Ｌ－Ｔｒｐと略記することもある）、Ｄ－プロリン（以下、Ｄ－Ｐｒｏと略記することもある）、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン（以下、ＡｌａＣｙｓと略記することもある）又は酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を各０．４５ｇずつ添加して溶解させた。ガラス瓶を２５℃に設定した箱型乾燥機内で２４時間振盪させた。２４時間後、スラリー中の結晶を顕微鏡観察して、β型結晶への転移の有無を判断した。
　その結果、Ｌ－アラニン、Ｌ－システイン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｄ－プロリン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン及び酸化型グルタチオンのいずれの化合物の共存下においても、α型結晶からβ型結晶への転移の抑制が認められた。
〔実施例２〕
還元型グルタチオンのα型結晶の保存時における媒晶剤の添加によるβ型結晶の発生抑制効果の確認試験
　Ｌ－アラニン、Ｌ－システイン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン又は酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）と、比較試験のためにＬ－ヒスチジン塩酸塩（以下、Ｌ－Ｈｉｓと略記することもある）を各５重量％（対還元型グルタチオン）含有する水溶液（１０ｍＬ）に還元型グルタチオンのα型結晶５ｇを浸漬させた後、メンブレンフィルターにて分離した時に得られた結晶全量を瓶に詰め、結晶部分が４０℃となるように恒温槽にて静置保存した。３時間後の結晶各１ｇを２５℃の水１０ｍＬで溶解し、４３０ｎｍにおける透過率を測定し、濁りを確認して、β型結晶への転移の有無を判断した。結果を表１に示した。表１中の媒晶効果において、○はβ型結晶の発生が抑制されたことを示し、×はβ型結晶が発生したことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示されるように、還元型グルタチオンのα型結晶をＬ－アラニン、Ｌ－システイン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン又は酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）と共存させることにより、β型結晶発生の抑制が認められた。
〔実施例３〕
還元型グルタチオン水溶液の保存時における媒晶剤の添加効果の確認試験
　還元型グルタチオン（１００ｇ）を１Ｌビーカーに計りとり、水を加え、１Ｌになるまでメスアップした。４０℃で加温して結晶を完全に溶解し、メンブレンフィルターを用いてろ過をした。調製した還元型グルタチオン水溶液（１００ｇ／Ｌ）に〔実施例１〕で媒晶効果が確認された化合物と、比較試験のためＬ－ヒスチジン塩酸塩を各５重量％（対還元型グルタチオン）ずつ添加し、１０℃に冷却後、２４時間攪拌した。２４時間後に上清をポアサイズ０．４５μｍのフィルターにてろ過し、上清中の還元型グルタチオンの濃度をＨＰＬＣにて測定し、当該濃度の変化に基づいて、β型結晶の発生の有無を判断した。結果を表２に示した。表２中の媒晶効果において、○はβ型結晶の発生が抑制されたことを示し、×はβ型結晶が発生したことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　Ｌ－アラニン、Ｌ－システイン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｄ－プロリン、Ｌ－アラニル－Ｌ－システイン又は酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を含む還元型グルタチオンの各水溶液では、β型結晶発生の抑制が認められた。
〔実施例４〕
還元型グルタチオン水溶液の保存時のβ型結晶の発生の抑制に必要な媒晶剤の添加量の検討
　還元型グルタチオン（１００ｇ）を１Ｌビーカーに計りとり、水を加え、１Ｌになるまでメスアップした。４０℃で加温して結晶を完全に溶解し、メンブレンフィルターを用いてろ過をした。調製した還元型グルタチオン水溶液（１００ｇ／Ｌ）に媒晶効果が確認されたＬ－アラニンを０．０１重量％～１重量％（対還元型グルタチオン）ずつ添加し、１０℃に冷却後、１５時間攪拌した。１５時間後に上清をポアサイズ０．４５μｍのフィルターにてろ過し、上清の還元型グルタチオンの濃度をＨＰＬＣにて測定し、還元型グルタチオンの濃度の変化を観測することによるβ型結晶の発生の有無又は程度を判断した。時間経過及び媒晶剤の有無による還元型グルタチオンの濃度変化の結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　Ｌ－アラニンを添加していない還元型グルタチオンの水溶液は１５時間後には還元型グルタチオンの約２０％がβ型結晶として発生していることが認められた。一方、媒晶剤としてＬ－アラニンを添加した水溶液では、β型結晶の発生が抑制されることが分かった。また、Ｌ－アラニンの添加量が多いほど、β型結晶の発生が起こりにくいことが分かった。
　還元型グルタチオンの水溶液に共存させる媒晶剤の添加量としては、Ｌ－アラニンの場合、還元型グルタチオンに対して、好ましくは０．０１重量％以上であり、より好ましくは０．１重量％以上、特に好ましくは１重量％以上であることが分かった。
〔実施例５〕
還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法（１）
　還元型グルタチオン（５０ｇ）と水（５００ｍＬ）を１Ｌビーカーに添加した。その調製液にＬ－アラニン、Ｌ－システイン又は酸化型グルタチオンを、各２．５ｇ添加し、４０℃で加温して結晶を完全に溶解し、メンブレンフィルターを用いてろ過をした。調製液（ろ液）の還元型グルタチオン濃度がα型結晶の飽和溶解度以上となるようにエバポレーターにて濃縮し、還元型グルタチオンの濃縮晶析を行った。濃縮液を２５℃まで冷却し、２４時間攪拌した後、スラリー中の結晶を顕微鏡観察して、β型結晶への転移の有無を判断した。
　その結果、Ｌ－アラニン、Ｌ－システイン又は酸化型グルタチオンを添加した晶析では、β型結晶が発生することなくα型結晶のみが起晶した。
〔実施例６〕
還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法（２）
　還元型グルタチオン（５０ｇ）と水（５００ｍＬ）を１Ｌビーカーに添加した。その調製液にＬ－アラニン又はＬ－システインを還元型グルタチオンに対して、それぞれ１０重量％添加し、４０℃で加温して結晶を完全に溶解し、メンブレンフィルターを用いてろ過した。調製液（ろ液）の還元型グルタチオン濃度がα型結晶の飽和溶解度以上となるようにエバポレーターにて濃縮し、還元型グルタチオンの濃縮晶析を行った。濃縮液を２５℃まで冷却し、２４時間攪拌した後、スラリー中の結晶を顕微鏡観察することにより、β型結晶への転移の有無を判断した。
　その結果、Ｌ－アラニン又はＬ－システインを添加した晶析では、β型結晶が発生することなくα型結晶のみが起晶した。
　Ｌ－アラニン又はＬ－システインをそれぞれ１０重量％添加して晶析させることにより取得した結晶は、共に粉末Ｘ線回折において、回折角２θが、６．３°、１２．６°、１３．８°、１６．２°、２２．３°、２５．７°、３０．１°、３１．９°、３２．０°及び３３．５°にピークを有する還元型グルタチオンのα型結晶であることが分かった。
　本発明によれば、還元型グルタチオンのα型結晶の製造（晶析）や保存の際に、特定の媒晶剤又は保存剤を共存させておくことにより、β型結晶の発生及びβ型結晶への転移が顕著に抑えられ、還元型グルタチオンのα型結晶を効率良く、かつ安定的に製造することができる。また、本発明によれば、品質及び生産性の両面において優れた還元型グルタチオンのα型結晶を安定的に供給することができるので、医薬品、食品、化粧品等の多岐にわたる分野において有用である。
　本願は、日本に出願された特願２０１５－１１４８５５を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。

