CN114685600A

CN114685600A - 一种丙谷二肽的分离纯化方法

Info

Publication number: CN114685600A
Application number: CN202011595873.3A
Authority: CN
Inventors: 何嘉俊; 朱程军; 张凯莉; 李建华; 李敬; 唐鹏; 查丽燕; 苏海霞; 郭丽萍; 黄蕾; 凡佩; 张吉书; 杨磊; 刘莎
Original assignee: Wuhan Grand Hoyo Co ltd
Current assignee: Wuhan Grand Hoyo Co ltd
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2022-07-01

Abstract

本发明提供了一种丙谷二肽的分离纯化方法，其包括以下步骤：向溶解于甲酸的丙谷二肽粗品中添加溶剂，所述溶剂包括氢氧化钠的醇溶液，待所述丙谷二肽粗品析晶完全后，降温后离心即可。使用本发明的分离纯化方法分离纯化丙谷二肽时，能够有效去除三肽、四肽、以及多肽杂质，所得丙谷二肽的收率高且纯度高，并且对设备和工艺环境要求较低，更适于工业化生产。

Description

一种丙谷二肽的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种丙谷二肽的分离纯化方法。

背景技术

丙谷二肽(Alanyl Glutamine)，化学名为N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(见式1)，分子式：C₈H₁₅N₃O₄，分子量：217.15。本品为白色结晶性粉末；无臭无味；易溶于水、甲酸，不溶于乙醇、甲醇、丙酮和乙醚。

谷氨酰胺是一种条件必需氨基酸，是生物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶等的重要前体物质,也是蛋白质合成与分解的调节物。但谷氨酰胺本身由于不稳定、水溶性低而不能直接作为药物，只有将其转化为稳定的衍生物才能充分发挥谷氨酰胺对人体的作用。Peter Furst等发现丙氨酰谷氨酰胺(简称丙谷二肽)是谷氨酰胺理想替代品并于1995年将其开发为肠外营养用药。该药物具有促进肌肉蛋白合成、改善危重病人的临床与生化指标、维持肠道功能、保持机体氮平衡、增强免疫系统等作用，尤其在对大面积突发性创伤的病人具有重要的营养支持作用，目前在欧美等被广泛使用。

丙谷二肽的合成方法早期为化学合成法，但化学法合成，存在步骤较长，用到的化学试剂较多等问题，限制了其工业化应用。

近年来由于日本科学家Yokozeki和Hara等在酶技术上的突破(Yokozeki K.,HaraS.,Journal of Biotechnology,2005,115(02):211-220.)，采用酶法合成丙谷二肽能够直接以L-丙氨酸和L-谷氨酰胺为底物在酶催化的作用下一步合成丙谷二肽，与之前的化学合成法相比技术上，成本上、安全上都取得飞跃性突破，但是该技术路线会产生难以去除的三肽杂质丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺、四肽杂质丙氨酰丙氨酰丙氨酰谷氨酰胺和其它多肽类杂质。在目前的工艺技术中大家多采用2～3倍体积水溶剂丙谷二肽粗品，再加入大量的甲醇进行除杂和精制。中国专利CN110407914A公开了一种丙谷二肽的分离提纯方法，即粗品溶解于3倍量的水中，再加入0.1～50％的酸性物质，30～80℃加热搅拌，加入6倍水量的甲醇析晶，65℃减压干燥得纯化的精制品，纯度最高达到99.83％，单个杂质小于0.1％。该技术使用了粗品12倍水量的甲醇，资源浪费较大，对设备和工艺环境要求较高，且除杂效果不佳。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中去除制备丙谷二肽时产生的三肽、四肽、以及多肽杂质时资源浪费较大从而成本较高、对设备和工艺环境要求较高且除杂效果不佳等缺陷，提供了一种丙谷二肽的分离纯化方法。使用本发明的分离纯化方法分离纯化丙谷二肽时，能够有效去除三肽、四肽、以及多肽杂质，所得丙谷二肽的收率高且纯度高，并且对设备和工艺环境要求较低，更适于工业化生产。