Claims (9)

  1. 　脂肪族アミノ酸、含硫アミノ酸、芳香族アミノ酸、類縁化合物及びジペプチドからなる群より選択される少なくとも１つの化合物からなる、還元型グルタチオンのβ型結晶の発生及び／又は還元型グルタチオンのα型結晶からβ型結晶への転移を抑制するための媒晶剤。
  2. 　請求項１記載の媒晶剤を含有する、還元型グルタチオンのα型結晶。
  3. 　媒晶剤の含有量が、還元型グルタチオンのα型結晶に対して０．０１～１０重量％である、請求項２記載の結晶。
  4. 　還元型グルタチオンを含有する水溶液に、請求項１記載の媒晶剤を添加する工程、及び還元型グルタチオンのα型結晶を晶析させる工程を含む、還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法。
  5. 　媒晶剤の添加量が、還元型グルタチオンに対して０．０１～１０重量％である、請求項４記載の方法。
  6. 　還元型グルタチオンの水溶液に、請求項１記載の媒晶剤を添加する工程を含む、還元型グルタチオンの水溶液の保存方法。
  7. 　媒晶剤の添加量が、還元型グルタチオンに対して０．０１～１０重量％である、請求項６記載の方法。
  8. 　還元型グルタチオンのα型結晶に、請求項１記載の媒晶剤を添加する工程を含む、還元型グルタチオンのα型結晶の保存方法。
  9. 　媒晶剤の添加量が、還元型グルタチオンに対して０．０１～１０重量％である、請求項８記載の方法。
PCT/JP2016/066586 2015-06-05 2016-06-03 還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法及び当該結晶の保存方法 WO2016195070A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201680032873.8A CN107636006B (zh) 2015-06-05 2016-06-03 还原型谷胱甘肽的α型晶体的生产方法和所述晶体的保存方法
JP2017522276A JP6868556B2 (ja) 2015-06-05 2016-06-03 還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法及び当該結晶の保存方法
EP16803501.2A EP3305801A4 (en) 2015-06-05 2016-06-03 PROCESS FOR PREPARING AN ALPHA FORM CRYSTAL FROM REDUCED GLUTATHION AND METHOD FOR STORING THE SAID CRYSTAL
US15/579,592 US10407463B2 (en) 2015-06-05 2016-06-03 Method for producing alpha-form crystal of reduced glutathione, and method for storing said crystal