本发明人经过大量研究后意外发现，当采用甲酸作为丙谷二肽的良溶剂，以氢氧化钠的醇溶液进行析晶时，能够有效去除三肽、四肽、以及多肽杂质，且有效提高所得丙谷二肽的收率和纯度。此外，本发明还可进一步同时采用氢氧化钠的醇溶液和小极性溶剂(例如正庚烷等)的混合溶剂进行析晶，能够使得析晶效果更佳，从而能够大大减少相关溶剂的用量，从而降低成本。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种丙谷二肽的分离纯化方法，其包括以下步骤：向溶解于甲酸的丙谷二肽粗品中添加溶剂以使得所述丙谷二肽粗品进行析晶，所述溶剂包括氢氧化钠的醇溶液，待所述丙谷二肽粗品析晶完全后，降温后离心即可。

本发明人在试验过程中有尝试过采用其他酸性溶剂，但发现最终都难以达到去除杂质的目的，只有采用甲酸时最终才能有效去除杂质。本发明人还有尝试使用碳酸钠的醇溶液进行试验，但最终效果均不理想，还尝试过使用甲醇钠、乙醇钠，效果同样不理想，并且这些试剂价格还很昂贵。

本发明中，所述的析晶完全通常是指丙谷二肽粗品被完全析出。本领域技术人员应当知晓，进行本领域常规操作就能够使得丙谷二肽粗品结晶，最终完全被析出。

本发明中，所述离心主要是为了甩料，以得到分离纯化后的丙谷二肽产物。

本发明中，所述的甲酸可以加入粗品中，粗品也可加入甲酸中，两者添加顺序可以不分先后。

本发明中，仅能向丙谷二肽粗品中添加(例如以滴加的形式进行添加)所述溶剂。本发明人有尝试过向所述的溶剂中添加粗品，发现会导致最终的分离纯化效果不佳。因此，所述的添加优选通过滴加的方式进行。

本发明中，所述溶解可以通过本领域常规的溶解方式，例如可以通过搅拌进行溶解，优选通过在室温下搅拌进行溶解。所述溶解通常是溶解至溶液澄清(将粗品溶解完全)即可，即使达到溶清即可。所述的室温具有本领域技术人员常规所理解的含义，例如20～25℃左右。

本发明中，所述的溶解于甲酸的丙谷二肽粗品通常是指将丙谷二肽粗品溶解于甲酸中，并且溶解时的溶剂可仅有甲酸而不存在其他种类的溶剂例如水。即，所述的溶解于甲酸的丙谷二肽粗品中不含水。

本发明中，所述氢氧化钠的醇溶液可为本领域常规，例如其中的氢氧化钠占所述醇溶液的质量体积比可以为5-20％，例如15％，例如可为5-15％或15-20％等。

本发明中，所述的醇溶液通常可以优选为低级醇溶液。所述的低级醇通常是指碳链较短的醇类，比如可以是指含有6个碳原子以下的一元醇及二元醇。所述的一元醇通常是指在分子内仅含有一个羟基的醇；二元醇则通常是指具有两个羟基(-OH)的醇类；所述的醇溶液例如可以为乙醇溶液、甲醇溶液、异丙醇或乙二醇溶液。

本发明中，所述溶剂还可以包括小极性溶剂，所述小极性溶剂为溶于醇类但不溶于水的直链烷烃或其衍生物。所述的直链烷烃或其衍生物中的衍生物具有本领域技术人员通常所理解的含义，通常可以是指直链烷烃分子中的氢原子被其他原子或者原子团所取代而生成的一系列化合物。所述小极性溶剂可为本领域常规，例如可以为选自正庚烷、正己烷和甲基叔丁基醚中的一种或多种。当进一步同时采用氢氧化钠的醇溶液和小极性溶剂(例如正庚烷等)的混合溶剂进行析晶时，能够使得析晶效果更佳，从而能够大大减少相关溶剂的用量，降低了成本。在某一较佳实施例中，所述的溶剂由氢氧化钠的醇溶液和小极性溶剂组成。

本发明中，所述的醇类具有本领域技术人员通常所理解的含义，通常可以是指分子中含有跟烃基或苯环侧链上的碳结合的羟基的化合物，其官能团为-OH，所述的醇类包括但不限于甲醇、乙醇、苯甲醇、乙二醇等。

本发明中，所述小极性溶剂的体积可以优选为所述甲酸体积的0.5-2.5倍，例如0.75倍或1倍，例如可为0.75-2.5倍、0.5-0.75倍或0.5-1倍等。

本发明中，所述氢氧化钠的醇溶液与所述小极性溶剂的体积比可以优选为(0.2～1.5):1，例如0.5:1、0.75:1或1:1，例如可为(0.5～1):1、(05～0.75):1等。

本发明中，所述溶剂的体积通常可以为所述甲酸体积的1.5-5倍，例如2倍或3倍。

本发明中，所述溶解于甲酸的丙谷二肽粗品中，所述丙谷二肽粗品与所述甲酸的质量体积比可以优选为(0.5-1):1，例如为1:1。

本发明中，所述降温可为本领域常规，例如可以优选降温至5-10℃。

本发明中，所述丙谷二肽粗品可为本领域常规制得的粗品，例如可以是经酶催化法制得的粗品，所述粗品通常以丙谷二肽干物质的形式存在。

在某一较佳实施例中，所述的丙谷二肽粗品通过以下方式得到：将混合后的谷氨酰胺和纯化水降温至15℃，调节pH值至9.0，加入酶，开始滴加丙氨酸甲酯盐酸盐水溶液，并控制pH维持在9.0，反应结束后加入30％体积的甲醇，升温60℃，灭活。优选还包括后处理，其包括以下步骤：60℃条件下加入活性炭脱色，过滤后过电渗析。减压旋蒸去除溶剂后，加入1.5倍体积水升温至60℃，滴加甲醇析晶。降温至10℃，离心，滤饼60℃真空干燥，得到丙谷二肽粗品。

在某一较佳实施例中，所述的丙谷二肽粗品通过以下方式得到：依次向反应釜中加入5kg的谷氨酰胺和纯化水，开启搅拌，降温至15℃，调节pH值至9.0，加入酶，开始滴加3.5kg的丙氨酸甲酯盐酸盐水溶液，并加入氨水控制pH维持在9.0，滴加完后用HPLC检测反应终点，反应结束后加入30％的1.8kg甲醇，升温60℃，灭活。然后进行后处理，包括：60℃条件下加入活性炭脱色，过滤后过电渗析。减压旋蒸去除溶剂后，加入1.5倍体积的750g水，升温至60℃，滴加3.2kg甲醇析晶，约2h滴加完毕。降温至10℃，离心，滤饼60℃真空干燥，得到丙谷二肽粗品5.82kg。

在某一较佳实施例中，所述的分离纯化方法包括以下步骤：将丙谷二肽粗品加入到甲酸中(丙谷二肽与甲酸质量体积比优选为1:1)，室温下搅拌溶清后，滴加NaOH的醇溶液(例如20％的NaOH乙醇溶液、15％的NaOH甲醇溶液、5％的NaOH异丙醇溶液或15％NaOH乙醇溶液)与小极性溶剂(例如正庚烷或甲基叔丁基醚)的混合溶剂，混合溶剂与甲酸的体积比优选为(1.5:1)～(3:1)，例如2:1，加入完毕后，降温至5-10℃，离心(以便甩料)即可。

经过上述分离纯化方法所得的产品符合药品级质量标准，可根据实际需要应用于各行各业，例如可以添加至细胞培养基以供细胞培养使用等。

本发明中，所述“包括或包含”可以是指除了包括后面所列举的成分，还存在其他成分；也可以是指“由……组成”，即只包括后面所列举的成分而不存在其他成分。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：使用本发明的分离纯化方法分离纯化丙谷二肽时，能够有效去除三肽、四肽、以及多肽杂质，所得丙谷二肽的收率较高且纯度大大提升，并且对设备和工艺环境要求较较低，更适于工业化生产。