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015114855 2015-06-05
JP2015-114855 2015-06-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016195070A1 true WO2016195070A1 (ja) 2016-12-08

Family

ID=57441284

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/066586 WO2016195070A1 (ja) 2015-06-05 2016-06-03 還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法及び当該結晶の保存方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10407463B2 (ja)
EP (1) EP3305801A4 (ja)
JP (2) JP6868556B2 (ja)
CN (1) CN107636006B (ja)
WO (1) WO2016195070A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10858393B2 (en) 2016-03-17 2020-12-08 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Crystal of reduced glutathione and method for producing same

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113754717A (zh) * 2021-10-15 2021-12-07 南京高新工大生物技术研究院有限公司 一种还原型谷胱甘肽α型晶体的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61282397A (ja) * 1985-06-07 1986-12-12 Kohjin Co Ltd グルタチオン及びγ−グルタミルシステインの精製法
JPH05339286A (ja) * 1992-06-10 1993-12-21 Kazuoki Ishihara 還元型グルタチオンの安定化法および安定化組成物
JP5243963B2 (ja) * 2006-10-16 2013-07-24 協和発酵バイオ株式会社 グルタチオンの結晶およびその製造法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5125908B2 (ja) 2008-09-05 2013-01-23 味の素株式会社 シトルリンの晶析方法
JP2011223896A (ja) * 2010-04-15 2011-11-10 Ajinomoto Co Inc ペプチドの製造方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61282397A (ja) * 1985-06-07 1986-12-12 Kohjin Co Ltd グルタチオン及びγ−グルタミルシステインの精製法
JPH05339286A (ja) * 1992-06-10 1993-12-21 Kazuoki Ishihara 還元型グルタチオンの安定化法および安定化組成物
JP5243963B2 (ja) * 2006-10-16 2013-07-24 協和発酵バイオ株式会社 グルタチオンの結晶およびその製造法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10858393B2 (en) 2016-03-17 2020-12-08 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Crystal of reduced glutathione and method for producing same

Also Published As

Publication number Publication date
CN107636006A (zh) 2018-01-26
US20180170959A1 (en) 2018-06-21
US10407463B2 (en) 2019-09-10
CN107636006B (zh) 2021-11-09
EP3305801A4 (en) 2019-01-23
JPWO2016195070A1 (ja) 2018-03-22
EP3305801A1 (en) 2018-04-11
JP6868556B2 (ja) 2021-05-12
JP2021080265A (ja) 2021-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Effect of sodium chloride on the nucleation and polymorphic transformation of glycine
Kaptein et al. Attrition‐enhanced deracemization of an amino acid derivative that forms an epitaxial racemic conglomerate
JP2021080265A (ja) 還元型グルタチオンのα型結晶の製造方法及び当該結晶の保存方法
WO2016121810A1 (ja) Ｎ－アセチルノイラミン酸アンモニウム塩・無水和物の結晶及びその製造方法
EP3150623A1 (en) Solvate of cyclic peptide compound, preparation method for same, and uses thereof
Sun et al. Additive-assisted preferential crystallization of racemic component: A case of norvaline
Elfassy et al. Crystallization of amino acids at the chiral ionic liquid/water interface
US7820860B2 (en) Method for separating compound-forming chiral systems
Vartak et al. Surface functionalization in combination with confinement for crystallization from undersaturated solutions
O'Mahony et al. Investigating the dissolution of the metastable triclinic polymorph of carbamazepine using in situ microscopy
JP6826267B2 (ja) クエン酸誘導体のジアステレオマーの製造方法
CN110114333B (zh) 赖氨酸乙酰水杨酸盐·甘氨酸颗粒的改进合成
Pons-Siepermann et al. Purification of nitrophenols using complex-assisted crystallization
JP5125908B2 (ja) シトルリンの晶析方法
Chen et al. Pasteur revisited: chiral separation by crystallization on self-assembled monolayers
Dhanasekaran et al. Nucleation control, separation and bulk growth of metastable α-l-glutamic acid single crystals in the presence of l-tyrosine
JPS59227848A (ja) ポリペプチド類の製造方法
JP6716903B2 (ja) ジペプチドの製造方法
JP5596695B2 (ja) エリスロマイシンの結晶化方法
CN104592046B (zh) 光学活性的缬氨酸复合物及其生产方法
Sato et al. New optical resolution method for racemic DL-aspartic acid by crystallization in the presence of d-or l-asparagine as a tailor-made additive
JPH04352796A (ja) アスパルテームの晶析法
HRP20020122A2 (en) Methods for crystallization of n-(1(s)-ethoxycarbonyl-3-phenylpropyl)-l-alanine n-carboxyanhydride
Yang et al. Ternary phase diagram and the formation mechanism of two distinct solid solutions of amino acid systems: L-Valine/L-norvaline and L-valine/L-alanine
Abd Rahim et al. Screening of carbamazepine-ibuprofen co-crystal formation using non-stoichiometric and stoichiometric methods

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16803501

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017522276

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15579592

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2016803501

Country of ref document: EP