附图说明

图1显示了丙谷二肽粗品的HPLC检测图谱。

图2显示了实施例1中的HPLC检测图谱。

图3显示了实施例2中的HPLC检测谱图。

图4显示了实施例3中的HPLC检测谱图。

图5显示了实施例4中的HPLC检测谱图。

图6显示了对比例1中的HPLC检测谱图。

图7显示了本发明实施例中的工艺路线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

以下实施例中，所述的丙谷二肽粗品的合成过程如下：依次向反应釜中加入谷氨酰胺(5kg)和纯化水，开启搅拌，降温至15℃，调节pH值至9.0，加入α-氨基酸酯酰基转移酶(购自北京百奥莱博科技有限公司)，开始滴加丙氨酸甲酯盐酸盐水溶液(3.5kg)，并加入氨水控制pH维持在9.0，滴加完后用HPLC检测反应终点，反应结束后加入30％(体积百分比)甲醇(1.8kg)，升温60℃，灭活。

后处理：60℃条件下加入活性炭脱色，过滤后过电渗析。减压旋蒸去除溶剂后，加入1.5倍体积水(750g)升温至60℃，滴加甲醇(3.2kg)析晶，约2h滴加完毕。降温至10℃，离心，滤饼60℃真空干燥，得到丙谷二肽粗品5.82kg。

实施例1

实施例中的工艺路线如图7所示，具体的：取100g粗品溶解在1倍体积的甲酸中(100ml)，室温搅拌(室温指的是20～25℃)，待其溶清后，滴加20％NaOH乙醇溶液100ml和正庚烷100ml的混合溶剂,对丙谷二肽的粗品进行结晶。待其析晶完全，降温至10℃。离心甩料，60℃真空干燥，粉碎粉筛得到精制后成品丙谷二肽共计92.3g，收率92.3％。精制后通过液相来检测三肽以及多肽等杂质的去除情况。粗品HPLC结果见图1和表1，丙谷二肽的含量为87.66％，其中三肽含量为6.4％，四肽含量为1.91％，通过精制工艺后丙谷二肽的含量提高到了99.82％，其三肽，与四肽杂质以及其它杂质均已除净，HPLC结果见图2和表2。甲酸溶残检测含量为0.03％，乙醇溶残检测含量为0.02％均符合药品级的质量要求，结果见表8。

表1丙谷二肽粗品HPLC检测结果

表2实施例1中HPLC检测结果

实施例2

将100g粗品溶解在1倍体积的甲酸中(100ml)，室温搅拌(室温指的是20～25℃)，待其溶清后，滴加15％NaOH甲醇溶液50ml和正己烷250ml的混合溶剂,对丙谷二肽的粗品进行结晶。待其析晶完全，降温至10℃。离心甩料，60℃真空干燥，粉碎粉筛得到精制后成品丙谷二肽共计92.3g，收率92.3％，纯度为：99.90％。HPLC结果见图3和表3。甲酸溶残检测含量为0.03％，甲醇溶残检测含量为0.03％均符合药品级的质量要求，结果见表8。

表3实施例2中HPLC检测结果

实施例3

将100g粗品溶解在1倍体积的甲酸中(100ml)，室温搅拌(室温指的是20～25℃)，待其溶清后，滴加5％NaOH异丙醇溶液150ml和正庚烷50ml的混合溶剂,对丙谷二肽的粗品进行结晶。待其析晶完全，降温至10℃。离心甩料，60℃真空干燥，粉碎粉筛得到精制后成品丙谷二肽共计88.0g，收率88.0％，纯度为：99.77％。HPLC结果见图4和表4。甲酸溶残检测含量为0.02％，异丙醇溶残检测含量为0.03％均符合药品级的质量要求，结果见表8。

表4实施例3HPLC检测结果

实施例4

将2kg的粗品溶解在1倍体积的甲酸中(2L)，室温搅拌(室温指的是20～25℃)，待其溶清后。滴加15％NaOH乙醇溶液1.5L和正庚烷1.5L的混合溶剂,对丙谷二肽的粗品进行结晶。待其析晶完全，降温至10℃。离心甩料，60℃真空干燥，粉碎粉筛得到精制后成品丙谷二肽共计1.814kg，收率90.7％，纯度为：99.76％。HPLC结果见图5和表5。甲酸溶残检测含量为0.04％，乙醇溶残检测含量为0.03％均符合药品级的质量要求，结果见表8。

表5实施例4HPLC检测结果

综上所述，上述精制工艺流程能够解决多肽难以去除的问题，并且所采用精制工艺步骤简单，易于操作，所用溶剂廉价易得生产成本底，产品纯度均在99％以上，杂质去除效果好，具有很好的工业使用价值。

对比例1(参照CN110407914A精制方法)

将100g粗品溶解在3倍体积的纯化水中(200ml)，再加入30％的一水柠檬酸升温至60℃搅拌，保温30min后加6倍体积的甲醇析晶，滴加1800ml甲醇对丙谷二肽的粗品进行结晶。待其析晶完全，降温至10℃。离心甩料，65℃真空干燥，粉碎粉筛得到精制后成品丙谷二肽共计90.01g，收率90％，纯度为：91.59％，HPLC结果见图6和表7。将其与实施例2进行对比，见表6：实施例2的纯度为99.90％，比实施例1的纯度为91.59％。对比杂质情况实施例2中的三肽、四肽均未检出，对比例中三肽杂质为4.81％，四肽杂质为0.8％。我们可得出以下结论本实施例提供的精制方法除杂效果要明显优于CN110407914A精制方法。

表6实施例2与对比例1结果对比

样品名	三肽	四肽	甲醇溶残	纯度	收率
						实施例2	未检出	未检出	0.03	99.90％	92.3％
对比实施例1	4.81％	0.8％	0.2	91.59％	90％

表7对比例1HPLC检测结果

表8溶残检测：

Claims

1.一种丙谷二肽的分离纯化方法，其特征在于，其包括以下步骤：向溶解于甲酸的丙谷二肽粗品中添加溶剂，所述溶剂包括氢氧化钠的醇溶液，待所述丙谷二肽粗品析晶完全后，降温后离心即可。

2.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述溶解为通过搅拌进行溶解，优选在室温通过搅拌进行溶解；

和/或，所述的溶解于甲酸的丙谷二肽粗品中不含水；

和/或，所述的添加优选通过滴加的方式进行。

3.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述氢氧化钠的醇溶液中氢氧化钠占所述醇溶液的质量体积比为5-20％，例如15％。

4.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述的醇溶液为低级醇溶液，其中所述低级醇优选为含有6个碳原子以下的一元醇和二元醇，所述的醇溶液例如为乙醇溶液、甲醇溶液、异丙醇或乙二醇溶液。

5.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述溶剂还包括小极性溶剂，所述小极性溶剂为溶于醇类但不溶于水的直链烷烃或其衍生物，所述小极性溶剂优选自正庚烷、正己烷和甲基叔丁基醚中的一种或多种。

6.如权利要求5所述的分离纯化方法，其特征在于，所述小极性溶剂的体积为所述甲酸体积的0.5-2.5倍，例如0.75倍或1倍。

7.如权利要求5或6所述的分离纯化方法，其特征在于，所述氢氧化钠的醇溶液与所述小极性溶剂的体积比为(0.2-1.5):1，例如0.5:1、0.75:1或1:1。

8.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述溶解于甲酸的丙谷二肽粗品中，所述丙谷二肽粗品与所述甲酸的质量体积比为(0.5-1):1，例如为1:1。

9.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述降温为降温至5-10℃。

10.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述丙谷二肽粗品为经酶催化法制得的粗品。